Guia Prac.micro

5/9/2018 Guia Prac.micro - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/guia-pracmicro 1/25

1

PROPUESTA EXPERIMENTAL A.F.P.

INTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ .

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA.

MATERIA DE MICROBIOLOGIA .

PROPUESTA PRACTICA N° 1

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN , AISLAMIENTO Y TINCIÓN

OBJETIVO: En esté experimento el estudiante desarrollara las diferentestécnicas, de inoculación y aislamiento propuestas, comprobando cuales sonlas más adecuadas dependiendo de las características morfológicas de cadaorganismos .

INTRODUCCION : Las diferentes técnicas utilizadas para aislar o bien paracultivar un organismo dependen del criterio que se utiliceLas técnicas de inoculación tienen diferente objetivo, algunas se utilizan conel único fin de que los microorganismos se multipliquen sobre el medio decultivo., a estas se les llama técnicas de inoculación masiva.

Cuando se parte de mezclas bacterianas, las técnicas que se utilizan son:aislamiento por estría cruzada, con estas técnicas se separan bacterias , sobrela superficie del agar , y además permite comprobar si la técnica cumplió sufunción haciendo una comparación de la morfología macroscópica .

El aislamiento o separación de diferentes microorganismos como levadurasde bacterias , bacterias de bacterias o bien simplemente para contar lapoblación microbiana por el método de las diluciónes y la siembra por vaciado es muy común .

La separación de microorganismos por la técnica de filtración es muy utilizadaen el laboratorio se sugiere probar con las técnicas de filtro Wattman ymembrana Millipore

Materiales y Procedimientos.

Cajas de Petri estériles, con agar nutritivo.Cajas de Petri estériles con medio de Papa dextrosa agar.Cajas de Petri estériles.Matraz Erlenmeyer de 150 ml con agua estéril

Matraz KitazatoEmbudo Buchner Membrana de Millipore.Microscópio binocular.Varilla angular de vidrio.Asa con circunferencia.Varilla de cristal en angulo recto.Tubos de ensaye con 9 ml de agua destilada estéril.Tubos de ensaye con medio de cultivo inclinado.Mechero Fisher.



2


Alcohol de 95°Pipetas estériles de 1 ml.Pipetas estériles de 2 ml.Medio de Agar de Soya y Trpticaseína .AlgodónAguja de disección,

EQUIPO PARA TINCION DE GRAM.Colorante cristal violeta.Solución de yodo para Gram.Solución decolorante, acetona -butanol (95%)Safranina de Gram.Palillo aplicador.

5Jerigas de 5 ml y de 10ml

CEPAS BACETRIANAS. por equipoCepas 1 de Escherichia coli . en tubo inclinadoCepa de levadura de Sacharomyces en tubo con medio líquídoCepas 2 de Klebsiella en tubo con medio inclinadoCepa 3 de Aspergillus en medio inclinado

EL ALUMNO .Después de leer cuidadosamente la práctica e investigar lo referente a lamisma para lograr el objetivo entregara al maestro un diagrama de flujodonde indique los pasos a seguir .

PROCEDIMIENTO PARA BACTERIAS:

Inoculación masiva; De dos bacterias y una levadura en cajas de Petri conmedio de cultivo nutritivo, (previamente colocada a prueba de esterilidad).

Al inocular la caja Petri semi abierta y mantenga la tapa inclinada por encimadel agar para proteger la superficie contra contaminación durante cada pasode la operación de sembrado como se observa en la figura.



3


El estudiante debe tener cuidado de no rasgar la superficie del agar, duranteel sembrado, se trata que las bacterias adheridas a la asa se distribuyan sobrela superficie del agar .

La distribución se hace con un asa o con hisopo trazando lineas paralelassobre la superficie y luego se continua estriando sin que se crucen las líneas

Etiquete la cajas con su nombre y el número de experimento, incúbelas a latemperatura ambiente en posición invertida, para evitar que el agua que secondensa en el interior de la cubierta gotee sobre la superficie de crecimiento.La condensación puede dispersar y mezclar los organismos haciendo imposibleel aislamiento de las colonias puras.

POR VARILLA ACODADA.

En una caja de Petri se coloca 0.1ml de una suspención bacteriana ,en elcentro de la caja de Petri.

La varilla, tiene un doblez con un angulo de 90°, esta se sumerge en alcohol, seacerca a la flama del mechero para que se inflame, siempre cerca de la zonaestéril, se deja enfriar.

Se coloca sobre la muestra se efectúa un corrimiento de la muestra con lavarilla, en un angulo de 360°C.

Se incuba a temperatura de 37°C por 24 hr.

Observar el aislamiento de las colonias, describir la morfología colonial. Decidir ensu base a sus observaciónes cual método es mejor

Observe el crecimiento, describa la morfología colonial según se pide paracada cepa :

CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS : cepa 1 cepa 2 cepa 3

Color de la colonia:

Bordes de la colonia

Aspecto de la colonia :

Forma :

Tamaño

Apariencia :

INOCULACION DE HONGOS EN MEDIO DE PDA



4


TOMAR ESPORAS Y COLOCARLAS EN EL CENTRO DE LA CAJA

AISLAMIENTO POR ESTRIA CRUZADA de DOS CEPAS BACTERIANAS:

Se trata de separar las bacterias que estén presentes en el inóculo original.,diluyendo la cantidad de bacterias en cada estría. Utilizando cajas con mediode cultivo previamente esterilizado, y a prueba de esterilidad.

Se deposita el inóculo sobre un lugar especifico.

A partir de esté se quema el asa, se deja enfriar, y posteriormente se hacenestrias paralelas, tratando de no regresar sobre ninguna de ellas.

Se hacen varios aislamientos alrededor de la caja , como muestra la figura .

Describa la morfología colonial , tratando de identificar las colonias aisladas.

ASLAMIENTO POR DILUCIONES

En cinco tubos de ensayo se colocan 9.9 ml de agua destilada estéril , seesterilizan teniendo cuidado de dar un leve giro en sentido contrario al tapón derosca.

Apartir de una suspención de varios(2) microorganismos haga diluciónes ,

utilizando pipeta estéril y a partir de las dos últimas diluciónes inocule por vaciado , agite con movimientos circulares para dispersar las bacterias .

Incube a temperatura 37 °C por 24 horas

Cuente el número de bacterias que se desarrollaron en un contador de colonias.

Cual es su criterio sobre el uso de está técnica y los cuidados que debe tener



5


AISLAMIENTO POR FILTRACION .

Para separar cianobacterias y hongos de bacterias se puede utilizar la filtraciónen papel Watttman ya que estos organismos son muy grandes comparados conlas bacterias , por lo que si se pone a peso constate el papel filtro antes y despuésde la filtrada , se puede determinar el peso de los microorganismos y así comoaumenta con el tiempo .

TINCIÓN DE BACTERIAS .

La tinción de Gram.

Limpie 4 portaobjetos y prepare 4 frotes idénticos en cada porta, de lasiguiente manera: cerca de uno de los extremos del portaobjetos prepare unpequeño frotes de la cepa en estudio más o menos del tamaño de unamoneda pequeña.

Caliente el portaobjetos sin excederse solo para fijar las bacterias al cristal.

Cubra el portaobjetos con cristal violeta de Gram teniendo cuidado de que el

liquido bañe al frote déjelo reaccionar por un minuto .

Descarte el exceso de colorante y lave en la llave brevemente.

Aplique el yodo de Gram y déjelo reaccionar por un minuto.

Lave en la llave.

Agregue con cuidado la solución decolorante , gota a gota , tan pronto comolas gotas de la solución ya no arrastren el color , lave a la llave para detener laacción del decolorante .

Cubra el porta con la solución de Safranina ., y déjela reaccionar por 10 a 20segundos

Lave el exceso de colorante y seque al aire .

Describa la morfología microscópica de las cepas que inóculo y compare conlas aisladas .

OBSERVACIONES



6


INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA .

MATERIA DE MICROBIOLOGIA

PROPUESTA PRACTICA .No 2

EFECTO DE LOS FACTORES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE EL DESARROLLOMICROBIANO

Objetivo : Demostrar el efectos de algunos factores físicos y agentesquímicos sobre el desarrollo bacteriano.

GENERALIDADES :En la vida diaria controlar el desarrollo microbiano es de gran importanciapara el profesional que trabaja con alimentos, o bien con materiales estérileses importante conocer el fundamento de las diferentes técnicas yaplicarlas correctamente , algunos de los factores físicos que se utilizan paraesterilizar es utilizar una temperatura elevada , en un medio húmedo y conpresión dentro del recipiente como es el caso de la autoclave la cual inhibeel desarrollo microbiano .Si se modifican los valores de pH los microorganismos alteran su actividad

metabólica e incluso la inhiben , las diferentes temperaturas influyen en elcrecimiento de los organismos el efecto se observa desde las temperaturasbajas donde se disminuye la velocidad de reacción hasta la inactivacion delas enzimas o desnaturalización debido a un aumento en la temperaturacomo la usada en los hornos para esterilizar .

El efecto de la luz ultravioleta sobre un cultivo bacteriano se demuestracuando la morfología colonial varía , al modificar la tensión superficial contensodepresores cambia el desarrollo microbiano .

Así mismo se propone probar el efecto de algunos compuestos químicos

antimicrobianos dejando abierta la propuesta de los estudiantes para probar el efecto de algún extracto vegetal con propiedades bacteriostaticas obactericidas . En relación a los compuestos propuestos son : metales pesados, halógenos, desinfectantes comunes como fenol, benzal, alcohol,determinando si el efecto es bactericida o no., y la “eficacia” de los

compuestos probados observando su efecto en el crecimiento microbiano.



7


Así mismo se propone probar el efecto de algunos compuestos químicos antimicrobiano dejando abierta la propuesta de los estudiantes para probar el efecto de algún extracto vegetal con propiedades bacteriostaticas obactericida . En relación a los compuestos propuestos son : metales pesados ,halógenos, desinfectantes comunes como fenol, benzal, alcohol,determinando si el efecto es bactericida o no., y la “eficacia” de los

compuestos probados observando su efecto en el crecimiento microbiano.

Materiales y Reactivos :

Material y Equipo:Tubos de 16 X 150 con tapón de rosca de baquelita .Cajas de Petri estériles.Cajas de Petri no estériles.Hisopos estériles.Pinzas de disección.Asa y porta asa.Discos de papel filtro de 1 cm de diámetro estériles.

Horno .Potenciómetro.Matraces Erlenmeyer.Mechero Bunsen.Autoclave.Algodón.Papel de estraza.Gradilla para tubosVarilla de vidrio con angulo en 90°Lampara de luz ultravioleta.5 Pipetas de 10 ml estériles y no estériles.

5 Pipetas de 1 o 2 ml estérilesREACTIVOS:

Caldo nutritivo . Cobre en forma de sal.( solución al 2% )HCL al 1 % Mercurio en forma de solución ( merthiolateNaOH 10% Plata en forma de nitrato o coloidalAgua destilada Yodo disuelto en alcohol al 2 %Desinfectante para mesa( Benzal ) Alcholes : etanol 70%, metanol 70%,

propanol al 70%Tween 80 preparado a una concentraciónde 1%..

Cloro en presentación comercial (cloralex )

Agar nutritivo Fenol al 2 %Jabón de tocador. ( en solución ) Plomo en forma de sal ( solución al 2 %)Detergente comercial ( en solución )Zinc en forma de sulfato ( en solución )

Cepas bacterianasBacillus subtillis en caldo ( 15 ml de medio )Staphylococcus aureus(10 ml de medio )Escherichia coli.(10 ml de medio )

PROCEDIMIENTO :El catedrático :



8


Expondrá las bases teóricas para el desarrollo experimental ,organizara el trabajo con los alumnos para su desarrollo .

El alumno : Entregará un diagrama de flujo donde describa las cada uno

de los pasos que realizara en el laboratorio para lograr elobjetivo .

I.- ACTIVIDADES PROPUESTAS :

Efecto del pH.

a) Preparar tubos con medio de cultivo enriquecido, a diferentes pH paracada cepa , se propone utilizar pH 4.0 ; de 5.0 ; 7.0 ; 8.0, esterilizar enautoclave y dejar a prueba de esterilidad por 24 Hr a temperaturaambiente.

b) Inocular , con pipeta estéril de 1ml cada uno de los microorganismospropuestos en tubos de caldo nutritivo , previamente esterilizados ycolocados en incubación durante 24 hr a temperatura de 37 °C

c) Leer los resultados del crecimiento .

d) Llenar el siguiente cuadro , indicando desarrollo con cruces.

Microorganismo pH : 4.0 pH : 5.0 pH : 7.0 pH: 8.0B. subtillisS aureus.

E. coli.

Que explicación daría cuando un microorganismos de vuelve resistente a un pHdiferente al óptimo??Que utilidad tiene esté concepto de pH en el control de un desarrollo microbiano

2.-Efecto de la tensión superficial .

Microorganismo a utilizar Bacillus subtillis

a) Cada uno de los tubos que previamente se etiquetaron, para diferenciar

correctamente las concentraciones del Tween., se esterilizan en autoclave.

10 ml de caldo nutritivo + 1ml de tween 8010 ml de caldo nutritivo + 0.5 ml de tween.10 ml de caldo nutritivo sin adición.

b) Se inocula con una pipeta estéril un mililitro de una suspenciónbacteriana al tubo inclinado donde crece la cepa de Bacillus, se le añaden 10ml de agua destilada estéril con una pipeta previamente esterilizada, encondiciónes de esterilidad .



9


c) Incubar todos los tubos inoculados, a 37 °C.

d) Observar el desarrollo de todos los tubos procure no agitarlos , anote si elcrecimiento del microorganismo fue en la superficie , en todo el medio o enel fondo del tubo.

e) Explique porque la variación en el desarrollo bacteriano con respectoal tenso depresor ?

Efecto de la temperatura sobre el desarrollo microbiano .

Nota : Cada estudiante puede trabajar con una cepa bacteriana, pero lasconclusiones serán de las tres cepas.

T1.- Inocular con 1 ml de cada uno de los microorganismos con que setrabajará en cada tubo con caldo nutritivo estéril.T2.- Cada tubo será incubado durante 24 horas a diferentes temperaturas :a - 5 °C., a 37 °C ; 45 °C ; 55°C; y 65 °C.T3.-Medir el desarrollo cualitativamente observando turbidez presente yasignando cruces correspondientes.T4.-Con los resultados de todas las cepas probadas ,llenar el siguiente cuadro

Microorganismo -5°C 37 °C 45°C 55°C 65°CE, coliS. aureusB. subtillis

5.- Como explica los resultados obtenidos , con las diferentes temperaturas?

Se sugiere que para probar el efecto del calor húmedo para controlar eldesarrollo microbianos, no se utilice ninguna cepa , se trabajara con lapoblación existente en el medio ambiente.

1.- Preparar en dos matraces Erlenmeyer , 40 ml de agar nutritivo, cada uno.Seguir todas las instrucciones de preparación que tienen los frascos.2.- Un matraz con medio se esteriliza en autoclave. Despues de esterilizar el

medio y esperar que se enfríe de 55°c a 60 °C., se vacía en dos cajas de Petridesechables, estériles. Toda la maniobra cerca del mechero.3.- El otro matraz se vacía sin esterilizar , cuando aún esté caliente el medio, encajas de Petri estériles, desechables. Toda la maniobra cerca del mechero.4.- En ambos casos, se espera que se solidifique el medio y se incuban a 37 °Cpor 24 hr, revisar durante tres días .5.- Determinar donde existió contaminación.



10


EFECTO DE LOS FACTORES QUIMICOS SOBRE EL DESARROLLO MICROBIANO,

INSTRUCCIÓNES: Se propone que el estudiante trabaje de forma individual conuna cepa, por equipo se proporcionaran tres cepas diferentes , con las cualesse trabajaran por diferentes personas del equipo.Y además se propone que cada equipo utilice con una serie de

reactivos otra técnica para probar inhibición del crecimiento, lamisma será investigada por cada equipo

La conclusión del desarrollo experimental se realizara en conjunto .

1. Previamente antes de iniciar la inoculación se deben tener preparadas y aprueba de esterilidad suficientes cajas con agar nutritivo.

2.-Usando hisópos estériles, sembrar masivamente en cajas de agar nutritivocon cada uno de los diferentes microorganismos con los cuales se trabajara.

3.-En cada caja se probarán diferentes compuestos químicos, cada uno de loscompuestos químicos se colocaran si estan en solución , embebiendo los discosde papel filtro, impregnados con las substancias que se mencionaron alprincipio cuidando de que el papel absorba no permita que se escurra . Si sonsólidos se depositan sobre la superficie.

4.- Usando pinzas flameadas al mechero, colocar adecuadamente discos depapel filtro impregnados con las substancias que se menciono conanterioridad, procurando usar diferentes compuestos por alumno.

4.1.- Una caja para los jabones disueltos en agua estéril , detergentes en aguaestéril , y tensodepresores como Tween 80 disuelto en agua estéril al 10 %.Cuidar que los jabones no se escuran

4.2.- Una caja para los metales estos se colocan depositando los cristales encuatro puntos equidistantes : Zinc en polvo ., Sulfato de Cobre en cristales .,Acetato de Plomo en polvo., cualquier otro metal en polvo que ud elija .

Otra caja donde coloque en un disco de papel nitrato de Plata u otro quetenga plata.,

4.3.- Una caja para los alcoholes y el merthiolate que contiene mercurio :Metanol., Etanol., Propanol.

4.4.- Una caja para los halógenos : Cloro ( Cloralex)., Yodo en solución enalcohol al 2%., Fluor o solución bucal con fluor.

4.5.- Una caja con desinfectantes como Fenol 2%, 4% y al 8% ., Benzal al 2 %y benzal sin diluir .



11


5.0 .- Incube por 24 hr a 37 °C.

6.0.- Mida el diámetro del halo de inhibición de cada compuesto.

7.0.- Llene el cuadro siguiente con los resultados del experimento anotando lel diámetro de inhibición .

COMPUESTOQUIMICO

Escherichia coli Bacillus subtilis Staphylococcusaureus.

Jabón en soluciónDetergente en sol.Tween 80 en sol.Metales pesadosPlata

MercurioCobrePlomoZincAlcoholes:MetanolEtanolPropanolBactericidas :FenolBenzalCloro

YodoFluor

Antibiograma:

En diferentes cajas inocule una bacteria gram positiva y en otra una bacteria gram



12


negativa , solicite un antibiograma , colóquelo encima en condiciónes deesterilidad

Incube por 24 hr y lea su resultado midiendo el diámetro de los halos de inhibición

Diga cual es el mejor antimicrobiano y menos tóxico para usarlo en alimentos .

cual es el más barato y eficaz para mesas de trabajocuales son los factores que afectan la acción antimicrobiana .

OBSERVACIONES



13



DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUÍMICA


PROPUESTA PRACTICA N°3

CURVA DE CRECIMIENTO DE ESCHERICHIA COLI .

OBJETIVO :Se determinarán experimentalmente el tiempo que tardan dos

microorganismos diferentes en desarrollar las diferentes etapas de crecimiento, condiciónes óptimas y variando las situación para cuantificar como afectaen su curva de crecimiento.

INTRODUCCION :Las células vivas presentan diferentes etapas en su desarrollo cada una deestas indica las características de desarrollo de la población que se estámidiendo . Para medir las diferentes etapas de desarrollo se utilizan diferentestécnicas , para la las bacterias microscópicas se recomienda la técnica deaislamiento por diluciónes e inoculación por vaciado., comparándola con latécnica de lectura de la turbidez .Para las bacterias fotosintéticas se recomienda la técnica determinación declorofila y peso seco para cuantificar su desarrollo .

MATERIAL Y EQUIPO :

7 Matraces Erlenmeyer de 150 ml2 Matraces Nefelométricos2 Matraces Erlenmeyer de 250 ml2 Matraz de 500 ml Erlenmeyer 1 Matraz Kittazato10 vasos de precipitado de 250 ml.10 Tubos de ensayo de 16 x 15020 Pipetas de 1 ml .7 discos de papel filtro a peso constante

12 cajas de pertri estériles.AlgodónMechero Fisher.Papel de estraza para envolver.Papel aluminio .

EQUIPO :EspectrofotómetroBomba de vacioContador de colonias



14


Embudo Buchner Una agitadora de matracesUna lampara de luz naturalAutoclaveHornoagua destilada.

agar nutritivo

CEPAScaldo nutritivo con la cepa de Escherichia coli con un crecimiento de 10 a 12hr a 37 °CMatraz con cepa de Phormidum .

Desarrollo experimental propuesto :DETERMINACION DE LA CURVA DE CRECIMIENTO POR METODOSESPECTROFOTOMÉTRICOS

De forma simultánea también leerá la variación de la absorvancia durante eldesarrollo de la curva de crecimiento, de tal forma que compare ambosresultados .

a) En un matraz nefelométrico prepare 50 ml de medio de cultivo , esterilizar ydejar 24 horas a prueba de esterilidad .

b) inocular al mismo tiempo los dos matraces el erlenmeyer con 100ml de medioy el nefelométrico con 50 ml de medio .

c) Iincubar a 37 °C en agitadora

CIANOBACTERIAS :Para diferenciar la técnica usada en la determinación de el crecimiento de

bacterias y de cianobacterias, prepare medio de cultivo para cianobacteriasy distribúyalo en 7 matraces.Incubar la CIANOBACETRIA a temperatura ambiente, y con una lampara deluz blanca .

La determinación se realizara por cuantificación de clorofila y peso seco , enpapel filtro wattman ., y por clorofila la lectura se realizara cada 24 horas en elcaso de cianobacterias .

TECNICA DE AISLAMIENTO :1.- Una ves que se tiene el cultivo de Escheria coli, en caldo nutritivo en lascondiciónes especificadas .

2.- Rotular los tubos con claves que indique la serie de diluciónes que serealizaran en los recipientes que contienen 9.9 ml o bien se puede hacer enfrasco de gerber añadiendo 99 ml de agua y esterilizar en agua destilada .

3.- Se recomienda tomar cada hora las muestras durante las siguientes 6horas y despues cada 2 horas hasta concluir el tiempo de prueba .



15


4.- Al cumplirse cada uno de los intervalos ,Usted tomará con la pipeta exactamente 0.1ml de cultivo bacteriano y lotransferirá al tubo con 9.9 ml de agua destilada estéril .Tape bien el tubo y agítelo bien para desbaratar los racimos de bacteriasEsta primera dilución es 1:100 del cultivo original .

5.- Transfiera con la pipeta exactamente 0.1ml de está dilución al siguientetubo con 9.9 ml de agua estéril, repitiendo el lavado de la pipeta como en elcaso anterior .Agítelo bien. En esta nueva suspención es una dilución 1: 10 000 del cultivooriginal

6.-Repita dos veces más el mismo procedimiento transfiriendo exactamente0.1ml de esta nueva dilución como anteriormente se explico .

7.- Para inocular de las diluciónes que anteriormente se realizaron, seseleccionan de las últimas dos diluciónes 1 ml , utilizando la técnica devaciado, cuidar que la temperatura del medio no sea muy alta ,inmediatamente agitar para distribuir las bacterias por todo el medio ,

8.- Espere que solidifique el agar, inviértalas e incube a 37 °C por 24 - 28 hr.

Para preparar el medio para cianobacterias se da siguiente lista de materiales.

SOLUCION DE MACROELEMENTOS SOLUCION DE MICROELEMENTOS NaHCO3 25 g/l H3BO3 2.85 g/lCa CL 2. 2 H2O 25 g/l MnCL2.4H2O 1.81 g/lMg SO4 7 H 2 0 25 g/l ZnSO4.7 H2O 0.222 g/lNa2CO3 5 g/l CuSO4.5 H2O 0.080 g/l

Na2EDTA. 2H2O 1.1 g/l MoO3Na 0.015 g/lKNO3. 7H2O 200 g /lK32HPO4 25 g/lFeSO4.7H2O 1 g/l

1.- De esta solución se toma 1 ml y se añade a 1 l de agua tanto demacroelementos como de microelementos .se esteriliza en autoclave.2.- Se inocula con una suspención de 10 ml de cianobacterias , en condiciónesde esterilidad con una pipeta estéril .3.- Se incuba cerca de una lampara de luz blanca , se mueve de ves encuando, o bien se coloca en una agitadora para que suavemente se agite .

4.- Para determinar su crecimiento se puede determinar la concentración declorofila por día , y hacer una curva de peso seco contra tiempo


DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUÍMICA



16



PROPUESTA PRACTICA N°4

INOCULACION EN MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS ,

DIFERENCIALES Y ENRIQUECIDOSMEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDO , SELECTIVO Y DIFERENCIAL..

.

OBJETIVO: Seleccionar los medios de cultivo en base a su función ycomposición química, determinar la morfología macroscópica de las cepasen los diferentes medios .

INTRODUCCION: Los medios de cultivo se clasifican en base adiferentes características , desde el punto de vista de composición química yen base a su función . Es importantes identificar las funciones bioquímicas quetiene cada uno de los componentes dentro de los medios de cultivo, en estedesarrollo experimental se propone que el alumno seleccione diferentesmedios de cultivo como pueden ser medios enriquecidos, selectivos ydiferenciales , que más frecuentemente se utilizan para identificar lascaracterísticas macroscópicas que caracterizan a cada cepa .

Para estudiar el medio donde se cultiva un tejido vegetal ., se sugiere hacer una revisión bibliográfica del tema y visitar un laboratorio que se especialice en

esto .

MATERIALES Y REACTIVOS:

MATERIALES Y EQUIPOS. REACTIVOS.Autoclave Medio de cultivo sólido

enriquecido, selectivo,diferencial.

Estufa de incubación Medio de cultivo líquido.Horno Agua destiladaMechero. Desinfectante.Cajas de Petri. Soluciónes Bouffer para calibrar

potenciómetro.Tubos con tapón de rosca.Matraces Erlenmeyer CEPAS.Probeta. Escherichia coli (bacilos, G-)Espátula. Bacillus subtillis (bacilus, G +)Balanza. Staphylococcus aureus ( cocos G

+)Gradilla. Pseudomonas aeruginosa (

bacilo G-)



17


Microscópio estereoscópico .Potenciómetro.Asa y portasa.Algodón.

PROCEDIMIENTO:

MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y/ DIFERENCIALES.,Y ENRIQUECIDOS .

Para el desarrollo de está práctica se recomienda primero a partir de una listade medios existentes en el laboratorio seleccionar y clasificar los medios deestos distinguir dos o tres medios que se encuentren clasificados como medioscomplejos y sintéticos.Elegir dos medios de cultivo enriquecidos, dos selectivos, y dos diferencialesA partir de una lista de medios hacer la clasificación y llenar el siguientecuadro:

Clasificación de Medios de Cultivo

NOMBRE DEL MEDIO DE CULTIVO EN ESTUDIO :

CLASIFIQUE EL MEDIO DE CULTIVO EN BASE A SU FUNCIÓN Y/ O A SUCOMPOSICIÓN :

F U E N T E S N U T R I T I V A S .MEDIO DECULTIVO

CARBONO NITRÓGENO AZUFRE FOSFORO SALES

MINERALES.

INHIBIDOR COLORANTE

PROCEDIMIENTO :

Preparar medio de cultivo:1. Para los medios con agar , se siguen las instrucciones que hay en cada unode los medios , para pesar y disolver los componentes del medio.



18


2. Se debe dejar a “ Prueba de Esterilidad “ por 24 hr .3. En el caso de que el medio sea líquido , verificar las condiciónes deesterilización recomendadas en el frasco., en el caso de que el medio no seesterilice con autoclave, sino con filtro Millipore ., se recomienda esterilizar antes los tubos de ensaye en autoclave con tapón de algodón, o bien contapón de baquelita con rosca de baquelita.

4. Los medios después de prepararlos y haber pasado la prueba de esterilidad, se pueden utilizar, o bien guardarlos en refrigeración.5. La inoculación de los medios con las cepas se hará con una asa. Y serecomienda la estría cruzada para aislar las colonias y hacer la descripciónmorfológica de cada una de las cepas microbianas en los diferentes mediosde cultivo.6. Anotar las características morfológicas de las diferentes cepas como son:

forma de la colonia:tamaño de la colonia:bordes:elevación:apariencia:

7. Por regla general siempre se debe hacer frote y tinción de la cepa que seinocula antes y despues que está se desarrollo para verificar que no hubocontaminación.Con respecto al desarrollo morfológico en los diferentes medios se recomiendaconsultar el Manual Bioxon para verificar que la colonia inoculada sedesarrollo conforme se esperaba.Se recomienda consultar el capítulo de medios de cultivo de esté texto ,comoguía.Anote y fotografie el color de los medios antes de inócular compruebe que escomo lo marca la bibliografíaDespués del desarrollo microbiano y diga como es el color del medio einterprete el significado del cambio , del crecimiento o de la inhibición delmicroorganismo .

OBSERVACIONES


DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA .

MATERIA DE MICROBIOLOGIA .

PROPUESTA PRACTICA N° 5



19


PARA PROBAR MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIA( PRUEBAS BIOQUÍMICAS.)

MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES .

Durante el proceso de aislamiento e identificación de bacterias en el trabajode laboratorio se seleccionan medios de cultivo para dirigir la selección debacterias que se consideran patógenas o enterotoxigenicas ., en el caso deque el aislamiento sea dirigido a otros fines como aislar microorganismos conactividad antibiótica, o productores de enzimas, vitaminas u otros., laestrategia de selección cambia .Una ves que las bacterias se aislaron en medios selectivos y/o diferenciales, yse determina que se ha logrado aislar una sola colonia microbiana, con lascaracterísticas morfológicas que son interesantes, como lo es el que sean o nofermentadoras de azucares como lactosa , tamaño, apariencia , color entreotros.Posteriormente se inoculan en medios enriquecidos para que de aquí, setoma un inóculo para hacer las pruebas bioquímicas,

MATERIAL: REACTIVOS:Tubos de ensaye de 13 x100 Agar MIOMatraces erlenmeyer de 125 ml. Agar SIMProbeta de 50 ml Agar de LIAEspátula Agar TSIMechero Agar de Citaro de Simons.Balanza granataria. Gelatina nutritiva.

Autoclave. Caldo R.M. - V.P.Gradilla. Caldo Urea.Asa bacteriológica.

CEPASEscherichia coli.Pseudomonas aeruginosaProteus mirabilis.Aerobacter sp.

Estas pruebas se desarrollan en medios diferenciales , donde elmicroorganismo inoculado debe tener una única célula de origen., aislado delas otras colonias que se hayan desarrollado. Las pruebas que se realizanreciben diferentes denominaciones ., las más comunes son :

MIO : M : MOVILIDAD., I INDOL., O: DESCARBOXILACIÓN DE LA ORNITINA.SIM : S: SULFURO DE HIROGENO I : INDOL M: MOVILIDAD.



20


LIA: L : LISINA DESCARBOXILACIÓN.TSI : FERMENTACIÓN DE TRES AZÚCARES : GLUCOSA., SACAROSA., Y

LACTOSA.CITRATO DE SIMMONS: UTILIZACIÓN DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DEENERGIA Y DE CARBONO..CALDO R.M. - V.P. : DETERMINA LA HABILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS

PARA PRODUCIR, ACIDO( R.M.) O ACETOINAS ( V.P.) A PARTIR DE GUCOSA.CALDO UREA: DETERMINAR LA CAPACIDAD PARA PRODUCIR UREASA .

Desarrollo:

1.- Preparar los medios de cultivo especificados, calculando los mililitros paraun tubo por cepa y un tubo testigo. (Verificar antes de preparar el medio el pHdel agua )2.- Distribuirlos, colocando 3 ml en cada tubo. Taparlos con algodón ycolocarlos en un recipiente para esterilizar.3.- Esterilizar según las indicaciones específicas para cada medio de cultivo .4.- Después de esterilizar, gelificar los medios de:LIA, la inclinación no debe ser pronunciada.TSI (Triple azúcar y hierro) , se debe inclinar lo suficiente para que se forme unpico de flauta largo.El Citrato de Simons inclinación normal.El SIM no se inclina , se deja detenido en la gradilla para que se gelifique enese lugar.5.-Dejar a prueba de Esterilidad por 24 hr a 37°C.6.- Inocular cada cepa en la serie de pruebas bioquímicas preparadas,siguiendo las instrucciones de sembrado para cada una.7.-Incubar el tiempo señalado para cada prueba y a la temperatura

especificada.8.-Después del tiempo de incubación , observar detenidamente cada pruebacomparando con el tubo testigo los cambios que se han producido y en elcaso necesario agregar reactivos que se indican.9.- Con los resultados obtenidos , elaborar un cuadro y consultar la bibliografíapara comprobar la identidad del microorganismo estudiado.

PRUEBAS COMUNES PARA EL ESTUDIO DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE.

PRUEBA MEDIO/INOCULO

REACTIVO INCUBACIONa 37°C

POSITIVO NEGATIVO.

INDOL caldo peptonadoo caldo triptona.

0.5 de reactivoKovacs.

1-2 dias Rojo Amarillo claro

R.M. Caldo glucosa 0.5 ml rojo de 1-2 Rojo Amarillo



21


ROJO DEMETILO (RM)

metilo

V.P.VOGES-PROSKAUER.

Caldo glucosa 0.2ml de KOH0.6ml de alfanaftol 5%.

1-2 Rojo Turbio o café

CITRATO DESIMMONS

Medio deSimmons con

Azul debromotimol,inoculado enestría

ninguno 4 días Crecimiento yvire del medio a

color azul.

Medio de colorverde

( no vira )

PRODUCCIÓNDE H2S

TSI o Kligler(inoculación porpicadura yestria)

ninguno 1-2 hasta 7 días En la picadura selee un

precipitadonegro.

No cambia.

PRODUCCIONDE UREASA

Caldo Stuart rojode fenol

ninguno 2 horas Violeta Rojizo

CRECIMIENTOEN KCN

Caldo cianuro deMoeller.

2 dias crecimiento no crece.

PRODUCCIONDE FENILALANINA DE 5AMINASA

Agar fenilalanina(estria)

0.4 de FeCl 10% 1 dia Producción deac. fenilpirúvico ,verde en la estría

.

Amarillo

L I A.M I O.DESCARBOXILASA DE LAORNITINA,LISINA YARGININA.

Medio de Moellercon púrpura debromocresol ,sello de aceitemineral oparafina./ inoculopicadura.Medio deFalkow conpurpura debromocresol.

ninguno 4 días Moeller : violetaó Rojo

Falkow púrpura.

Amarillofermentación dela glucosa.

SIMSULFURO DEHIDROGENO.INDOL.MOVILIDAD.

SIM (picadura)indol:0.5 ml dereactivo deKovacks

2 dias Sulfhidrico :precipitado negroIndol : rojoMovilidad: turbioo difución delinóculo.

SH: color delmedio nocambia.Indol: amarillo.Movilidad :solocrece en lapicadura.

T S IFERMENTACION DEAZUCARES:GLUCOSASACAROSA YLACTOSA., MOVILIDAD Y

PRODUCCIÓNDE SHGAS DEGLUCOSA

T S I.Medioenriquecido ycon rojo de fenol., tiosulfato.,fierro.

18- 24 Hr Superficielactosa +:amarillo.Fondo amarillo yburbujas de aire:glucosa +., gas+

Fondo ypicadura negro:H2S +

Sin cambio o decolor rojo:lactosa -

Sin cambio:glucosa -sacarosa -

Fondo sincambio.

PRUEBA MEDIO REACTIVO INCUBACIÓN POSITIVO NEGATIVO.



22


INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ.

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA

PROPUESTA PRACTICA DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA N° 6 HONGOS

OBSERVACION E IDENTIFICACIÓN MORFOLOGICA DE HONGOS.

OBJETIVO:Identificar las características macroscópicos y microscópicas más distintivas de

algunas cepas de hongos , observando la organización de sus estructurasreproductoras Para esto se deberá utilizar la técnica de inoculación parahongos filamentosos, y para levaduras

MATERIAL: REACTIVOS:Estufa de incubación. Alcohol para flamear las pinzas y aguja.Caja de Petri. Fenol al 2%Varilla doblada en V Medio de cultivo para hongos : PDA O

AGAR CZAPEC.Pipetas pasteur. Glicerina 20% , estéril.Pipetas graduadas de 10 ml. (estériles) Formaldehido 10%

Porta objetos. Colorantes para la técnica de gramCubreobjetos. Colorantes para la técnica de azul dealgodón acético.

Espátula Desinfectantes.Bisturí. MEDIO DE CULTIVO :Pinzas de disección. P.D.A.Aguja de disección CZAPECKVaso de precipitado de 100 mlMechero Fisher.

Cepas:Rhizopus nigricansMucor rouxxi

Asprgillus niger.Penicillium sp.Neurospora sitophila.Hansenula polymorha.Sacharomyces cerevisiae.

Desarrollo :1.- Preparar con anticipación cajas con medio de PDA. Y Czapeck .



23


2.- A partir de los tubos donde se han desarrollado las cepas de hongos ylevaduras, tomar el inoculo con el asa recta o bien asa con un doblez en unangulo de 90°., tomar una muestra de las hifas o esporas de los hongos ydepositarla en el centro de la caja con medio de cultivo.En el caso de levaduras se inocula haciendo estrias para separar las colonias .3.- Las cajas se incuban a temperatura ambiente durante 4 a 8 días ., se

deben revisar diariamente , para verificar el desarrollo .4.- Cuando se observe que el desarrollo es suficiente se anotan los siguientesdatos: ver tabla N° 1.5.-Describir la morfología microscópica tomando un poco del micelio entreporta y cubreobjetos, tratando de desorganizar lo menos posible las estructurasdel hongo. Puede usarse lugol o lactofenol para la preparación.6.-A las cepas de hongos levaduriformes , hacerles frote y teñir por el métodode Gram, observar a inmersión.7.-A las cepas de hongos filamentosos practicarle el método del microcultivo,para su completa observación.8.-Compara sus observaciones con la bibliografía y anotar sus conclusiones.

Tabla N°1 Descripción de las características macroscópicas ymicroscópicas de los hongosSi las hifas son septadas o no.El color del micelioSi el micelio es claro o ahumadoAspecto de la colonia si es un hongo filamentoso ; algodonosa.,aterciopelada .,arenosa, vellosa.La producción de esporas : sexuales o asexualesClasificación de el tipo de espora que se produce : oospora.,cigospora., ascospora., basidiospora.Clase de esporas asexuales : esporangiosporas , conidios oartrosporasCaracterística de las estructuras donde se forman las esporas:esporangios: tamaño, forma , color y locallización.Conidios : simples ., ramificados , en cadena., formados por gemación., en masas.Forma y disposición de los esterigmas o fiálides. Aspecto de los esporangióforos o conidióforos : simples o ramificados ,tipo de ramificación ., tamaño y forma de la columnela apical delesporangióforo.Presencia de estructuras especiales: estolones., rizoides., célulasbasales., apófisis., clamidospoas., esclerocios ., etc.

METODO DEL MICROCULTIVO:

a.- Esterilizar cajas de petri de cristal , y dentro de está una varilla de cristal enV ., encima de este se coloca un portaobjeto y un cubreobjeto.b.- Preparar una caja con medio de cultivo para hongos (sabourond.,czapeck. o papa dextrosa agar), en la parte externa de la caja cuadricular demanera que se formen cuadros de 1 cm 2 .



24


c.- En forma estéril , con bisturí, cuadricular por dentro del agar y transferir uncúbito del mismo, al portaobjetos.d.- Inocular con una cepa pura el centro de los cuatro costados con el asa enangulo en 90° y despues colocar el cubreobjetos sobre el cubo de agar inoculado.e.- Con una pipeta estéril colocar en la base de la caja 10 ml de glicerol al 20%

estéril, cuidando de no mojar el microcultivo.f.- Incubar a 28°C, observar cada 24 hr hasta detectar un buen desarrollo.g.- Cuando se observe crecimiento del hongo, retirarle con una pipeta pasteur y bulbo de hule, el glicerol al 20% estéril, cuidando de no mojar el microcultivo .h.- Agregar solución de formaldehido al 10% y dejarlo un mínimo de 2 horaspara su inactivación.i.- Sacar el microcultivo. Puede observarse en microscopio estereoscópico ydespués practicarle alguna tinción para hongos.J.- Separar cuidadosamente el portaobjetos del cubreobjeto, quitar el agar con cuidado , para no desorganizar el crecimiento , y teñir cada uno por latécnica de azul de algodón acético.



25


Documents

Guia Prac.micro