GUIA DE LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA Programa de Biologia

Martha Lily Ocampo Maryeimy Varon Lopez

PRACTICA 8. IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

Introducción

Los hongos son de mayor complejidad que las bacterias y de mayor tamaño. Estos eucariotas no poseen pigmentos fotosintéticos, por esta razón, no pueden aprovechar las sales minerales del terreno para fabricar su propia materia orgánica mediante la fotosíntesis como hacen las plantas (autótrofas) y por ello se dice que son organismos heterótrofos. Así, estos dependen de nutrientes orgánicos disueltos por sistemas enzimáticos específicos, que son absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática. Los hongos se desarrollan y toleran concentraciones de acidez elevadas, requieren de humedad para su desarrollo la cual la obtienen de la atmosfera y del medio. Son colonizadores de diferentes sustratos por lo que juegan un papel importante en la descomposición de la materia orgánica convirtiéndola en sustancias simples y asimilables por los seres vivos. Este grupo de organismo se dividen en dos, los unicelulares como las levaduras y los pluricelulares como lo hongos filamentosos. Las levaduras se reproducen de forma asexual por gemación, son de forma esférica, alargada u oval y pueden exhibir diferentes colores como blanco, rosado y rojo; con frecuencia se encuentran formando una cubierta pulverulenta fina sobre frutos y hojas. Los hongos filamentosos poseen una estructura característica llamada hifa, la cual tiene diferentes partes en su interior (Figura 1) estas, forman el talo y el conjunto de hifas ramificadas forma el micelio. El principal mecanismo de reproducción asexual de los hongos es por la fragmentación de hifas vegetativas o por la producción de esporas en conidióforos y esporangióforos, formados en hifas aéreas, llamadas reproductivas.

Figura 1. Imagen ampliada de la parte interna de la levadura e hifa (septada y aseptada) Los hongos tienen diferentes tipos de hábitats, como son: A. Saprófitos o saprobios, es decir, que se nutren a partir de la descomposición de la materia

orgánica muerta o inerte. Dependiendo de la especie de hongo podremos encontrar especies terrestres pratícolas (en prados o pastos), o forestales (suelo de bosques), lignícolas (sobre madera), fimícolas (sobre excrementos o estiércol), o sobre sustratos de lo más diverso (hojas, piñas, frutos, etc.). Ejemplos de esta asociación son: ________________________________________________________________________________

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B. Parásitos, que serán los 4 hongos que viven a expensas de otros seres vivos, animales, vegetales u otros hongos. Ejemplo: Armillaria mellea, parásita de diversas especies de árboles. Dependiendo de las situaciones algunos hongos saprófitos pueden actuar como parásitos o viceversa. Ejemplos de esta asociación son:

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C. Simbiontes, que se asocian a otros seres vivos sacando provecho de esta asociación ambas partes. La simbiosis más frecuente la desarrollan el micelio de los hongos con las raíces de las plantas, denominándose a esta simbiosis Micorriza. Ejemplos de esta asociación son: ________________________________________________________________________________

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Los hongos se pueden clasificar en 8 filos de acuerdo con la presencia de estructuras de reproducción, tales filos son: Microsporidia, Blastocladiomycota, Zygomyota, Neocallismatigomycota, Chytrhiddomycota, Glomeromycota, Basidiomycota y Ascomycota (Raven, 2011). Los cuales presentan diferentes características indicadas en la tabla 1. Filo Características Ejemplos Grafico Microsporidia

Blastocladiomycota

Zygomyota

Neocallismatigomycota

Chytrhidomycota

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Glomeromycota

Basidiomycota

Ascomycota

No obstante, existen otros criterios no menos importantes como tamaño del cuerpo reproductor, estructuras de producción de esporas asexuales y características de las hifas que permite dividirlos de forma general en micromicetos y macromicetos. MICROMICETOS Algunos ejemplos de micromicetos son:

Levadura Fusarium Alternaria

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Penicillium Mucor Aspergillius MACROMICETOS (macro = grande, visible; miceto = hongo), son aquellos que son capaces de formar estructuras visibles y con forma definida con función esporífera (producción de esporas) denominadas carpóforos, cuerpos fructíferos o, popularmente, setas) que constan de hifas que conforman el micelio. El micelio, generalmente no puede observarse (está inmerso en la tierra, madera, residuos, etc.), crece lenta y continuamente y cuando las condiciones ambientales y nutricionales son adecuadas, dará lugar a un carpóforo o cuerpo fructífero o seta que primero será como una pequeña bola o huevo denominada primordio y que al crecer formará una seta adulta que producirá esporas. La seta, al igual que el micelio, está constituida por hifas, aunque compactadas dando lugar a formas y colores característicos de cada especie que podemos ver, por lo que el estudio de estos hongos se realiza en base al estudio de estos carpóforos (Figura 2). Los macromicetos constan de dos partes aparentemente bien diferenciadas: una difusa, subterránea y vegetativa, que se denomina micelio, y otra visible, de aparición esporádica y con función reproductora que es el carpóforo o seta

Figura 2. Macromiceto, incluyendo partes de diferentes género. Las MICORRIZAS: este término se emplea para describir la asociación existente entre determinados hongos del suelo y las raíces de las platas terrestres. Su significado literal es hongo-raíz y etimológicamente, la palabra se ha formado del término griego “mykos” (hongo) y del vocablo latino “Rhiza” (raíz). Clasificación de las micorrizas Se pueden distinguir tres grupos fundamentales según la estructura de la micorriza formada:

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Ectomicorrizas Endomicorrizas Ectoendomicorrizas

Se caracterizan porque desarrollan una espesa capa de micelio sobre la zona cortical de las raíces absorbentes de la planta las hifas del hongo no penetran en el interior de las células de la raíz, si no que se ubican sobre y entre las separaciones de éstas. Se pueden observar a simple vista.

Los hongos que las producen se caracterizan por colonizar intracelularmente el córtex radical o sea que no hay manto externo que pueda verse a simple vista. Las hifas se introducen inicialmente entre las células de la raíz, pero luego penetran en el interior de éstas, formando vesículas alimenticias y arbúsculos. Por ello este grupo se las conoce también como micorrizas vesículoarbusculares (MVA) los cuales constituyen la simbiosis más extendida sobre el planeta.

Presentan características intermedias entre las Ectomicorrizas y las Endomicorrizas, pues presentan manto externo, como las ectomicorrizas, pero también penetran en el interior de las células, como las endomicorrizas y no existen vesículas ni arbúsculos. Este grupo se presenta tanto en Basidiomycota como Ascomycota y son más abundantes en angiospermas que en gimnospermas. Su distribución es restringida.

Figura 3. Diferencias entre endo y ectomicorriza. Extraído de http://www.asturnatura.com/

Objetivos:

• Adquirir destrezas en el montaje de diferentes metodologías para la manipulación y aislamiento e de los hongos

• Identificar las morfologías macro y microscópicas de los hongos, diferenciando las estructuras que los componen.

• Determinar las diferentes clases de hogos teniendo en cuenta características morfológicas y reproductivas.

Metodología 1. Siembra de hongos invertida y por punción en PDA Para esta metodología se requiere que todo el material este esterilizado. Se procede a separar una parte del micelio del hongo con un asa de siembra o palillo, previamente esterilizada en la flama del mechero.

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Se debe abrir la caja de Petri que contiene medio Papa Dextrosa Agar (PDA) sosteniéndola boca abajo. Luego de esto, se realizan 4 punciones una alejada de la otra. Se incuban las cajas de Petri en forma invertida, envueltas en vinipel o parafilm, a 28-30 ºC durante 3-5 días.

Figura 4. Método, siembra de hongo por punción 2. Montaje de la impronta de hongos (cinta adhesiva) Se debe colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio. Luego se procede a cortar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente; con pinzas de disección doblar la cinta en “U” con el adhesivo hacia afuera. Abrir la caja Petri cerca del mechero y presionar suavemente la cinta adhesiva sobre la periferia de la colonia. Después, se debe colocar suavemente la cinta con la muestra sobre la gota de azul de lactofenol, evitando la formación de burbujas para no alterar las estructuras. La cinta puede funcionar como cubreobjetos o encima puede colocarse de nuevo otro cubreobjetos para mantener la muestra por más tiempo, dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio.

Figura 5. Montaje de hongos en cinta adhesiva

3. Técnica de Microcultivo Esta técnica consiste en colocar dentro de una caja de petri palillos de madera estriles y sobre ellas una lámina portaobjetos. Estos palillos evitan el contacto del portaobjeto con el fondo de la caja. Cortar cuadros aproximadamente 1cm2 y 3 mm de espesor de medio de cultivo que puede ser PDA, OGY o Saboraud con un bisturí estéril y caliente. Se debe colocar el cuadro de medio en el portaobjetos que está sobre un par de palillos en una caja de Petri (previamente esterilizada).

Observaciones

Observaciones

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Tomar con el asa él inoculo del hongo previamente seleccionado. Más tarde se debe inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar y posteriormente, colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio. Luego se debe adicionar agua en la caja Petri humedeciendo el papel filtro que se encuentra en el fondo de ella y que proporcionara una atmosfera húmeda. Finalmente, Incubar la caja a 28° C durante 48 h.

Figura 6. Metodología microcultivo. 5. Extracción de Hongos Formadores de Micorriza Arbuscular HFMA. Se debe colectar de 100 a 300g de suelo el cual debe llevarse en un tamiz de 600 µm encima de otro de 75 µm y este a su vez encima de uno de 45 µm con flujo de agua constante. Luego de este procedimiento, se debe colectar lo que queda en el último tamiz en tubos falcón de 50 ml y se debe adicionar sacarosa al 75% teniendo especial cuidado de no homogenizar la muestra, después se centrifuga a 3500 rpm durante cinco minutos. Se retira la interfase y se lava con agua destilada en un tamiz de 45 µm hasta retirar la sacarosa. El producto final se observa al estereoscopio colocando una gota en una caja de petri (ver figura 6). Si se quieren observar las esporas con mayor detenimiento en el microscopio es necesario realizar la tinción con PVGL+MEZLER.

Figura 6. Metodología para extracción de HFMA.

Observaciones

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Hongos Macromicetos A los hongos escogidos para la caracterización debe realizárseles un registro fotográfico antes de la recolección, con la finalidad de tener las imágenes de los especímenes en fresco y ver su hábitat natural, además de conservar algunas de sus características morfológicas. Posteriormente se extraen del sustrato sobre el cual crecen, utilizando una navaja o cuchillo; los cuerpos fructíferos se envuelven en papel encerado y se colocaron dentro de una canasta, procurando colocar abajo los más pesados y los más ligeros, arriba. Para poder llegar a una clasificación debe ayudarse con libros de micología, páginas de internet y artículos científicos, claves taxonómicas, en estos encontrara que las características macroscópicas más sobresalientes de un macromiceto son: El píleo, que es la parte superior del cuerpo del hongo, en la que se encuentra la porción fértil llamada himenóforo y que presenta variaciones morfológicas; este posee diversas formas los cual nos permite reconocer hongos de diferentes grupos taxonómicos. Margen del píleo: Esta característica consiste en las diferentes formas en las que se puede presentar la orilla del píleo. El pie denominado estípite, que sostiene al píleo. Hay una gran variedad de formas con y sin estípite El anillo, que se presenta como una estructura adherida al estípite en el grupo de los agaricales, es un fragmento del velo que cubre al himenóforo en desarrollo. Cabe mencionar que no en todas las especies de macromicetos se encuentran todas estas partes, pero es importante conocerlas en su totalidad para poder identificar otras características más específicas. Hábito de crecimiento: Se refiere a la forma de crecer de los hongos en el sustrato: solitario, si crece aisladamente; gregario, si crece uno cerca de otro; cespitoso, si crecen en grupos muy juntos, pero nacen de forma independiente, y connato, si crecen unidos desde el estípite. Tipo de unión con el sustrato Los hay estipitados y sésiles. En estos últimos, el píleo se encuentra unido directamente al sustrato. También encontramos otras variantes como resupinado, efuso-reflejado e imbricado. Color de las partes El color es una de las características que más varía ya que responde a la madurez del hongo, a la humedad del ambiente y a la cantidad de luz que haya en el momento de la recolección. Ornamentación Hace referencia a dos partes del cuerpo del hongo: la superficie del píleo y la superficie del estípite, en caso de presentarse. La ornamentación puede ir desde la ausencia total de cualquier estructura, lo que se denomina glabro, hasta la presencia de pequeñas granulaciones, fibras, escamas o estructuras semejantes a pelos. De acuerdo con estas características, identifique mínimo 2 setas del área de colecta.

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Metodología. 1. Sintetizar la Metodología en un diagrama de flujo.

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Resultados Imagen Posible MO y su uso 1.Siembra de hongos invertida y por punción en PDA

2.Montaje de la Impronta de hongos (cinta adhesiva)

3.Técnica de Microcultivo

3. Extracción de Hongos Formadores de Micorriza Arbuscular HFMA.

5. Macromiceto

Macromiceto

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Discusión: Una página aproximadamente. Adicionalmente, responda el cuestionario de la página siguiente.

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Cuestionario

1. Cuál es la importancia ecológica de hongos, líquenes y micorrizas? 2. ¿Qué medidas sugeriría usted para impedir que el pan adquiera moho? 3. Mencione brevemente tres enfermedades micóticas importantes en las plantas y tres en humanos. 4. Describa la manifestación clínica que puede presentarse por exposición a Aspergillus. 5. Defina dimorfismo y de ejemplos. 6. Proponga un área de interés particular donde aplique los mohos, levaduras o setas para

solucionar problemas ambientales.

Conclusiones. Bibliografía