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HPLC
Tania G. García Mendoza Lizet Núñez Peña Karina Ortega Becerril Lilia Serapio Morales
M. en C. Harlem Haydeé Cruz Bailón
Cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC)
técnica analítica ampliamente versátil
Utilizado para el análisis de productos
farmacéuticos, biomoléculas,
polímeros, y muchos compuestos orgánicos.
HPLC Técnica de separación física realizada en la fase líquida Una muestra se separa en sus componentes mediante la distribución
entre la fase móvil (solventes orgánicos) y una fase estacionaria (columna empaquetada de partículas pequeñas adsorbentes).
Mikhail Tswett
botánico ruso
1903
1930
Columnas de sílice
1952A.J.P.
Martin y colabora
dores
1960 Horvath,
Kirkland, y Huber
Cromatografía líquida
de alto rendimient
o
1980 HPLC
Ventajas y limitaciones Análisis de múltiples compuestos
de muestras reales y mezclas complejas
Precisión <0,5% (RSD). HPLC es altamente automatizado Altamente sensibles (ng), (pg) y
(fg) Componentes lábiles Susceptible de 60% a 80% de
todos los compuestos existentes, 15% para CG
Es una técnica preparativa, proporciona recobros cuantitavos de muchos componentes lábiles de mg a kg.
• La separación es menos eficiente que CG capilar.
• Mas difícil para novatos
Modalidades de HPLC
Cromatografía de fase normal (NPC)Cromatografía líquido-sólido o Cromatografía de adsorción
Fase móvil no polar y la fase estacionaria es polar (gel de sílice) Compuestos polares, no polares e isómeros, muestras complejas. Fácil contaminación, para reducir este problema se utilizan grupos
amino-o ciano enlazados a los grupos silanol.
Cromatografía en Fase Reversa (RPC)
Se basa en la interacción del analito entre las dos fases, una fase móvil polar y un fase estacionaria no polar
Octadecilo (C18) con soporte de
sílice
Cromatografía de Intercambio iónico (IEC)RCOO- + R4 N+ [R4 N+, -OOCR]0 Par iónicoRNH3
+ + RSO3 - [RNH3
+, - O3SR]
Fases estacionarias:•Sulfonato (intercambio catiónico)•amonio cuaternario (intercambio aniónico)•Sílice (intercambio aniónico)
Se basa en el intercambio de analitos iónicos con los contra iones de los grupos iónicos unidos al soporte solido.
Analiza componentes iónicos, aminoácidos, proteínas y polinucleótidos
Cromatografia de Exclusion molecular (SEC)
Se basa únicamente en el tamaño molecular del analito.
Cromatografía de permeación en gel (GPC): se utiliza para la determinación de pesos moleculares de polímeros orgánicos.
Cromatografía de filtración en gel (GFC): se utiliza para la separación de materiales biológicos solubles en agua.
Otros modos de separación
Cromatografía de afinidad
Cromatografía Quiral
Cromatografía de interacción
hidrofílica (HILIC)
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Electrocromatografía (CE)
Cromatografía de fluido supercrítico
(SFC)
Cromatografía liquida de baja
presión
Columnas quirales:Proteínas, polisacárido, ciclodextrinas, tipo Pirkle, esteres corona y polímeros quirales
Cromatografía quiral:
Parecida a fase normalUtiliza una fase estacionaria polar tales como sílica y materiales de intercambio iónico pero eluyen con fase móvil polar de solventes orgánicos y Buffers acuosos.
Se utiliza para separar analitos Polares y péptidos hidrofílicos
Cromatografía de interacción hidrofílica:
Análoga a RPC pero utiliza bajo contenido de solventes orgánicos y altas concentraciones de sales
Se usa para la separación de proteínas que fácilmente se desnaturalizan.
Cromatografía de interacción hidrofóbica:
Utiliza simultáneamente la electroforesis y la cromatografía
La diferencia es que utiliza un campo eléctrico y el eluyente es capaz de separar por sí mismo los componentes
Electrocromatografía:
Utiliza columnas de relleno y una fase móvil de fluido presurizado supercrítico como dióxido de carbono modificado con un solvente orgánico polar
Se utiliza principalmente para analitos no polares
Cromatografía de fluidos supercríticos
Otras formas de cromatografía liquida de baja
presión.
Cromatografía en capa fina (TLC)
Cromatografía flash
Cromatografía en papel
Algunos corolarios de sentido común
La muestra debe ser soluble• Si no está en solución no puede ser analizada por HPLC . Cuestiones de
solubilidad a menudo complican ensayos de analitos de baja solubilidad o componentes de difícil extracción de matrices de muestra. Recuperaciones bajas a menudo se derivan de la etapa de preparación de muestras pobres en lugar de análisis por HPLC
Para que se produzca la separación de los analitos deben ser retenidos y tener la migración diferencial en la columnaLa separación no puede ocurrir sin la retención y suficiente interacción con la fase estacionaria. Para el análisis cuantitativo los analitos deben tener diferente retención en la columna frente a otros componentes
La fase móvil controla la separaciónDonde las fases estacionarias proporcionan un medio para la interacción con el analito, la fase móvil controla la separación total. En el desarrollo del método de HPLC los esfuerzos se centran en encontrar la fase móvil adecuada para separa el analito de otros componentes. Excepciones a esta regla son exclusión por tamaño, cromatografía quiral y cromatografía de afinidad
Todas las columnas de fase C18-unidos no son iguales y no son intercambiables
Hay cientos de columnas C18 en el mercado. varían enormemente en su retención y características silanol
La solución de analito final debe prepararse de la fase móvil:la solución de analito final, si es posible, deben disolverse en la fase móvil o en un disolvente "débil" así como en la fase la móvil inicial. Muchos anomalías, tales como picos de división o picos con fronteo son causadas por la inyección de muestras disueltas en solventes más fuertes que la fase móvil. inyectar un volumen más pequeño (2-5µL) para minimizar estos problemas.
Cada método analítico tiene sus propias advertencias, limitaciones y dificultades:un método de desarrollo científico experimentado debe identificar estos posibles escollos y se centran en la búsqueda de condiciones para minimizar los problemas de estas áreas para un análisis más fiable
