I

.".""

L . *

1 4 6 6 3 8

NOMBRE: Herrera Munguia Ana. Tel.,6 79 98 64. Mat. 85343957

Vizquez Murrieta Rosa Martha. Tel. 7 62 10 91.

Mat. 86345435

LICENCIATURA: Ingeniería de los Alimentos. Unidad Iztapalapa. Divisidn de Ciencias Bioldgicas y de la Salud..

TRIMESTRE LECTIVO: 92-0

HORAS SEMANA: 6

TITULO DEL TRABAJO : FERMENTACION MALOLACTICA EN- -VINOS TINTOS EMPLEANDO UNA CEPA DE PEDIOCQCCUS SPP.

NOMBRE DEL ASESOR: Enbl. Alberto Reyes Dorantes.

LUGAR DONDE SE REALIZO EL TRABAJO: ,Universidad Aut6noma Metropolitana. Unidad Iztapalapa. Edif. "S". Lab. 152 .

FECHA DE INICIO: 10 de Octubre de 1991.

FECHA DE TERMINACION: 8 de Octubre de 1992.

FIRMA DE LAS ALUMNAS:

R.MARTHA VAZQUEZ MURRIETA

FIRMA DEL ASESOR: Endl.ALBERT0 REYES DORANTES

1

. ..".""-

148638

F E R M E N T A C I O N M A L O L A C T I E N V I N O S T I N T O S

E M P L E A N D O U N A C D E P E D I O C O C C U S

2

C A

E P A S P P

I NDI CE

PAg RESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

ANTECEDENTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6

8

OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

OBJETIVO GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

OBJETIVOS ESPECIFICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

METODOLOGIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

ANALISIS Y DISCUSION DE RESULTADOS ....................... 35

CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

SUGERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

APENDICE A : METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

DETERMINACION DE ACIDEZ TOTAL . . . . . . . . . . . . . . . 45

DETERMINACION DE ACIDEZ VOLATIL . . . . . . . . . . . . . 46

DETERMINACION DE ACID0 LACTICO: M&todo de Barker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

M9todo por Cromatografía de gases . . . . . . . . . . . . 49

DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES . . 50

DETERMINACION DE ALCOHOL .................... 51 DETERMINACION DE pH ......................... 52 TINCION DE GRAMM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3

............. .I - 1 1 1 1 1 - 1

R E S U M E N

4

RESUMEN

En este experimento se utili26 vino tinto Cachold , cepa. Ruby-Cabernet , el cual fu& inoculado con Pediococcus spp , para inducir la fermentaci6n malolactica . Se realizaron las siguientes determinaciones : contenido . d e etanol, azúcares reductores totales, acidez volatil, acidez total, trcido lictico, pH y temperatura. La fermentacidn se realiz6 a una temperatura de 22: 2OC y a un pH de 3.8, se observb que ambos parametros no influyeron en la produc.ci6n de icido lictico . No hubo variacibn significativa en la acidez total, lo que indica que el contenido de Acido milico se mantuvo casi constante . El Vino contenfa 11OG.L. de etanol y la cantidad de azkares reductores totales se redujo de 4.12 a 2.62 g/l al fina€ de la fermentacibn. El alto grado alcoh6lico inhibib la fermentacibn malolActica y el consumo en los azúcares confirm6 que hubo produccidn de icido lictico a partir de 4stos y no del Acido malic0 , por lo que se concluye que no hubo fermentaci6n malolactica . La cantidad de icido lactic0 se determin6 por dos metodos : MBtodo de Barker y MQtodo por cromatografia de gases . Los resultados obtenidos mediante el m6todo por cromatografla de gases mostraron una variacibn de hasta 7.6 g/l entre valores continuos , mientras que el metodo de Barker mostrd una variacibn. de 0 . S g/l entre valores contfnuos; 10 cual indica que el m6todo de Barker fu6 m A s

confiable en este experimento .

5

I N T . R O D U C C I O N

6

I NTRODUCCI ON

El acid0 milico es uno de los dcidos orgdnicos mds abundantes en el reino vegetal, es el dcido característico de muchas frutas. Contribuye a definir el estado de madurez, de la uva y aún, en gran medida la calidad del vino ( 7 ) . El sabor a uva verde de los vinos de ciertos aKos de verano frio, asf como el caracter dspero de los vinos jbvenes se deben al icido malico ( 3 ) . En ciertas regiones vitivinicolas frías donde uvas relativamente inmaduras contienen eisvada concentracidn de dcido mhlico, se producen vinos que inicialmente son icidos (7) . La fermentacidn maloldctica es inducida para desacidif icar, tener estabilidad microbiana y / o modificar el sabor y 'aroma; es un fenbmeno microbioldgico que ocurre de manera natural o inducida por medio de bacterias y/o levaduras quienes transforman los icidos orginicos (milico, tartirico, cítrico, etc) en dcido lktico, acetic.0, así como en algunos metabolitos secundarios como COZ, alcohol. diacetilo, etc; logrando una disminucibn notable en la acidez total del vino, conformando un vino de elevada calidad sensorial al integrar el bouquet de fermentacibn ( 3 ) . La realizacibn de la fermentaci'dn maloldctica, permite una pronta aplicacidn.de las operaciones de bodega para el almacenamiento y

af5ejamiento del vino, lo cual es necesario para evitar un posible ataque microbian0 posterior (7) .

7

A N T E C E D E N T E S

a

ANTECEDENTES

Morfologia y fisiologia de los generos de Leuconostoc y

Pediococcus .

Leuconostoc. * Las celulas pueden ser esfericas o lenticuladas ( en agar 1 , usualmente forman pares y cadenas , celulas Gramm positivas. El genero puede ser dividido en dos grupos , dentro del segundo se encuentran los microorganismos que crecen en vino , los cuales comprenden una de las especies de Leuconostoc oenos , quien crece en medios con pH entre 4 . 8 y 4 . 2 o aún mAs bajos ; su crecimiento es lento en,medios que contienen 10 % de etanol , siendo su rango de temperatura de 10 a 35 o C , siendo el bptimo de. 18 a 24 o C . Buchanan's , (1975).

Pediococ'cus. * Cdlulas esfericas nunca elongadas , forman colonias de color blanco grisaceo , aparecen en pares o tetradas como resultado de una divisidn alternada a lo largo de dos' planos perpendiculares , . rara vez se encuentran solos o en cadenas , son Gramm positivos ;

presentan fermentacibn 'homo1Actica ; su temperatura 6ptima de crecimiento va de 25 a 40 o C . Su crecimiento depende de la presencia de carbohidratos fermentables ; la glucosa es fermentada probablemente mediante la ruta de Embden-Meyerhoff a DL o L(+) lactato: Pediococcus es la única bacteria lactica dividida en dos planos ;

se pueden ver cadenas cortas que estin formadas por pares de cdlulas . Las especies pueden ser clasificadas por su tolerancia a la temperatura y pH ; crecen en caldo o agar MRS ; aparecen junto con lactobacilos y leuconostoc y fisolc5gicamente tienen mAs en comdn con estos microorganismos que con estreptococos. Buchanan's ,. (1975).

9

* Una diferencia importante entre los subgrupos de las bacterias acidolhticas se basa en la naturaleza de los productos que se forman en la fermentacidn de los aztícares. Un grupo denominado homofermentativo , produce virtualmente un Único producto de fermentacidn , el Acido lactico, mientras que el heterofermentativo produce entre otros compuestos etanol y COZ. . Br0ck.T.D (1987) .

Influencia de cepas de bacterias iniciadoras en la fermentaci6n malolictica

* La fermentaci6n malolActica, aparece en los vinos como el resultado de la actividad metabdlica de ciertas cepas adaptadas de bacterias Scido 1Acticas.Bovin Jaques (1980) . * Oreglia en 1978, observb que vinos de regiones frias que han sufrido la fermentacidn malolSctica , llegan a tener una cantidad de Scido mdlico que varia de 0.2 a 5 g/l . * Costello en 1985 , realizd una evaluacidn de dos cepas comerciales de L.oenos para la inducci6n de la fermentaci6n malolictica bajo condiciones de vinificacibn. Observ6 que la j degradacidn del icido milico en los vinos inoculados'empezd con la '

adicidn de los cultivos iniciadores y que la conversibn a Acido lactic0 se completb despues de 100 dlas aproximadamente. * Para vencer el retraso de la FML, Beelman,,R.B. (1989) ,sugiere la seleccidn de levaduras compatibles con bacterias licticas, la optimizacidn de preparaciones de cultivos iniciadores y del tiempo de inoculacibn, ademis del uso de levaduras que eliminen inhibidores.

I

* La estimulacibn de la fermentacibn malolactica por inoculaci6n con bacterias seleccionadas ha sido tratada durante mucho tiempo y recientemente diversas'c.epas comerciaies han sido desarrolladas , pero aQn las ventajas de inducir la fermentaci6n malolactica (FML) por inoculacibn a menudo falla, debido a la rApida perdida en viabilidad despues de la inoculaci6n al vino; para evitarlo es importante optimizar la preparacidn y el tiempo de reactivacidn de cultivos iniciadores en vino, para asegurar gran viabilidad y

actividad malolactica en vino. Krieger,S.A.(1991).

Cinetica microbiana Y FML.

* Maret y Sozzi en 1979, proporcionaron evidencias acerca de que Leuconostoc es el responsable de la FML despues de-que Pediococcus cerevisiae y Pediococcus pentosaceus se han desarrollado. * En una evaluacidn realizada por Costello en 1985, se encontr6 que la viabilidad de dos cepas comerciales de L. 'oenos decreci6 rapidamente despues de 75 días de haberse ,realizado la inoculacibn. * Cinco cepas de L.oenos difirieron en cinbtica de crecimiento y velocidades de degradaci6n de dcido mAlico. Susan B. Rodriguez. ( 1990 1 . * Drysdale,G.S. en 1988, afirmb que Acetobacter aceti es una bacteria acdtica, que para su crecimiento requiere de una fuente de carbbn tal como el Acid0 acetico.

Parametros a controlar en la FML.

ETANOL.

* Webb e Ingraham en 1960, atribuyeron la presencia de un alto contenido de alcohol como una de las razones para la falta de & x i t o al inducir la FML en vinos terminados. Por otro lado Garvie en 1967;comprob6 que todas las cepas de L. oenos crecieron en un medio sintetic0 que contenla 10% de etanol.

b

11

* Kunkee en 1991, sefialb que la fermentaci6n malolActica puede ser retardada mas no necesariamente inhibida por una solucibn de 10 a 14 7. (v/v) de alcohol. * Generalmente el etanol es el principal inhibidor del

crecimiento bacteriano en vino. La resistencia al etanol varía de una cepa a otra y es influenciada por otras condiciones en el medio; normalmente se acepta que las concentraciones de 13% de etanol o mayores limitan el crecimiento bacteriano. Lafon-Lafourcade (1983). * En un estudio realizado se observd que el 96% de las cepas crecieron a una concentracibn de 10% de etanol aunque la velocidad de crecimiento fue muy variable. Britz-Tracey (1990).

* El pH del vino es uno de los factores mas importantes que regula el crecimiento bacteriano y la FML. Britz,T.J.(1990) . * En un experimento realizado por Bidan en 1956 , demostr6 que el crecimiento de bacterias malolhcticas'era retardado en un rango de pH entre 3.5 a 4 . 0 , y que había inhibici6n abajo de 3.5 ; arriba de pH de 4.0 es favorecido su crecimiento. * Beelman en 1977, inform6. que algunas cepas de L. oenos crecieron mejor a pH de 5.5, menos a pH de 4 . 5 y escasamente a pH de 3.5. * Davis,C.R. en 1985, afirm6 que los vinos contienen una acidez titulable de entre. 0.55-0.85% . La reducci6n de la acidez en el vino por medio de la FML puede variar desde 0.1-0.3% y el pH puede aumentar de 0 , l a 0.3 de una unidad. Sugiere que para vinos de clima frío,, los cuales tienen una alta acidez , se realice la FML y para vinos de clima caliente ( baja acidez ) no se realice.

12

* Se observd que la viabilidad y crecimiento de L. oenos

estuvieron fuertemente.ligados a l pH del vino. El pH 6ptimo de crecimiento estuvo entre 4.5 y 5.5. A velocidad de degradacidn de glucosa es embargo, la degradaci6n del malato fue de degradac'idn del malato es mas alta a 5.5. Britz-Tracey (1990).

pH menores a 4 . O la fuertemente inhibida, sin m A s rApida. La velocidad pH de 3.5 que a pH de

8 Se.observ6 que a valores de pH 3.6 y 3.8 existe un marcado efecto inhibitorio sobre el crecimiento bacteriano. Britz-Tracey ( 1990 1.

TEMPERATURA.

* Lafon-Lafourcade y Ribkreau-Gayon en 1983, demostraron que las altas temperaturas favorecen la FML mientras que 1,as bajas la desfavorecen . * En un estudio se determin6 que los efectos e interacciones de pH (3.6, 3.8 Y 4.0); SO (25 y 50 mg/l); etanol ( 7 % , lo%, y r3%,

v/v) y temperatura (15 y 25OC) sobre el Crecimiento de 54 cepas de L-oenos , influyen fuertemente en su comportamiento.Britz-Tracey (1990).

2

Contribucibn de la FML en el sabor del vino.

* Los meritos de la fermentaci6n malolactica han sido ampliamente discutidos, incluyen la desacidificaci6n y el desarrollo de aromas y s'abores complejos. Costello P. J. (1985). * Davis, C.R, en 1985, afirm6 que las bacterias acidolacticas son organismos fermentativos , que aparte de producir dcido ldctico como principal metabolito final, tambi4n producen compuestos de sabor, tales como acetaldehido, Ac. ac6tico , etanol, diacetilo , acetoina y 2.3-butanodiol en productos fermentados . A partir de acetaldehido por reducci6n con nucle6tido de piridina reducido , se forma etanol , el cual es un producto de fermentacibn bacteriana bastante coman .Burrows W,(1974) .

e

* En un estudio realizado se encontrd que L. oenos modifice5 significativamente el aroma y cuerpo del vino. Henick (19901.

* Henick and Kling en 1990 ,investigaron la contribuci6n en sabor de 6.cepas de L.oenos en vino bajo condiciones de fabricacibn comercial, la bacteria modificd el aroma y cuerpo del vino.

Agentes inhibidores de las bacterias ldcticas .

x King y Beelman en 1986 ,observaron que existe cierto

antagonismo entre las levaduras y las bacterias lacticas cuando crecen juntas en jugo de uva o en medio sintetice. * En 1989 Splittstoesser determind , que los icidos grasos de cadena media, presentes en muchas bebidas alcoh6licas, son tdxicos tanto para las levaduras como para las bacterias lacticas. * Edwards en 1990 confirma que los s6lidos de uva insolubles y los restos de levaduras influyen en la formaci6n de Acidos grasos de cadena media y de otros compuestos volhtiles, así como en el crecimiento de levaduras y bacterias lacticas..

14

O B J E T I V O S

15

OBJETIVO GENERAL : * Inducir la fermentacidn malolictica ( FML 1

en un vino .tinto Ruby-Cabernet, empleando una cepa de Pediococcus s p p .

OBJETIVOS ESPECIFICOS : * Disminuir la acidez total de un vino tinto Ruby-Cabernet del estado de Zacatecas mediante la fermentacidn malolactica ,empleando una cepa de la familia Streptococaceae : Pediococcus SPP *

* Establecer si el pH, temperatura Y

grado alcohdlico del vino , a los cuales se realizb la FML fueron los adecuados para lograr el efecto deseado de la cepa empleada sobre este vino.

-

16

M E T O D O L O G I A

17

Verificacidn de la viabilidad de la cepa.

Se realizaron siembras en medio sdlido de agar MRS en cajas Petri, en condiciones est&riles' y a temperatura ambiente ( 22OC 2OC 1 ;

para observar características microbiol6gicas.

Induccidn de la cepa.

Se inoculd la cepa Pediococcus spp en matraces Erlenmeyer de 250 m1 con 100 m1 de caldo de microinoculacidn , se incubb a temperatura ambiente ( 22OC 2 2OC ) durante 48 hrs; al termino de este tiempo se tomaron 50 m1 de caldo, se colocaron en un matraz de 250 m1 y se les agreg6 5 0 . m1 de vino esteril, se incub6 nuevamente durante 48 hrs; despu68 se tomaron 50 m1 de esta mezcla , se colocaron en un matraz de 250 ml .y se les adicionaron 50 m1 de vino libre de alcohol, se incubaron durante 48 hrs; a continuaci6n se tomaron S O m1 de la mezcla anterior y se vaciaron a un matraz de 250 m1 agregdndose 5 0 m1 de 1

~

vino ( el cual no recibid ningQn tratamiento previo). El desarrollo de esta. etapa se realizd en condiciones est6riles, a i temperatura ambiente ( 22OC 2OC ) empleando el vino comercial '

Cachola de la variedad Ruby Cabernet. Antes de cada inoculaci6n se realizaron observaciones al microscopio mediante tinci6n Gramm para observar caracteristicas morfol6gicas.

i

Desarrollo de la fermentacibn malolActica.

Primera etapa.

En un matraz Erlenmeyer con capacidad de 2 1 se agregaron 1700 m1 de vino tinto marca Cacholi, variedad Ruby Cabernet, el cual fue inoculado a una concentracidn del 3% con una cepa de Pediococcus s p p , es decir, 5 m1 de in6culo. El matraz fue cubierto con un tap5n de plhstico e incubado a temperatura ambiente ( 22Oc 2Oc).

Segunda etapa.

posteriormente, se realizaron los siguientes analisis iniciales: 1. Determinacidn de pH, segQn la A.O.A.C. ( 24 2. Determinacidn de acidez volitil, segQn la A.O.A.C.( 24 ).

3. Determinacibn de azúcares reductores totales, Por el metodo del DNS. ( 30 1

4 . Determinacidn de icido lActico.( 5

5. Determinacidn de acidez total.( 24 1

Tercera etapa.

El vino inoculado fue repartido en 10 frascos de diluci6n , con una capacidad de 180 m1 de la siguiente manera. En cada frasco se colocaron 170 m1 de vino o hasta dejar el menor espacio de cabeza posible para evitar charas de aire grandes. Los frascos se etiquetaron del No.1 al 10, dejindose a temperatura ambiente, (22' 2 " ~ ) .

Cuarta etapa.

El muestre0 se realizd como se. indica a continuaci6n. Se tomaron dos muestras por separado, una cada tercer dla a un frasco. Este procedimiento se repiti6 para los demas frascos, hasta terminar con el frasco No.10.

19

1 4 6 6 3 8

1

El volumen de cada muestra fue de 30 ml, los *cuales se

dividieron a la mitad, es .decir, 15 m1 para analisis inm'ediatos y

15 m1 para analisis posteriores por cromatografla .

Quinta etapa.

Analisis inmediatos. Al volumen de 1s m1 de vino se le realizc5 los siguientes andlisis. 1. Determinacibn de pH ( 24

2 . Determinacidn de acidez volitil ( 24 1 3. Determinacibn de ficido lfictico ( S )

Sexta etapa.

An6lisis posteriores por cromatografía de gases. El volumen de 15 m1 de vino se colocd en frascos esterilizados con sello hermitico con una capacidad de 50 ml, empleando una jeringa estiril de 20 m1 con filtro Millipore de 3.0 micras de dibmetro. Los frascos con muestra fueron etiquetados y se congelaron para que al terminar con el último frasco (No.10) se realizara el siguiente anilisis por cromatografía de gases.

l. Determinacidn de icido lactic0 ( 38 1

20

" """."

- .

R E S U L T A D O S

21

IIEHPO DE FERIIENTACION

(horas)

48

96

i 44

240

336

432

376

MORFOLOGIA II ICROSCOPICA

I IPO DE HICROORGANISHO AGRUPACION GRAHH

COCOS

Cocos y bacilos

cocos

cocos

cocos

cocos

cocos

Pares Y solos

Agrupados en circulos

Pares y cade- nas

S o l o s

Solos, pares, tetradas y ca denas

Solos, pares cadenas -- Y arpas

. Soios y cade- nas -

22

I I

PIIRmROS I

EIMOL ( O G m L n )

A a R m T m

(g/1)

ACIDEZ T O M ( g / l )

ACIDEZ UOLAI IL (g/l)

ACIDO LACIICO, ( S A )

ACIDO LACIICO, ( g A )

MIDO HALICO, (g/l)

ACIDO HALICO, ( g A )

pH

lím 50

4m12

8m40

0.409

lm ill

0.960

6.880

7.031 '

3m89

DESPUES DE L b FERHENIACION

llm 00

4m12

8.21

Bm3f9

1,884

0,213

6,157

7 m 828

3m88

23

- ERHEHIACION (hn)

0

48

96

144

192 I

248

288

336

384

432

480

528

576

624

672

72b

768

816

864

912 -

~~ ~

0 m 409

e, 359

0,258

0.210

0, 330

0 m 158

0.228

0.348

0,360

0,188

0,306

0,282

0,650

' 8,386

0,408

0 m 359

im ill

8,546

8,556

1.104

í m 814

1, 484

l m 123

1,353

ím268

8,665

0,410

0,938

1, 574

1,521

1, 884

~

N I D O LACIICO' (g / l )

8,960

1, 148

8,148

3,831

8,757

1,762

7,972

8,383

1, 098

8,430

0,413

2,608

0,895

2,052

0,213

- 3.89

I n 81

31 88

3.90

3m85

In87

3m89

3m83

3m86

!m87

3m86

3 m 83

3,83

!m83

3m86

3m88

~

20m0

20m0

23m0

20. 0

25, 0

23.0

25.0

24m5

23,s

241 5

231 8

22m0

221 0

22m0

22m8

23.8 - tletodo de Barker,

* Hetodo de c r m a t o g r a f i r de gases, 2 4

cA)BIOS rISIcoQuIHIco9 Pn U COWP081CION DEL U1110 TIMO Ruby-Cabwntt DURIIIIIE U PERIBWIACION Cow Ptdiococcus spp -

'ERNENTACIO# (hrr)

0

48

96

144

1 92

2 40

288

336

384

432

480

528

576

624

672

728

768

816

864

912 -

ACIDEZ TOTAL (g/l)

8,40

8,40

8.40

8,40

8 ,4e

8.40

8,40

8,40

8 ,40

8, 40

8.40

8.40

8,40

8.40

8 ,40

8.21

ACIDEZ F I JA (g/l)

7.907

8 , 041

8,142

8,190

8,078

8,258

8,172

8,052

8 , 048

8,220

8 , 094

8,118

7,750

8,094

1,992

a , 220

1,520

0.905

0.814

2.034

1,964

1,712

1 * 47i

1.713

1,574

0,947

1,060

1,244

1,982

2,064

6,880

7,495

.7,586

6,366

6,436

6.688

6.929

6.687

6 , 826

7,453

7.348

7,156

6,418

6, 157

' Hetodo de Bukcr,

- ERHENIICION

(hrs) .

0

48

96

1 44

192

2 40

288

336

384

432

48 0

528

576

624

672

720

768

816

864

912 -

CAllPIOg FISIC#UIHIC@S m U COClPOSICION DU UIWO TIMO Rubu-Cabmet WRANTP Id PWI(BMACIOI( Cow Pcdiococcur spp

A C IDEZ TOTAL (g/l)

8,40

8,40

8,40

8,40

81 40

8,40

8,40

8,40

8,40

8,40

8 ,'40

8.40

8.40

8 ,40

8,40

8,21

* letodo de cronatografia de gases. 26

ACIDEZ FIJA (g/l>

7.907

8,041

8,142

8,190

8,870

8 250

8,172

8,052

8 848

8,220

8,094

8,118

71 758

8 094

7,992

8.228

ACIDEZ UOM?IL+ Cg/l)

ACID0 LACIICO, T "

L

TlELn n.5

m

2 Cono.

1

0,5

O

COMPORTAMIENTO DE LA ACIDEZ VOLATIL DURANTE LA FERMENTACION (e)

n

O 200 400 600 800 1000 tlempo (horro) - Ac.lactico "- Acidez volatil

COMPORTAMIENTO DE LA ACIDEZ VOLATIL DURANTE LA FERMENTACION (e)

8 -

6 -

4 -

2 -

(*I MEf.CROMATOQRAFIA

1 ,S-

1

O

COMPORTAMIENTO DEL pH DURANTE LA FERMENTACION (*)

I I I I

6 PH

4

3

2 m cu

1

O O 200 400 $00 800 1000

tlmmpo (horaal - AC. lactic0 + pH

( 4 METODO DE BARKER

10 Conc. (all)

8.

6

4

2

O

COMPORTAMIENTO DEL pH DURANTE LA FERMENTACION (*)

4

3

2 o O

1

0 O 206 400 600 800 1000

tlempo (horro)

---" Achctico "- pH

e

COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA ' DURANTE LA FERME,NTACION (*)

O ' I I I

30

( C) Temp.

26

20

16

10

5

O - O 200 400 600 800 1000

timmpo (hotad . " Ac.lactico -" Temperatura

( 0 ) METODO DE BARKER GRAIFUCA No5

4 10 Conc. l a m

8

6

4

2

o

COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA DURANTE LA FERMENTACION (*)

30 Tomp.

( C) 25

20

16

10

5

O O 200 400 600 800 1000

Tlompo (horro)

-" Ac.lactica -"- Temperatura

c

Y

I PI o o O o m W

3 X m 3

O

Iu O O

P O O

o) O O

00 O O

is o O

O o!

U U

01

33

-0 L O

10

8

6

4

2

O

DURANTE LA FERMENTACION (*) .,

V I I I I

O 200 400

-" Ac. lactic0

600 800 1000 tlempo (horro)

GRAFlCk COMPARATIVA. MET. DE BARKER V$ MET. ,CROMATOGRAFIA

2- - 2 9 6

(g/I) Conc.

Conc. (O/I)

- 2

- 1,6

- 1

0 9 5 -

- 0,s .

0 1 I I I - 0 O 200 400 600 800 1000

Tlompo (horro)

" MetBarker -" Met.Cromatografia

GRAIFOCA No.9

A N A L I S I S Y D I S C U S I ' O N . D E

R E S U L T A D O S

35

ANALISIS Y DISCUSION DE RESULTADOS

Al termino del experimento se agruparon los resultados en tablas y

graficas en las cuales se apoyard el andlisis y discusibn de los mismos.

Caracteristicas morfol6gicas de Pediococcus spp observadas al microscoDio.

Pediocaccus spp es clasificado como un microorganismo Gramm positivo, de forma esferica, que aparecen en pares o en cadenas; pudiendose ver cadenas cortas que estan formadas por pares de celulas ( 12 ) ; durante las observaciones al microscopio realizadas a lo largo de la ,fermentacidn pudo corroborarse lo anterior, 4stas se emplearon para monitorear la morfologia del microorganismo durante el'desarrollo de la fermentacih. En la tabla No.1 se aprecia que hubo presencia de microorganismos Gramm negativos, probablemente bacterias aceticas (201, los cuales contaminaron el. vino, estos fueron observados a lo largo de la fermentacidn y se presume que fueron los responsables de la disminucidn en la acidez volatil durante la misma.

Comportamiento del pH y la temperatura durante la fermentacidn.

Los rangos de pH y temperatura a los cuales Pediucoccus s p p puede desarrollarse van de 3.5 a 6.5 y de 25 a 4OoC respectivamente (12) , sin embargo, hay que recordar que -el objetivo de este experimento es inducir al microorganismo a realizar la fermentacidn malolActica, bajo las condiciones de un vino del estado de Zacatecas. Ver tabla No.2. De la tabla No.3 se puede observar que la temperatura se mantuvo en un rango constante de 22?2OC durante la fermentacidn malolActica, asi mismo el pH de 3.85 se mantuvo estable con una ligera variacidn de -0.05 unidades. +

36

Como se observa en las grificas de pH (grAficas No.3 y 4), así como en las grificas de temperatura (grificas No.4 y 5 ) ; no se encontrd una relaci6n directa o inversamente proporcional en la produccidn de Acido lictico con respecto a estos dos parimetros, debido a que no hubo una variacidn significativa en los mismos.

Comportamiento de la acidez volatil durante la fermentacidn.

En la tabla No.2 y en las grificas No. 1 y 2 se observa que la tendencia en la produccidn de acidez volatil fue a disminuir a 10. largo de la fermentacibn. .Considerando los valores reportados en la tabla No.1, se observa que hubo una ligera disminucibn en la cantidad de acidez voldtil global, 0.05 g / l , lo cual pudo deberse a la presencia de microorganismos Gramm negativos ,quienes fueron observados en los frotis realizados durante la fermentaci6n ,' los cuales consumen Acido acetic0 y acetaldehído ( 1 1 ) como es el caso de Acetobacter aceti (2-0).

Comportamiento de la acidez total durante la fermentaci6n.

De la tabla No.2 se observa que el cambio de la acidez total entre el inicio y el final de la fermentacidn malolActica fue minimo, 0.2 g/l, por lo que se considera que la acidez total se mantuvo casi constante. Dado que la acidez total representa tanto acidez volatil como acidez fija, que a su vez esta constituída por icido milico y

icido lkctico; es posible relacionar estos 'parimetros, acidez fija y acidez volAtil, para cuantificar la cantidad tedricamente probable de Acido mAlico presente en el vino.

37

Curiosamente, de la tabla No.3, en los resultados de la -cantidad de dcido mblico, se observa un comportamiento similar al de la acidez total, es decir, no hay cambios significativos, debido a que la variacidn en la cantidad de icido mdlico fucS minima durante la fermentacidn, lo anterior implica.que dada la pequeKa reduccibn de Bste Acido, Pediococcus spp opt6 por no seguir la vía del icido milico para la produccidn de Acido ldctico sino que eligid otra via metabdlica.

Comportamiento del etanol y.azúcares durante la fermentacidn .

En.la tabla No.2 se observa que la cantidad de azúcares del inicio al final de la fermentacidn, se redujo en un 40% (1.5 g/l), el etanol se mantuvo prActicamente constante (11-11.5OG.L.) ; estos dos últimos parametros resultan muy interesantes debido a la reducci6n en los azúcares y a la alta concentracidn de alcohol. Se

sabe que el etanol es el principal inhibidor del crecimiento de las bacterias ldcticas en un vino ( 28 1, un alto contenido de alcohol propicia que no se 'desarrolle la fermentaci6n malolactica en vinos terminados ( 39 1. En estudios anteriores (1 , 3 4 1 , en los que se utili26 la misma cepa de Pediucoccus s p p , se encontr6 que este microorganismo fue capaz de desarrollar la fermentacidn malolictica con un contenido de 9*G.L., sin embargo, no fue capaz de desarrollarse a 12OG.L.,

en este experimento se trabajd con un vino cuya concentraci6n de etanol fue de 11OG.L.; cuyo grado alcdholico esti muy cercano al límite ,anteriormente establecido, en el que la fermentacibn malolictica puede ser retardada mbs no necesariamente inhibida por una concentracidn de 10-14% de alcohol ( 27 ) , lo cual implica que aunque el microorganismo aún es capaz de desarrollarse no puede llevar a cabo la fermentacidn malolictica, es decir, reducir el icido milico a dcido ldctico.

38

Se sabe que la'fermentacidn malolActica es la producci6n de Acido lactic0 a partir de Acido malic0 ( 4 1, apoyindose en la grifica No.7 (produccidn de icido 'lictico) asf como en la tabla No.3, se presume que no existi6 fermentacidn malolactica; Bsto se corrobora con la disminuci6n de azircares (Tabla No.21, por lo que se supone que el acido lictico se produjo de 6stos y no del icido malico. Bajo condiciones severas, el crecimiento de Pediococcus Spp

depende de la presencia de carbohidratos fermentables, donde la glucosa es fermentada probablemente mediante la. ruta de Embden-Meyerhoff a DL o L(+) lactato. ( 12 )

AnAlisis comparativo de los mktodos de determinacidn de Acido lictico empleados en el presente estudio.

Las grificas No. 7 y 8 muestran los resultados del contenido de icido ldctico obtenidos de la fermentacidn mediante dos metodos: el de Barkery por cromatograffa de gases respectivamente. Las cantidades de icido lictico presentes en los vinos de regiones frías llegan a tener desde 0.2 hasta 5 g/l de icido lactic0 ( 31). La determinacidn de Acido lactic0 por el metodo de cromatografla de gases, muestra una concentracidn de icido ldctico que va de 0.213-8.140 g/l, existiendo en valores intermedios una variacidn de hasta 7.6 g/l entre valores continuos .Por otro lado, el mdtodo de Barker muestra resultados mds confiables, como se observa en la tabla No.4, donde se obtuvo concentraciones de Acido lactic0 que van de 0.410-1.884 g/l, existiendo en valores intermedios una variaci6n de 0.5 g/1 entre valores continuos, lo que indica una correlacidn de datos esperada. Como se aprecia en la grdfica No.6, el metodo de Barker y el mdtodo por cromatograffa de gases coinciden en algunas etapas de la fermentacidn por lo que se sugiere no descartarlo sin antes determinar su confiabilidad.

39

.

TiemPo de fermentacidn. ~~ ~~ ~~~

Si se observa detalladamente la grafica No.7, existe una tendencia a aumentar la cantidad de Acido lactic0 en la última etapa de la fermentacibn, es decir, a partir de los 28 días, esto implica que

de haber continuado la fermentacidn, probablemente hubiera seguido esta tendencia.

40

1 4 6 6 3 8

C O N C L U S I O N E S

41

CONCLUSIONES

* Las observaciones al microscopio indicaron que el microorganismo inoculad6 era Pediococcus spp.

* NO se encontrd una relacihn directa o inversamente proporcional en la produccidn de 6cido ldctico con respecto .al pH y la temperatura; por lo que &tos no influyeron significativamente sobre la fermentacidn.

* La mínima variacidn en la acidez total, indica que no b.1. t r , ?

. consumo de Acido mblico.

* La disminucibn en la cantidad de azúcares y la elevada concentracidn de etanol, lloG.L., fueron factores determinantes en la elecci6n de la degradacibn de los azúcares y no del Acido malic0 por el microorganismo.

* Dado que el microorganismo cpnsumid los azúcares y no el bcído mAlico, no hubo fermentaci6n malolbctica.

* En este experimento el metodo que result6 mbs confiable para la determinacidn de Acido lictico fue el de Barker.

42

..,

S U G E R E N C I A S

43

SUGERENCIAS

* Inducir la fermentacidn malolbctica en un vino con una concentraci5n de alcohol menor a los lloG. L. y con un menor contenido de azacares.

* Realizar curvas de determinacidn de dcido lbctico y bc'ido mdlico con patrones de los mismos ,confrontando los resultados obtenidos , con el fin de determinar la confiabilidad.de Bstos .

* Ampliar el tiempo de fermentacibn, .a un tiempo tal que la acidez voldtil no rebase los 3 g/l, con el fin de obtener al final de la grafica una curva decreciente de produccidn de frcido lactico.

* Determinar la cantidad de SOz , etanol, acidez volatil, acidez total, azúcares reductores totales , &ido mfrlico y &ido lictico durante la fermentacidn malolbctica.

* Ampliar el rango de temperatura en la fermentacidn, no excediendo los 25OC, en un vino con las mismas caracterlsticas que el empleado en este experimento, para verificar los resultados obtenidos en el mismo.

* El metodo de determinacidn de acid0 ldctico por cromatograffa de gases no se debe descartar sin antes determinar su confiabilidad.

44

A P E N D I C E A M E T O D O S

45

\

Determinaci6n de acidez total. ( 24 1

En un matraz Erlenmeyer de 125 ml, se colocan 20 m1 de agua hervida; se aKaden unas gotas de disolucidn. de azul de bromotimol al 1 9. como indicador; se adicionan ademe 5 m1 de muestra (vino) y se valora con disolucidn de hidrdxido 'de sodio 0.1 N hasta obtener una coloracidn azul tenue definida.

La acidez total valorable se expresa en Acido tartArico mediante el cAlculo siguiente :

V * N * 0.075 * 1000 Acido tartiric'o ( g/l 1 =

V

Donde :

V = volumen de hidrdxido de sodio consumido en la valoracidn del vino, en ml.

N = normalidad de la disolucibn de hidr6xido de sodio. v = volumen de la muestra, en ml.

0.075 = miliequivalentes de Acido tartarico.

NOTA : Si el vino contiene COZ, se eliminar-A este por agitacibn.

46

Determinaci6n de acidez volitil. 24 1

Se colocan 10 ml. de muestra ( vino 1 en un microdestilador .Se destilan aproximadamente 20 ml. de,muestra, que se reciben en un vaso de precipitados que contenga un poco de agua recien destilada. Se afiaden unas gotas de fenolftalefna como indicador y

se valora con disolucidn de hidrdxido de sodio 0.01 N hasta un color rosa suave, pero definido. La acidez volAtil valorable se expresa en dcido acetic0 mediante el cdlculo siguiente:

N. * V * 0.06 Acid0 acetic0 ( g/l ) = ......................

V

Donde : N = normalidad de la disolucidn de hidr6xido de sodio. V = volumen de hidrdxido de sodio consumido en la

valoracidn del vino, en ml. v = volumen de la muestra en ml.

0.06 = miliequivalentes de dcido acbtico.

47

. - ..I""".. ""." -.

Determinacidn de dcido lictico. ( S 1

curva estandar : Disolver 0 . 5 g de Lactato de Litio anhidro en 100 m1 de agua desionizada. Tomar 1 m1 de esta solucidn y llevarlo a un volumen de 100 m1 con agua desionizada en un matraz aforado ( solucibn estdndar 1 . Preparar la curva de la siguiente manera :

Concentracidn Sol. Estandar HzO Desionizada g/2 m 1 1 ( m1 1 ( m1 1

0.0 0.0 10.0

25. O 2.5 7 . 5

50.0 5.0 5.0

75.0 7.5 2.5

100.0 10.0 0.0

NOTA : La curva estandar debe realizarse por duplicado.

1 Se colocan 2 m1 de muestra en un tubo de ensaye de 18 a 23 mm de i

dihetro interior. Se adiciona 1 m1 de solucidn de sulfato de cobre al 20 % y 7 m1 de agua desionizada para hacer un volumen de i 10 ml. Se agrega aproxihadamente lg de hidr6xido de calcio a la solucic5n y de inmediato se agita vigorosamente; si no se obtiene una coloraci6n azul, se agrega m% h i d r 5 : x i c t c I de ca lc io ant.^^ de desarrollo de color. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente por lo menos durante media hora con una agitaci6n ocasional, despues es centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos. El líquido sobrenadante es usado para el desarrollo final de color, como se

describiri adelante. A l tomar 1 m1 de alfcuota para el analisis se debe tener cuidado de no incluir ningún material s6lido. que usualmente se presenta en la pelicula de la superficie. La pipeta con la alícuota debe ser limpiada. en la punta antes de ser transferida a otro tubo de ensaye.

-~ ~ ~~

Desarrollo de color : Adicionar al m1 de allcuota tomado 0 .05 m1 de soluci6n de sulfato de cobre al 4% y afladir exactamente 6 m1 de acid0 sulfarico concentrado, mezclando el contenido del tubo mientras el icido es adicionado. Poner el tubo en un baKo de agua hirviendo durante 5 minutos. Quitarlo y colocarlo en un .baFlo de agua fria abajo de 2Ooc.

Cuando el contenido del tubo este suficientemente frio, adicionar exactamente 0.1 m1 de la soluci6n alcalina de p-hidroxidifenil. Dispersar el reactivo precipitado tan ripido y uniformemente como sea posible en la solucim y poner el tubo en un baRo de agua a 3OoC durante 30 minutos, agitAndolo a los 15 minutos y a los 30 minutos. Pasados los 30 minutos poner el tubo en agua hirvinedo por 90 segundos. Quitarlo y ponerlo en agua fria a temperatura ambiente. Dejarlo reposar 10 min y leer en espectrofot6metro a 560 nm con fototubo normal. Leer la concentracidn de icido lactic0 obtenida en la curva estandar.

Determinacibn de dcido lictico por cromatografla de gases. ( 38 )

Para la cuantificacibn de Acido lactic0 se empled un cromatdgrafo de gases modelo 3700 marca'varian, el tipo de columna fue porapack Q . S . (80/100), cuyas dimensiones son 10 pies de longitud y

didmetro de 0.1 pulgadas, de acero inoxidable. Las condiciones a las que se inyectaron las muestras, el patrdn de etanol y el patrdn de Acido lactic0 fueron las siguientes: Temperatura del inyector = 100°C , Tiempo = 3 min . Temperatura del detector = 2 O O 0 C , Tiempo = 3 min . Atenuacidn = 32 Velocidad de la carta = 0 . 5 cm /nin .

Se inyecte un microlitro de Acid0 lfictico y se determind que el tiempo de resolucidn es de 16 mins. ( * l . Se inyectb un microlitro de etanol y se determind que'el tiempo de resolucidn de Bste es de 6 min. ( * )

Se inyectd un microlitro de vino de las muestras congeladas en el cromatdgrafo a las condiciones anteriormente indicadas, el tiempo de resolucidn de cada muestra es de aproximadamente 20 min. Una vez que se obtiene el cromatograma se inyecta la siguiente muestra. Obtenidos los cromatogramas se agrupan los resultados de % de Area de la curva correspondiente al etanol (curva obtenida a los 6 rnin.), y del Acido lactic0 (curva obtenida a los 16 min.). Para calcular el contenido de Acido lActico, se utiliza la siguiente relacidm:

- - ~

Etano' (g/1) = 74 Area de etanol 74 Area de lictico * 1 1 g/ ml

a

50

I 4 6 6 3 8 Determinacidn de azQcares reductores totales. ( 30 ) ~

.. . , i

. " . .

Curva esthdar :

Disolver 1 g de glucosa anhidra en 1000 m1 de agua destilada ( solucidn estandar 1 . Preparar la curva .de la siguiente manera :

Concentracidn Sol. estAndar Agua destilada ( mg/l 1 ( m1 1 ( m1 1

0 . 0 0.0 1.0

20.0 0.2 0 . 8

40.0 0 . 4 0.6

60.0 0.6 0.4

80.0 . O . & 0.2

100. o 1.0 0 . 0

NOTA : La curva estindar debe realizarse por duplicado.

Se coloca 1 m1 -de muestra en un tubo de ensaye de 1 a 23 mm de diAmetro interior. Se adiciona 1 m1 de solucibn de DNS; la mezcla se agita de inmediato vigorosamente, poner el tubo en un ban0 de agua hirviendo durante 5 minutos, quitarlo y colocarlo en un ban0 de agua fria abajo de 10°C. Agregar 8 ml- de agua destilada para hacer un volumen de 10 m1 y leer en un espectrofotdmetro a 575 nm con fototubo normal. Leer la concentracidn de azúcares reductores totales obtenida en la curva estandar.

51

Determinacidn de etanol. ( 2 4 - 1

Se colocan 50 m1 de viho en un microdestilador, de los cuales se destilan 25 ml, que son recibidos en un matraz aforado de 25 ml. Se pone a peso constante un picndmetro con capacidad de 25 ml, se pesa vacio .y a continuacidn con agua destilada, se registran ambos pesos. Una vez que se tiene el destilado se coloca en el picndmetro, se pesa y se registra el peso.

Donde : A es el peso del picndmetro vacio.

B es el peso del picndmetro con destilado.

C es el peso del picndmetro con agua

El valor obtenido "D",' es la gravedad especifica, con ella. se

localiza en las tablas el valor correspondiente al contenido de alcohol en % volumen y se realizan las correcciones necesarias de acuerdo a la temperatura a la.cua1 fue determinado -el contenido de

etanol en .la muestra.

Tablas del Amerine ( 1 )

52

"_""""

Determinacibn de pH. ( 24 1

Se colocan 20 m1 de soluci6n buffer de pH 4 . 0 1 en un vaso de precipitados de 50 m l , se estandariza el potencidrnetro (Conductronic pH 20) con la solucidn buffer al pH indicado a temperatura ambiente ( 2 2 2OC).

Se colocan aproximadamente 20 m 1 de vino en un vaso de precipitados de 50 m l , a continuacibn se enjuaga el electrodo con agua destilada, presiondndolo ligeramente con papel para eliminar el exceso de agua,se introduce en el vino y se registra la lectura de pH indicada en el potenci6metro.

53

Tincidn Gramm.' ( 41 )

1 ) Se preparan frotis delgados empleando una gota de vino que se extiende lo mejor posible sobre el portaobjeto, se seca al aire Y se fija con calor. Repetir este paso un par de veces mis.

2 ) Cubrir los frotis con reactivo de cristal violeta durante un minuto.

3 ) Lavar los portaobjetos en una corriente suave de agua destilada durante cinco segundos.

4 ) A continuacidn, lavar los frotis con reactivo de yodo y 1 v r ~ : o

a p l i c a r el ntismo r e a c t i v o durante un minuto. 5 ) Lavar como se indic6 en el paso 3. 6 ) Aplicar lentamente el reactivo de alcohol y seguir agregando

el decolorante hasta que la tintura ya no fluya del frotis. 7) Lavar inmediatamente como se hizo en el paso 3 .

8 ) Cubrir el frotis con reactivo de safranina durante 30

segundos. 9 ) Lavar como se indicd antes y dejar secar a temperatura

ambiente. 10) Observar cada frotis utilizando el lente de inmersidn en

aceite al microscopio.

54

- . .

S X B L I O G R A F I A

BI BLI OGWI A

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