Guia Estudio Enzimas

8/16/2019 Guia Estudio Enzimas

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GUÍA DE ESTUDIO ENZIMAS. Profesor Marcelo Ortega

Las enzimas.

Las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica que aceleran la velocidad de

reacción hasta alcanzar un equilibrio, es por esta razón que se denominan

catalizadores biológicos. Constituyen el tipo de proteínas más numeroso y

especializado y, actúan como catalizadores de reacciones químicas específicas en

los seres vivos o sistemas biológicos. Muchas de las enzimas no trabajan solas,

se organizan en secuencias, también llamadas rutas metabólicas, y muchas de

ellas tienen la capacidad de regular su actividad enzimática.

Se podría denominar a las enzimas como proteínas que catalizan reacciones

químicas sin ser consumidas durante este proceso, es decir, luego de la reacciónquímica las enzimas deben estar intactas. Sin embargo, es importante destacar

las enzimas no catalizan reacciones imposibles.

Estructura de las enzimas

Para comprender cómo funcionan las enzimas, es necesario saber qué son y

conocer la importancia de su estructura. Las enzimas son proteínas globulares

formadas por una o más cadenas polipeptídicas plegadas, creando una

“hendidura” donde encaja el sustrato y tiene lugar la reacción. Esta zona de la

enzima se denomina centro activo (sitio activo) y sólo unos pocos aminoácidos

están implicados en él. La proximidad de los aminoácidos en el centro activo está

determinada por la estructura terciaria, aunque también pueden ocupar posiciones

adyacentes en la estructura primaria. En una enzima con estructura cuaternaria,

los aminoácidos del centro activo pueden encontrarse incluso en diferentes

cadenas.

El centro activo es el lugar específico donde los sustratos se unen para que

posteriormente se lleva a cabo la reacción química.


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Figura 1. Enzima con un sustrato (azul) unido al centro

activo (hendidura) con un aminoácido clave del sitio activo

(rojo).

La configuración tridimensional del centro activo es complementaria a la del

sustrato y posee una distribución complementaria de sus cargas sobre la

superficie de unión. Es decir, si una región del sustrato tiene una carga negativa,

la zona correspondiente del centro activo tendrá una carga positiva y viceversa. En

1894, Emil Fischer, un químico alemán, comparó la especificidad de la enzima con

una llave y su cerradura. Pero, estudios posteriores sugirieron que el centro activo

es más flexible que el ojo de una cerradura, por lo tanto se sugirió en el año 1958por Koshland un modelo denominado de ajuste inducido en el cual el sustrato se

adapta al centro activo de la enzima y de esta forma se pueda realizar la catálisis

enzimática.

Figura 2. Modelo de ajuste

inducido en el cual el sustrato se

ajusta al centro activo de la

enzima.

Finalmente, se ha establecido que una combinación de los modelos es lo que

realmente sucede en la interacción de la enzima con el sustrato. La unión entre la

enzima y el sustrato altera la conformación de la enzima, ajustando el centro

activo al sustrato. Se piensa que este cambio inducido puede crear cierta tensión

en las moléculas reactivas y facilitar de esta manera la reacción.

Figura 3. Mecanismo de unión de la enzima

al sustrato.


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Mecanismo de acción de las enzimas. Catálisis enzimática.

Energía de activación

En toda reacción química se produce la transformación de unas moléculas

iniciales denominadas sustratos (S) en las reacciones bioquímicas y que se

transformaran en unas sustancias finales o productos (P). Esta transformación

necesita, en la mayoría de las reacciones, un aporte inicial de energía que

aumenta la energía cinética de las moléculas y éstas, reaccionan permitiendo que

un mayor número de ellas, choquen con suficiente fuerza para superar su

repulsión mutua y debilitar los enlaces químicos que poseen. La energía que

deben poseer las moléculas para iniciar la reacción se conoce con el nombre de

energía de activación.

El catalizador Un catalizador disminuye la energía de activación necesaria para

una reacción, porque forma una asociación pasajera con las moléculas que

reaccionan. Esta asociación aproxima a las moléculas que reaccionan y, favorece

tanto la ruptura de enlaces existentes, como la formación de otros nuevos. Cuando

existe un catalizador en la energía de activación, esta reacción puede suceder

rápidamente sin o con poca adición de energía. El catalizador no sufre ninguna

alteración permanente en el proceso y puede volver a utilizarse. Gracias a las

enzimas, las células son capaces de desarrollar reacciones químicas a gran

velocidad y a temperaturas relativamente bajas.

Reacciones enzimáticas En estas reacciones, la enzima (E) se une al sustrato

(S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). Después tiene lugar la

transformación del sustrato (S) en producto (P), liberándose el producto (P) y

quedando libre la enzima (E) para una nueva unión con el sustrato.

E + S -------------> ES -------------> EI -------------> EP -------------> P + E


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Las enzimas, como los demás catalizadores, aceleran la reacción sin alterar la

posición de equilibrio. En una reacción química tenemos:

Figura 4. Grafico de la diferencia de

energía que necesita una reacción no

catalizada (line más gruesa) y la misma

reacción con catálisis enzimática (línea

fina). (ES) significa la unión de la enzima

y el sustrato, (EI) la enzima con el

compuesto intermedio y, (EP) la

enzima con el producto. Los asteriscos

significan los estados de transición correspondientes a cadacomplejo ES, EI y EP

Cofactores y coenzimas

Cofactores Muchas enzimas necesitan para una correcta actividad enzimática la

adición de cofactores, que son determinados iones minerales (magnesio, zinc,

cobre, etc.). En algunos casos, los enlaces entre los iones y los radicales de

ciertos aminoácidos ayudan a mantener la estructura terciaria o a estabilizar la

estructura cuaternaria de la proteína .

Coenzimas Las moléculas orgánicas (como por ejemplo las vitaminas) que actúan

como cofactores se denominan coenzimas. Éstas se unen de manera temporal o

permanente a la enzima en una zona bastante próxima al centro activo. Cuando la

enzima es activada por una coenzima, el conjunto se denomina holoenzima, y


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cuando la inactiva, apoenzima. Las deficiencias en vitaminas pueden provocar

distintas enfermedades dado que la actividad enzimática se puede ver

perjudicada.

Tabla 2. Ejemplo

de enfermedades

producidas por

deficiencia en

algunas vitaminas

que actúa como

coenzimas.

Efectos de la temperatura y del pH.

La temperatura. Cada enzima tiene una temperatura óptima de actividad. Por

debajo y por encima de esta temperatura, la enzima ralentiza la velocidad de la

reacción enzimática, por lo tanto, la reacción química ocurre de forma más lenta.

Se observa que muchas de las enzimas, duplican

la velocidad de una reacción enzimática cuando se

aumenta la temperatura de unos 10° C

aproximadamente y luego cae muy rápidamente

por encima de los 40° C [Figura 5].

Figura 5. Efecto de la temperatura en la

velocidad de reacción enzimática.

El aumento en la velocidad de reacción se produce porque con temperaturas más

altas, existen más moléculas de sustrato con suficiente energía para reaccionar; la

disminución de la velocidad de la reacción es debida a la desnaturalización de la

enzima (la mayoría de las proteínas globulares se desnaturalizan por encima de

60 - 70°C).


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El pH. La actividad enzimática también viene regulada por el pH de la solución

enzimática. El pH óptimo o intervalo de pH de cada enzima es diferente y cuando

varía, la conformación de la enzima se altera, produciéndose un cambio en el

estado de ionización de grupos del sitio activo y llegando a no ser funcional. Esto

es debido a que la conformación de una proteína depende también, de las

atracciones y repulsiones entre los aminoácidos cargados negativamente y los

cargados positivamente. Además algunas cadenas laterales de aminoácidos

pueden actuar como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones críticas en

el sitio activo del enzima.

Figura 6. Efecto del pH en

la velocidad de reacciónenzimática.

El pH puede afectar de varias maneras:

El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que

pueden variar con el pH.

La ionización de aminoácidos que no están en el centro activo puede

provocar modificaciones en la conformación de la enzima.

El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.

Algunas enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estómago,

presenta un óptimo a pH=2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH= 12.

La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones

de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar

drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la

ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Fig. 7). Como ligeros

cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres


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vivos han desarrollado sist

pH intracelular: Los amorti

fisiológicos.

Figura 7. Efecto del p

velocidad de reacción enzi

Efecto de las concent

enzimática viene limitadade enzimas, de sustrato

reacción está relacionada

velocidad es diferente par

es constante, la velocidad

concentración del sustrat

están ocupadas por molé

(Figura 8). Existe un peri

cuando la enzima se mez

aumenta la concentració

donde ES permanece con

las reacciones enzimática

enzima. Muchas enzimas

cuando se necesitan. Otra

necesitan

mas más o menos complejos para mante

uadores

en la

ática.

aciones de enzima y de sustrato.

or diferentes factores como puede ser la c la disponibilidad de cofactores. La vel

directamente con la concentración de la e

cada enzima. Cuando la concentración

aumenta hasta alcanzar un máximo (Vma

siga aumentando. Todas las molécula

culas de sustrato y la velocidad no pue

do inicial denominado estado pre-estacio

cla con el gran exceso de sustrato y dur

ES. Seguidamente aparece el estado

tante en el tiempo. Las células regulan la

mediante la regulación de las concentra

son degradadas rápidamente y se si

, se segregan en forma inactiva y se activ

er estable el

La actividad

oncentracióncidad de la

nzima y esta

e la enzima

x) aunque la

de enzima

de aumentar

nario que es

ante el cual,

estacionario

velocidad de

ciones de la

tetizan sólo

n cuando se


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Figura 8.

Efecto de la

concentración

de la enzima

en relación a

la velocidad

de reacción (gráfico izquierdo). Efecto de la velocidad de la reacción en relación a

la concentración de sustrato en donde se indica la Vmax (gráfico de la derecha).

La curva que expresa la relación entre la concentración de

sustrato y la velocidad inicial tiene la misma forma para la

mayoría de las enzimas; se trata de una hipérbolarectangular, cuya expresión algebraica viene dada por la ecuación de Michaelis-

Menten, donde muestra la relación entre la velocidad inicial (Vo) y la concentración

de sustrato, S.

Figura 9. Cinética enzimática. Modelo

de Michaelis-Menten.

Los términos Vmax (velocidad máxima) y Km (constante de Michaelis) son dos

parámetros cinéticos característicos de cada enzima, que pueden determinarse

experimentalmente. La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando la velocidad

de reacción se hace independiente de la concentración de sustrato, cuando esto

ocurre la velocidad alcanza un valor máximo. Este valor depende de la cantidad de

enzima que tengamos. La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentración

de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima.

Este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es


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característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km

también indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor,

cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de

sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que

mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato.

En muchos casos es de vital importancia conocer estos parámetros cinéticos. En

principio, podrían obtenerse de forma poco rigurosa a partir de la curva de

Michaelis Menten, para lo cual sería preciso primero obtener el valor de la Vmax y

después, teniendo en cuenta que la Km es la concentración a la cual la velocidad

es la mitad de la velocidad máxima, podríamos obtener su valor. Sin embargo,

mediante la curva de Michaelis Menten es difícil estimar cuando se ha logrado

llegar a la Vmax. Es por ello que existen métodos gráficos más fiables que facilitanel cálculo preciso de la Km y la Vmax. Los cálculos se hacen en base a

transformaciones matemáticas de la ecuación de Michaelis; una de las

expresiones más utilizadas es la representación de Lineweaver-Burk (Figura 10).

En esta forma de cálculo se representa 1/V frente a 1/S, esto es la inversa de la

velocidad frente a la inversa de la concentración (de ahí que también la

representación sea conocida como de

dobles inversos), así se obtiene una recta

cuya intersección con el eje X es –1/Km y

con el eje Y es 1/Vmax, siendo la

pendiente Km/Vmax.

Figura 10. Cinética enzimática.

Representación de Lineweaver-Burk

La obtención de la Km y la Vmax de una enzima, es importante no sólo porque

son parámetros que la identifican, sino también por motivos que, en ocasiones,

pueden ser de vital importancia. Por ejemplo, algunos tipos de leucemia

(enfermedad en la que los glóbulos blancos proliferan anormalmente) pueden


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evitarse por la administración de una enzima, la Asparraginasa, que cataliza la

reacción de hidrólisis de la asparragina (Asn) a ácido aspártico (Asp).

Asn + H2O Asp + NH+4

Este descubrimiento condujo a la conclusión de que la Asn presente en la sangre es un

principio nutritivo para el crecimiento de los linfocitos malignos; el problema apareció

cuando se utilizaron distintas fuentes de asparraginasa, descubriéndose que no todas

eran eficientes. Al final se encontró la razón. Estas enzimas, de diferentes fuentes

(animal, vegetal o microbiana), tenían diferente Km respecto a la Asn. Como la [Asn] en la

sangre es muy baja, sólo aquellas enzimas con el valor de Km muy bajo (una mayor

afinidad por el sustrato) serían capaces de provocar la hidrólisis de la Asn. Así, se

comprobó al obtener los parámetros que la enzima que presentaba menor Km para la Asn

era la de una bacteria (E. coli), y fue la que se utilizó para controlar la enfermedad.

Inhibición enzimática. Existen sustancias que pueden impedir que la enzima

desarrolle su actividad catalítica, ralentizando o paralizando la reacción

enzimática. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimáticos. Teniendo

en cuenta que las reacciones químicas en la célula están catalizadas por enzimas,

es fácil intuir el papel de muchos inhibidores enzimáticos que actúan comofármacos, antibióticos o conservantes; otros pueden ser tóxicos, potentes

venenos. Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) es un analgésico que inhibe la

enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de prostaglandinas, implicadas

en la producción del dolor. Se conocen dos tipos principales de inhibición: la

reversible y a la irreversible. La primera implica una unión “no covalente” del

inhibidor y, por lo tanto, siempre puede revertirse. En la inhibición irreversible, el

inhibidor se une al enzima de forma “covalente” y permanente.

Inhibición reversible. Los distintos modelos de inhibición reversible implican la

unión no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos

por medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que


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afectan a la cinética de la reacción. Entre ellos están la inhibición competitiva, la

acompetitiva y la no competitiva.

El inhibidor competitivo, es una sustancia similar

en estructura al sustrato, con quien compite por el

sitio activo de la enzima.

Como consecuencia, aunque la velocidad máxima no se altera, para alcanzarla

sería necesario poner más cantidad de sustrato en el medio de reacción, lo que se

refleja, en la correspondiente curva de Michaelis, como un aparente aumento de la

Km (la enzima en presencia del inhibidor perdería afinidad por el sustrato). La

representación de dobles inversos permite observar claramente este tipo deinhibición. Así cuando se realizan distintos estudios a varias concentraciones de

inhibidor, obtenemos, mediante la representación de dobles inversos, distintas

rectas que se cortan en el mismo punto (para X=0), indicando que la Vmax no se

altera, pero la Km (y por lo tanto la afinidad) aparentemente sí, pues existen varios

puntos de corte para y=0, por lo tanto aparentemente varias Km, que además van

aumentando con la concentración del Inhibidor.

Figura 11. Representación de la variación de las curvas de Michalis Menten y de

Lineweaver Burk en a presencia de un inhibidor competitivo (Línea roja).


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La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su concentración respecto a la

del sustrato. Si hay un exceso de inhibidor éste bloqueará los centros activos de

las moléculas de enzima, resultando una inhibición total. No obstante, el proceso

es reversible si se procura exceso de sustrato, que desplazaría totalmente al

inhibidor.

Inhibición no competitiva. En la inhibición no competitiva, el inhibidor que no

necesita parecerse al sustrato, se une a la enzima en un sitio distinto al centro

activo, por lo tanto se une a un sitio alostérico. La unión del inhibidor no

competitivo a la enzima, no bloquea la fijación del sustrato e inactiva la enzima,

este presente o no el sustrato. Al igual que la inhibición competitiva, la inhibiciónno competitiva es reversible.

El inhibidor se puede unir tanto a la enzima libre o al complejo enzima-sustrato, de

este modo la afinidad de la enzima por el sustrato no se ve afectado por lo que la

Km no cambia su valor. Sin embargo, la presencia del inhibidor no permite formar

producto lo que significa que la Vmax se verá afectada y por lo tanto disminuirá en

presencia de este inhibidor.

Figura 12. Representación de la variación de las curvas de Michalis Menten y de

Lineweaver Burk en a presencia de un inhibidor no competitivo (Línea roja).

Inhibición acompetitiva o incompetitiva En la inhibición acompetitiva el inhibidor

se fija a un sitio diferente al del sitio activo. Este inhibidor sólo se une a la enzima


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(E) cuando ya se ha form

enzima libre. Este tipo de i

Figura 13. Representación

Lineweaver Burk en a pres

Figura 14. Representació

tipos de inhibición. Inhibici

no competitiva y acompetiti

ado el complejo ES enzima-sustrato y no

hibición disminuye la Km y disminuye la V

de la variación de las curvas de Michalis

ncia de un inhibidor acompetitivo (Línea r

n de los tres

n competitiva,

va.

se une a la

ax.

Menten y de

ja).


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Las interacciones alostéricas

suelen localizarse en puntos

estratégicos de las vías

enzimáticas, en los primeros

pasos o en puntos de ramificación

entre varias vías. A veces, el

propio sustrato actúa de efector

activador y su unión a la enzima

induce cambios en la

conformación del centro activo

que favorecen la catálisisenzimática. Otras veces, el

producto final de una secuencia de reacciones actúa como efector alostérico

inhibiendo la función de una de las enzimas. Este proceso se denomina inhibición

por retroalimentación o inhibición feed-back, y supone un ahorro energético, pues

el exceso de producto final inhibe su propia síntesis en los primeros pasos

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