Elvis Eduardo Montoya Fierro. Facultad de Odontologa Tijuana 1B
Q.F.B Blanca Saucedo. 12/Feb/13
HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DE LA CELULA Cromatografa en
ColumnaEs una tcnica de purificacin, puesto que permite aislar los
compuestos deseados de una mezcla es quizs el mtodo ms general,
utilizado para la separacin, a la vez que para la purificacin, de
diferentes compuestos orgnicos que se encuentren en estado slido o
lquido. En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria
utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el interior de una
columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el
paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria
se impregna con el eluyente o fase mvil. Seguidamente la mezcla
orgnica que nos interesa separar la depositamos por la parte
superior de la fase estacionaria, y as la fase mvil podr ir
atravesando el sistema. Los compuestos que se encuentran disueltos
en la fase mvil, poco a poco saldrn de la columna cromatogrfica, y
se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por
lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente, sern
las primeras en salir de la columna. En cambio, las sustancias ms
polares, quedan retenidas por ms tiempo en el absorbente, y a
menudo es necesario el uso de diferentes disolventes con la
finalidad de incrementar su polaridad para que sean arrastradas por
estos. Procedimiento La cromatografa en columna utiliza una columna
de vidrio vertical que se llena con un soporte slido adsorbente
(fase estacionaria: los ms utilizados son gel de slice (SiO2) y
almina (Al2O3). La muestra que se quiere separar se deposita en la
parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con
el eluyente (disolvente que constituye la fase mvil) que, por
efecto de la gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna.
Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase
estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna.
Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer
interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern
transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin.
As, de manera similar a otros tipos de cromatografa, las
diferencias en las velocidades de desplazamiento a travs del medio
slido se corresponden con diferencias en los tiempos de elucin por
la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de
la muestra original, que se recogern en fracciones diferentes.
Si el disolvente es muy polar la elucin ser muy rpida y
generalmente habr poca separacin de los componentes de la mezcla.
Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirn los
compuestos de la columna. Por lo tanto, la eleccin del eluyente es
crucial para el xito de la cromatografa en columna. A menudo se
utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elucin. La CCF
se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado
para cada separacin. En 1978 se introdujo una versin modificada
denominada cromatografa en columna rpida. La diferencia con la
cromatografa en columna tradicional es que en la tcnica rpida el
disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando una
presin positiva. Esto hace que las separaciones mejoren en
resolucin y se pueda disminuir el tiempo de elucin, por lo cual
constituye un mtodo de eleccin. Anlisis de los eluatos de la
columna Si los compuestos separados en una cromatografa en columna
son coloreados, el progreso de la separacin se puede monitorizar
visualmente. No obstante, a menudo los compuestos que deben ser
aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen
secuencialmente pequeas fracciones de eluatos en tubos rotulados y
la composicin de cada fraccin se analiza por cromatografa en capa
fina. Una vez identificadas las diferentes fracciones que contienen
el mismo producto, se renen, se elimina el disolvente y se analiza
la identidad de los componentes por mtodos espectroscpicos. La
cromatografa analtica se utiliza para separar mezclas, y tiene como
principal objetivo determinar la identidad y concentracin de los
componentes de una mezcla. La cromatografa preparativa se emplea
para purificar grandes cantidades de una especie molecular.
TincinLa mayora de los tejidos, sobre todo los de los animales,
son incoloros y por ello necesitamos teirlos para observar sus
caractersticas morfolgicas. Las tinciones generales estn basadas en
el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se consigue
colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente
hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas molculas
presentes en los tejidos gracias a afinidades qumicas. Se utilizan
normalmente para teir a las clulas y componentes tisulares que van
a ser observados con el microscopio ptico y por ello se realizan
habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las ms utilizadas
las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u
obtenidas en el criostato. Los colorantes son los elementos
principales de las tinciones generales. Son molculas que poseen
tres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que
normalmente es un anillo aromtico de benceno, al cual se le unen
dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado
cromforo, y otro que posibilita la unin a elementos del tejido
denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en
una molcula se denomina cromgeno. Segn la naturaleza qumica del
cromforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos,
derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados
de iminas quinnicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano,
derviados del xanteno y derivados de las talocianinas. Segn la
naturaleza qumica del radical auxocromo los colorantes se
clasifican en: Bsicos: son sales en las que la base aporta el
color, mientras que la parte cida es incolora. Tienen apetencia por
sustancias cidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la
matriz extracelular como los glucosaminoglucanos. As, ponen de
manifiesto el ncleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los
ribosomas por ser muy abundante, as como ciertas matrices
extracelulares ricas en componentes cidos. Ejemplos de colorantes
bsicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de
metileno o la hematoxilina cidos: son sales con el anin coloreado y
la base incolora. Tienen apetencia por sustancias bsicas, sobre
todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y
tambin el colgeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes
cidos son la fucsina cida, verde rpido, naranja G o la eosina.
Neutros: poseen una porcin cida y otra bsica, ambas con capacidad
para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teir tanto
las partes bsicas como las cidas de los tejidos. Indiferentes:
realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad qumica
sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudn
se disuelve en los lpidos y por tanto teir a las gotas de lpidos,
especialmente en los adipocitos.
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En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de
manera especfica y para ello usamos colorantes que tienen apetencia
por dichas estructuras. Por ejemplo, la tincin denominada azn
contiene azocarmn y anilina-naranja-cido actico que tie los ncleos
de rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teido de
azul. Otra tincin combinada es el tricrmio de Mallory que tie el
colgeno de verde, las clulas musculares de rojo. Cuando un
colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que
tiene en solucin se dice que ha ocurrido un fenmeno de
metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorcin de la
luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por
ejemplo, el azul de toluidina se vulve prpura cuando se une a
ciertos grnulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al
tejido tiene el mismo color que en solucin se denomina
ortocromasia. Tincin general: Es una de las tinciones ms comnmente
usada en histologa es la hematoxilina-eosina sobre cortes de
parafina. Como vemos se usa un colorante bsico y otro cido para
teir de diferente color a las estructuras cidas y bsicas de la
clula. Antes de proceder a la tincin, si partimos de cortes de
parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre
las secciones como es el desaparafinado, puesto que estos cortes
son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se
lleva a cabo. Seccin de un glomrulo de un rin de mamfero obtenida a
partir de una inclusin en parafina y teido con hematoxilina-eosina.
Los ncleos aparecen de color violceo (hemtoxilina) y el citoplasma
de color rosado (eosina). Tincin de semifinos: cuando se procesa
material para microscopa electrnica es necesario, a veces, hacerse
una idea de qu zona del tejido vamos a cortar. Tngase en cuenta que
el rea de una seccin para observar con el microscopio electrnico es
muy pequea. Adems, el proceso de osmificacin que ha de llevarse a
cabo previamente a la inclusin acarrea el oscurecimiento del
tejido, con lo que dificulta an ms la orientacin de la muestra. Por
ello es frecuente hacer secciones de 0.5 a 1 m de grosor con el
ultramicrotomo, para orientarnos en la muestra y seleccionar la
zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los
semifinos suelen tener reas ms ms grandes que las que
posteriormente vamos a usar para la obtencin de las secciones
ultrafinas. El colorante usado para teir secciones semifinas es
normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la
resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido.
Proceso de tincin de una seccin semifina. La porosidad de la
resina, el calor y las propiedades del colorante (azul de
tolouidina) hacen que se pueda ter el tejido sin necesidad de
eliminar previamente la resina. Contraste de ultrafinos: El
contraste no es estrictamente una tincin, puesto que no aporta
color a la muestra, pero s es un proceso para poder observar los
componentes ultraestructurales de la clula, por ese motivo lo
incluimos en este apartado. Aunque las secciones para microscopa
electrnica se pueden observar directamente con el microscopio
electrnico se suelen tratar previamente con metales pesados en un
proceso denominado contraste, obteniendo as una imagen ptima de la
ultraestructura celular. Tngase en cuenta que en la microscopa
electrnica lo importante no es aadir sustancias coloreadas sino
molculas que puedan interferir con el camino de los electrones
emitidos por el microscopio y que atraviesan la muestra. Los
electrones que atraviesan la muestra inciden sobre una pantalla
fosforescente que emitir destellos de luz cuando reciban el impacto
de un electrn y permite observar las caractersticas del tejido. Los
metales pesados unidos al tejido impedirn que pasen los electrones
y por tanto se ver una zona negra en la pantalla fosforescente,
mientras que en aquellas zonas de la clula donde no estn estos
metales provocaran reas luminosas en dicha pantalla. Por ello todas
las imgenes originales de microscopa electrnica son en blanco y
negro, aunque se puedan colorear posteriormente con un
ordenador.
MicroscopiaLa microscopia es la tcnica de producir imgenes
visibles de estructuras o detalles demasiado pequeos para ser
percibidos a simple vista. En este campo ha habido gran impulso por
parte de la fsica. Microscopio ptico: es el ms utilizado y que se
sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto.
El microscopio ptico ms simple es la lente convexa doble con una
distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta
15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que
disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos
mayores. Algunos microscopios pticos pueden aumentar un objeto por
encima de las 2.000 veces. El microscopio compuesto consiste en dos
sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos
opuestos de un tubo cerrado. El objetivo est compuesto de varias
lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado.
Las lentes de los microscopios estn dispuestas de forma que el
objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira
a travs del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen
real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes
focales de los dos sistemas de lentes.
El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazn
con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo
que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los
especimenes o muestras que se examinan con un microscopio son
transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se
suelen colocar sobre un rectngulo fino de vidrio. El soporte tiene
un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un
espejo que refleja la luz para que atraviese el espcimen. El
microscopio puede contar con una fuente de luz elctrica que dirige
la luz a travs de la muestra. Microscpico electrnico: es una
aplicacin valiosa de las propiedades ondulatorias de los electrones
porque genera imgenes de los objetos que no pueden verse a simple
vista o con el microscopio de luz. Segn las leyes de la ptica, es
imposible formar una imagen de un objeto de dimensiones inferiores
a la mitad de la longitud de onda de la luz empleada para
observarlo. Dado que el intervalo de longitudes de onda de la luz
visible comienza alrededor de 400 nm o 410^-5 cm, no es posible ver
algo que mida menos de 210^-5 cm. En principio, con los rayos X
podemos ver objetos en la escala atmica y molecular porque sus
longitudes de onda estn entre 0,01 y 10 nm. Sin embargo, no es
posible enfocar los rayos X, y las imgenes que se obtienen son
difusas.Por otro lado, al ser partculas cargadas, los electrones se
enfocan aplicando un campo elctrico o un campo magntico, de la
misma forma como se enfoca una imagen en la pantalla de televisin.
Segn la mecnica cuntica la longitud de onda de un electrn esta en
proporcin inversa con su velocidad. Si los electrones se aceleran a
grandes velocidades, se obtienen longitudes de onda tan cortas como
0,004 nm. Otro tipo de microscopio electrnico, denominado
microscopio tnel de barrido (STM, por sus siglas en ingls), utiliza
otra propiedad de la mecnica cuntica para generar imgenes de los
tomos de la superficie de una muestra, del electrn escapaz de
cruzar una barrera de energa por efecto tnel .En el STM la fuente
de electrones es una aguja de un material metlico (muchas veces de
tungsteno) con una punta muy fina. Entre la aguja y la superficie
de la muestra se mantiene un voltaje que permite a los electrones
atravesar la barrera de potencial.
Electroforesis en gel de agarosaEl trmino electroforesis se usa
para describir la migracin de una partcula cargada bajo la
influencia de un campo elctrico. Muchas molculas importantes
biolgicamente (aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos, cidos
nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solucin como
especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas
especies cargadas se van a separar en funcin de su carga cuando se
aplica un voltaje a travs de los electrodos. Existen muchos tipos
de electroforesis, que se engloban en dos categoras fundamentales:
-Electroforesis de frente mvil. -Electroforesis de zona.
Actualmente, slo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual
la muestra se desplaza sobre un soporte slido, como papel de
filtro, celulosa o gel (agarosa, acrilamida) y los componentes de
la muestra migran en forma de pequeas bandas, tambin llamadas
zonas. La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para
separar molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los
materiales ms comunes para separar molculas de cidos nucleicos son
polmeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se
colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampn de
pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA
sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a
pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan
como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en
funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao,
van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La
distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente
proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la
utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn
calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En
el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio,
sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es
fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la
electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se
vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y
los marcadores de peso molecular. El DNA problema que se va a
analizar mediante electroforesis en gel de agarosa en esta prctica
es DNA plasmdico. Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico,
circular y de pequeo tamao (entre dos y varios cientos de
kilobases) que se encuentran en muchas especies bacterianas. Se
caracterizan porque se replican de manera independiente del DNA
cromosmico bacteriano, tienen su propio origen de replicacin, y no
son necesarios para la viabilidad general de la clula, pero pueden
contener genes que contribuyan a la
supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren
resistencia a antibiticos. Una determinada clula bacteriana puede
no tener ningn plsmido o puede albergar un nmero variable de los
mismos. Algunas clases de plsmidos poseen la propiedad conocida
como replicacin relajada, esto es, estn presentes en forma de
muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento
y purificacin. Se han desarrollado un gran nmero de mtodos para la
purificacin de DNA plasmdico de bacterias y todos ellos implican
invariablemente tres pasos: a) Crecimiento de la estirpe bacteriana
portadora en medio de cultivo b) Recogida y lisis de las bacterias
c) Purificacin del DNA plasmdico El mtodo utilizado para la
obtencin de plsmido en esta prctica se denomina lisis alcalina y se
basa en la desnaturalizacin selectiva del DNA cromosmico mediante
alcalinizacin con NaOH y adicin de SDS 2(detergente), en
condiciones en las que el DNA plasmdico permanece prximo a su
estructura nativa, debido principalmente a su pequeo tamao y su
naturaleza circular y superenrollada. Al neutralizar el medio y
aadir una alta concentracin de sal (acetato potsico), se produce la
precipitacin de gran parte de las protenas debido al tratamiento
con SDS y a la alta concentracin de sales. Tambin precipita el DNA
cromosmico, probablemente porque se producen reasociaciones al azar
entre las diferentes regiones de este DNA y as se forman agregados
insolubles. Por el contrario, no precipita el DNA plasmdico, que
queda en el sobrenadante. Este DNA puede ser analizado y
visualizado mediante electroforesis en gel de agarosa. En cada una
de las calles del gel donde se cargue el DNA plasmdico, veremos
tres bandas de distinto tamao que correspondern a las tres formas
principales con las que migra el mismo en funcin de su grado de
enrollamiento. Son las formas circular, enrollada y superenrollada
que migran con menor a mayor velocidad, respectivamente, en una
electroforesis.
Bibliografahttp://www.biologia.edu.ar/microscopia/microscopia1.htm
http://blogs.creamoselfuturo.com/nano-tecnologia/2007/02/22/el-microscopio-electronico/
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AGAROSA.pdf
