MATERIALES Y MÉTODOS

Extractos ensayados: extracto Cl2CH2 de las partes aéreas de H. bonariensis y fracciones eluídas de una columna a presiónhidrostática. Fase estacionaria Silicagel 60, 70-230 mesh. Fase móvil: gradiente de elución con solventes de polaridad crecienteutilizando hexano, cloruro de metileno, acetato de etilo y metanol.

Línea celular: LLC-MK2. Cepa ensayada: L2/434/BU (cepa ATCC, Genotipo L2).

Se realizó un ensayo de viabilidad celular por reducción del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) hastadeterminar la dosis máxima no citotóxica para el extracto y las fracciones.La cepa resultó sensible a eritromicina, tetraciclina y levofloxacina según la determinación de la CIM en cultivo celular.

Ensayo anticlamidial:Se ensayaron cinco condiciones por cuadruplicado para cada extracto o fracción: A) 2 hs de preincubación del cultivo celular con elextracto/fracción, se lava el extracto y se hace la infección; B) 2 hs de preincubación con el extracto/fracción e infección; C)infección en presencia del extracto/fracción; D) infección en presencia del extracto/fracción y 48 hs de post incubación y E)infección sin presencia de extracto/fracción y luego 48 hs de post incubación con el extracto o fracción. Cada placa incluyócontroles de infección de la cepa sin tratamiento.

La reducción en el número de inclusiones se determinó por inmunofluorescencia luego de 48 hs de incubación.

Para el estudio de la actividad bactericida se repicaron los pocillos sin revelar de las condiciones en las que se observó 100% deactividad anticlamidial y se incubaron por 72 hs.

Análisis 1H-RMN del extracto Cl2CH2: espectrómetro Bruker DMX-600 (Bruker, Karlsruhe, Alemania) a 25 °C y frecuencia de 600 MHz.

Análisis por TLC: Fase estacionaria: Silicagel F254. Fase móvil: Tolueno-Acetato de Etilo (7:3). Revelador: H2SO4 50% en etanol y luz UV 254nm .

CONCLUSIONES

El extracto cloruro de metileno mostró un efecto inhibidor (90% -100%) cuando se añadió inmediatamente después de la inoculación, durante la etapa de crecimiento de la inclusión.

Esto podría deberse a una interferencia de los compuestos presentes en el extracto con las vías metabólicas celulares relacionadas con el desarrollo de la inclusión clamidial. El estudio

por 1HNMR del extracto mostró señales características de ácidos grasos de lípidos o cerebrósidos, compuestos fenólicos aromáticos, fitoesteroles, metil triterpenos y cerebrósidos.

Luego del fraccionamiento bioguiado por la actividad anticlamidial del extracto cloruro de metileno se obtuvo una fracción del extracto 100% bactericida y no citotóxica a la

concentración de 100 µg/ml. En la actualidad se están llevando a cabo estudios para caracterizar la composición química de la fracción activa y aislar el o los compuestos activos. Este es

el primer estudio de actividad anticlamidial de H. bonariensis.

Hydrocotyle bonariensis Lam.: Actividad anticlamidial de una planta medicinal argentina.

RESULTADOS

REFERENCIASGallo Vaulet M.L., Entrocassi A.C., Corominas A.I., Rodriguez Fermepin M. (2010). “Distribution study of Chlamydia trachomatis genotypes in symptomatic patients in Buenos Aires, Argentina: association between genotype Eand neonatal conjunctivitis BMC”. Research Notes 2010, 3:34.Hieronymus, J. (1882). Plantae Diaphoricae. Boletín de la Academia Nacional de Ciencias en Córdoba, Tomo IV, pp. 323-324.Ruffa, M.J, Ferraro G.E, Wagner M.L., Calcagno M.L., Campos R.H and Cavallaro L. (2002). Cytotoxic effect of Argentine medicinal plant extracts and human hepatocellular carcinoma cell line. J. Ethnopharmacol. 79:335-339.Toursarkissian, M. (1980a). Plantas Medicinales de la Argentina. Ed. Hemisferio Sur, Buenos aires, p. 131.

Cepa (genotipo) Condición Línea celular LLC-MK2

L2/434/Bu(L2)

A Sin inhibición

B 50±5%

C Sin inhibición

D 90-100%

E 90-100%

Actividad anticlamidial del extracto Cl2CH2 sobre genotipo L2 de C. trachomatis (100 µ/ml)

INTRODUCCIÓN

Hydrocotyle bonariensis Lam. (Araliaceae) es una planta perenne que crece en América del Sur. Es conocida como “Paragüitas”, “Sombrillade sapo“ o “Redondita de agua”. Sus hojas son utilizadas en etnomedicina en forma de cataplasmas para curar heridas, procesosinflamatorios y tratar erupciones cutáneas. Además, las infusiones de las hojas, flores y tallos se utilizan por sus propiedades diuréticas,estimulantes, emenagogas y antisépticas.

Chlamydia trachomatis infecta únicamente al ser humano y es la causa principal de las infecciones de transmisión sexual de origenbacteriano más prevalentes en el mundo y se han observado fallas en los tratamientos. Los antibióticos recomendados hasta el momentoson altamente efectivos para las infecciones agudas pero no sucede lo mismo para las infecciones que al no ser resueltas por elhospedador, resultan en inflamación crónica provocando patologías que pueden evolucionar hacia complicaciones como la enfermedadinflamatoria pélvica, el embarazo ectópico o la infertilidad.

Existe, por lo tanto, una importante oportunidad para probar la eficacia de las medicinas tradicionales y para el descubrimiento de nuevoscompuestos anticlamidiales.

El objetivo de este estudio fue detectar la actividad anticlamidial in vitro y evaluar la composición fitoquímica del extracto cloruro demetileno y de las fracciones activas de Hydrocotyle bonariensis.

Espectro de 1H-RMN del extracto Cl2CH2

63 3 2 2 2 2

2

1

7

1

1

1

1

1

5

44

S

El espectro de 1H-NMR del extracto Cl2CH2 mostró señales características de ácidos grasos (1),compuestos fenólicos aromáticos (2) , fitoesteroles (4), metil triterpenos (5) y cerebrósidos (7). Scorresponde al CH3OH-d4 residual.

Alejandra V. Catalano1, Andrea C. Entrocassi 2, Adriana Ouviña1, Paula G. López1, Marcelo Rodríguez Fermepin2

1Cátedra de Farmacognosia. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Junín 954. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. CP1113. Argentina.

2Unidad de estudios de Chlamydiae. Cátedra de Microbiología Clínica. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Junín 954. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. CP1113. Argentina.

alejandracatalano@gmail.com

Cepa (genotipo) Condición Línea celular LLC-MK2

L2/434/Bu(L2)

A Sin inhibición

B Sin inhibición

C 100%

D 100%

E 100%

Actividad anticlamidial de la fracción 18 sobre genotipo L2 de C. trachomatis (100 µ/ml)

Actividad bactericida de la fracción 18 sobre genotipo L2 de C. trachomatis

Cepa (genotipo) Condición Línea celular LLC-MK2

L2/434/Bu(L2)

A Crecimiento igual al control

B Crecimiento igual al control

C Crecimiento igual al control

D 100%

E 100%

Esquema de las diferentes etapas del ciclo de vida de Chlamydia tracomatis in vitro (A), (B), (C), (D) y (E). Las zonas sombreadas en rosa indican el punto del ciclo clamidial en contacto con el extracto o fracciones.

Análisis por TLC de las fracciones ensayadas

En los cromatogramas obtenidos mediante cromatografía en capa delgada (TLC) de las fracciones eluídas dela columna abierta se caracterizaron compuestos terpénicos.

Columna a presión hidrostática

Cromatograma 1. Fase estacionaria: SilicagelF254. Fase móvil: Tolueno-Acetato de Etilo (7:3).Revelador: H2SO4 50% en etanol y luz visible.

Cromatograma 2. Fase estacionaria:Silicagel F254. Fase móvil: Tolueno-Acetato de Etilo (7:3). Revelador: H2SO450% en etanol y luz UV 254nm.