UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Profesor: LUIS JAVIER NARVÁÉZ ZAMORA

BIOQUÍMICA PRÁCTICA DE LABORATORIO No. 5

RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS

Estas biomoléculas provienen del proceso fotosintético vegetal y su importancia bioquímica radica en su poder energético del cual se deriva en gran parte el mantenimiento de la vida de todos los organismos terrestres. a nivel humano, luego de ser ingeridos en la dieta alimentaria, son transformados den glucosa, la cual es inicialmente se almacena como glicógeno y luego es oxidada hasta CO2 y H2O. Los carbohidratos a nivel molecular son aldehídos (aldosas) y cetonas (cetosas) de polihidroxialcohóles; las unidades básicas son los monosacáridos, descritos a continuación:

D-aldosas

D-cetosas

Estas estructuras moleculares existen en la naturaleza gracias a los carbonos quirales o asimétricos, los cuales generan a su vez sus imágenes especulares o esteroisómeros. Por ejemplo el gliceraldehído tiene un carbono asimétrico y dos posibilidades de distribución de los cuatro grupos unidos a él. así, cada una de las estructuras moleculares de la gráfica anterior tiene su propio esteroisómero denominado derivado L PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS La condición de aldosas y cetosas les permite exhibir algunas propiedades exclusivas para este tipo de sustancias, entre ellas las siguientes: PRUEBA DE MOLISH La hidrólisis de los enlaces glicosídicos se puede lograr en medio ácido para producir monosacáridos susceptibles de deshidratación para producir furfural y sus derivados, los cuales a su vez reaccionan con -naftol produciendo un complejo de color morado característico. MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 ml, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 ml. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, -naftol (50 G/ L de etanol), H2SO4 concentrado. PROCEDIMIENTO En sendos tubos de ensayo se depositan 2 ml de cada carbohidrato, a cada uno se añaden 2 o 3 gotas de solución de a-naftol, luego y de manera cuidadosa se deja resbalar por las paredes del tubo, 1 ml de H2SO4 concentrado hasta conseguir la formación de dos capas. La prueba es positiva con la generación de un anillo de color morado en la interfase. PRUEBA DE LA ANTRONA Al igual de la prueba de Molish, la prueba de antrona sirve para reconocer carbohidratos en general. El fundamento teórico de esta prueba es el mismo de la prueba anterior. MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 ml, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 ml. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, antrona recientemente preparada (2g/L en H2SO4 concentrado). PROCEDIMIENTO En sendos tubos de ensayo se depositan 1 ml de solución de antrona, luego se agregan 5 gotas de solución de cada carbohidrato, mezclar y observar cambios de coloración; la prueba es positiva si se genera un color azul verdosa.

REACCIONES PARA CARBOHIDRATOS REDUCTORES Los carbohidratos pueden reducir los reactivos de Fehling 0 Benedict (soluciones alcalinas de iones cúpricos, en forma de complejos, con iones tartratos 0 citratos, respectivamente) 0 de Tollen (solucion amoniacal de una sal de plata) se conocen como azucares reductores. Todos los monosacaridos (aldosas y cetosas), y la mayoría de los disacaridos, son reductores exceptuando la sacarosa. Para explicar las dos primeras pruebas, el Cu(OH)2 al ser calentado en solución alcalina forma el CuO de color negro, en presencia de sustancias reductores, el Cu(OH)2 produce Cu2O de color rojo ladrillo. En las pruebas siguientes se usa CuSO4 en solución alcalina y un compuesto orgánico con un grupo OH- para reemplazar al hidróxido cúprico. Los carbohidratos con un grupo carbonilo libre o potencialmente libre o un grupo cetónico son sustancias reductoras. PRUEBA DE FEHLING El reactivo requiere dos soluciones (Fehling A y Fehling B), las cuales se preparan por separado Fehling A: Disolver 30 g de CuSO4.5H2O en 1 Litro de agua Fehling B: Disolver 150 g de tartrato de Na y K (Sal de Rochelle) en 100 ml de agua caliente, adicionar 900 ml

g de NaOH al 5% MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 ml, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 ml. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Fehling (mezclar volúmenes iguales de Soluciones de Fehling A y Fehling B) PROCEDIMIENTO En sendos tubos de ensayo se depositan 1 ml de Reactivo de Fehling, luego se agregan 1 ml de solución de cada carbohidrato, mezclar y observar cambios de coloración; la prueba es positiva si se genera un color rofo ladrillo PRUEBA DE BENEDICT Esta prueba es similar a la anterior con la diferencia del uso de una sola solución. El reactivo de Benedict se prepara de la siguiente manera: Disolver 170 g de citrato de sodio y 100 g de Na2CO3 en 800 ml de agua caliente; filtrar y completar el filtrado hasta 850 ml. Por aparte disolver 17 g de CuSO4.5H2O en 150 ml de agua, añadir lentamente esta segunda solución a la inicialmente preparada. MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 ml, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 ml. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Benedict. PROCEDIMIENTO En sendos tubos de ensayo se depositan 2 ml de cada una de laa disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, luego se adiciona 1 ml del reactivo de Benedict, a cada tubo y se hierve durante 3 minutos. Observar los cambios ocurridos y los colores generados. PRUEBA DE BARFOED Este reactivo reduce solamente a los monosacáridos, sin embargo, cuando una disolución de disacáridos se deja hervir por tiempo considerable, estos se hidrolizan dando reacciones positivas falsas. esta prueba es similar a las de Benedict y Fehling, la diferencia es la cantidad de óxido cuproso producido, razón por la cual es necesario dejar reposar por más tiempo. MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 ml, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 ml. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Barfoed (Disolver 14 g de acetato de cobre en 200 ml de agua y agregar 1.5 ml de ácido acético glacial) PROCEDIMIENTO En sendos tubos de ensayo se depositan 2 ml de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, luego se adiciona 1 ml del reactivo de Barfoed, a cada tubo y se hierve durante 1 minuto. Observar los cambios ocurridos y los colores generados. PRUEBAS PARA CARBOHIDRATOS ESPECÍFICOS PRUEBA DE BIAL PARA PENTOSAS Las disoluciones de pentosas al ser calentadas en HCl concentrado forman furfurales, los cuales se condensan con orcinol en presencia de iones férricos generando coloraciones verde azulosas características, sin embargo con las hexosas la reacción genera complejos coloreados. MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 ml, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 ml. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Bial (Disolver 1.5 g de orcinol en 500 ml de HCl concentrado, luego añadir 0.5 ml de FeCl3 100g/L y agregar 1.5 ml de ácido acético glacial), Alcohol amílico

PROCEDIMIENTO En sendos tubos de ensayo se deposita 1 ml de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, luego se adiciona 2 ml del reactivo de Bial, a cada tubo calentar hasta que se inicie la ebullición. Observar los cambios ocurridos y los colores generados.Una vez frios los tubos, agregar 0.5 ml de alcohól amílico. PRUEBA DE SELIWANOFF PARA CETOSAS Las cetosas también se deshidratan como las aldosas para formar derivados del furfural, los cuales a su vez reaccionan con resorcinol para generar complejos coloreados rojos El tiempo de deshidratación de las cetosas es menor que el de las aldosas, por tanto el calentamiento debe ser mucho más corto al empleado en la prueba anterior. MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 ml, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 ml. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Seliwanoff (0.5 g de resorcinol en HCl 3 M) PROCEDIMIENTO En sendos tubos de ensayo se deposita 1 ml de reactivo de Seliwanoff y añada 5 gotas de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, calentar en baño de agua hirviendo hasta la generación del color rojo característico de la prueba. PRUEBA PARA LUGOL PARA POLISACÁRIDOS Los polisacáridos forman complejos coloreados de absorción con el yodo, así por ejemplo, el almidón genera un color azul muy oscuro, mientras el glucógeno o el almidón parcialmente hidrolizado generan coloraciones del tono pardo rojizo. MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 ml, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 ml. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Lugol (5 mM en KI 30 g/L) PROCEDIMIENTO En sendos tubos de ensayo se deposita 1 ml de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, adicionarles 1 ml de reactivo de Lugol calentar en baño de agua hirviendo hasta la generación del color característico de la prueba. CUESTIONES 1. Plantear una ecuación para cada una de las pruebas realizadas durante la práctica. Indicar en cada caso la utilidad práctica. 2. Establecer la importancia de los carbohidratos en la biósfera y a nivel humano en particular. 3. Describir brevemente 3 enfermedades o desórdenes metabólicos derivados del metabolismo de carbohidratos. 4.Explicar la diferencia estructural de los carbohidratos D y L y los homopolisacáridos y los heteropolisacáridos.

REFERENCIAS

Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona:

Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera,

revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana

Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana.