I Ciencias Biológicas Iztapalapa.148.206.53.84/tesiuami/UAM21492.pdf · JUSTIFICACION ... a A la cafetería de la Unidad asiste un considerable numero de personas, ... Licuadora

Nombre: Martinez Lara Pedro.

Matricula: 90336377. ab

a Licenciatura: Ingenieria de los Alimentos

Ciencias Biológicas y de la Salud I Iztapalapa.

Teiéfono: 608 7435.

Trimestre lectivo: 96-1.

Horas a la semana: Veinte.

Titulo del trabajo: Manual de Análisis para el Control de la Calidad de los Alimentos de la Cafetería de la UAM-I.

7B

a Datos del asesor: Dr. Jorge Soriano Santos

Prof. Titular “C“, Tiempo Completo a Departamento de Biotecnologia.

a Lugar donde se realiza el servicio: Laboratorio S-156

Fecha de inicio: 9/06/95

Fzchs de terminaci6n: 9/12/95

a Clave:

si

Dr. Jorge Soriano Santos Asesor

Sr. Pedro Martinez Lara

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I

INDICE

INTRODUCCION .................................................................................................... iV

JUSTIFICACION ..................................................................................................... vi

OBJETIVOS ............................................................................................................ vi¡

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS .............................................................. viii

METODOLOGIA .................................................................................................... ix

ACTIVIDADES REALIZADAS .............................................................................. X

MANUAL DE TECNICAS PARA ANALISIS DE ALIMENTOS .......................... 1

COMENTARIOS ...................................................................................................... 114

BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................... 115

a ..< 111

INTRODUCCION

En los primeros tiempos el analista de alimentos se preocupaba principalmente de la adulteración gruesa. Ahora hay una tendencia creciente para examinar los alimentos desde un punto de vista mas positivo. Los alimentos procesados son producidos dentro de limites de los estandares prescritos por los fabricantes, establecidos también para cumplir con requisitos legales y con otros reconocidos como convenientes, al igual los alimentos en fksco. Esto se logra mediante la estandarización del proceso, tanto como sea posible en cada una de las siguientes etapas: en la granja, la materia “prima”, el proceso mismo y finalmente el producto y su almacenamiento. Esto ha necesitado el desarrollo de téaicas adecuadas para el análisis y control rápidos, que pretenden reemplazar métodos subjetivos para evaluar varias cualidades organolépticas mediante procedimientos mas objetivos.

En muchos laboratorios alimeniarios, la mayor parte del trabajo de rutina se refiere a métodos de análisis y al estudio de aditivos y contaminantes. Los principales componentes de inter& son humedad, grasa, proteínas, cenizas y carbohidratos, aprovechables y no aprovechables. En la practica los métodos usados pueden variar, de acuerdo al alimento que se examina. (,)

La verificación microbiología de los alimentos provee información concerniente a la calidad de los alimentos y de las condiciones sanitarias bajo las cuales fue manejado y/o procesado. En el caso de los alimentos contaminados, es posible conocer la fuente de contaminación y las condiciones en las cuales se dio. (9

El tipo de pruebas llevada a cabo son determinadas por el tipo de alimento en cuestión, así como el prop6sito especifico del análisis. Por ejemplo, una muestra de alimento que esta siendo investigada de posible contaminación por Clostridium boiulinum puede ser sujeta a diferentes pruebas de laboratorio, y no solo a un examen para organismos coliformes. (4)

Se han publicado procedimientos de referencia, reconocidos internacionalmente por organismos tales como ISO, IUPAC, Código Alimentario y la AOAC.

Algunos de los problemas en el analisis de alimentos provienen del hecho de que muchos de los ingredientes usados en la manufactura de alimentos compuestos son alimentos ellos mismos, de origen biológico y de composici6n química muy variada. Por ejemplo, la harina usada en la fabricación del pan, pasteles y galletas puede prepararse por varios procedimientos de molienda de diversas variedades de trigo. Por consiguiente, la composición del producto fabricado puede variar ampliamente, dependiendo de la composici6n de los ingredientes naturales o preparados.

Como en otros campos del análisis, la disponibilidad de buenos metodos es indispensable para obtener resultados correctos. No es exagerado enfatizar la gran importancia que tiene la limpieza de la mesa de trabajo y la atención meticulosa a los detalles en cada etapa. Los buenos resultados analíticos dependen también de la cuidadosa preparación de la muestra y un análisis preciso es de poco valor si los resultados no pueden interpretase significativamente. Por lo tanto, es importante que los trabajadores del laboratorio tengan una apreciación realista de los fundamentos del muestreo, de la estadistica y de los criterios de calidad, así como una comprensión del significado de los datos obtenidos. (,)

iv

a

trigo. Por consiguiente, la composición del producto fabricado puede variar ampliamente, dependiendo de la composición de los ingredientes naturales o preparados.

Como en otros campos del análisis, la disponibilidad de buenos métodos es indispensable para obtener resultados correctos. No es exagerado enfatizar la gran importancia que tiene la limpieza de la mesa de trabajo y la atención meticulosa a los detalles en cada etapa. Los buenos resultados analfticos dependen también de la cuidadosa preparación de la muestra y un análisis preciso es de poco valor si los resuliados no pueden interpretarse significativamente. Por lo tanto, es importante que los trabajadores del laboratorio tengan una apreciaci6n realista de los Aindamentos del muestreo, de la estadística y de los criterios de calidad, así como una comprensión del significado de los datos obtenidos. (,)

V

Justificación.

El Consejo Académico 1991-1993 en su sesión 127 , acordó integrar una comisión, que estaría

El Consejo Académico 1993-1995 acordó integrar una comisión cuya tarea consistiría en dar encargada de analizar la problemática de la Cafetería de la Unidad Iztapalapa.

. . seguimiento al funcionamiento de la Cafeteria de la Unidad Iztapalapa.

- el,

En base a estos esfuuzos realizados por el Consejo Academico, el trabajo que se pretende realizar esta encaminado a cooperar con las medidas que se han ido adoptando, referente a la cafeteria; ya que entre los puntos en que s e ha trabajado no se ha contemplado alguno que incida directamente sobre la calidad de .los alimentos que compra y expende la cafetería, y este trabajo es lo que pretende iniciar.

a eg a A la cafetería de la Unidad asiste un considerable numero de personas, pertenecientes al comunidad

universitaria, a adquirir sus alimentos, por lo cual hay que tener un estricto control sobre la calidad de los alimentos vendidos, ya que si se llegaran a encontrar en mal estado y10 a no contener los nutrientes necesarios repercute directamente sobre la salud del consumidor, y consecuentemente con el desarrollo de sus =@ actividades.

Como sabemos los tejidos internos de plantas y animales saludables están libres de microorganismos (estériles). Sin embarga, las superficies de vegetales y de la carne esth contaminadas con una variedad de microorganismos. La magnitud de la contaminación la reflejan uno o mas de los siguientes factores: la poblacián microbiana del ambiente del cual el alimento fue tomado, la condición de la materia prha , el metodo de manejo, el tiempo y condiciones de almacenamiento. (4,

a el)

La presencia de microorganismos en los alimentos puede dar como resultado cambios que llevan a mermas y descomposici6n, altemi6n de las cualidades nufricias y de la apeticibilidad y, en algunos casos, hacer que el alimento se vuelva tóxico para las personas. (2) *

Así como también, uno de los elementos para regular nuestro estatus nutricional general es disponer de información fidedigna sobre la composición nutritiva de alimentos. (3)

O m punto que se pretende cubrir con la aplicación de este manual, es que los proveedores de los diferentes a l ientos , tengan y mantengan una buena calidad durante todo el tiempo que surtan a la cafeteria; ya que se puede llegar a dar que un proveedor baje su calidad después de cierto tiempo, y con la aplicación de análisis a los productos se evitarían estas situaciones.

Por lo que el manual reunirá todo una serie de técnicas para el análisis de alimentos que cubra toda la gama de alimentos que trabaja la cafetería. Y estas técnicas se seleccionaran y/o adecuaran de acuerdo a las condiciones y necesidades de las instalaciones.

vi

OBJETIVOS

Elaborar un manual que reúna toda una serie de técnicas para analizar las caracterlsticas físicas, qulmicas, y microbiológicas de los alimentos de la cafetería de la UAM-I.

Asegurar y mantener una buena calidad de los alimentos de la cafeterla de la UAM-I.

Ayudar a dar un mejor servicio en la cafeterla, y por consecuencia evitar daños a la salud de los usuarios.

Procurar que los proveedores den y mantengan una buena calidad en los productos que proveen. 1

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

El presente manual será propuesto como un manual de consulta ante la comisión de seguimiento de los acuerdos de la cafeteria que esta integrada por:

Dr. Jorge Soriano Santos Dr. Raúl Conde Hernández Sr. Hugo Perez Pastenes Srita. Nuria Becerril Córtez

s Sr. N e h l i Miranda Pineda Sr. Rigoberio Ballesteros Romero Lic. Rogelio Miranda Ballesteros (asesor) Lic. Javier Hernández RamIrez (asesor) Sr. Federico Ortiz Trejo (asesor) Sr. Fidel Campero Sandoval (asesor) Sr. Antonio Rocha Vaidivia (asesor) Dr. Antonio Aguilar Aguilar (coordinador de la comisión)

Los que reunidos en la sesión del 11 de mayo de 1995 quedaron, se integrara un manual para realizar los análisis de las materias primas que ingresan a la cafetería para preparar los alimentos que se expenden, con el apoyo del Departamento de Biotecnologla, División CBS.

... V l l l

METODOLOGIA

Para la realización de este manual se siguieron los siguientes pasos:

Planteamiento de objetivos.

s Bosquejo general de los puntos a contener en el manual.

Recopilación de información bibliográfica. 2 ;

Discriminación de la infomación recopilada.

Diseflo del manual de tkcnicas de análisis.

Afuiación de las tkcnicas del manual de análisis.

Reporte fmal.

ix

ACTIVIDADES REALIZADAS

Plan de actividades.

I . Realización de la lista de los lugares en donde pudiera recopilarse infomaci6n Visitas, para recolección de infomaci611, a los siguientes lugares: Biblioteca de UAM, Unidad Iztapalapa

e Biblioteca de Laboratorios Nacionales de Salud Publica (Secretaria de Salubridad). Biblioteca de Procuraduría Federal del Consumidor. Biblioteca del Instituto Nacional de Nutrición. Biblioteca Central de UNAM.

2. Selecci6n de las Técnicas que integrarían el manual.

3. Adecuaci6n de las Técnicas a las condiciones bajo las cuales se realizaran.

4. Redacci6n y transcripcibn de las Tknicas.

5. Integración y diseflo del manual.

MANUAL DE TECNICAS

PARA

ANALISIS DE ALIMENTOS

1

iI

INDICE

I TECNICAS GENERALES PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO. 3 Preparación de la Muestra, Cuenta de Bacterias Mesofilicas Aerobias, Cuenta de Organismos Coliformes, Cuenta de Organismos Coliformes Fecales, Cuenta de Hongos y Levaduras, Cuenta de Stuphylococcus aureus, Investigación de Salmonella, Investigación de Vibrio cholerue.

11. PRODUCTOS CARNICOS 40 Preparación de la Muestra, Determinación de pH, Determinación de Humedad, Determinación de Cenizas, Determinación de Ftcula, Deteminación Nihitos, Determinación de Nitratos, Análisis Microbiológico.

111. PRODUCTOS LACTEOS 49 Mantequilla: Preparación de la muestra, Determinación de Humedad, Determinación de Grasa, Determinación de Sólidos No Grasos, Determinación de Acidez. Quesos: Prepmción de la muestra, Determinación de Humedad, Determinación de Cenizas, Determinación de Grasa, Determinación de proteha, Determinación de Acidez. Crema: Preparación de la muestra, Determinación de Sólidos Totales, Determinación de Grasa, Determinación de Gelatina, Determinación de Acidez Titulable. AnBlisis Microbiológico.

IV. PESCADO EN FRESCO. 64 Análisis de las Propiedades Sensoriales, Determinación de pH, Determinación de Trimetilamina, Análisis Microbiológico.

V. CARNE EN FRESCO. 69 Preparación de la m u e m , Determinación de Humedad, Determinación de pH, Análisis Microbiológico.

VI. FRUTAS Y HORTALIZAS. 72 Características Generales de Frutos, Características Generales de H o i t a l i , Clasificación del Producto y Parte a la cual de le aplica el Análisis de Residuos de Plaguicidas; Procedimiento de Muestreo, Preparación de la Muestra, Análisis Microbiológico.

VIL CEREALES Y PASTAS. 82 Determinación de Humedad, Determinación de Cenizas, Determinación de pH, Acidez Titulable, Análisis Microbiológico.

VIII. ALIMENTOS ENLATADOS. 87 Verificación del Engargolado, Medición de la Presión de Vaclo, y Espacio de Cabeza, Determinación de Peso Drenado, Análisis Microbiológico.

IX. HUEVO. 103 Determinación de la Calidad Exterior, Determinación de la Calidad Interior, Determinación de pH, AnPilisis Microbiológico.

X. ACEITES. 108 Determinación del Indice del Saponificación, Determinación del Indice de Acidez, Determinación del Indice de Esteres, Determinación del Indice de Yodo, Determinación del Indice de Peróxido.

2

. .

I TECNIC AS GENERALES P A M ANALISIS MICROBIOLOGIC0

Y DISOLUCIÓN DE

Material y equipo

a) Homo para esterilizar a i80°C.

b) Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas.

c) Baño María con termostato y termómetro.

d) Licuadora de una o dos velocidades controlados por un reóstato, con vasos metálicos estériles.

e) Balanza de capacidad no mayor a 2500 g y de sensibilidad de 0.1 g.

0 Utensilios estériles para la preparación de las muestras: cuchillas, pinzas, tijeras, cucharas, espitulas.

g) Pipetas bacteriológicas estériles de IO ml y 1 ml (graduación en 0.1 y 0.01 ml, respectivamente), con tapón de algodón.

h) Frascos de vidrio con tapón de rosca de 200 a 250 ml de capacidad, conteniendo 90 ml y tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca conteniendo 9 ml de solución buffer diluyente, en ambos casos f 1% del volumen sefíaiado después de la esterilización.

Medios de cultivo y reactivos

a) Medios de cultivo. Se indican en cada técnica y alimentos en particular.

b) Solución buffer diluyente.

Solución stock KH,PO, 34 g Agua destilada .................................................. 500 ml

...........................................................

Disolver el fosfato en agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con hidróxido de sodio IN. Llevar a un litro con agua destilada. Esterilizar durante 20 minutos a 121OC. Conservar en refrigeración. Tomar 1.25 ml de solución stock y llevar a un litro con agua destilada, esta es la solución de trabajo. Distribuir en porciones de 99,90 y 9 ml, según se requiera. Esterilizar a 12IoC durante 20 minutos.

3

..... . . . . . . ,

Procedimiento

a) s i se trata de una muestra congelada de un alimento originalmente liquido o licuable, fundirla por completo y homogeneizarla por agitación vigorosa del recipiente.

b) Si la muestra es liquida o semilíquida, agitarla firmemente. Cuando el producto por analizar llena totalmente el recipiente, es recomendable vaciarlo en otro (estéril) para homogeneizarlo; se tendrk cuidado de e evitar contaminaciones al escurrir el liquido por el labio de ambos recipientes.

c) Si se trata de alimento sólido pesar 10 g de la muestra obtenidos de diferentes zonas auxiliándose de cuchara, cucharilla, abatelenguk, espátula o cuchillo estéril. Transferirlos a un vaso de licuadora estéril y agregar 90 ml de solución diluyente calentada o no, según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento.

d) Licuar durante 1-2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea.

e) Puede substituirse el tratamiento con licuadora, haciendo uso de mortero estéril y procediendo de tal manera que se logre un a suspensión completa y homogénea de la muestra.

f) La anterior constituye la primera dilución de la muestra.

g) Continuar las diluciones de la muestra con el mismo diluyente, siguiendo los pasos que ilustran los esquemas 1 y 2, según convenga para cada caso. La selecciái de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del numero esperado de microorganisnos en la muestra con base en los resultados de anfüisis previos, y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado.

h) Utilizar pipetas diferentes para cada dilación inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca será menor de 10% de la capacidad total de la pipeta. Para transferir 1.0 ml no usar un pipeta de m8s de 10 ml de capacidad; para transferir 0.1 ml no usar pipetas mayores de 1.0 ml.

i) Si la pipeta es terminal y se tnuisfiere un volumen de liquido equivalente a su capacidad total, escunida en 3 segundos y soplar suavemente una vez. AI inocular la caja, aplicar la punta de la pipeta al fondo y dejar escurrir. En una zona sin liquido aplicar la pipeta una sola vez y retirarla.

j) Mientras se dora el liquido dentro de la pipeta, la punta de esta debe aplicarse en el interior del cuello del frasco y mantenerse en posición vertical, para lo cual este ultimo deber inclinarse lo necesario.

Para aspirar el liquido de las muestras con la pipeta, sumergir esta lo menos posible al realizar la operación.

k) Cada botella con diluyente que se inocule deberá agitarse siempre de la misma manera: 25 movimientos de abajo hacia arriba en un arco de 30 cm completados en 7 segundos, o cualquier otro que conduzca la mismo resultado.

I) Transferir la muestra y/o cada una de las diluciones a las cajas Petri (recuento en placa) o tubos con medio (recuento en tubo) que se requieran para cada paso .

4

PREPARACI6N DE DILUCIONES

' 901111 90 ml 90 ml MUESTRA ORIGINAL- - - -

10 g Dilución 1:lO Diluci6n 1:lOO Diluci6n 1:lOOO

90 mi

Dilución 1:lOOOO

Volumen del diluyente:

Volumen inoculado:

Dilución:

T 10'

'7 1 o 2

'r 1 0 5

PREPARACIÓN DE DILUCIONES E INOCULACION DE CAJAS

l T 1 o"

10 ml lml lml lml 90ml 9ml 9ml 9ml MUESTRA

lml

DIRECTA

lml lml lml lml

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5

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1)

Material y equipo.

a) Homo para esterilizar a 180 OC.

b) Autoclave con termómetro o manómetro probado con termómetro de máximas.


d) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos mekilicos est6riles.

e) Balanza de capacidad no mayor a 2500 y de sensibilidad de 0.1 g.

f) incubadora con termostato que evite variaciones mayores de I 0.1 OC.

g) Utensilios estériles para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas.

h) Pipetas bacteriológicas estériles de 10 ml graduadas en 0.1 y 0.01 ml, respectivamente.

i) Frascos de vidrio de boca angosta de 250 ml de capacidad con tapón de rosca conteniendo 90 ml, o tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca conteniendo 9 ml de solución buffer diluyente, en ambos casos i 1% del volumen señalado después de la esterilización.

j) Contador de colonias Quebec o equivalente.

k) Contador manual Tally.

I) Cajas Pehi estériles de 100 X 15 mm.


a) Solución buffer diluyente.

b)Agar-triptona-extcto de levadura.

Extracto de levadura ................................................. 2.5 g ..................................................................... Tnptona 5 g

Dextrosa (d-glucosa) ................................................. 1 g Agar ........................................................................... 15g Agua destilada ............................................................ 1000 ml

...

Procedimiento

a) Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que su inoculación, la adici6n de los medios de cultivo y su rotación, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación.

b) Para la preparación y dilución de la muestra seguir las indicaciones seflaladas en 1.

c) Practicar las diluciones decimales que se estimen convenientes de acuerdo con el esquema contenido en I .

d) Transferir 1 ml de la muestra y de c/u de las diluciones a cajas Petri estériles, evitando todo tipo de contaminación durante la maniobra y apEcarldo la punta de la pipeta al fondo de la caja mientras escurre el liquido.

e) Agregar 12 a 15 ml del medio de cultivo fundido y manteniendo a temperatura de'45-48°C en b a o de agua. Mezclarlo con la muestra (6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido c o n M o y 6 de atrás a adelante) sobre una superficie lisa y horizontal y cuidando que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. Preparar testigos del medio en cajas sin inoculo.

r) El tiempo transcurrido desde el momento que al muestra se incorpora al diluyente, hasta que fuialmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no excederá de 20 minutos.

g) incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y a la temperatura que se requiera, según el tipo de alimento de que se trate.

h) Seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 30 a 300 colonias, pues es en ellas donde será menor el error en el recuento.

i) Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de hongos), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de pqueiías partículas de alimento.

j) Con el auxilio de la lente de aumento y de la cuadricula de contador, contar todas las colonias de las placas seleccionadas. Si el numero se estima mayor de 300, y no se dispone de placas preparadas con las diluciones subsecuentes, contar e la mitad o en un cuarto representativo de ella, multiplicando por 2 O por 4 el numero obtenido. el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros grandes de la cuadricula del contador.

k) Multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el numero de colonias por mililitro o gramo de la muestra.

I) Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, utilicese la placa cuyo recuento se aproxime mas a esta cifra. Si la placa correspondiente a la primera dilución es la iinica que presenta colonias y estas son menos de 10, reportar el numero de colonias contadas seguridad de la frase: en la dilución 1:iO.

m) Debe apreciarse una razonable proporcionalidad en el numero de colonias que aparezcan en las placas de acuerdo con las diluciones utilizadas. En tanto no exista esta relación, el personal del Laboratorio deber6 adquirir la destreza necesaria hasta conseguirlo antes de efectuar estudios que sean validos. AI iniciarse en el trabajo de Laboratorio es recomendable inocular las cajas correspondientes de cada dilución por duplicado y computar las medidas aritméticas.

n) Si todas las placas: I ) no muestran colonias, 2) muestran excesiva difusión de las mismas, 3) esthn contaminadas o no son satisfactorias por cualquier motivo, anótese respectivamente: 10 sin colonias, 20 colonias difusas, 3) inconcluyente por accidente de Laboratorio.

a) Redondear la cifra obtenida en el recuento de manera que solo aparezcan 2 digitos significativos al inicio de esa cifm 128 se reportara como 130; 2417 como 2400; 49 cm 49, etc.

O) Reportar: Cuenta de bacterias mesofilicas aerobias en placas de agar-triptona-extracto de levadura incubadas X horas a 35OC.

8

. . . . ... , ~. .. - - ~

MOS COLIFORMES

Materiel y equipo

Recuento de colonias en medio sólido

a) Homo para esterilizar a 18OoC.

b) Autoclave con termómetro o manbmetro probado con termómetro de máximas.


d) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos metálicos estériles.

e) Balanza de capacidad no mayor a 2500 g y de sensibilidad de O. 1 g.

g) Frascos de vidrio de 200 a 250 mi de capacidad con tapón de rosca, conteniendo 90 ml y tubos de vidrio de 16 X 150 mm con tapón de rosca, conteniendo 9 ml de solución buffer diluyente; en ambos casos f 1% del volumen señalado despues de la esterilización.

b) Pipetas bacteriológicas estériles de 10 ml y ml graduadas en 0.1 y 0.01 ml, respectivamente.

i) Gradillas adecuadas al tamafío de los tubos.

j) Cajas Petri de 100 X 15 mm.

k) incubadora con termostato que evite variaciones mayores de i O.l°C.

I) Contador de colonias Quebec o equivalente.

m) Contador manual Tally.

Recuento por düucióa en tubo

a) Los señalados en a) - i) del párrafo anterior.

b) Tubs de cultivo de 22 X 175 mm.

c) Tubos de cultivo de 16 X 150 mm.

d) Tubos de cultivo de 13 X 100 mm.

e) Campanas de fermentación.

fj Asa de platino o nicromel de 3mm de diámetro.

Medios de Cultivos y reactivos

Recuento de colonias en medio sólido

a) Agar rojo violeta bilis.

Extract6 de levadura ........................................ Peptona, ............................................................ Sales billares ..................................................... Lactosa .............................................................. Cloruro de sodio ................................................ Rojo neutro ........................................................ Cristal violeta .....................................................

Agua destilada .................................................... Agar ....................................................................

3.0 g 7.0 g 1.5 g

10.0 g 5.0 g

0.03 g 0.002 g

15.0 g 1000 ml

Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y dejar reposar por un minuto. Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7.4.

Calentar con agitacih constante y hervir durante dos minutos. Envasar en recipientes estériles.

El pH Tial del medio debe ser 7.4.

Solución buffer diluyente.

Reeuento por dilución en tubo

a) Caldo lauril sulfato triptosa (LST)

Triptosa ................................................. 20 g Lactosa .................................................. 5 g K2HP04 ................................................ 2.75 g KH*P04 ................................................ 2.75 g NaCl ....................................................... 5 g Laurel sulfato de sodio ........................... 0.1 g Agua destilada ....................................... 1000 mi

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Hervir. Distribuir en tubos de 16 X 150 con campana de fermentaci6n en volúmenes de IO ml. Esterilizar a i2i°C durante 15 minutos. El pH fmal del medio debe ser 6.8.

b) Caldo de lactosa bilis verde brillante (LBVB)

Peptona ...................................... 10 g Lactosa ...................................... 10 g Ox-gall ...................................... 20 g Verde brillante .......................... 0.0133 g Agua destilada .......................... 1000 ml

10

. ., . . . ., ,

Disolver los ingredientes o 40 g del medio deshidratado en 1 litro de agua destilada. Hervir.

Esterilizar a 121°C por 15 minutos. El tiempo iota1 del calentamiento no debe exceder de 30

El pH fmal debe ser 7.1 a 7.4.

c) Solución buffer diluyente.

Distribuirlo en volúmenes de I O ml en tubos de 18 X 150 mm con campana de fermentación.

minutos, lo que puede lograrse con un precalentamiento del autoclave.

Procedimiento

a) Consultar las indicaciones generales seiialadas en 1

b) Preparar la muestra y sus diluciones decimales de acuerdo al diagrama contenido en I .

c) Transferir un mililitro o un volumen decimal de la muestra o de sus diluciones a cajas Petri.

d) Agregar de 12 a 15 ml de medio agar rojo violeta bilis fundido y mantenido a 45-48OC.

e) Si fuera necesario, inocular las cajas con un volumen mayor de 1.0 ml (puede usarse hasta 3.3 ml de la diluci6n para 15-20 ml de medio) o alternativamente; incluir mas de una caja inoculada cada una con 1 ml, a fui de poner en evidencia colonias de colifortnes cuando su numero fuera muy reducido en la m u e m : 3 placas conteniendo cada una 3.3 ml, de la diluci6n 1 : 10 permitm examinar 1 g o 1 ml de la muema

f) Mezclar correctamente el medio con la muestra. Dejar solidificar sobre una superficie plana y horizontal y agregar 4 ml del mismo medio de cultivo extendiéndolo para cubrir completamente la superficie.

g) Dejar solidificar e incubar las cajas en posición invertida durante 24 f 2 horas, a 32-35OC.

h) Contar las colonias de colifomes desarrolladas (ver). Las colonias de color rojo obscuro, con halo de pncipitaci6n y diámetro de 0.5 mm o mayor, se consideran típieas de los organismos colifomes en los productos lácteos. En otros alimentos no suelen mostrar el halo.

Las colonias de ciertas formas de cocos a veces producen colonias seme'antes y reportar: Cuenta de organismos coliformes en placas de agar rojo violeta bilis incubada 24 horas a 35 6 C.

Recuenta por diluci6n en tubo

a) Consultar las indicaciones generales senalas en 1.

b) Preparar la muestra y sus diluciones decimales de acuerdo al diagrama contenido en 1.

c)Prueba presuntiva I. Inocular 1 mililitro por dilución a cada uno de los tres tubos con I O ml de caldo laurel sulfato

tr i pt o s a.

2. Incubar los tubos por 48 f 2 horas a 35OC. Examinar los tubos a las 24 f 2 horas y observar si hay acumulación de gas en la campana de fermentación. La presencia de gas en cualquier cantidad, dentro de 48 horas, hace positiva la prueba,

i

d) b e b a confirmatoria I . Agitar suavemente los tubos de caldo laurel sulfato triptosa que resultaron positivos en la prueba

presuntiva. Transferir una o dos asadas de cada tubo al caldo lactosa bilis verde brillante al 2%. AI efectuar la reinoculación sostener el tubo primario (LST) en un ángulo tal que se pueda tomar la asada evitando la película que existiera en el medio. Sacar el asa del liquido en sentido perpendicular a su superficie, de manera que se forme un menisco bien defuiido.

2. incubar el caldo LBVB (2%) por 48 f 2 horas a 35OC y hacer la lectura correspondiente sobre la formación de gas. Determinar el numero de organismos de acuerdo con la tabla correspondiente, tomando como base el numero de tubos de LBVB que demuestm producción de gas en 48 f 2 horas a 35OC.

3. Reportar NMP de coliformes por gramo o mililiiro.

12

s COL-

Material y equipo

a) Homo para esterilizar a 1 80°C.

b) Autoclave con termómetro o manómetro probado con termómetro de máximas.


d) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos metálicos estériles.

e) Balanza de capacidad no mayor a 2500 g y de sensibilidad de 0.1 g.

f) Utensilios estériles para la preparación de las muestrss: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espáíulas.

g) Pipeias bacteriológicas estériles de IO ml y 1 ml, graduadas en 0.1 y 0.01 ml, respectivamente.

h) Gradillas adecuadas al tamaño de los tubos.

i) incubadora con termómetro que evite variaciones mayores de 0.loC.

j) Tubos de vidrio de 16 < 150 mm, con tapa de rosca

k) Frascos de vidrio de boca angosta de 250 ml de capacidad, con tapón de rosca, conteniendo 90 ml de solución buffer diluyente f 1% del volumen señalado después de la esterilización.

I) Tubos de vidrio de 13 X 100 mm.

m) Asa de platino o nicromel.

Medios de cultivo

a) Caldo laurel sulfato triptosa Triptosa ................................................ 20 g Lactosa ................................................ 5 g Fosfato dipotásico (K2HP04) ............. 2.75 g Cloruro de sodio (NaCI) ..................... 5 g Laurel sulfato de sodio ........................ O. 1 g Agua destilada ..................................... 1000 ml

Disolver 35.6 g del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir y disiribuir en tubos de 16 X I 5 0 en volúmenes de I O ml, con campana de fermentación. Esterilizar a 15 libras (121'C) durante I5 minutos. El pH final del medio debe ser 6.8.

13

I

. . b) Caldo EC. Triptosa o tripticasa ............................... 20 g Lactosa 5 g Sales biliares .......................................... 1.5 g Fosfato dipotásico ( K,HPO,) .............. 2.75 g Fosfato monopotásico (KH,PO,) ......... 1.5 g Cloruro de sodio (NaCI) ........................ 5 g

...................................................

Agua destilada ....................................... 1000 ml

Disolver 37 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Hervir y distribuir 10 ml de medio en tubos de 18 X 150 mm con campana de fermentación. Esterilizar a 15 libras (121OC) durante 15 minutos. El pH fmal del medio debe ser 6.9.


Procedimiento

a) Prepara la muestra y sus diluciones de acuerdo a las indicaciones contenidas en 1 .

b) h e b a presuntiva

1. Inocular 1 ml de cada dilución a cada uno de 3 tubos con 10 ml de caldo laud sulfato üiptosa.

2. Incubar los tubos durante 48 f 2 horas a 35 OC. Examinar los tubos a las 24 f 2 horas y observar si hay acumulación de gas en la campana de fermentación. Reincubar 24 hora mas. La presencia de gas, en cualquier cantidad, denho de 48 horas hace positiva la prueba.

c) h e b a confmatona

1. Agitar suavemente los tubos de caldo laud sulfato hiptosa que resultaron positivos. Transferir 2-3 asadas de cada tubo a tubos con caldo EC.

2. Incubar los tubos a 44.5OC * 0.2' C y observar si hay formación de gas a las 24 horas y 48 horas.

3. Los tubos que presentan gas al cabo de 48 horas son positivos

4. Determinar el numero mas probable de organismos coliformes fecales por g o ml de alimento.

14

Material y equipo

a ) Homo para esterilizar a iSO°C.

b) Autoclave con termómetro o manómetro probado con term6metro de máximas.


d) Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de f O.IoC.

e) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un &tato, con vasos metálicos estenles

f) Balanza de capacidad no mayor a 2500 g y de sensibilidad de 0.1 g.

g) Utensilios estériles para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas y espátulas.

h) Frascos de dilución de 200 a 250 ml de capacidad con tapa de rosca, conteniendo 90 ml de solución buffer diluymte f 1% del volumen seiíalado después de la esterilización.

i) Pipetas bacteriológicas de I O y 1 ml graduadas en 0.1 y 0.01 ml, respectivamente.

j) Cajas Petri de 100 X I 5 mm.

k) Gradillas adecuadas al tamaño de los tubos.

m) Contador manual Tally.

Medios de cuitivo y reactivos

a) Agar papa dextrosa Papa blanca ............................................. 200 g Dextrosa 20 g

Agua destilada ......................................... 1000 mi

.................................................. ......................................................... Agar 15 g

Infusión de papa Suspender la papa pelada y picada en 1000 ml de agua destilada. Hervir durante 30 minutos y filtrar

varias veces. En esta infusión disolver los demás ingredientes. Añadir agua destilada hasta completar el volumen inicial (1000 mi). Calentar a ebullición, hasta disolución total del medio. Distribuir en porciones de IOOml y esterilizar en autoclave por 15 minutos a 12I0C. Enfriar a 45-4SoC y acidificar a pH 3.5 con solución estéril de ácido taMrico al 10% (aproximadamente 1.4 ml de ácidoll00 ml de medio). Una vez que se ha agregado el hcido tartarico no se vuelva a calentar el medio.

a =a

15

.......... . - , .. .

II

=, =b =b 7) * Procedimiento

b) Solución esteril de ácido tartárico al 10%. Ac. tartárico ................................................ 10 g Agua destilada ............................................ 100 ml

Disolver y esterilizar a 121OC durante 15 minutos.


I a) Preparar la muestra y las diluciones decimales de acuerdo a las indicaciones seflaladds en 1.

b) Colocar 1 ml de cada dilución por duplicado en cajas Petri esteriles y agregar 12-15 ml de agar

c) Homogeneizar y dejar solidificar. Incubar una sene de placas a 22OC durante 5 días y la otra serie

d) Contar Las colonias de hongos en la serie incubada a 22OC y las colonias de levaduras en la sene

papa dextrosa fundido y acidificado y mantenido a 45-48OC.

a 35OC durante 48 horas.

incubada a 3SoC, as1 como en la incubada a 22OC.

e) Multiplicar por la inversa de la dilución y reportar: Cuenta de hongos en placas agar papa dextrosa acidificada incubadas 48 horas a 35OC o 5 días a 22OC (según el caso en el cual el recuento sea mas elevado), por gramo Órnililitro de la muestra.

16

. .

= R

pu-

Material y equipo

Método Baird-Parker

a) Homo para esterilizar a 18OoC.

b) Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas.

c) Baño Maria con termostato y termómetro.

d) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos metalicos estériles.

e) Balanm de capacidad no mayor a 2500 g y de sensibilidad de 0.1 g.

f) Utensilios estbriles para la preparación de las muestra: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espitulas.

g) Frascos de dilución de 200 a 250 ml de capacidad con tapón de fosca conteniendo 90 ml y tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca conteniendo 9 ml de solución buffer diluyente en ambos casos f 1% del volumen seAalado después de la esterilización.

h) Tubos de cultivo de 12 X 75 mm.

i) Gradillas adecuadas al tamaño de los tubos.

j) Pipetas bacteriológicas estériles de 10 ml y Iml, graduadas en 0.1 y 0.01 mi, respectivamente.

k) Cajas Petn de 100 X 10 mm

1) Varilla de vidrio de 3.5 mm de diámetro y 20 cm de longitud, con un doblez terminal en ángulo recto de 4 cm.

m) Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de f O.i°C.

n) Contador de colonias Quebec o equivalente.

fl) Contador manual Tally.

o) Asa de platino o nicromel.

M&do de Vonel-Johnson

a) Los scflalados en a) a k) del párrafo anterior.

b) Tubos de cultivo de 16 X 150 mm.

c) Asa de platino o nicromel

d) incubadora con termostato que evite variaciones mayores de t O.i°C.

17

. < .., . .~

a) Solución buffer diluyente.

b) Agar de Baird-Parker

I . Medio base: ......................................................... Peptona 10 g

Extracto de came 5 g Extracto de levadura I g Cloruro de Iitio ........... : ................................... 5 g Cliciia ........................................................... 12 g Piruvato de sodio ........................................... 10 g Agar 17g

.......................................... ..................................... . .

...............................................................

Suspender 60 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada, calentar agitando

El pH fmal de la base debe ser 6.8.

2. Medio completo. Enfiiar el medio base estéril a 45-50°C y agregar 10 ml de una solución al 1% de telurito de potasio

Preparación de la emulsión de yema: Lavar con agua y jabón los huevos que sean necesarios, desinfectarlos con tintura de yodo. Abrirlos

en condiciones asépticas y vaciarlos en un separador de claras estéril. Transferir las yemas en una probeta estéril hasta medir un volumen de 60 ml y completar a un volumen de 90 ml con solución salina estéril. Transferir a un matraz con trozos de vidrio y agitar fumemente para formar la emulsión. Filirar a través de gasa.

Todo el material utilizado debe ser estézil y se habajara bajo flujo laminar o en condiciones de esterilidad. Secar la superficie de las placas manteniendo las cajas con las tapas ligeramente abiertas a 37OC durante una hora. Emplear las placas dentro de las 24 horas posteriores a su prcparación.

i_ constantemente y hervir durante un minuto. Esterilizar a lZl°C (15 libras) durante 15 minutos.

estéril y 90 ml de emulsión de yema de huevo. Homogeneizar y distribuir en cajas Petri estériles. a -Q

a 1.11 c) Caldo infusión cerebro corazón @HI)

Infusión cerebro de ternera .................... 200 g Infusión corazón de res ........................ 250 g Proteosa-peptona 10 g Cloruro de sodio (NaCI) 5g Fosfato disódico ................................... 2.5 g Glucosa ................................................ 2 g Agua destilada ..................................... I000 mi

.................................. ......................

Disolver 37 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Hervir. Distribuir en tubos de 12X 75 mm, en volúmenes de 0.3 ml. Esterilizar durante 15 minutos a I5 libras de presión. El pH fmal del medio debe ser 7.4.

-.

d) Plasma humano o de conejo Plasma humano o de conejo diluido volumen a volumen con solución salina estéril.

e) Solución salina Clomro de sodio ..................................... 0.85 g Agua destilada ........................................ 100 mi

.- Disolver y distribuir en volúmenes de 25 ml. Esterilizar a 121OC (IS libras) durante IS minutos.

IR

........... -..- -

a) Solución buffer diluyente zm

b) Caldo soya iripticasa, con 10% de NaCI. Tripticasa ................................................ 17 g Phytona 3 g Cloruro de sodio ..................................... 100 g Fosfato de potasio dibásico .................... 2.5 g Glucosa .................................................. 2.5 g

...................................................

Agua destilada ........................................ 1000 ml

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Hervir. Distribuir en tubos de 16 X I 5 0 mm

Esterilizar a 15 libras (12i°C) durante 15 minutos. El pH h a 1 debe ser 7.3.

c) Agar Vogel-Johnson

volúmenes de 4.5 ml.

.................................................... Triptona 10 g Exiracio de levadura 5 g Manitol 10 g K2HPü4 ................................................... 5 g Cloruro de Iitio ......................................... 5 g Glicina 10 g Agar ............................................................ 16 g Rojo de fenol ............................................ 0.025 g Agua destilada ......................................... 1000 ml

................................ .....................................................

. . ......................................................

Disolver los ingredientes o el medio deshidratado en un litro de agua destilada, mezclar bim, agitar frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Agregar 20 ml de soluci6n de telurito de potasio al 1% (estéril). Enfnar a 45OC. Distribuir en cajas Petri. El pH fmal del medio debe ser 7.2.

d) Caldo infusi6n cerebro corazón (BHI).

e) Plasma humano o de conejo.

fl Solución salina,

Procedimiento.

a)F’reparacih y diluci6n de la muestra consultar en 1.

b) Colocar 0.1 ml de cada dilnci6n sobre una placa de agar Baud-Parker y extenderla con la varilla de vidrio en toda la superficie del medio. Usar una varilla para cada diluci6n.

c) Incubar las placas invertidas a 35-37OC durante 24-48 horas. DespuCs de 24 horas seleccionar las placas que muestren de 50 a 150 colonias aisladas; contar y manar todas aquellas que aparezcan negras y brillantes, con o sin ligero borde blanco, y rodeadas por una zona clara en el fondo del medio opaco. Estas colonias son sospechosas de S aureus. Incubar las placas 24 horas más e incluir en el computo las colonias nuevas que reiinan las características ya señaladas.

19

d) Seleccionar la caja que contenga más de 150 colonias tlpicas y practicar la prueba de coagulasa.

e ) h e b a de coagulasa:

I . Sembrar el numero de colonias, que correspondan según el cuadro, en tubos con 0.2 ml de caldo infusi6n cerebro coraz6n. Incubar a 35OC durante 24 horas.

Numero de colonias sospechosas en la placa

Menos de 50 51-100

101-150

Colonias por probar

3 5 I

2. Agregar 0.2 ml del plasma diluido volumen a volumen con soluci6n salina estéril.

3. Incubar en baño de agua a 35-37OC y observar a intervalos de 1 hora hasta 6.

4. Reportar positiva la prueba si hay fomaci6n de coagulo total de la mezcla

t) Computar el contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el numero de colonias, la diluci6n seleccionada para el recuento y el volumen inoculado, por ejemplo: Si la dilución scleccionada para el computo final es lo-' y se contaron 148 colonias, probar 7. Si de ellas 5 resultan positivas a la prueba de coagulasa, el calculo final será

1. Total de colonias coagulasa positiva en la placa:

7 colonias ................................. 5 positivas 148 colonias ................................. X

X = 105 colonias positivas (en la dilución 10-3 de la placa inoculada con 0.1 mi.)

2. Redondear la cifra a 2 dIgitos significativos.

105 .............................................. 100

3. Como 0.1 ml de la diluci6n 10-3 corresponde a 1 ml de la dilución 10-4. Multiplicar el numero de colonias por la inversa de esta dilución:

100 x (11104) = 100 x 104 = 1000000.

g) Reportar: Cuenta de S. aureus coagulasa positiva coüg (o mi) de alimento.

Si la prueba de coagulasa resulta negativa en todas las colonias probadas reportar O coüg.

a) Preparación y dilución de la muestra. Consultar

b) Transferir I .O ml de cada diluci6n a tubos conteniendo 4.5 ml de caldo soya tripticasa

c) Incubar a 35OC durante 48 f 3 horas

20

, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . ,,.. 11_1 .I._. ........

d) Inocular por estrla una asada de los tubos con desarrollo a placas de agar Vogel-Johnson de manera de puedan obtenerse colonias bien aisladas.

e) Incubar a 35OC durante 48 i: 3 horas.

f) Seleccionar las colonias negras (reductoras de telurito), convexas, brillantes y practicar la prueba de coagulasa.

g) Determinar el contenido de S. aureus, coagulasa positiva en la muestra de acuerdo con los resultados obtenidos en la prueba de coagulasa: IO, 100, 1000, etc. según la mayor dilución positiva en al prueba.

h) Reportar: estimación del contenido de S. aureus coagulasa positiva por g (o mi) de alimento.

Reducción de nucleasa termoestable

La producción de nucleasa termoestable es una propiedad característica de case todas las cepas de S. m w . La prueba de nucleasa, es una prueba, rápida y sencilla que permite confmar la presencia de S aureusr

Medios de cultivo

Agar azul de toluidina DNA Acido desoxirribonucleico ....................................... 0.3 g Agar ....................................................................... 10.0 g Cloruro de calcio anhidro (Sol. 0.01) ................... 1.0 ml Cloruro de sodio .................................................... 10.0 g Azul de toluidina (sol 0.1 M) ................................ 3.0 ml Hidroximetil-aminometano (Tris)(SoI. 0.05 M) ... 1000 mi

Ajustar el pH del tris a 9.0, agregar los ingredientes restantes excepto el azul de toluidina, dentar a ebullici6n para disolver el DNA y el agar. Agregar el azul de toluidina. Distribuir en frascos pequeños con tapón de hule. No es necesario esterilizar.

1. Tomar un portaobjetos limpio y agregar 3 ml del medio fundido esparciendolo bien por la superficie. Cuando el agar solidifique hacer orificios de 2 mm de diámetro, con una pipeta Pasteur.

2. Aiíadir con una pipeta Pasteur una pequefla gota de cultivo, calentado I5 minutos en baño de agua

3. Incubar los portaobjetos en cámara húmeda durante 4 horas a 37OC.

4. Se considera positiva cuando aparece un halo rosa brillante extendido por lo menos 1 nun

hirviendo. (Se puede usar el mismo cultivo de la prueba de coagulasa) en un orificio de la laminilla

alrededor del orificio.

21

........ .~ . . , . I,._'. , . . -_ . . . . . . . . .

7. INVESTIGACION DE SALMONELLA Equipo y material

a) Homo para esterilizar a i80°c

b) Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de i O.l°C y termómetro.

c) Autoclave con termómetro o manómetro, probada con termómetro de máximas.

d) Baiío María con termostato para evitar variaciones mayores de f O.IoC y termómetro.

e) Balanza de capacidad no mayor de 2500 g y de sensibilidad de 0.1 g.

f , Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato. Vaso con tapa esteril de 1 litro de

; a

capacidad.

g) Utensilios est6riles para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas.

h) Tubos de ensaye de 16 X 150 mm.

i) Pipeias bacteriológiuis esteriles de IO y 1 mi de capacidad, graduadas en 0.1 y 0.01 mi, respectivamente.

k) Cajas P& de 100 X IO mm.

I) Tubos de ensaye de 13 X 100 mm.

m) Asa de platino o nicromel de 3 mm de diámetro y asa recta.

n) Portaobjetos de vidrio lavados y desengrasados.

fl) Aplicadores de madera


Medios de preenriquecimiento

a) Agua peptonada

Peptona ......................................... 10 g Cloruro de sodio ........................... 5 g M 2 P 0 4 ....................................... 1.5 g Na,HPO,. I2 H20 ...................... 9.0 g Agua destilada ............................... 1000 ml

Disolver los componentes en un litro de agua destilada, ajustar el pH a 6.8 f 0.1, distribuir en volúmenes de 225 ml en frascos o matraces. Esterilizar a 113-1 15OC por 20 minutos.

b) Agua destilada estéril L-

22

I I 1

a) Caldo selenito cistina Triptona ............................................ 5 g Lactosa ............................................. 4 g Fosfato disódico ............................... 10 g Selenito ácido de sodio .................... 4 g L-cistina ........................................... 0.01 g Agua destilada ................................. 1000 ml

. .

Disolver 23 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, calentar a ebullici6n durante IO minutos en un baño de agua y distribuir en volúmenes de 10 y 1225 ml en recipientes, según se requiera. Esterilizar a 103OC, durante 5 minutos.

El pH fuial debe ser 7.0.

b) Caldo tetrationato

Base: Proteosa peptona o triptona ................... Sales biliares .......................................... Carbonato de calcio ............................... Tiosulfato de sodio ................................

5 g 1 g

10 g 30 g

Agua destilada ....................................... 1000 ml

. .

Disolver 46 g del medio deshidratado en u litro de agua destilada y calentar e ebullici6n. Esterilizar a 12OoC por 15 minutos. Distribuir en volúmenes de 10 6 125 ml en recipientes estériles segiin se requiere.

Antes de usar el medio agregar 2 ml de una soluci6n de yodado yoduro (6 g de cristales de yodo y 6 de yoduro de potasio disueltos en 20 ml de agua) y 0.5 ml de solución de verde brillante, 1:lOOO por cada 1100 ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no deberá caleniarse y s& usado el mismo dfa de su preparación.

a) Agar verde brillante Extracto de levadura ..................................... 3 g Proteosa peptona Num 3 o polipeptona ......... 1 O g Cloruro de sodio ............................................ 5 g Lactosa ........................................................... 10 g Sacarosa ......................................................... 10 g Rojo de fenol .................................................. 0.8 g Verde brillante ................................................ 0.0125 g Agar ................................................................ 20 g Agua destilada ................................................ 1000 mi

Disolver los ingredientes en el agua, mezclar bien, calentar a ebullici6n. Esterilizar en autoclave a 121OC por 15 minutos: pH final 6.9; enfriar a 5OoC. Distribuir en cajas Petri.

23

. -

U

b) Agar sulfito de bismuto

Extracto de carne de res ................................... 5 g Peptona ............................................................. 1 O g Glucosa ............................................................. 5 g

Sulfato ferroso ................................................... 0.3 g Sulfito de bismuto indicador ............................. 8 g Verde brillante ................................................... 0.025 g Agar ................................................................... 20 g Agua destilada ................................................... 1000 mi

. . Fosfato disódico ................................................ 5 g

Suspender 52 g del medio deshidratado en un litro de agua. Calentar hasta ebullición completa agitando frecuentemente. Enfriar a 45OC y distribuir en cajas Petri estériles.

El medio no debe esterilizarse en autoclave, ya que el sobrecalentamiento afecta su selectividad.

El pH final debe ser de 7.7

.-

c) Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Xilosa .............................................................. L-lisina ............................................................ Lactosa ............................................................ Sacarosa ........................................................... Cloruro de sodio ............................................... Extracto de levadura ......................................... Rojo de fenol .................................................... Agar ....................................... 1 .......................... Desoxicolato ..................................................... Citrate de hierro y amonio ................................ Agua destilada ...................................................

3.75 g 5.00 g 7.50 g 7.50 g 5.00 g 3.00 g 0.08 g

15.00 g 2.50 g 0.80 g 1000 ml

Suspender el medio en el agua caliente agitando frecuentemente hasta que hierva. E n h a 500C, y vaciar en cajas, pH fmal del medio, 7.4. No se esterilice.

d) Agar SS Extracto de came ................................................ 5 g Proteosa peptona ................................................. 5 g Lactosa ................................................................ 10 g Sales biliares ....................................................... 8.5 g Citrato de sodio ................................................... 8.5 g Tiosulfato de sodio .............................................. 8.5 g Citrato fémco ...................................................... 1 g Agar ..................................................................... 13.5 g Verde brillante ..................................................... 0.00033 g Rojo neutro .......................................................... 0.25 g Agua destilada ..................................................... 1000 mi

. .

Suspender los ingredientes o el medio deshidratado en un litro de agua destilada y calentar a ebullición hasta disolución completa. N o esterilizar en autoclave. Enfriar a SO%, distribuir en cajas Petri esteriles.

El pH fuial debe ser aproximadamente 7.

P 5 I

I - r=)

a) Agar triple azúcar fierro Polipeptona .......................... CiONrO de sodio .................................................. Lactosa ................................................................. Sacarosa ...............................................................

Sulfato ferroso amónico ....................................... Tiosulfato de sodio .......................... Rojo de fenol ......................................... Agar ............................................................ Agua destilada .......................................................

.................................................

Suspender 65 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta completa disolución. Enfiar a 6OoC y ajustar el pH de tal forma que después de la esteriliuici6n se de 7.3 f O. 1.

Esterilizar a 121OC durante IS minutos. Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 X 100 mm. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1.0 a 1.5 cm.

b) Caldo surraco Caldo base rojo fenol .......................................... 1.6 g

Urea .................................................................... 1.0 g Agua destilada ...................................................... 100 ml Azul de timol 2-3 gotas ......................................

Sacarosa ............................................................. 1.0 g

0.3 ml

Disolver los ingredientes en 100 ml de agua y calentar hasta completa disoluci6n. Disiribuir el medio en tubos de 13 X 100 mm con tap611 de algod6n en voliimenes de 2 ml. Esterilizar a 10 libras durante 10 minutos.

Indicador de azul de timol

Azul de t h o 1 .......................................................

Agua destilada ..................................................... 100 ml

1.6 g Hidr6xido de sodio (0.1 N) ................................. 35 g

c) Caldo manitol

.............................................................. Tripticasa 10 g Clomro de sodio s g

Manitol 5 g Agua destilada ....................................................... 1000 mi

.................................................... Rojo de fenol ......................................................... 0.018 g

..................................................................

Suspender 21 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Distribuir en volúmenes de 2-3

El pH final debe ser 7.4 ml en tubos de 13 X 100 mm y esterilizara 121°C por no mas de 15 minutos.

25

. : . ,. ,,. ....

d) Agar hierro lisina (Edwars y Fife) Peptona o gelisato .......... Extracto de levadura ...... Glucosa .......................... L-lisina ................................................................... 10.0 g Citrato fémco amónico .......................................... 0.5 g Tiosulfato de sodio ................................................. 0.4 g Púrpura de bromocresol ............................ 0.02g

Suspender los componentes en un litro de agua destilada, mezclar bien, calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la solución completa, enfriar a 50-60°C y ajustar la reacción de tal modo que el pH después de la esterilización sea de 6.7 I O . 1. Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos pequefios (de 13 X 100 mm) y tapar de modo que se mantengan condiciones de aerobiosis durante se uso. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 12 minutos. Dejar que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.

Se dispone de este medio en forma deshidratada en el comercio; prepararlo siguiendo las instrucciones del envase.

e) Medio de SIM Tripticasa ........................................................... 20.0 g Tiotona ............................................................... 6.1 g

Tiosulfato de sodio ............................................ 0.2 g Agar ................................................................... 3.5 g

Sulfato femso-amónico ................................... 0.2 g

Suspender 30 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada calentar a ebullición agitando üecumtemente hasta lograr una disolución completa. Dkiribuir el medio en volúmenes de 2 ml en tubos de 13 X 100 nun y esterilizar en autoclave a 12IoC, durante 15 minutos. El pH final 7,3 f 0.2. Dejar solidificar en posición vertical.

., f) Agar PDS

Proteosa peptona o polipeptona ............... Dulcitol .................................................... 5.0 g Dextrosa ................................................... 1.5 g Fosfato dibásico de potasio ...................... Fosfato dibásico de sodio ......................... CiONro de sodio ....................................... Sulfito de sodio ......................................... Citrato de bismuto ............................ Citrato dibásico de amonio ............... Agar .......................................................... 15.0 g Agua ......................... ........................... 1000 ml

1 .O g

1.0 g 1.5 g 2.5 g 3.0 g

Se recomienda preparar 100 ml de medio

Calentar a ebullición hasta disolver el agar. Dejar enfriar y agregar 5 g de cloruro de magnesio. Agitar. Ajustar el pH con NaOHIN. El pH final, 7.5 a 7.6.

Esterilizar por corriente de vapor de 15-20 minutos. Distribuir en tubos de 13X150 mm, en volúmenes de 2 ml. Dejar solidificar en posición vertical, guardar a una temperatura entre Z0C a SOC.

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g) Caldo malonato ................................. Extracto de levadura I g

2 g Sulfato de amonio ..................................... Fosfato dipotbico (K,Hpo,) .................... 0.60 g Fosfato monopoiásico (KH,PO,) .............. 0.40 g Cloruro de sodio ......................................... 2 g Malonato .................................................... 3 g ANI de bromotimol ................................... 0.025 g Agua destilada ........................................... 1000 ml

Disolver lo ingredientes en un litro de agua destilada. Distribuirla en tubos de 13 X 100 mm en cantidades de 2 ml. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. El pH fmal deberá ser 6.7.

a) Solución de verde brillante al 0.1% Verde brillante ......................................... O. 1 g

100 mi Agua destilada estéril ..............................

Cristales de yodo ..................................... 6.0 g

Agua destilada ........................................ 20 mi

b) Solución de yodo-yoduro

Yoduro de potasio ................................... 6.0 g

Conservar en fiasco ámbar.

c) Reactivo de Kovac pdimetil-aminobenzaldehido ................ 5 g Alcohol amllico ...................................... 75 mi Alcohol clorbidrico concentrado ............ 25 mi

Disolver el pdimetil-aminobenzaldehido en el alcohol amllico y despuCs agregar el hido clorhídrico Imtamente. Conservar en frasco ámbar.

d) Solución salina al 0.85% Cloruro de sodio ...................................... 0.85 g Agua destilada ......................................... 100 mi

Disolver el NaCl en el agua, esterilizar a 121°C por 15 minutos.

Procedimiento

a) Preparar la muestra del alimento por analizar

b) heenriquecimiento

1. Transferir asépticamente 25 ml o 25 g de alimento homogeneizado a un frasco conteniendo 225 ml de agua peptonada. Licuar se fuera necesario por un minuto.

2. Incubar a 35OC por 24 horas

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. . . . . . . . . . . . . ... .--i . -

* I_---

1

c) Enriquecimiento

1 . Transferir 1 ml del cultivo anterior a un tubo, conteniendo 10 ml de caldo selenito cistina y 1 ml a otro conteniendo 10 ml de caldo tetrationato. Homogeneizar.

2. Incubar a 35OC por 24 horas

3. Si el alimento no requiere preenriquecimiento, colocar 12-15 g en 125 ml de caldo selenito y 12- I5 g en caldo tetrationato. Licuar si fuera necesario, por un minuto. Incubar a 35OC por 24 horas.

d) Aislamiento

J 1. Agitar los frascos del cultivo anterior y por medio de un asa, sembrar sobre la superficie de cuando menos 2 cajas de medios diferenciales selectivos, por cada fiasco, manera de obtener colonias bien aisladas.

Los medios utilizados pueden ser agar verde brillante, agar sulfito bismuto, agar XLD o agar S.S.

Incubar por 35OC por 24 horas. Observar los cultivos para identificar colonias sospechosas de Salmonella:

1. Agar verde brillante. La Salmonella que no fermenta la lactosa ni la Sacarosa, tienen un color rojo o rosa, rodeadas de color rojo. Las bacterias fermentadoras de la lactosa producen colonias amarillas.

2. Agar sulfito bismuto. La mayoria de las salmonelas son capaces se reducir el sulfato y sulfito a nilfuro, produciendo colonias negras con o sin brillo metálico, rodeadas de un halo café, que posteriormente se toma negro. en ocasiones las colonias pueden ser de color cafe.

3. Agar XLD. Las colonias de salmonella generalmente presentan centro negro por producción de H2S. Las fermentadoras de lactosa y sacarosa producen colonias amarillas. El desoxicolato previene el surgimiento de Proteus.

4. Agar S.S. Las colonias son trastúcidas, transparentes u opacas algunas veces con centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

c) Identificación bioquimica. Seleccionar al menos 2 colonias típicas, sospechosas que se encuentren aisladas de cada placa.

Transferir con un asa de cada colonia seleccionada a una serie de tubos de cultivo sin volver a tocar la colonia.

La serie de tubos de cultivo consiste en agar TSI, agar LIA, agar SIM, caldo surraco y caldo manitol.

1. Agar TSI. ES medio se inocula por picadura en el fondo y por estrfa en la superficie.

2. Agar LIA. Este medio se inocula como el anterior.

3. Agar SIM. Este medio se inocula por picadura.

4. Caldo Surraco

5. Caldo Manitol.

Incubar las serie por 24 horas.

28

I

Coníírmaci6n

Para confmar la presencia de Salmonella y Arizona utilizar el medio PDS. Apartir del tubo de cultivo TSI, que haya dado la serie de bicquimicas presuntivas para Salmonella, inocular una cantidad abundante pro picadura a través de medio PDS y a tubos con caldo malonato y caldo dulcitol.

La prueba positiva en el medio PDS se observa por ennegrecimiento completo del medio, por la producción de H,S, la Salmonella y Arizona son positivas.

La diferenciaci6n de Arizona se hace por medio de caldo de malonato y caIdo dulcitol. Arizona utiliza el malonato produciendo una alcalinizaci6n del medio y un vire a ani1 por el indicador azul de bromotimol y no Fermenta el dulcitol como lo hacen la mayoria de las Sahnonellas.

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i

DE V i

Material y equipo

Licuadora y vasos de licuadora estériles Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 ml de capacidad con tapa de rosca Varilla de vidrio de 3 mm de dihmetro y 20 cm de largo, con un doblez terminal en hngulo recto de 4 cm Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0.2 g de sensibilidad Balanza analítica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad Incubadoras de 39-4OoC Baño de agua de 42 f O. 1 OC y 35-37 OC Cucharas estériles u otros insúumentos apropiados para transferir muestras de alimentos Cajas de Petri estenles de 15 X 100 mm de plástico Pipetas estériles de 1 ml con graduación de 0.01 ml, de 5 10 ml con graduación de 0.1 ml Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicromel o platino Tubos de cultivo o de ensayo de 16 X 150 mm y 20 XI50 mm Tubos para bioquímica o ensaye de 10 X 75 mm o 13 X 100 mm Tijeras y pinzas esta les Lampara @ara observar reacciones serológicas). Mecheros Bunsen o Fisher Papel pH (rango 1-14) con un máximo de graduación de 0.4 unidades de pH por cambio de color Potenciómetro Bolsas de polietileno de 2 8 X 37 cm con tapa resellable Aparato de filtración y membranas de 0.45 micras

~ ........

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Medios de cultivo

a) Agua Pcptonada Alcalina (APW) Pepiona ...................................................... IO g

Agua destilada ............................................ 1000 ml ........................................ Cloruro de sodio 10 g

Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar este sea de 8.5 f 0.2. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 12loC.

b) Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS). Extracto de levadura .................................................... Proteosa peptona .......................................................... Sacamsa ....................................................................... Tiosulfato de sodio ...................................................... Ciirato de sodio ............................................................ Sales biliares ................................................................ Bilis de buey ................................................................ C l a r o de sodio .......................................................... Citrato ferric0 .............................................................. Azul de bromotimol .................................................... ANI de timo1 .............................................................. Agar ........................................... Agua destilada ........................... ..................

. .

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Preparar en un matraz por lo menos tres veces mas grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 5OoC y colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45OC antes de usar.

c) Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC)

Solución 1 : ........................................................................ Peptona 10 g

Extracto de carne ......................................................... 5 g 20 g Cloruro de sodio

Solución stock de colorantes 1000 X 1 ml Agar 15 g Agua destilada ............................................................. 900 ml

.......................................................... ..........................

.............................................................................

Ajustar el pH a 7.6. Hierva hasta que se disuelva el Agar. Esterilizar por autoclave I5 minutos a 1210C.. EnMe de 48-55OC.

Solución Stock de Colorantes 1000 X: Azul de Bromotimol

Eianolal 95% ............................................................... 100 ml

..................................................... 4 g Rojo de cresol 4 g ...............................................................

Para obtener un color f m e del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando repetidamente los colorantes en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4% (pesdvolumen). Agregue 1 ml de esta solución a cada litro de agar mCPC, la cual tendiá al fuial 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por litro.

Solución 2: ...................................................................... Celobiosa 10 g

Colistina ....................................................................... 400000 g Pol i ix ina .................................................................... 100000 g

.............................................................. Agua destilada 100 ml

Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua destilada. EnMe y agregue los antibióticos. Esterilice por filtración, agregue la solución 2 la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri.

d) Agar T l N l (Agar Triptona y Sal) 10 g Triptona o tripticasa

Cloruro de sodio ........................................................... IO g Agar 20 g Agua destilada .............................................................. 1000 ml

.....................................................

..............................................................................

Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos, Esterilice en autoclave 15 minutos a 12I0C. Deje solidificar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles.

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I

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e) Agar Gelatina (GA) Peptona ......................................................................... 4 g Extracto ........................................................................ 1 g Gelatina ........................................................................ 15 g Agar .............................................................................. 15 g Agua destilada .............................................................. 1000 ml

Suspenda los.ingredientes y hierva hasta disoluci6n de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7.2 f 0.2; Esterilice es autoclave 15 minutos a 12I0C. Enfríe de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles.

f) Agar Gelatina con Sal (GS) PrepararltrgQ gelatina (GA), pero adicionando 30 g de cloruro de Sodio por cada litro. Suspenda los

ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7.2 f 0.2. Esterilice en autoclave 15 minutos a 12IoC. Enfríe de 45-50°C, coloque en cajas Petri. Si es necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp tal como V. alginolyticus, use de 25-30 g de agar por litro.

g) Caldo Glucosa de Hugh-Leifson Peptona ....................................................................... 2 g Extracto de levadura ................................................... 0.5 g Cloruro de Sodio 20 g Dextrosa ...................................................................... 10 g

Agar ............................................................................. 3 g Agua destilada ............................................................. 1000 ml

.........................................................

Púrpura de Bromocresol ............................................. 0.015 g

Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el agar. Ajuste el pH a 7.4 f 0.2. Coloque en tubos y esterilice en autoclave 15 minutos a 121OC.

h) Medio Base de Descarboxilasa (Argiiina, Lisina y Omitina) Base

Peptona ................................................................... 5 g Exiracto de levadura 3 g Dextrosa @-glucosa) ...._. I g

Agua destilada ........................................................ 1000 ml

............................................... ........................... ............

Ptúpura de Bromocresol ......................................... 0.02 g

Para caldo de arginina, lisina y ornitina, adicione 5 G de L-aminoácido a 1 litro de base. Como control, use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio spp haloiilicos, adicionar 15 g de Cloruro de Sodio por litro. Ajuste el pH de tal manera que después de la esterilizaci6n sea de 6.5 f 0.2. Distribuya en tubos y esterilice en autoclave I O minutos a 12loC.

i) Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal TINo, TINI, TIN3, TIN6, T,N8 y TINlo ................................................. Triptona o Tripticasa 10 g

Cloruro de sodio ...................... Agua destilada ........................................................... 1000 ml

O, IO, 30, 60, 80 o 100 g

Disuelva los ingredientes en agua destilada, para TINono agregue cloruro de sodio, para TINl use I O g de cloruro de sodio: así respectivamente. Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 X 150 mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 12IoC. Ajuste el pH a 7.2 f 0.2. Coloque en tubos y esterilice en autoclave I5 minutos a 121°C.

i

j) Caldo Soya Tripticasa (TSB) Peptona de tripticasa (Triptona) ................................ 17 g

Cloruro de sodio ........................................................ 5 g

Dextrosa 2.5 g

peptona de fitona (Soytona) ......................................

Fosfato dipot&ico ...................................................... 2.5 g

Agua destilada ........................................................... 1000 mi

3 g

.....................................................................

Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolución. Distribuya 225 ml en matraces de 500 ml o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 12I0C. El pH fmal debe ser de 7.2 f 0.2.

k) Agar Soya Tripticasa (TSA) Peptona tripticasa (Triptona) ......................................... Peptona de fitona (Soytona) 5 g Cloruro de sodio 5 g

.............................................................................. 15 g Agua destilada .............................................................. 1000 mi

15 g .........................................

........................................................... Agar

Suspenda los ingredientes en agua, destilada y hierva durante un minuto hasta disolución del agar. Para Vibrio spp halofilicos, agregar 15 g de cloruro de sodio. Didbuya dentro de tubos a m a m e s . Esterilice en autoclave durante 15 minutos a i2i°C. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfriar de 45- 5OoC y distribuya en cajas a Petri. El pH fmal dehe ser de 7.3 f 0.2.

I) Agar de Hieno Kligler (KIA) Peptona polipeptona .................................................... 20 g Lactom ........................................................................ 20 g Dextrosa ...................................................................... I g

0.5 g

Rojo de feno1 ............................................................... 0.025 g Agar ............................................................................. 15.0 g Agua destilada ............................................................. 1000 ml

Cloruro de sodio ......................................................... Cimto ferric0 amoniacal ... ................................... 0.5g Tiosulfato de sodio ............ .................................... 0.5g

Suspender los ingredientes y hervir hasta disolución del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 12IoC. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7.4 f 0.2.

m) Agar Arginma Glucosa Inclinado (AGS) Peptona ............................................................. 5 g Extracto de levadura ........... : ............................ 3 g Triptona ............................................................ 10 g Cloruro de sodio ............................................... 20 g Glucosa ............................................................. 1 g L-arginiina ......................................................... 5 g Citrato ferric0 amónico .................................... 0.5 g Tiosulfato de sodio ........................................... 0.3 g Púrpura de bromocresol ,

Agua destilada ...............

.................... 0.02g Agar .................................. ...................... 13.5 g

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. . . . . . . :. .. .~ .... ..... . ., ..

=m =.

Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolución del agar, y distribuir en cantidades de 5 ml a tubos de 13 X 100 mm. Ajustar el pH de 6.8 a 7.0. Esterilizar en autoclave de IO a 12 minutos a 121OC. Deje solidificar el medio inclinado.

n) Agar Triple ANcar y Hierro (TSl) Polipeptona ..................................................... Cloruro de sodio .............................................. Lactosa ............................................................ Sacarosa .......................................................... Glucosa ........................................................... Sulfato ferrosa amónico .................................. Tiosulfato de sodio ..........................................

Agar .................................................................. Agua destilada ..................................................

Rojo de fenol ....................................................

Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullici6n, agitando ocasionalmente hasta completa disolución. Enñiar a 6OoC y ajuste el pH de 7.3 f 0.1.

A) Agar de Hierro y Lisina (LIA) Peptona o gelisato .................................................. Extracto de levadura .............................................. Glucosa .................................................................. L-Lisina .................................................................. Citrato fémco amónim ......................................... Tiosulfato de sodio ................................................ Wrpura de bromocresol .... : ................................... Agar ....................................................................... Agua destilada .......................................................

5.0 g 3.0 g Log

10.0 g 0.5 g

0.04 g 0.02 g 15.0 g 1000 ml

Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121°C. Enñiar de 50- 60OC y ajustar el pH de 6.7 f 0.1. Distribuir en volúmenes de 3 mi en tubos de 13 X 100 mm. Los tubos se enelan en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parie inclinada de 2 cm.

o) Caldo Rojo de Metilo y Voges Proskauer (RM-VP) Peptona 7 g Glucosa 5 g Fosfato dipotásico 5 g

................................................................

................................................................ ................................................

Agua destilada ..................................................... 1000 ml

Disolver los ingredientes en 800 ml de agua tibia. Par Vibrio spp halofílicos, agregar 15 g mas de cloruro de sodio (para una concenhación fmal del 2%). Filtrar, enñiar a 2OoC y diluir a 1 litro. Distnbuya en tubos. Esterilizar en autoclave durante 12-15 minutos a 121OC. Ajustar el pH de 6.9 i 0.2.

p) Medio para prueba de movilidad (Semisólido) ........................................................... Peptona 10 g

Extracto de came ............................................. 3g 5 g Cloruro de sodio ..............................................

Agar 4 g Agua destilada ................................................. 1000 ml

.................................................................

34 . . ............ . . . . :- . ~ . . . . . . . . . . ___- . . .~ ..........

Calentar con agitaci6n y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar. Para Vibrio spp halofilicos agregar 15 g mas de cloruro de sodio (para una concentración fuial del 2%). Distribuir en tubos con tap6n de rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 12I0C. Ajustar el pH de 7.4 f 0.2.

Soluciones y Reactivo

a) Prueba de Rojo de Metilo Reactivo

Rojo de metilo .................................................. Alcohol eülico 300 ml Agua destilada .................................................. 200 ml

O. 1 g , . ..................................................

Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema.

Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4.5 y la prueba es POSITIVA. Un color amarillo se reporta como prueba NEGATIVA.

b) Prueba de Voger-Proskauer Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.

Reactivo .................................................... u-Naftol 5 g

Alcohol etílico absoluto ................................ 100 ml

Añadir 0.6 ml de la soluci6n de a-Naftol y 0.2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de cultivo.

Resultados: El desarrollo de una coloración rojo en 15 minutos constituye una reacción POSITIVA.

c) Prueba de Oxidasa Reactivo

N,N,N,N-Teirametil-p-Fenilendiamino ...................... 0.5 g Agua destilada ............................................................. 100 ml

Conservar m frasco oscuro a 5 6 IOOC. El reactivo durante 14 dias. Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35'C. Agregar 0.3 ml de

reactivo.

Resultado: La reacción positiva se observa para la producción de un color azul en un minuto.

d) Reacción de Indol Reactivo de Kovac

p-dimetilaminobenzaldehido .................................. 5.0 g Alcohol amílico ...................................................... 750 ml Acido clorhídrico concentrado ............................... 25 ml

Disolver el p-dimetilaminobenxaldehido en el alcohol amllico y agregar el ácido clorhldrico lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en fiasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo va del amarillo al café claro. Se debe conservar a 4OC.

Procedimiento.

reactivo. El desarrollo de un color intenso, constituye una prueba POSITIVA para indol. Sembrar un tubo con 5 ml de caldo triptona. incubar 48 horas a 53OC. Agregar de 0.2 a 0.3 ml del

Procedimientos para enriquecer y aislar Y. cholerae y Y. mimicus de agua y alimentos

I . Pnparación de la muestra

Pesar en forma aséptica una muestra de 25 g y colocarla en una licuadora estéril de 500 ml de capacidad. Cortar las muestras grandes en trozos pequeiios antes de licuarlas. Agregar 225 ml de agua peptonada alcalma y licuar para homogeneizar durante dos minutos a la máxiima velocidad. Para los moluscos bivdvos preparar un compuesto de 10-12 piezas con todo y el liquido de las valvas, y licuar hasta que quede bien mezclado. Verter 50 g de este compuesto a 450 ml de agua peptonada alcalina. Verter de esta dilación (10-1) 250 ml a otro recipiente estéril.

Debido a elevado crecimiento de bacterias entéricas en hortalizas, puede resultar dificil el aislamiento de bacterias de Vibrio por lo que es recomendable hacer diluciones de la muestra licuada hasta obtener una dilución fmal de 1 y proceder como de costumbre. Ejemplo: verter la muestra mezclada (25 g mezclados con 225 ml de agua peptonada alcalina) en un frasco grande estéril que contenga 2250 ml de agua peptonada alcaliia. Si no se dispone de recipientes grandes estériles, la dilación de la muestra licuada podría diluirse en una porción de 1: 10 en porciones menores.

Para muestras de pescado y marisco, especialmente molusco bivalvos, también preparar diluciones de la muestra en 9Oml de agua peptonada alcalina (APW), (10" hasta llegar a una dilación fmal de 104 y proceder como de costumbre. Eso se hace debido a la interferencia con otros vibrios.

2. incubar las diluciones, de 6 a 8 horas a 35-37OC

El periodo de incubación no debe exceder de ocho horas

a) Excepción: Incubar un segundo frasco de homogeneizado de moluscos bivalvos y un grupo de diluciones de 6 a 8 horas a 42OC.

b) Excepción: Incubar el homogeneizado de alimentos congelados durante un periodo de 6 a 8 horas, sembrar el inoculo sobre el agar para el aislamiento y vuelva a incubar el frasco de homogeneizado de tal forma que el tiempo sea de 18 a24 horas de 35-37OC.

3. Resembrar Después de la incubación, y sin agitar, transferir el inoculo de la pelicula (crecimiento superficial)

con un asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivo: Agar con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa, polimixima B y colistina (mCPC), la polimixina B inhibe al biotipo Clásico de V. cholerae. incubar el agar TCBS durante 18 a 24 horas de 35-37OC y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39-4OoC.

36

4. Morfologla colonial Examinar las placas a fin de determinar se presentan las características coloniales que a continuación

se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aplicarlas con esMa cruzada para aislarlas en agar T l N l o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentración de NaCl) e incubar durante 12-18 horas a 35-37OC. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza de las colonias, antes de las pruebas bioquhicas, se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal (GS) en el segundo día. Los resultados serán confiables si las placas de aislamiento muestran colonias puras.

a) Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (el Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para la fermentación de las sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos.

Nota: Las especies de Vibrio no producen colonias pequeflas de color crema en agar TCBS. Las colonias de V. mimicus, que es& estmchamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa ntgativas). La mayoría de las demás especies de Vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes.

b) Agar mCPC. Las colonias de V. cholerae el Tor son púrpuras (negativas para la fermentación de la celobiosa). E l Y. whificur produce colonias amarillas achatadas, con el centro opaco y los bordes traslúcidos. La mayoría de las demás especies de Vibrio no crecen fácilmente en agar mCPC.

5. Diferenciación Diferenciación de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios.

a) TSI, KIA y agar inclinado de arginima y glucosa (AGS). Inocular las colonias individuales m medios de cultivo TSI (agar de triple azúcar y hierro), KIA (agar hierro kliger) y AGS, picar y estriar en el agar inclmado. incubar los íubos inoculados, con el tapón no muy apreiado, durante 18 a 24 horas de 35- 37OC. Se recomienda estos medios porque las reacciones pamiten efectuar una diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de Vibrio, Aeromonas, PIesiamam shigelliaks y otras bacterias.

b) Caldo triptona al 3% de NaCl (TIN3) inocular las colonias en los caldos TINo y TIN3) e incubar durante 18 a 24 horas de 35-37OC. El V.

cholerae y el V. mimicus crecerán en TINo y TIN3. Algunas especies de bacterias que no son vibrios y que presentan reacciones similares a las del V. cholerae en medios de TSI y LiA no crecen en-T,N3. La mayoría de las especies de la familia Vibrionaceae crece solamente en TIN3.

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Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA) y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) par demminar la tolerancia de los cultivos puros a la sal. Dividir las placas en ocho sectores, inocular una línea recta en el centro de un sector de las placas, tanto de GA como de GS con cada cultivo puro. Incubar durante 18 a 24 horas de 35-37OC. E1 P! cholerae y el P! mimims crece& solo en la placa con GS. Para leer la reacción de la gelatinasa sostener la placa sobre una superficie negra, observar un halo opaco alrededor de la colonia de los microorganismos gelatinosa positivos.

c) Caldo glucosa de Hugh-Leifson Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir

un tubo con una capa de aceite mineral estéril o vapor liquido (50% de petrolato y 50% de parafuia) unos dos centímetros de grueso. Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas de 35-37OC. Las especies de Vibrio utilizan la glucosa tanto para la oxidación como par ala fermentación, las especies de Pseudomonas, que comúnmente se aislan del pescado y los mariscos con métodos de enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio, utilizan glucosa solo para la oxidación.

37

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f

d) Fmeba de oxidasa Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCI) u otro medio

que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar un circulo de papel filtro en una caja de Peiri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa esteril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidase positivos, el papel se tomara púrpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio son oxidas positivas (excepto el Y. metschnnkoviz).

6. Identificación y Confmación de V. cholerae 01, Y. cholerae NO O 1 y Y. mimicus.

a) Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, AGS, TINO y TIN, o GA y GS, y caldo glucosa de Hugh-Leifson.

~

"

. . . . . . . . . . . . . . . . . j . . . ................... .__ .. _._ii, . .

I_ ......

b) Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar.

NOTA Los cultivos puros que se someterán alas demb pruebas serológicas y bioquímicas para el V. cholerae son sacarosa positivos (amarillos) en agar TCBS y sacarosa negativas (verdes) en el caso de Y. mimicus o son celobiosa negativos (verde-púrpura) en agar mCPC, crecen en caldo TINo o en placas con GA; presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos gram negativos y producen ácido a partir de la glucosa, tanto en la oxidación como en la fermentaci6n, en el caldo de cultivo de Hugh-Leifson

c) Pruebas bioquímicas Las reacciones bioquímicas para identificación de Y. cholerae y otras especies bacterianas afmes

figuran en el cuadro anexo a este manual. La formula para todos las medios bioquímicos debed contener por lo menos un 2% de NaCI. En vez de medios convencionales se pueden usar tiras APIZOE, con 2% de NaCl ' como diluyente. Para el V. cholerae se puede usar solución salina fisiolbgica (0.85% de NaC1) como diluyente.

d) Fmeba serológica de aglutinación. Usar antisuero de diagnostico del grupo O1 y del subgrupo Inaba (Factores AC) y Ogawa (Factores

AB) par el anügeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y negativos, y los controles salinos para cada antisuero usado. Seguir las instrucciones del antisuero. Como es posible que los antlgenos se los antisueros esién relacionados entre si, hay que realizar pruebas bioquímicas para confmar que el cultivo puro sea de V. cholerae 01 o NO 01.

I . Los cultivos que agluthan con el antisuero del grupo 01, pero no en solución salha fisiológica simple, son de V. cholerae del grupo 01 si las reacciones bioquimicas contiman que el cultivo puro de V. cholerae. Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para grupos especfficos pueden ser clasificados según el subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa.

Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa, tienen los 3 factores (A, B y c) y son del serotipo Hkojima.

Los cultivos que aglutinan con el antisuero polivalente pero no aglutinan con antisueros haba y Ogawa, son se pueden tipificar con estos antisueros.

38

2. Los cultivos de Y. cholerae cuya identidad se haya confirmado con métodos bioqulmicos y que no aglutinen con el antisuero del grupo O1 son Y. cholerae NO 01. El suero para la clasificación de V. vulnificus NO O1 según el tipo se puede obtener de R.j. Siebeling.

3. Los cultivos que se agiutinan en el antisuero del grupo O1 y en solución salina, no se pueden clasificar según el tipo. Sin embargo, si se usa en medio mas rico, como TSA o agar infusión cerebro conizón @HI), se puede eliminar esta autoaglutinación.

f) Características minimas para la identificación de Y. cholerae Las cmcterlsticas que permiten suponer las presencia de Y. cholerae como minim0 son las

siguientes:

I. Morfología. Bacilo o bacilo encorvado, asporogénico y gramnegativo. 2. Aspecto en TSI Esela ácido, picadura ácido, gas negativo y WS negativo. 3. Prueba de Hugh-Leifson. Fermentación y oxidación de la glucosa positivo. 4. Oxidasa en los citrocromos positivo. 5. Prueba de la ArgUimahidrolosa: negativo. 6. Prueba de la Lisinadescarboxilasa: positivo. 7. Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y Y. mimicus. 8. C m h i e n t o a 42OC positivo. 9. Prueba de halofilia con NaCI. 0 % positivo, 3%: positivo, 6% negativo. Algunas cepas de Y. cholerae NO O1 se desarrollan a 0%

IO. Fermentación de la sacarosa: positivo par V. cholerae y negativo para Y. mimicus. 11. Prueba de ONPG positivo. 12. Fermentación de la arabinosa: negativa.

de NaCI.

BIBLIOGRAFIA

. I . . -Laboratorio Nacional de Salud Publica, c, México, 1980. . . . . . -Laboratorio Nacional de Salud Publica, -r oara -México, 1980. . . . . . . . -Laboratorio Nacional de Salud Publica, -;México, D.F., 1989. -Laboratorio Nacional de Salud Publica, . . . . de Vibno , México, D.F., 1990.

39

U

11. PRODUCTOS CARNICOS

ANALISIS FISICOQUIMICO

b I p P

P

Para prevenir la perdida de agua durante la preparación subsecuente manejo no se deben usar muestras pequeiías (La cantidad minima aceptable es de 500 9). Guardar el material molido en recipientes de vidrio o similares con tapas herméticas que la protejan del aire y del agua.

Preparar las muestras para el anaisis como sigue:

A) Carnes h s c a s , carnes secas, cames curadas, carnes ahumadas, etc. Separar completamente hasta donde sea posible cualquier porción de hueso, pasar rápidamente t res

veces a través de un molino de alimentos con placas da apróxhadamente 3 mm de aberhua, mezcla perfectamente despues de cada molienda y comenzar todas las determinaciones lo mas rápido posible. Si ocunim cualquier demora, congelar la muesira para inhibir la descomposición (-2 a -4OC).

b) Carnes enlatadas Pasar todo el contenido de la lata a través de un molino de alimentos como se indico en.

c) Embutidos Remover la cubierta y pasar a través de un molino de alimentos como se indico en.

Material

Potmciómetro Vaso de p.p. de 150 ml Licuadora

Reactivos

Solución buffer estsndar, con pH entre 6 y 8.

Procedimiento - Pesar IO g de muestra, colocarla en el vaso de la licuadora y agregar 100 ml de agua recientemente hervida a 25'C. Licuar hasta que haya incorporación (30 segundos). Vaciar el contenido en el vaso de p.p. y determinar el pH inmediatamente, usando el potenciómetro ya calibrado por la solución buffer.

40

.~ . . . . . : . .. .I :,._. . . .~ . . . .. .

i

Material

Cdpsula para humedad o cristalizador de vidrio de 4.0 cm de alto por 8.0 cm de diámetro Gasa de hoja doble Desecador, conteniendo material absorbente

Balanza analítica son sensibilidad de 0.1 mg Estufa con íegulador de temperatura, para mantener a 100-102°C

a a

Puizas para crisol

1)

Procedimiento

Cortar un circulo de gasa del tamaño del fondo del cristalizador, colocar en este y dejar en la estufa

Distribuir perfectamente sobre toda la gasa de 2-3 g de muestra finamente molida. Regresar el cristalizador a la estufa y mantener ahí por 4 horas (Cuando el material presente alto

contenido de agua, mantener en la estufa de 16-18). Despues de transcurrido este tiempo, dejar enfnar el cristalmdor en un desecador y pesar.

hasa peso constante, sacar de la esíufa, enfriar en un desecador y pesar.

C~lculos

%de Humedad = [(CM - CMS)K'M] * 100

En donde:

CM = Peso del cristalzador con muestra húmeda en gramos CMS =Peso del cristalizador con muestra seca en gramos PM = Peso del muestra en gramos.

Material

Crisol de porcelana de 4 cm de diámetro x 5 cm de altura Bao de vapor Parrilla electnca Pinzas para crisol Mufla con pirómetro acoplado Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg

Reactivos

Acetato de magnesio anhidro (Grado Reactivo) al 15% m/v, o Acetato de magnesio tetrahidratado (Grado Reactivo) al 25% d v .

-

Procedimiento

Pesar de 1-3 g de muestra fuiamente molida dentro de un crisol de porcelana a peso constante. Agregar 1 ml de acetato de magnesio anhidro o acetato de magnesio tetrahidratado. Colocar el crisol

en un bafio de agua y evaporar a sequedad. Colocar el crisol con lo muestra seca en una parrilla y calcinar lentamente para evitar proyecciones hasta que no haya desprendimiento de humos. Completar la calcinaci6n en una mufla controlada entre 550-600 durante I hora, dejar enfriar la mufla y pasar el crisol a un desecador.

Completada la calcinaci611, enfriar en desecador y pesar (se debe de tener cuidado al mover el crisol que contenga cenizas esponjosas ya que tienden a ser arrastradas por el aire con gran facilidad. Para evitar esto, tapar el crisol con un vidrio de reloj a peso consmte al momento de pasar al desecador hasta antes de pesar).

Conjuntamente determinar un blanco del reactivo utilizado.

Cálculos

%de Cenizas = [(pi - P,)/PM] * 100

En donde:

P , =Peso del crisol con cenizas en gramos P2 = Peso del crisol vacío a peso constante en gramos P, =Peso de la muestra en gramos

Material

Cápsula de porcelana de 8 cm de diámetro. Agitador de vidrio

Reactivos

Solución de Iodo-Ioduro de Poiasio (Lugol).- Disolver 6 g de Ki en 70 ml de agua; cuando este completamente disuelto, agregar 2 g de iodo met8lico, disolver y llevar a 100 ml.

Procedimiento.

Pesar 5 de muestra preparada como se indica en y aansferir a una cápsula de porcelana, agregar una

Agregar unas gotas de la soluci6n de iodo-ioduro y mezclar con ayuda de un agitador deyidrio. La cantidad suficiente de agua caliente para que la muestra se disgregue perfectamente, dejar enfriar.

aparici6n de un color aml, indica la presencia de almidón.

I

DE F E C P

Material

Matraces voluméiricos de 250 mi Bureta graduada de 50 mi Matraces Erlenmeyer de 500 ml Pipetas graduadas de IO mi Pipetas volumétricas de 5 ml Embudos de filtración de 15 cm de diámetro Papel f@oc Lana de vidrio Balanza analítica con sensibilidad de O. 1 mg Placa caliente Cuerpos de ebullición

Reactivos

Acido clorhldrico. Grado reactivo.

Solución alcohólica de fenolhleina al 1%.

Solución (A) de sulfaio de cobre.

reposar 2 dlas y filtrar a través de lana de vidrio. Disolver 34.639 g de CuSO, 5H20 y 50 g de hidróxido de sodio en agua y diluir a 500 mi, dejar

Solución (B) de tartrato de sodio y potasio.

reposar 2 dfas y film a través de lana de vidrio. Disolver 173 g de KNaC,€bO, 4H20 y 50 g de hidróxido de sodio en agua y diluir a 500 ml, dejar

Solución acuosa de azul de metilo al 0.2%.

Solución patrón de sacarosa. diluir con

agua a 100 ml. Guardar algunos dias a temperatura ambiente (aproximadamente 7 días a 12-15 C, 3 días a 20-25OC o 15 minutos a 67OC) después de esta inversión, diluir a un litro (esta solución es estable por algunos meses en refrigeración).

Pesar 9.5 g de sacarosa y disolver en 50 ml de agua, agregar 5 mi de HCI concentrado J .

Solución diluida de sacarosa. Diluir 10 ml de la solución patrón a 100 ml con agua (Iml = mg de sacarosa).

i

Titilación de la solución A-B. Medir con pipeta volumétrica 5 mi de la solución A y 5 ml de la solución B en un matraz

Erlenmeyer de 500 ml. Agregar 100 ml de agua y unos cuerpos de ebullición, calentar en parrilla cerrada a ebullición y agregar poco a poco, con bureta, la solución patrón de sacarosa diluida, hasta la casi reducción total del cobre. Agregar 1 ml de las solución de azul de metileno y continuar con la titilación hasta la desaparición del color azul (mantener continua la emisión de vapor para prevenir la reoxidación del cobre o del indicador). Si el gasto es menor de 15 ml o mayor de 50 ml de la solución de azúcar invertida, hacer la dilución apropiada o reformulación para que quede dentro de ese rango.

Calcular los mg de sacarosa que se necesitan para titular la solución A-B. Este valor corresponde ai factor (F) del reactivo.

43

, . . ., ,.. . . . - . .

Solución de hidróxido de sodio 1: 1 miv. Procedimiento.

En un matraz Erlenmeyer de 50 ml colocar 1-5 g de muestra preparada como se indica en y agregar 150 ml de agua y 25 ml de HCI concentrado. Colocar el matraz en el refrigerante y reflujar de 60-90 minutos. Enfriar, y agregar unas gotas de fenolftaleina, neutralizar con hidróxido de sodio 1 :I y enfriar.

Pasar a un matraz volumétrico de 250 ml, llevar a la marca con agua, filtrar, colocar el filtrado en la bureta y proceder a la titilación como se indica en

CAlCUlOS.

%de Almidón = [(250*F)N)*100*0.9]/P.M.

En donde:

V = ml gastados para titular la solución A-B F = Factor del reactivo en g de sacarosa. 0.9 =Factor de conversión de glucosa a almidón P.M. = Peso de la muestra

Material

Matraz voluméfrico de 250 ml Tubos Nessler de 50 ml Pipetas volumetricas de 2 ml Pipetas graduadas de lOml Vasos de precipitados de 50 ml Baño de vapor Balanza analítica con sensibilidad de O. 1 mg Espectrofotómetro

Reactivos

Reactivo de Griess. a)Disolver 0.5 g de Acido sulfanilico en 30 ml de &ido acético glacial y 120 ml de agua destilada.

Film se es necesario (guardar en refrigeración). b)Disolver 0.1 g de alfanaftilamina (NAFTIAMINA 1) m 120 mi de agua destilada calentando,

enfriar, agregar 30 ml de ácido acético glacial y filtrar (guardar en refrigeración). Si cualquiera de las soluciones se toma colorida, agitar con 0.5 g de zinc en polvo y film. Mezclar ambas soluciones y guardar en frasco iimbar.

Solución saiurada de cloruro de mercurio (HgCI,).

44

Solución patrón de nitrito de sodio

solución a un litro con agua destilada (1 ml = 0.005 mg de NaNO,). Reparación de la curva de comparación.

En tubos Nessler de 50 ml o en tubos de ensaye de 60-70 ml, medir solución patrón : 0.0, 0.1, 0.5, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 18.0 ml y llevar a la marca con agua destilada, agregar 2 mi de reactivo de Griess. Mezclar perfectamente y después de 20 minutos, leer en espectrofotómetro a 520 nm. Ajustar el cero del instrumento con el blanco. Trazar una curva graficando concentraciones contra absorciones o usar estos patrones para comparar visualmente.

Pesar 0.500 g de NaN02 puro, disolver en un litro de agua libre de nitritos. Diluir 10 ml de esta

Procedimiento Pesar 2 g de muestra preparada como se indica en (1.0) en un vaso de precipitados de 50 mi y

agregar aproximadamente 40 ml de agua libre de nitntos y calentada a 80°C, mezclar perfectamente con un agitador teniendo cuidado de romper todos los grumos, transferir todo el contenido a un matraz volumétrico de 250 ml, lavar el vaso y el agitador con varias porciones de agua caliente (160 ml aproximadamente).

Colocar el matraz en baño de vapor por espacio de 2 horas, agitando ocasionalmente. Agregar 5 ml de solución saturada de cloruro de mercurio y mezclar. Si hay color aíladu menos de 5 g de carbón vegetal y agitar. Enfriar a temperatura ambiente, diluir a la marca con agua libre de nitritos y mezclar. Filtrar, tomar una allcuoia de 50 ml en tubos de Neesler, agregar 2 mi de reaaivo de Gness, mezclar y dejar reposar 20 minutos para desarrollar color. Este color puede leerse visualmente con su respectiva escala por comparación o bien leer su absoreión en un espectrofotómetro a 520 nm, ajustando el aparato a cero de trasmisión con el blanco.

cblculos

ppm de NaN02 = ( L * 5 * 1000) I PM

En donde: L =Lectura en la curva de NaN02 en mg. PM = Peso de la muestra.

Material

Matraces volum~tricos de 100 ml Tubos de Nessler de 50 mi Pipetas volumetncas de 25 mi Pipetas graduadas de 10 ml Cápsulas de porcelana de d10 cm. de dihetro Baño de agua Balanza analítica con sensibilidad de O. I mg Espectro fotómetro

Reactivos

Solución de ácido fenol disulfónico.

total, enfriar y agregar 3 ml de agua. Calentar 6 g de fenol con 37 ml de ácido sulfúrico concentrado en un baflo de vapor hasta disolución

Crema de alúmina. Preparar un a solución saturada en agua de sulfato de potasio y aluminio con 12 moléculas de agua.

Afladir hidróxido de amonio con constante agitación hasta que la solución sea alcalina al tornasol, dejar que se asiente el precipitado y lavar por decantación con agua hasta que el agua del lavado de ligera reacción para sulfatos con BaCI,. Tirar el exceso de agua y guardar la crema residual en frasco cenado.

Solución de aceiato de plomo básico Calentar 430 g de acetato de plomo básico, 130 g de oxido de plomo y 1 litro de agua por 30

minutos. Dejar enfriar y sedimentar. Decantar el liquido sobrenadante y ajustar su densidad a 1.25 con agua recientemente hervida.

Solución patrón de comparación Disolver 1 g de nitrato de sodio puro y seco en agua, diluir a 1 litro. Evaporar 10 ml de esta solución

a sequedad en ban0 de vapor, agregar 2 ml de ácido fenol disulfónico y mezclar rápida y perfectamente con la ayuda de un agitador de vidrio, calentar cerca de 1 minuto en baño de vapor y diluir con agua a 100 ml(1 ml - 0.1 mg de NaNO,).

Hidr6xido de amonio. Grado reactivo.

Solución saturada de sulfato de plata.

Preparación de la curva de comparación. En tubos de Nessler de 50 ml, medir de 1.0 a 20 ml de la solución pairón, agregar 5 ml de hidróxido

de amonio a cada tubo y diluir a 50 ml. Los tubos patrones así preparados son estables por algunas semanas si se guardan perfectamente tapados. Leer el color obtenido en un espectrofotdmetro a 420 nm.

Trazar una curva grafcando absorciones contra concentraciones. Hacw otra curva evaporando 10 ml e la solución concentrada (1 g de nitrato de sodio en un litro de agua) agregar 2 ml del reactivo, mezclar rápida y perfectamente con un agitador de vidrio.

Calentar 1 minutos en baño de agua y diluir a un litro ( I ml = 0.01 mg de NaNO,)

Preparar una serie de tubos usando cantidades que vayan de 1.0-20.0 ml , agregar 5 ml de hidróxido de amonio a cada tubo y diluir a 50 ml.

Proceder como se indico antes.

I.. . .. -. . . , .. ~

46

Procedimiento.

Pesar de 1-2 g de muestra preparada como se indica en (1.0) en un matraz volumétrico de 100 ml, agregar 20-30 ml de agua calentar en un baño de agua por I S minutos agitando ocasionalmente.

Agregar 3 ml de solución saturada de Ag,SO, libre de nitratos, agitar. Agregar IO ml de solución de acetato básico de plomo y 5 ml de crema de alúmina, agitando después de cada adición. Dejar enfriar y diluir a la marca en agua, agitar y filtrar a traves de papel, regresando el filtrado hasta que pase claro.

Evaporar 25 ml del filtrado a sequedad, agregar 1 ml de solución de hcido fenol disulfónico, mezclar r$pida y perfectamente con un agitador de vidrio, agregar 1 ml de agua, 3-4 gotas de H2S0, y calentar en baíío de agua de 2-3 minutos, teniendo cuidado de no secar la muestra.

Agregar cerca de 25 ml de agua y un exceso de hidróxido de amonio, transferir a un matraz volumétrico de 50 ml o a un tubo de Nessler de 50 ml. Agregar 0.5.1.0 ml de crema de alúmina si no esta completamente claro; diluir a la marca y filtra.

Preparar un blanco de muestra evaporando otros 25 mi del filtrado clarificado, agregar 1 ml de ácido sulfúrico concentrado, mezclar rápida y perfectamente con un agitador de vidrio, agregar 1 ml de agua y calentar en baíío de agua durante 2-3 minutos, teniendo cuidado de no secar la muesúa; agregar 25 ml de agua y un exceso de hidróxido de amonio, transferir a un tubo de Nessler de 50 ml y llevar a la marca. Con este blanco ajustar a c m el aparato y leer la muestra.

Comparar la muestra contra tubos patrón o leer a 420 nm para interpolar con una curva pairón.

Cglculos

ppm de NaNO, = (I * 4 * 1000) I PM

En donde: L =Lectura en la curva de NaNO, en mg. PM -Pew de la muestra.

ANALISIS MICROBIOLOGIC0

P

Preparar como se indica en I. del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

Seguir las indicaciones seflalas en 2 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

NOTA: Esta cuenta se aplica a todos los productos, exceptos los fermentados. Incubar las cajas en posición invertida a 32OC por 72 horas.

47

Seguir las indicaciones seílalas en 6 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

NOTA: Invertir las placas e incubar durante 45-48 horn a 35°C (Baird-Parker). Incubar en cámara húmeda 4 - 24 horas a 35'C (Nucleasa).

Seguir las indicaciones seílalas en 7 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

NOTA Enriquecimiento, incubar a 43°C por 24 horas y continuar aislamiento.

BIBLIOGRAFIA:

-A.O.A.C. ' 13 ih edition, 1980. -Laboratorio Nacional de Salud Publica, -Laboratorio Nacional de Salud Publica, -s Y Ffslco C U h W d G -México, D.F., 1983. -Laboratorio Nacional de Salud Publica, fi, México, D.F., 1990.

' México, D.F., 1989. . . . . .

111. PRODUCTOS LACTEOS


MA”JCQUrUAY MARGARINA J 3

Ablandar completamente la muestra en el recipiente que la contiene, por calentamiento en un baño de agua, mantenido a baja temperatura (39OC). Evitar el sobrecalentamiento que pueda causar la separación visible del suero. Agitar frecuentemente pero con cuidado durante el proceso de ablandamiento para reincorporar cualquier grasa separada y terminar cuando se observe fluidez en la muestra. La consistencia optima se alcanza cuando la emulsión obtenida corresponde a un maierial fluido y no alterado que representa la verdadera calidad de la muestra.

Separar la muestra del W o y agitar frecuentemente o colocar el recipiente que contiene la muestra en un agitador mecánico que simula la agitación manual, este debe tener un brazo de 23 cm de largo que oscile a una frecuencia de 425 f 25 vecedminuto; en un arco de 4.5 cm. Continuar agitando hasta que la muestra al enfriarse, presente un aspecto espeso y de consistencia cremosa. Pesar lo mas rápido que sea posible la porción para el análisis.

Material

Vasos de precipitedos de 250 ml Placa caliente. Estufa con regulador de temperatura 83OC. Balanza analltica con sensibilidad de 0.1 mg.

Procedimiento

Pesar de 2-6 g de muestra (1.5-2.5 para muestras saladas) preparada como se indica en , en un vaso de precipitados de 250 ml, a peso constante.

Calentar a baja temperatura en placa, agitando en forma circular. Tener cuidado de que no haya proyecciones de la muestra y que el residuo no se queme. Calentar hasta la casi total expulsión de agua (lo cual se nota porque no se fonna vapor de agua en las paredes del vaso y la grasa queda msparente) y colocar en la estufa a 830C durante I hora. Enfriar en desecador, pesar rápidamente.

Cdlculos

%de Humedad = [(Vm - Vs) * PM] * 100

En donde:

Vm = Peso del vaso con muestra.

PM = Peso de la muestra. V s = Peso del vaso con muestra desecada.

Material.

Agitador de vidrio de 8 X 150 mm Placa caliente Probeta de 50 ml Estufa con regulador de temperatura, 830C Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg

Reaciivos

Éter de W l e o (P.E. 30-36OC). Grado Reactivo.

Procedimiento

AI residuo de la determinación de humedad, agregar 50 ml de &ter de petróleo, mezclar perfectamente u t i l i d o un agitador de vidrio.

Dejar reposar para que las sustancias que no son solubles en el éter se sedimente; desechar decantando la solución de éter de petróleo (es importante que las decantaciones se hagan con cuidado con el propósito de no arrastrar partfculas del sedimento). Repetir la extracción 2 veces mas, utilizando 15 ml en cada ocasión.

Evaporar los residuos del disolvente en placa caliente a baja temperatura, colocar el vaso en la estufa por 1 hora, enfnar en desecador y pesar dpidamente.

C~lculos

% de Grasa = [(Vs - Vg)/PM] 100

En donde:

Vs = Peso del caso con muestra desecada. Vg - Peso del vaso desecado sin grasa. PM = Peso de la muestra.

50

N DE S-

Sobre la muestra sometida a calentamiento (eliminación del contenido de agua), tratada con disolvente orgánico (eliminación del contenido de grasa). Se obtiene un residuo de materiales insolubles; que por medio de cálniios se reportan como sólidos no grasos.

Cálculos.

% de sólidos no grasos = [(Vg

En donde:

Vg = Peso del vaso desecado sin grasa. Vv = Peso del vaso vacío. PM = Peso de la muestra.

Material

Bureta de 225 ml graduada en décimas Pipeta volumetrica de 1 ml Vasos de precipitados de 250 ml Balanza analltica con sensibilidad de O. 1 mg

Vv)/PM] * 100

Reactivos

Solución valorada de hidróxido de sodio 0.1 N. Solución alcohólica de fenolhleina al 1%

Procedimiento

Pesar 18 g de muestra preparada como se indica en , en un vaso de precipitado de 250 ml. Agregar 90 ml de agua (previamente calentada), agitar perfectamente y enfriar a aproximadamente 66OC. Agregar 1 ml de la solución indicadora de fenolfialeina y titular con la solución de hidróxido de sodio hasta la obtención de un color rosa pálido uniforme en la fase acuosa.

NOTA: El color rosa en la mezcla debe mantenerse unifonne. Un periodo máximo de 3 minutos en la titilaci6n es recomendado.

51

i, Calculos

% de acidez en Acido láctico = [(V*N*O.O9)/PM] * 100

En donde:

V = mi de hidr6xido de sodio O. 1 N requeridos en la titilacibn. N =Normalidad dela solución de hidróxido de sodio. 0.09 = Miliequivalente del Acido láctico. PM = Peso de la muestra.

QUESOS

Pasar la muestra sin corteza 3 veces a naves de un cortador de alientas (este procedimiento es el mas indicado) o wrtm o desmenum la muestra finamente y mezclar perfectamente.

Con los quesos, crema cottage y quesos similares, proceder de la siguiente manera: poner de 300-600 g de muesira, que este a una temperatura aproximada de 1S0C, en el vaso de una licuadora de 1 litm y mezclar por unos minutos (2-5) para obtener una mezcla homogénea. La temperatura final deberá ser de 2SoC aproximadamente.

I- F P

Material

Cipsula para humedad o cristalizador de vidrio de 4.0 cm de alto por 8.0 cm de diámetro Gasa de hoja doble Desecador, conteniendo material absorbente Pinzas para crisol Balanza analítica son sensibilidad de 0.1 mg Estufa con regulador de temperatura, para mantener a 100-i02°C -

Procedimiento

Cortar un círculo de gasa del tamaiio del fondo del cristalizador, colocar en este y dejar en la estufa

Distribuir perfectamente sobre toda la gasa de 2-3 g de muestra finamente molida. Regresar el cristalizador a la estufa y mantener ahí por 4 horas (Cuando el material presente alto

contenido de agua, mantener en la estufa de 16-18). Despues de transcurrido este tiempo, dejar enfriar el cristalizador en un desecador v oesar.

hasta peso constante, sacar de la estufa, enfiiar en un desecador y pesar.

I .

C&lCUlOS

%de Humedad = [(CM - CMS)/PM] 100

En donde:

CM = Peso del cristalizador con muestra húmeda en gramos CMS = Peso del cristalizador con muestra seca en gramos PM = Peso del muestra en gramos.

z)

Material

Crisol de porcelana de 4 cm de diámetro x 5 cm de altura Panilla eléctrica Desecador

Mufla con pirómelro acoplado Baianza analítica con sensibilidad de O. 1 mg

Pinzas para crisol

Procedimiento

En un crisol a peso constante pesar de 3-5 g de muestra preparada como se indica en, colocar en un baño de agua, secar aproximadamente una hora (si el contenido de grasa es alto, colocar una pequefla cantidad de algodón absorbente en el crisol). Colocar en una parrilla y quemar lectamente para evitar proyecciones hasta que ya no haya desprendimiento de humos. Completar la calcinación en una mufla a 55OoC. Dejar enfriar en un desecador y pesar.

Cdlculos

% de Cenizas = [E', - P&'Ml* 100

En donde:

P, =Peso del crisol con cenizas en gramos P, = Peso del crisol vacío a peso constante en g m o s P3 = Peso de la muestra en gramos

TODO FAOíROESE-GOTTLIEB)

Reactivos

Hidróxido de amonio. Grado Reactivo. Alcohol etilico. Grado Reactivo. Eter de petr6leo G.R. (P.E. 30-6O0C). Eter etllico G.R. (Libre de peróxido).

I -

Material

Tubos de extracción Roehring Mojonnier. Vasos de precipitados 100 ml. Probetas Agitadores de vidrio Pipetas de IO ml, graduadas Vidrios de reloj Perlas de vidrio Balanza analitica con sensibilidad de O. 1 mg Baño de agua con sistema eléctrico pani control de temperatura o placa caliente con termostato

Procedimiento

Pesar 1 g de muesira preparada como se indica en, con aproximación al mg en un vaso de precipitados de 100 ml, agregar 9 ml de agua y 1 ml de hidróxido de amonio.

Mezclar para hacer una pasta homogenea y calentar en parrilla cerrada a baja temperatura hasta que la casefna se ablande. Agregar IO ml de ácido clorhidrico y varias perlas de vidrio o cualquier otro material inerte previamente a la digestión con ácido p m prevenir las proyecciones. Tapar el vaso con vidrio de reloj.

Digerir suavemente 5 minutos o colocar el vaso en un baño de agua hirviente durante 20 minutos. Enfriar y transferir a un tubo de Roehrhg o Mojonnier, lavar el vaso con l h l de alcohol etilico pasando los lavados al tubo que contiene la muestra, tapar y agitar vigorosamente. Agregar 25 ml de éter etílico, tapar y agitar vigorosamente por 60 segundos. Agregar 25 ml de éter, tapar y agitar vigorosamente por 60 segundos. Agregar 25 ml de éter de petr6leo. tapar y agitar vigorosamente por 660 segundos. Dejar reposar hasta que el liquido superior este prácticamente claro (Si el tubo es de Mojonnier centrifugar a una velocidad cercana a 600 rpm por 20 minutos o hasta que las fases se separen.)

Decantar la capa etérea en un vaso de precipitados lavando el labio y el tapón del tubo con una mezcla de partes iguales de los dos éteres. Agregar estos lavados al vaso. Repetir la extracción del liquido sobrante en el tubo, dos veces mas utilizando 15 ml de cada disolvente en cada ocasión y agregando agua si fuese necesario pero sin hacer los lavados del labio y tapón con la mezcla de disolventes.

Evaporar los disolventes del vaso en una placa caliente o un baño de agua caliente evaporación, cuidando que no se proyecte o derrame la solución: desecar la grasa extraida a la temperatura del agua a ebullición cuando se utilice un baño y después en la estufa a 102 I2OC o al vacio a 70-75OC con presión menor de 50 mm de Hg. Enfriar en desecador y pesar el vaso ya Mo.

Extraer la grasa del vaso ya pesado, utilizando de 15-25 ml de éter de petróleo caliente; volver a desecar el vaso como se indico antes y pesa después cuando este Mo.

>

54

CAlculos

% de Grasa = [(PI - P,)/PM] * 100

En donde:

P, = Peso del vaso con muestra desecada. P,= Peso del vaso después de extraer la grasa P M = Peso de la muestra.

NOTA Corregir el peso de la grasa por la determinación de un blanco de reactivo. Si el blanco es mayor de 0.5 mg purificar o reemplazar estos reactivos. Las diferencias en las determinaciones por duplicado practicadas por el mismo analista debe ser mas o menos variable en 0.OSg de grasa por 100 gramos de producto.

Material

Matraz de Kjeldahl de 800 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml Bureta de 50 ml Probeta

Balanza analtica con sensibilidad de 0.1 mg Digestor-destilador de Kjeldahl

,i Cuerpos de ebullici6n

Reactivos

Ácido sulfúrico. Grado Reactivo. Sulfato de cobre. G.R. Gra¡¡¡¡Ia de G c . G.R. Sulfato de sodio anhidr0.G.R. Ácido b6rico al 4% en agua. Soluci6n de hidróxido de sodio G.R. 1: 1 mlv. Ácido clorhidrico 0.1 N. Indicador de Wesslow.-Rojo de metilo al 0.2% en un mezcla de 60 ml de etanol y 40 ml de agua. Azul de metileno al 0.2% en agua. Mezclar 2 partes de rojo de metilo con 1 parte de azul de metileno.

55

Procedimiento

Pesar 2 g de muestra preparada como se indica en y pasar a un matraz de Kjeldahl, agregar 2 g de sulfato de cobre, I O g de sulfato de sodio anhidro, 25 ml de ácido sulfirico y unos cuerpos de ebullición. Colocar el matraz en el digestor y calentar cuidadosamente a baja temperatura, hasta que todo el material este carbonizado y aumentar gradualmente la temperatura hasta que el contenido del matraz este completamente claro, dejar por 30 minutos mas. Dejar enfriar y agregar 400 ml de agua destilada, para disolver completamente el residuo del matraz; dejar enfriar, agregar 6-7 granallas de zinc y estratificando y sin agitar, agregar 50 ml de solución de hidróxido de sodio. Conectar el matraz al destilador y recibir el destilado en un mairaz Erlenmeyer de 500 que contenga 50 ml de ácido b6rico y unas gotas de indicador de Wesslow (la parte terminal del tubo del destilador debe estar dentro del ácido). Destilar hasta aproximadamente 300 ml, retirar el matraz y titular con ácido clorhídrico O. I N.

-1

7)

a =.

Calculos =m

%de Proteínas = [(V*N*O.O14*100)PM] * 6.38 En donde:

V = ml de ácido clorhídrico kO.l N requeridos en la titilación. N =Normalidad del ácido clorhídrico. PM = Peso de la muestra. 6.38 = Factor para convertir nitrógeno a proteínas de la leche.

a =a

3d) DE

a Material

Vaso se de precipitados de 250 ml Embudo de filtración de 9 cm de dibetro Pipeta volumétrica de 25 ml Bureia de 25 ml graduada en decimas

Papel filtro Whatman No. 1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml

a ib ~ Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg

Reactivos

Soluci6n de hidr6xido de sodio O. 1 N. Soluci6n alcoh6lica de fenolftaleina al 1%.

56

Procedimiento.

Pesar 10.0 g de muestra preparada como se indica en un vaso de precipitados de 250 mi. Agregar agua (calentada a 40°C hasta completar un volumen de 105 ml. Agitar vigorosamente y filtrar.

Pipetear 25 ml del filtrado (esto representa 2.5 g de muestra) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml, agregar unas gotas de indicador y titular con la solución de hidróxido de sodio, hasta la aparición de un color rosa pálido que persista por un periodo de 30 segundos.

CBlCUlOS

% de Acidez en ácido láctico = [(V'N*0.09)/2.5] * 100

En donde:

V= ml de hidróxido de sodio 0.1 N requeridos en la titilación. N =Normalidad del hidróxido de sodio. 0.09 = Miliequivalente del ácido láctico. 2.5 =Equivalente en peso del volumen de la muestra.

CREM S - Antes de separar las submuestras para las pruebas, mezclar las muestras por sacudimiento, vaciado o

agitacidn (o utilizando un homogenizador de mano) hasta que se pueda vaciar fácilmente y forme una emulsión uniforme. Si la muestra es muy p e s a , calentar a 30-35OC y mezclar. En el caso de presentar grumos o tenga mantequilla separada, calentar la muestra aproximadamente a 38OC, colocando en un baíío de agua caliente (temperaturas mayores de 38OC pueden ocasionar la separación de aceite especialmente en las cremas ligeras). Mezclar perfectamente las porciones parta el análisis y pesar inmediatamente.

S TOT-

Material

Cápsula de níquel de 5 cm de diámetro Pinzas para crisol Gasa Desecador Estufa con regulador de temperaturas, 98-1OO0C Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg

57

P

P P P P P

Procedimiento

Pesar 2-3 g de muestra preparada como se indica en dentro de una chpsula de níquel a peso

Colocar la cápsula en un baño de vapor por un periodo de 10-15 minutos o hasta sequedad; llevar la constante que contenga una pequefla cama de gasa.

cápsula a la estufa y secar durante 3 horas a 98-1OO0C. Enfriar en desecador y pesar el residuo rápidamente.

CáICUlOS

% de sólidos totales = [(Pi - P,)PM] * 100

En donde:

PI = Peso de la cápsula con la cama de gasa. P2 =Peso de la cápsula con residuo seco. PM = Peso de la muestra.

Reactivos

Hidróxido de amonio. Grado Reactivo. Alcohol etilico. Grado Reactivo. Eter de petróleo G.R. (P.E. 30-6OoC). Eter etilico G.R. (Libre de peróxidos).

Material

Tubos de extracción Roehring Mojonnier. Vasos de precipitados 100 ml. Probetas Agitadores de vidrio Pipetas de 10 ml, graduadas

~ Vidrios de reloj Perlas de vidrio Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg BaAo de agua con sistema eléctrico para control de temperatura o placa caliente con termostato

Procedimiento

Pesar 5 g de muestra preparada como se indica en un tubo de extracción de grasa, diluir con agua

Agregar 1.25 ml de hidróxido de amonio (2 ml si la muestra se encuentra agria), mezclar destilada hasta 10.5 ml y mezclar.

perfectamente. Agregar IO ml de alcohol etllico y agitar perfectamente.

sa

Agregar 25 ml de éter etílico, tapar y agitar vigorosamente durante 1 minuto (dejar enfriar se es necesario), agregar 25 ml de éter de petróleo, agitar nuevamente 1 minuto. Centrifugar el tubo de extracción a 600 rpm o dejar reposar hasta que el liquido superior se encuentre completamente claro.

Decantar la capa etérea en un vaso de precipitados de IOOml, lavando el labio del tubo y el tapón con una mezcla de partes iguales de los disolventes (agregando al mismo vaso).

Repetir la extracción del liquido sobrante del tubo, dos veces mas utilizando 15 ml de cada disolvente en cada ocasión y agregar agua si fuese necesario, pero omitiendo lavar con la mezcla de disolvente después de la extracción final.

Evaporar los disolventes en baño de agua a una temperatura apropiada que permita la eficiente evaporación, teniendo cuidado de no permitir al proyección o derrame de la solución.

Desecar la grasa extraída a la temperatura de agua a ebullición cuando se utilice un baRo y después en la estufa a 102 f 2OC o al vacío a 70-75OC con presión menor de 50 mm de Hg. Enfriar en desecador, pesar el vaso ya frío.

Extraer la grasa del vaso ya pesado utilizando 15-25 ml de éter de petróleo caliente; volver a desecar el vaso como se indico antes y pesar despubs cuando este frfo.

Cglculos

% de Grasa - [(PI - P@Ml 100

En donde:

PI = Peso del vaso con muestra desecada. P2 = Peso del vaso despues de extraer la grasa. PM = Peso de la muestra.

Material

Agitador de vidrio de 8 cm Vaso de precipitados de 50 ml Embudo de filtración de 6 cm de dihetro Tubo de ensaye de 16 o I 8 X 180 mm. Papel filtro Whatman No. 1 Pipeias graduadas de 5 y 10 ml Balanza analítica con sensibilidad de O. 1 mg

Reactivos

Acido Nítrico concentrado. Grado Reactivo Solución ácida de Hg (No.3)2. Disolver 1 g de Hg en 1.42 ml de " 0 , y diluir esta solución a 2 5 veces su volumen con agua. Solución acuosa saturada de ácido pícrico.

59

'e;.

Procedimiento

Medir I O ml (IO g) de muestra preparada como se indica en un vaso de precipitados de 50 ml, agregar I O ml de solución iicida de nitrato de mercurio. Agitar la mezcla, agregar 20 mi de agua destilada y agitar. Dejar reposa 5 minutos y filtrar (si hay mucha gelatina presente, el filtrado ser opalescente y no podrá obtenerse completamente claro).

Tomar una porción del filtrado, en un tubo de ensaye y agregar un volumen igual de solución acuosa saturada de ácido plcrico.

En presencia de cualquier cantidad considerable de gelatina se produce un precipitado amarillo; cantidades mas pequeflas, serán identificadas por una turbidez en la solución.

NOTA: Muchas muestras, con o sin cuajo y libres de gelatina, dan distintos precipitados cuando son tratados con este método, estos precipitados difieren en caracterlsticas producidas por el ácido pícrico con gelatina.

El precipitado de gelatina-ácido picric0 es dividido fmamente ya que as1 esta mas apto para mantenerse en suspensión, se sedimenta lentamente y se adhiere fuertemente a los lados y al fondo del contenedor, del cual es dificil se separar.

El precipitado producido por el ácido plcrico en ausencia de gelatina es floculento, se separa rápidamente (dejando en suero prácticamente claro), no se adhiere a las paredes del contenedor y es fácilmente removido, lavando con agua.

Material

Bureta graduada de 50 ml Cápsula de porcelana de 8 cm de diámetro Pipeta volumCtrica de 2 ml Pipeta graduada de 10 ml Balanza analítica son sensibilidad O. I mg

Reactivos

Indicador de fenolftaleina. Disolver 1 g de fenolftaleina en 1 10 ml de alcohol etílico (95% V N y agregar solucibn de NaOH O. 1

N hasta que una gota de una coloración rosa que desaparece dpidamente. Llevar a 200 ml con agua destilada.

Solución patrón de acetato de rosanilina.

de ácido acético glacial. Llevar a 100 ml con alcohol etllico. Almacenar en recipiente Bmbar.

Solución diluida de acetato de rosanilina.

Disolver 0.12 g de acetato de rosanilina en 50 ml de alcohol etllico (95% V.V) que contenga 0.5 mi

Diluir 1 ml de la solución patrón a 500 ml de la mezcla alcohol etílico-agua destilada (1:l).

60

Procedimiento

Pesar I O g de muestra preparada como se indica en cada una de dos cápsulas de porcelana. A una de ellas, agregar I O ml de agua y 2 ml de solución diluida de acetato de rosanilina, agitar. Esta cápsula servirá como blanco. A lo otra cápsula agregar 2 ml de solución de fenolftaleina y titular con hidróxido de sodio 0.1 N.

Agitando continuamente hasta la aparición de un color rosa que persista por 30 segundos.

Cálculos

%de acidez (ácido láctico) = [(V8N’0.09)¡PM] * 100

En donde:

V = ml de NaOH 0.1 N requeridos en la titilación. N =Normalidad de la solución de NaOH. 0.09 = Miliequivalente del ácido láctico. PM = Peso de la muestra.


P Preparar como se indica en I. del apartado de Tecnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

Seguir las indicaciones señalas en I1 del apartado de T6cnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

NOTA: Esta cuenta se aplica a cremas, helados, quesos fundidos y para untar; mantequilla y margarina de mesa que no han sido adicionadas de cultivos Iácticos. No se efechia en quesos, leches y cremas ácidas o mantequillas en las que se han utilizado en su elaboración diversos cultivos lácticos. Incubar las cajas en posición invertida a 32-35°C por 48 horas.

61

--

a

MOS COLIFORMES FECALES

Seguir las indicaciones seflalas en IV del apartado de Técnicas Generales Para Analisis Microbiologico.

Seguir las indicaciones seflalas en V del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

NOTA: Esta determinación se aplica a quesos (excepto aquellos que han sido madurados con hongos), mantequillas y leches acidificadas; se puede aplicar a helados hechos con frutas naturales o nueces. Dejar solidificar e incubar las cajas en posici6n invertida a 22OC.

Seguir las indicaciones seflalas en VI del apartado de Técnicas Generales Para Analisis Microbiologico.

NOTA: Esta determinación se aplica a crema para pasteles, quesos (principalmente frescos), postres preparados a base de leche como: flanes, gelatinas o natillas. Invertir las placas e incubar por 45-48 horas a 3 5 T Coagulasa. Incubar en un baíio de agua de 35-37°C y observar a intervalos de una hasta seis horas, si no hay formación de coágulos, observar a las 24 horas. Termonucleasa. Calentar por 25 minutos 0.3 ml de cultivo en BHI en baño de agua hirviendo. Incubar en ctimara humeda durante 4 a 24 horas a 35OC.

Seguir las indicaciones seflalas en 7 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiologico

NOTA: Esta determinación se efectúa a quesos (principalmente frescos) y se puede aplicar a helados u otros a l i e n t o lácteos como flanes, natilla, etc., en caso de que la inspecci6n advierta un peligro por las condiciones de conservación de la materia prima, higiene etc., y en casos de brotes en los que este involucrado este tipo de productos. Preenriquicimiento. Incubar a 35°C por 24 horas. Enriquecimiento. incubar a 45'c por 24 horas.. Aislamiento. incubar a 35°C por 24 horas. Identificación Bioqulmica. Incubar pro 24 horas a 35°C.

62

BIBLIOGRAFIA

, México, D.F., 1989. - Laboratorio Nacional de Salud Publica, , . , . , Pane 11, México, - Laboratorio Nacional de Salud Publica,

D.F., 1989. - Laboratorio Nacional de Salud P u b l i c a J & a d k D m i c a s v P r o c p -,México, D.F., 1989.

' I . a I . . . . . . .

IV. PESCADO EN FRESCO

ANÁLISIS FISIQUIMICO

S E N S O W

1. Observar el color y olor del producto, asi como su aspecto y consistencia, anotar las observaciones; indicar en que fase se encuentra este producto.

2. Apariencia General.

si es opaco, amarillento con mal olor, etc.

lateral o de color olivo claro en la parte dorsal.

Observar si la superficie de la piel es lustrosa, con reflejos brillantes, con mucus tnuisparente, o bien

Observar si las escamas presentan un brillo plateado iridiscente, con tonos dorados debajo de la línea

Cuando el pescado ha perdido su frescura, el color de las escamas se toma oscuro, grisheo y además se pierde la firmeza en la implantaci6n de las escamas en la piel, es decir se desprenden con facilidad.

Aunque es preciso mencionar que hay ciertas variaciones, según la especie, en relaci6n a las escamas, por ejemplo, la pescadilla anchoveta, anchoita, etc. tienen las escamas implantadas flojamente en su estado fresco. A su vez, en especies como la corvina negra, las escamas conservan una fuerte adherencia a la piel, aun en estado de putrefacción avanzado.

3. Apariencia de los Ojos. Observar cuidadosamente la apariencia de los ojos, y determinar si es cóncavo ptano o convexo. Cuando el pecado es fresco, la órbiu del ojo se encuentra llena, cbncava, prominente, con la pupila

negra y la cornea transparente. Las arterias de las comeas se ven con claridad y no desaparecen cuando se efectiia presi6n sobre ellas.

Sin embargo este aspecto tiene poca duración, después de que se ha sacrificado, situaci6n que h i t a el valor de esta evaluacibn.

A las 24 horas de muerto, comienza la opalescencia de la cornea y a las 48 horas, el ojo ya se encuentra hundido, debido a la deshidrataci6n del colch6n grasoso que lo soporta.

4. Características del olor. Determinar el olor del pescado con base en el siguiente criterio: Mientras el pescado es fresco, retiene un olor suigéneris, que no resulta desagradable; pero cuando

comienza su descomposici6n, como consecuencia de la actividad microbiana o por degradación proteinica, se liberan sustancias amoniacales volhtiles que le imparten mal olor.

h m ,, ,- .. .. . . ... ,...., . . . . .. . . I .

64

5. Apariencia de las Branquias o Agallas.

rojo brillante. o bien en algunas especies un color rojo pálido u oscuro.

horas el color se toma gris y el mucus pegajoso mal oliente.

Apreciar la apariencia de las branquias considerando que el pecado fresco tiene branquias de color

El color de las branquias empieza a perderse a las 24-48 horas del sacrificio del animal. Entre 36-48

6. Coloración de la Columna Vertebral.

a lo largo de la columna vertebral de la muestra proporcionada. A través de corte longinidinal en la parte ventral superior del pescado, Observar el color de la sangre,

7. Consistencia del músculo.

hundimiento.

anaquel, la musculatura se toma mas fl9cida.

Presionar con el dedo indice, diversos puntos del cuerpo del pescado y observar si se presenta

En pescado fresco no existe hundimiento del músculo, en cambio conforme avanza la vida de

Material

Potenciómetro Vaso de p.p. de 150 ml Licuadora

Reactivos

Solución buffer esiándar, con pH entre 6 y 8.

Procedimiento

Pesar IO g de muestra, colocarla en el vaso de la licuadora y agregar 100 ml de agua recientemente hervida a 25OC. Licuar hasta que haya incorporación (30 segundos). Vaciar el contenido en el vaso de p.p. y determinar el pH inmediatamente, usando el potenciómetro ya calibrado por la solución buffer.

65

. .

a a

a a

~ 1 6 ~ DE TRIMETILAMINAOTOCOLORIMETRIA

Material y equipo

Espectro fotómetro Celdas Bauch and Lomb Mortero con pistilo Pipetas voluméiricas de 20 ml Matraz aforado de 100 ml Papel filtro poro medio 3 tubos de ensaye con tapón de baquelita.

Reactivos

Acido tricloroacético 10% Carbonato de poiasio al 50% Tolueno Acid0 picrico (0.02 g en 100 mi de tolueno) Sulfato de sodio anhfdro Formaldehido (Agitar con carbonato de magnesio y diluir con 3 volúmenes de agua)

Procedimiento

1. Macerar en un mortero con pistilo, 5 g de muestra suspenderla en 15 ml de agua destilada. Afladir 20 ml de 4.cido tricloroacético, macerar un poco mas.

2. Incorporar cuantitativamente esta mezcla, en un matraz aforado de 100 ml y llevar el aforo con agua destilada; agitar y dejar reposar 1 minuto. Filtrar con papel filtro de poro medio.

3. Tomar 2 ml del filtrado en un tubo de ensaye con tapón de rosca y afíadir 1 ml de formol, IO ml de tolueno y 3 ml de carbonato de potasio al 50%, tapar y agitar en vortex durante 30 segundos con el objeto de pasar las aminas a la fase orgánica.

4. Tomar una alicato de 5 ml de la fase orgánica y llevar a un tubo de ensayo con tapón de baquelita, agregar 0.3-0.4 g de sulfato de sodio y decantar sobre otro tubo de ensayo conteniendo 5 mi de ácido plcrico observándose el desarrollo de un color amarillo.

C~lculos.

Leer en el espectrofotómetro a 410 nm e interpolar en una curva tipo, elaborada con concentraciones variables de trimetilamina, equivalentes a un intervalo de 0.002 a 0.02 mg de nitrógeno, tratada de igual manera que la muestra.

66

ANÁLISIS MICROBIOLOGIC0 - Preparar como se indica en 1. del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

Seguir las indicaciones señalas en I1 del partado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

NOTA: Incubar por 72 horas a 32%

Seguir las indicaciones seflalas en III del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

Seguir las indicaciones seflalas en IV del apartado de Tkcnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

Seguir las indicaciones seflaladas en VI1 del apartado de Tecnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

Seguir las indicaciones seflaladas en VI1 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

BIBLIOGRAFIA

-Peanon, D., -is of Foods , 6 ih edition, J and A. Ed. Churchill, LTD. London, 1962. -OMS, Nom as , Tomo I y 11, 1967 . .

68

' . . ',>

2 c f

67

V. CARNE EN FRESCO


Para prevenir la perdida de agua durante la preparación subsecuente manejo no se deben usar muestras pequeflas (La cantidad mlnima aceptable es de 500 9). Guardar el material molido en recipientes de vidrio o similares con tapas herméticas que la protejan del aire y del agua.

Separar completamente hasia donde sea posible cualquier porción de hueso, pasar rápidamente tres veces a traves de un molino de alimentos con placas da apróximadamente 3 mm de abertura, mezcla perfectamente después de cada molienda y comenzar todas las determinaciones lo mas rápido posible. Si ocurriera cualquier demora, congelar la muestra para inhibir la descomposición (-2 a -4OC).

a# * aB

Material

Cápsula para humedad o cristalizador de vidrio de 4.0 cm de alto por 8.0 cm de diámetro Gasa de hoja doble Desecador, conteniendo material absorbente Pinzas para crisol Balanza analítica son sensibilidad de O. 1 mg Estufa con regulador de temperatura, para mantener a 100-102°C

* * =ax) Procedimiento

Cortar un círculo de gasa del tamaño del fondo del cristalizador, colocar en este y dejar en la estufa

Distribuir perfectamente sobre toda la gasa de 2-3 g de muestra fuiamente molida. Regresar el cristalizador a la estufa y mantener ah1 por 4 horas (Cuando el material presente alto

contenido de agua, mantener en la estufa de 16-18). Después de transcurrido este tiempo, dejar enfriar el cristalizador en un desecador y pesar.

hasta peso constante, sacar de la estufa, enfriar en un desecador y pesar. 33 =69 ZB

Calculos = % de Humedad = [(CM - CMS)PM] * 100

En donde: .-

CM = Peso del cristalizador con muestra húmeda en gramos CMS = Peso del cristalizador con muestra seca en gramos PM = Peso del muestra en gramos. 33

Material

Potenciómetro Vaso de p.p. de 150 ml Licuadora

Reactivos

Solución buffer esthdar, con pH entre 6 y 8.

Procedimiento

Pesar IO g de muestra, colocarla en el vqso de la licuadora y agregar 100 mi de agua recientemente hervida a 25'C. Licuar hasia que haya incorporación (30 segundos). Vaciar el contenido en el vaso de p.p. y determinar el pH inmediatamente, usando el potenciómetro ya calibrado por la solución buffer.

ANhISIS MICROBIOLOGIC0

P Preparar como se indica en I. del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

Seguir las indicaciones seiíalas en I1 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

NOTA: Incubar las cajas en posición invertida a 32'C por 72 horas

SMOS C O L I F O R W

Seguir las indicaciones señalas en 2 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

DE ORGANISMOS COLIFORMES F E W

Seguir las indicaciones señalas en IV del apartado de Tkcnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

Seguir las indicaciones seflaladas en VI1 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

BIBLIOGRAFIA -A.O.A.C. -Laboratorio Nacional de Salud Publica, ' , México, D.F., 1989. -Laboratorio Nacional de Salud Publica, p o s v Flsico ProductosCBmicos, Mexico, D.F., 1983.

' , 13 th edition, 1980.

. . . . .

71

VI. FRUTAS Y HORTALIZAS EN FRESCO

Las partidas o lotes de fmtas propias para el consumo deberán estar constituidas por frutas procedentes de especies vegetales legitimas y sanas, que satisfagan las siguientes condiciones minhas, excepto casos especiales:

a) Deberán ser frescas, de reciente cosecha para el consumo inmediato.

b) Deberán haber llegado al grado máximo de evolución, del tamaño, aroma, color y sabor propios de la especie y variedad.

c) Deberán presentar grado de maduración tal que les permita soportar la manipulación, el transporte y la conservación en condiciones adecuadas.

d) De- ser cogidas cuidadosamente a mano y no deberán estar golpeadas o dafladas por cualquier lesión de origen fisico o mecánico que afecte su apariencia.

e) Deberán estar sanas, libres de insectos, parhitos, hongos y microorganismos que les causen daños o detaloro.

f ) No pod& contener substancia terrosa, suciedades o cuerpos extraños adherentes a la superficie de la cáscara que les causen daílos y las desfiguren total o parcialmente.

g) Deberán estar exentas de humedad externa anormal, olor y sabor e x m o s , ramos y hojas.

h) Deberán estar libres de residuos de fertilizantes y plaguicidas

i) No pod& presentar hendiduras o grietas recientes en la cáscara, perforaciones, cortes y magulladuras. La pulpa y el pedúnculo deberán estar mtactos y fmes.

j) Las frutas deberán corresponder a las indicaciones de calidad constatadas en el rotulo

k) Los vehlculos donde serán transportadas las frutas, no podrán ser utilizados para otros fmes de transporte que pueden poner en peligro su higiene, como estiércol, aves, animales y otros.

Las frutas deberán ser acondicionadas de manera que queden protegidas y ventiladas adecuadamente. Las caracterlsticas organolépticas de las frutas no deberán ser alteradas por el material del envase. Cuando en el rotulo sean utilizadas impresiones topográficas, estas no deberán estar en contacto con las frutas. E l contenido de cada lote o caja de frutas deberá ser uniforme y en el mismo grado de madurez. Los cajones o embalajes deberán estar completamente limpios, libres de mohos, de residuos de tierra y suciedades. Los cajones y cajas para embalaje deberán ser de madera ligera y resistentes a los golpes; la madera deberá ser pobre en resina y no deberá comunicar a las frutas olores y sabores exiraños. El envase debera ser de material resistente a la acción de las frutas.

Las frutas de acuerdo con sus características serán clasificadas en:

a) México Extra. Esta clase deberá ser constituida por frutas de optima calidad, sin defectos, bien desarrolladas y maduras. Las frutas deberán presentar tamaño, color y forma uniformes. Los pedúnculos y la pulpa deberán estar intactos y firmes. No serán permitidas manchas o defectos en la cascara.

12

. . . . ,. .,_ . , . . .. ~. .. .

b) México I . Esta clase deberá estar constituida por frutas de calidad buena, sin defectos serios. Las frutas deberán presentar tamaño, color y forma uniforme. Las frutas deberán estar bien desarrolladas y maduras. Serán tolerados ligeros defectos en la forma, tamaño y color. Las htas podrán presentar ligeras manchas en el epicarpio (cascara), siempre que no perjudiquen su apariencia general. La pulpa deberá estar intacta y firme. El pedúnculo podrá esta ligeramente dañado.

c) Mexico 2. Esta clase deberá estar constituida por frutas de buena calidad pero que no fueron clasificadas en las clases anteriores. Las frutas podrán presentar ligeros defectos en el color, desarrollo y formación, siempre que no perjudiquen su apariencia su apariencia y Conserven sus características. Las frutas no podrán ser de tamaño muy pequeiio. La cascara no podrá estar dafíada siendo no obstante tolerados pequeños defectos o manchas. La pulpa deberá estar intacta. No serán permitidas grietas abiertas en las frutas, pero se& toleradas grietas cicatrizadas.

d) México 3. Esta clase será constituida por fmtas que no fueron clasificadas en las clases anteriores siempre que conserven sus características. No será exigida la uniformidad en el tamafío, color, grado de maduración y forma. Las frutas pueden ser de tamaño pequeño. La pulpa deberá estar intacta, fume y sana. Serti tolerada la falta de pedúnculo. No serán permitidas grietas abiertas, pero serán toleradas las grietas cicatrizadas, defectos y manchas en la cascara. Las frutas de esta clase serán utilizadas en confiterla.

Los lotes de hortalizas aptas para consumo, deberán ser procedentes de especies vegetales legitimas y sanas que, satisfagan las siguientes condiciones mínimas:

a) Deberán ser frescas, de cosecha reciente, para el consumo inmediato. Deberán cosecharse de preferencia en la madrugada y abrigadas inmediatamente de los rayos solares y del viento fuerte.

b) Deberán ser recogidas al conseguir su grado normal de evolución y ser presentadas al consumo en perfecto estado de desarrollo, tamaño, aroma y color propios de la especie y variedad.

c) Deberán ser sana, libres de enfermedades, insectos, parásitos y hongos que les causen dafíos o deterioro.

d) No deberán estar dafladas por cualquier lesión de origen fisico o mecánico que afecte su apariencia.

e) Deberán estar libres de la mayor parte posible de tierra adherida.

f, No deberán estar libres contener suciedades o cuerpos extraAos adheridos a su superficie.

g) Deberán estar exentos de humedad externa anormal, olor y sabor extraños

h) Deberán estar libres de residuos de fertilizantes y plaguicidas.

i) Deberán presentarse intactas y firmes.

j) Deberán corresponder a las indicaciones de calidad constatadas en el rotulo.

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j) Los vehículos en serán transportadas las hortalizas no podrán ser utilizados para otros fines de transporte que puedan poner en peligro su higiene, como estiércol, aves, animales y otros.

Las hortalizas deberán ser acondicionadas de manera que queden protegidas, ventiladas adecuadamente y al abrigo de contaminaciones. Las Características organolépticas de las hortalizas no deberán ser alteradas por el material del envase. Cuando en el rotulo sean utilizadas impresiones topográficas, estas no deberán estar en contacto con las hortalizas. El contenido de cada lote o caja de hortalizas, deberá ser uniforme y contener honalizas del mismo origen, variedad, calidad, y del mismo grado de desarrollo. El envase deberá estar completamente limpio, libres de mohos, de residuos, de tierra y suciedades. El envase deberá estar completamente limpio, libres de mohos, de residuos, de tierra y suciedades. El envase deberá ser de material resistente a la acción de las hortalizas.

Las hortalizas, de acuerdo con sus características, senin clasificadas en:

a) México Extra. Esta clase estar constituida por hortalizas de optima calidad, bien desarrolladas, Compactas y fumes. No serán permitidos defectos en las hortalizas de esta clase. Deberá haber uniformidad en la coloración, tamaño y forma.

b) México I . Esta clase estar constituida por hortalizas de buena calidad, bien desarrolladas, compactas y fumes. Las hortalizas deberán presentar coloración uniforme, típica de la variedad. No serán permitidos daños en las hortalizas que alteren su forma y apariencia, sin embargo serán tolerados ligeros defectos o manchas. No serán permitidos grietas, cortes y perforaciones.

c) México 2. Esta clase estará constituida por hortalizas que no fueron clasificadas en la clase anterior. Serán tolerados ligeros defectos en la forma y ligera decoloración de las hortalizas, siempre que no afecten seriamente sus características. Serán, tambik toIerados pequenos daños de origen físico o mecánico que no causen defectos graves en las hortalizas.

..

UCTO. Y PARTE A LA C p

GRUPO 1. HORTALIZAS DE R A K E S Y TUBERCULOS.

mayoría subterráneos, de diversas especies de plantas. Puede consumirse la hortaliza entera. Alimentos amiláceos derivados de rakes s6lidas ensanchadas, tubérculos, bulbos o rizomas, la

Hortalizas de raices y tub4rculos: remolachas nitabagas zanahorias apio nabo remolacha azucarera nabos batatas chinvias papas a m é rábanos

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PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE S E APLICA EL ANALISIS. Producto entero después de eliminar las coronas. Lavar las rakes o los tubérculos con agua frla

corriente, cepillando con cuidado, si es necesario, con un cepillo suave para eliminar la tierra suelta y otros resto, a continuación, secar con papel de seda limpio mediante ligeros toques. En el caso de las zanahorias, una vez secadas, separar con cuidado las coronas con ayuda de un cuchillo, cortando por la base del tallo en le punto m8s bajo de la unión de los peciolos externos. Si con las coronas quedan anillos de tejido de nilz, se separan de ellas y se recombinan con las raíces.

GRUPO 2. HORTALIZAS DE BULBO. Alimentos de sabor picante derivados de bulbos carnosos y escamosos o yemas de plantas del genero

Allinum de la familia de las lliliáceas (Liliaceae). Puede consumirse el bulbo entero una vez eliminada la piel apergaminada.

Hortalizas de bulbo: puerros ajos cebollas de primavera cebollas

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE SE APLICA EL ANALISIS.

suavemente el producto seco.

piel apergaminada que sea fácil de eliminar.

Eliminar la t i e m adherida, por ejemplo, enjuagando ligeramente con agua comente o cepillando

Cebollas de bulboisecas y ajos: Producto entero tras la eliminación de las rakes, as1 como de toda la

Puerros y cebollas de primavera: Hortalizas entera tras eliminar las rakes y la tierra adherida.

GRUPO 3. HORTALIZAS DE HOJA (EXCEPTO HORTALIZAS DE HOJA BRASSICA). Al ientos derivados de las hojas de una amplia variedad de plantas comestibles (excepto Hortalizas

del Grupo 4), incluidas las hojas de las hortalizas del Grupo I . Puede consumirse la hoja entera. Las hortalizas de hoja de la familia Brassica forman un grupo separado.

Hortalizas de hoja: hojas de remolacha espinacas endivia lechuga hierbas de los canónigos hojas de remolacha cardo suizo hojas de rábano

azucarera

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE S E APLICA E L ANALISIS. ' Producto entero tras eliminar las hojas claramente descompuestas o marchitas.

GRUPO 4. HORTALIZAS DE HOJA BRASSICA. Alimentos derivados de las hojas, tallos y florescencias no maduras de plantas conocidas

comúnmente y clasificadas en botanica como brasicaceas, y que se conocen también como coles. Puede consumirse la hortaliza entera.

Hortaliuis de hoja brassica: brécoles coliflores col rizada coliabos repollo de Milán coles chinas coles coles de Bruselas coles lombardas mostaza de sarepta

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE SE APLICA E L ANALISIS. Producto entero tras eliminar las hojas claramente descompuestas o marchitas. En las coliflores y

brécoles con inflorescencia, analizar solamente la inflorescencia y los tallas, eliminando las hojas; en las coles de Bruselas analizar solamente los brotes.

75

GRUPO 5. HORTALIZAS DE TALLO. Alimentos derivados de los tallos o brotes comestibles de una serie de plantes. Hortalizas de tallo: alcachofas espárragos apio ruibarbo achicoria (witloof)

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE SE APLICA EL ANALISIS. Producto entero tras eliminar las hojas claramente descompuestas o marchitas. En el ruibarbo y los

!j Q p h g o s , solo los tallos. En apio y espárragos limpiar la tierra, por ejemplo enjuagando ligeramente con agua corriente o cepillando suavemente el producto seco.

GRUPO 6. LEGUMBRES. Semillas secas o frescas y vainas no maduras de plantas leguminosas, que se conocen comúnmente

como frijoles, alubias, guisantes o arvejas. Pueden consumirse frescas como vainas enteras o como producto desgranado.

Legumbres: frijoles habas soja frijoles enanos frijoles en vaina maní caupi frijoles verdes frijoles comunes habas de Lima guisantes de

hebra

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE SE APLICA EL ANALISIS Producto entero.

GRUPO I. HORTALIZAS DE FRUTO DE PIEL COMESTIBLES.

consumirse la hortaliza entera. Frutos no maduros o maduros de diversas plantas, por lo general, cepas o arbustos anuales. Puede

Hortalizas de fruto de piel comestible: pepinos pimiento berenjenas quimbombo zapalla patisón tomates

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE SE APLICA EL ANALISIS. Producto entero, previa eliminación del tallo.

GRUPO 8. HORTALIZAS DE FRUTO DE PIEL NO COMESTIBLE.

comestible esta protegida por una piel, corteza o cáscara que se quita y descarta antes del consumo. Frutos no maduros o maduros de diversas plantas, por lo general, cepas o arbustos anuales. La parte

Hortalizas de fruto de piel no comestible: cantalupos melones sandia calabaza amarilla calaba común calabaza confitera

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE S E APLICA EL ANALISIS. Producto entero, previa eliminaci6n del tallo.

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GRUPO 9. FRUTOS CITRICOS. Producidos por árboles de la familia de las rasáceas y se caracterizan por su piel aceitosa y

aromAtica, forma esférica y gajos internos con vesiculas llenas de jugo. La pulpa del fruto puede consumirse en su forma carnosa o exprimida como bebida. Puede emplearse para conservar la totalidad del fruto.

Frutos CftIiCOS: limón naranja toronja mandarina

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE SE APLICA EL ANALISIS. Fruto entero.

GRUPO 10. FRUTAS DE PEPITA. Producidas por árboles relacionados con el género pyms de la familia de las rosáceas (Rosaceae). Se

caracterizan por el tejido carnoso que rodea el corazón del fruto, que consiste en cárpclos apergaminados que encierran las semillas. Exceptuando el corazón, se puede consumir toda la fruta en su forma 6esca o previa elaboraci6n o previa elaboración.

F N ~ de pepita: manzanas peras membrillos

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE S E APLICA EL ANALISIS. Producto entero, previa el¡¡nación del tallo.

GRUPO 11. FRUTAS D E HUESO. Producidos por árboles relacionados con el genero p m u s de la familia de las roshceas (Rosaceae), y

se caracterizan por el tejido carnoso que rodea una única semilla de cáscara dura. Puede consumirse toda la fruta, exceptuando la semilla, en su fonna fresca o elaborada.

FNW de hueso: albaricoques nectarinas cerezas melocotones cerezas agrias cerezas dulces cinielas

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE S E APLICA EL ANALISIS. Producto entero, previa elim¡nacibn del tallo y hueso, pero calcular y expresar el residuo en relaci6n

con el fruto entero sin taiio.

GRUPO 12. FRUTAS PEQUEÑAS Y BAYAS. Se obtiene de una variedad de plantas CUYO fruto se caracteriza por una elevada relación superficie-

FNW pequeiías y bayas: Z BTrnO raS uva arándanos americanos frambuesas fresas arándanos agrios bayas de Logan grosellas

peso. Toda la fruta, en muchos casos incluida la semilla, puede consumirse en su forma fresca o elaborada.

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE S E APLICA EL ANALISIS. Producto entero, previa eliminaci6n del opérculo y el tallo. Grosellas: fruta entera con tallo.

77

.-

I -

GRUPO 13. FRUTAS VARIADAS DE PIEL COMESTIBLE.

regiones tropicales o sub-tropicales. Puede consumirse toda la fruta en forma fresca o elaborada. FNtOs no maduros o maduros de una variedad de plantas, normalmente arbustos o &boles de

Fnitas variadas de piel comestible: dátiles higos aceitunas

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE SE APLICA EL ANALISIS.

el residuo en relación con el producto entero. Higos: fmta entera. Dátiles y aceitunas: producto entero, previa eliminación de tallos y huesos, pero calcular y expresar

GRUPO 14. FRUTAS VARIADAS DE PIEL NO COMESTIBLE. Frutos no maduros o maduros de diferentes tipos de plantas, normalmente arbustos o árboles de

regiones tropicales o sub-tropicales. La pane comestible está protegida por una piel, corteza o cáscara. La fruta puede consumirse fresca o elaborada.

Frutas variadas de piel no comestible:

granadillas pifías mangos guayabas aguacates bananos fruta kiwi papayas

PARTE DEL PRODUCTO A LA QUE SE APLICA EL ANALISIS. Producto entero a no ser que se califique. Piña: previa eliminación de la corona. Aguacate y mango:

producto entero previa eliminación del hueso, pero calculando en relación con la fruta entera. Bananos: previa eliminación de los tejidos de la corona y el tallo.

ODEirlyEsTBEp

1. Material que ha de tomarse. Las muestras de cada lote que ha de ser examinado deberán tomarse por separado.

2. Precauciones que han de adoptarse. En el curso de la toma de muestras primarias y en todos los procedimientos subsiguientes, deberán

adoptarse precauciones para evitar la contaminación de las muestras o cualquier otro cambio que pueda influir perjudicialmente en las determinaciones analíticas o hacer que la muestra de laboratorio no sea representativa de la muestra a granel.

3. Muestras primarias. En la medida de lo posible, estas muestras deberán tomarse de todo el lote. Deberá registrarse toda

desviación de este requisito. En lo posible las muestras primarias deberiin ser de tamaño semejante y el peso total combinado de todas las muestras primarias (muestras a granel) nunca debed ser inferior al necesario para la muestra fmal teniendo presente el posible requisito de una nueva subdivisión y la provisión de muestras de laboratorio adecuadas. El número de muestras primarias que han de tomarse se indica en el siguiente cuadro:

Peso del lote en kilogramos

menor de 50 51-500 501-2000

Número mínimo de muestras primarias que han de tomarse 3 5 I O

1 -*

Para los producto elaborados en latas, botellas, envases u otros recipientes pequeños se podrá seguir el siguiente plan de muestreo, especialmente cuando no se conozca el peso del lote.

4. Preparación de la muestra a granel La muestra a granel se forma uniendo y mezclando muestra primarias.

5. Preparación de la muestra fuial. a) La muestra a granel deberá, posiblemente, constituir la muestra final. b) Si la muestra a granel es demasiado grande, la muestra final podrá prepararse a partir de ella

utilizando un método conveniente de reducción. No obstante, en este procedimiento no deberh cortarse ni dividirse las frutas y hortalizas individuales.

Producto Ejemplos Cantidad mínima requerida Producto pequefíos o ligeros, peso bayas, guisantes (arvejas), 1 kg de la unidad hasta 25 g aceifunas,perejil aproximadamente

Productos del tamaño medio, peso manzanas, naranjas, zanahorias, 1 kg (por lo menos 10 unidades) de la unidad normalmente entre 25 patatas Y 250 g

Producto de tamaño grande, peso coles, melones, pepinos de la unidad superior a 250 g

. 2 kg (por lo menos 5 unidades)

Para información sobre el desarrollo de las técnicas para andisis de Residuos de Plaguicidas de Methods o f Analysis of the Association o f Oficial Analytical Chemists consultar el capitulo 29

(A:O.A.C., 1981), el cual contiene los análisis de los siguientes residuos: Método General para Plaguicidas Organofosforado y Organoclorados Captano Carbarilo DDT Malation Paration ,entre otros plaguicidar de uso común.

I 79

ANÁLISIS MICROBIOLOGIC0

P

Preparar como se indica en I. del apartado de Tecnicas Generales Para Análisis Microbiológico -- Seguir las indicaciones seflalas en I1 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis

Microbiológico.

NOTA: Incubar de 32 OC por 72 horas.

Seguir las indicaciones seflalas en Ill del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

Seguir las indicaciones seflalas en IV de! apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiol6gico.

Seguir las indicaciones seflaladas en VI1 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiol6gico.

Seguir las indicaciones seflaladas en VI1 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiol6gico.

80

BIB L I O G RA F I A

-OMS,

-A.O.A.C. O f f i c i a l d s O f h d Y U ’ . 13 th edition, 1980.

,Tomo I y 11,1967. . . - w, Volumen 2, Suplemento I . 1993.

81

. -

VII. CEREALES Y PASTAS

P Material

Cgpsula para humedad o cristalizador de vidrio de 4.0 cm de alto por 8.0 cm de diámetro Gasa de hoja doble Desecador, conteniendo material absorbente Pinzas para crisol Balanza analítica son sensibilidad de 0.1 mg Estufa con regulador de temperatura, para mantener a 100-102°C

Procedniento

Cortar un círculo de gasa del tamaño del fondo del cristalmdor, colocar en este y dejar en la estufa

Distribuir perfectamente sobre toda la gasa de 2-3 g de muestra fmamente molida. Regresar el cristalizador a la estufa y mantener ahi por 4 horas (Cuando el material presente alto

contenido de agua, mantener en la estufa de 16-18). Después de transcurrido este tiempo, dejar enfriar el cristalizador en un desecador y pesar.

hasta peso constante, sacar de la estufa, enfriar en un desecador y pesar.

Cglculos

% de Humedad = [(CM - CMS)PM] * 100

En donde:

CM = Peso del cristalizador con muestra húmeda en gramos CMS = Peso del cristalizador con muestra seca en gramos PM = Peso del muestra en gramos.

Material

Crisol de porcelana de 4 cm de diámetro x 5 cm de altura Baño de vapor Parrilla eléchica Pinzas para crisol Mufla con pirómetro acoplado Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg

Reactivos

Acido nítrico, grado reactivo Agua destilada

Procedimiento

Pesar de 1-2 g de muestra finamente molida dentro de un crisol de porcelana a peso constante (si el alimento presenta alto contendido de humedad, colocar en un baño de vapor y secar aproximadamente I hora). Colocar el crisol con IG mcesm seca en una parrilla y calcinar lentamente para evitar proyecciones hasta que no haya desprendimiento de humos. Completar la calcinación en una mufla controlada entre 550- 600 durante 1 hora, dejar enfriar la mufla y pasar el crisol a un desecador.

Comprobar que las cenizas sean blancas, en caso contrario para ayudar a completar la calcinación romperlas partículas con un alambre de platino o humedecer el residuo carbonáceo frío con agua destilada o ácido nítrico y proceder como se indica en el párrafo anterior. Completada la calcinación, enñiar en desecador y pesar (se debe de tener cuidado al mover el crisol que contenga cenizas esponjosas ya que tienden a ser arrastradas por el aire con gran facilidad. Para evitar esto, tapar el crisol con un vidrio de reloj a peso constante al momento de pasar al desecador hasta antes de pesar)

c á 1 c u 1 os

%de Cenizas = [(PI - P,)í€'M] * 100

En donde:

PI = Peso del crisol con cenizas en gramos P2 = Peso del crisol vacío a peso constante en gramos P3 = Peso de la muestra en gramos

Aparatos :

Una muffla provista con term6meiro Recipiente para ceniza, preferentemente de Platino o Sílica. Uno relativamente poco profundo, recipiente ancho es deseable.

Procedimiento :

Pesar 3-5 g. (cO.01g.) de muestra bien mezclada dentro del recipiente de ceniza el cual ha sido encendido, enfriado en desecador y pesado rápido después de obtener la temperatura ambiente

Colocar en la muffla a no por encima de 425' y gradualmente aumentar la temperatura a 550° para harinas de trigo suave y para alimentos y materia prima en pmceso, 6 575'- 590' para harinas de trigo duro. Incinerar hasta ser obtenida ceniza gris encendido. La ceniza no debe estar hacia a la mecha. Enfriar en desecador y pesar rápido después de ser obtenida la temperahira ambiente.

83

Si es deseado la ceniza puede ser transferida a un pequeño reloj de cristal contrapuesto y pesado directamente. Transferir ceniza, invertir recipiente ; regularmente la ceniza será transferida por completo al reloj de cristal por este procedimiento. Si la ceniza se clava, usualmente puede ser removida con la punta de la espátula.

Pan:

Utilizar 3-5 g. de muestra preparada (metodo 62-05) y proseguir como en el procedimiento descrito. Reportar resultados sobre bases de pan fresco o sobre cualquier base húmeda deseada.

Notas : 1. Los recipientes de ceniza de Níquel son preferidos a los de porcelana o Sllica; ellos deben ser limpiados vigorosamente después de cada incineración. 2. Por deteminación de ceniza para pesar directo, los recipientes de platino son preferibles; si es usado de Silica o poreelam, pulir con fmo papel de esmeril para mantener la superficie interior lisa y brillante. 3. Como la ceniza de harina es higroscópica, No enfriar más que alrededor de 6 muestras en un desecador en clima húmedo.

- Aparatos : Utilizar electrodo y equipo potenciodtrico.el cual ha sido checado con una solución buffer con un pH conocido.

Reactivos : Preparar una solución buffer, descrita en el método 70-1 5, y utilizar para checar app.

Procedimiento :

Harina : Colocar 10 g. de harina (o múltiplos de este) en un matraz y agregar por cada log. de harina 100ml., agua ma, recientemente hervida a temperatura de 25".

Fan: 1. Utilizar 15 g. de migajón fresco, separado en pequeños trozos (ver nota).

2. Agitar el matraz hash obtener una suspensión libre de grumos. Mantener la suspensión a 25"por 30 minutos agitando continuamente o intermitentemente de tal manera que las partlculas de harina se mantengan en suspensión. Dejandola por 10 minutos más.

3. Decantar liquido sobrenadante dentro del recipiente que contiene al electrodo e inmediatamente determinar el pH utilizando un potenciómetro y electrodos los cuales han sido calibrados previamente con soluciones buffer de pH. conocidos.

Nota : Como el pH de extractos de productos de panaderla disminuye es importante determinar inmediatamente el extracto preparado.

1 84

Aparatos :

I . Una bureta graduada con divisiones de O. I ml. 2. Cacerola barnizada con porcelana blanca de 50 ml. de capacidad 3. Pipeta volumétrica de 17.6 ml.

Reactivos :

I . Fenolftaleina I%, preparación disolver lg. de fenolftaleina en 50 ml. de alcohol etílico al 95% y aforar a l00 ml. con agua.

2. Hidróxido de Sodio, solución O. 1N.

Procedimiento :

1. Disolver y dispersar IO g. de la muestra en 100 ml. de agua y mezclar vigorosamente manteniéndola aproximadamente una hora, agitando suavemente y entonces pipetear 17.6 ml. dentro de la cacerola de porcelana. Enjuagar la misma pipeta con 17.6 ml. de agua y agregar esta muestra en la cacerola.

2. Afladiu 0.5 ml de fenolftaleina y titular con una solución estandarizada de Hidróxido de Sodio 0.1 N hasta que un ligero color rosa persista por 30 segundos.

C~lculos

% de acidez = [(V*N*meq)/PM] * 100

En donde:

V = ml de hidróxido de sodio 0.1 N requeridos en la titilación. N =Normalidad dela solución de hidróxido de sodio. meq = Miliequivalentes del ácido de referencia.. PM = Peso de la muestra.


P Preparar como se indica en I. del apartado de Tkcnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

Seguir las indicaciones sefíalas en I1 del apartado de Técnicas Generales Pam Análisis Microbiologico.

NOTA: Incubar de 32-25’C por 72 horas.

Seguir las indicaciones seflalas en V del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiologico.

BIBLIOGRAFIA

-AACC, 17 th, 1962. -A.O.A.C.

México, D.F., 1990.

‘ , 13 th edition, 1980. -Labratono Nacional de Salud Publica, cnntml Físico p, V

86

J

VIII. ALIMENTOS ENLATADOS

Material Micr6metro Abridor bacteriol6gico p , i n T o alicates 3

Procedimiento :

a) Observar externamente, mgargolado de las latas, determinar la presencia de defectos (ganchos salientes, labios o "V", cortes en la hojalata, costura falsa, etc.).

b) Usando un abridor bacteriológico cortar la sección central de la cubierta, aproximadamente 3/8 pulgada del doble cierre.

c) Con las pinzas o alicaías remover el remanente del centro de la cubierta.

d) Usando pinzas, cortar completamente el doble cierre, cuidando de no distorsionar el gancho del cuerpo.

e) Determinar las siguientes medidas(de acuerdo al esquema de la siguiente hoja) Gancho del cuerpo Gancho de la tapa Ancho del sello Grosor

f) Con las medidas anteriores, calcular el porcentaje de traslape o sobreposici6n, utilizando la

%de traslape = GT + GC + G - A 100

GT = Gancho de la tapa GC = Gancho del cuerpo G = Grosor A =Ancho del sello

siguiente f6rmula :

Donde :

Vacuómetro Vernier (pie de rey) Balanza

Procedimiento :

a) Medu la presión de vacío, clavando la punta del vacuómetro de un solo golpe en la tapa de la lata, mantener f m e el vacuómetro y leer.

b) Retirar la tapa de la lata e introducir el pie de rey para medu el espacio de cabeza, tomando la medida del espacio que hay entre la superficie del producto y la tapa de la lata.

c) Pesar el contenido del envase para verificar el peso neto; posteriormente se desecha la salmuera o jarabe y pesar solamente los sólidos para checar el peso drenado y comparar con lo reportado en la etiqueta.

Material Malla el No. 8 o No 20

Procedmiento

inclinar la malla en un ángulo de 17-20" para facilitar el drenado. Drenar dos minutos, directamente pesar ya sea los sólidos drenados o el Ifquido, y pesar el envase vaclo y seco. De los pesos obtenidos, determinar el % de llquido y % contenido de sólido drenado.

Pesar el envase lleno, abierto, y vaciar el contenido sobre una malla No. 8 sin tirar el producto.

ANÁLISIS MICROBIOLOGIC0

Material y equipo

Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de mttximas Homo para esterilizar a 180°C Incubadoras con termómetro y termostato que evite variaciones mayores de O.IoC Potenciómetro de escala expandida Microscopio compuesto Mecheros bunsen Abrelatas sanitario Recipientes de anaerobiosis Pinzas, espátulas y cucharas Charolas Pipetas serológicas de IO ml con tapón de algodón Pipetas despuntadas o tubos de 8 mm de diámetro con tapón de algodón Bulbo para pipeia Tubos de cultivo de 18 X 150 o de 22 X 175 mm Embudos grandes de tallo corto Potaobjetos Cajas de Petri Punzón para latas Asa de platino o nicromel en porta-asas Cepillo para lavar las latas Toallas o gasa estériles Batas de trabajo Guantes Turbante s Cubrebocas Yodo al 2% (en alcohol al 70%) Sistema para producir condiciones de anaerobiosis Varillas de vidrio de 20 cm de longitud y 3 mm de p e s o , dobladas en dngulo recto de 5 cm en no de sus extremos

Medios de cultivo

A continuación se presentan las fórmulas y los procedimientos para preparar los medios empleados, en el análisis microbiológico de los productos enlatados. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones para se preparación impresas en al etiqueta respectiva.

1 . Caldos

a) Caldo glucosa púrpura de bromocresol Glucosa ............................................................. 10.0 g Extracto de carne .............................................. 3.0 g Peptona ............................................................. 5.0 g

2.0 ml Púrpura de bromocresol (1.6% en alcohol) ..... Agua destilada .................................................. 1000 mi

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y envasar en tubos de 22 X 75 mm, en volúmenes de 12 a 15 ml. Esterilizar a 12IoC durante 15 minutos.

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. - . . . . . . , . . . :,.. ..

b) Caldo hígado picado Higado fresco de r Agua destilada ...... Peptona ......................... Fosfato dipotásico ..................... Almidón soluble ..........................

Poner el hígado picado en agua, calentar a ebullición y dejar a fuego lento durante una hora. Enfriar, retirar la capa de grasa, ajustar el pH a 7.0 y hervir otro IO minutos. Filtrar, a traves de gasa o manta de cielo, presionando para quitar el exceso de liquido. Agregar el

caldo la peptona, el fosfato y el almidón soluble. Ajustar el pH a 7.0 y llevar el volumen del caldo a 1000 ml con agua destilada.

Filtrar a traves de papel filtro gmeso; en este paso el caldo y la carne pueden guardarse en refrigerador, si el medio no puede terminarse el mismo día. Envasar en tubos de 22 X 175 mm volúmenes de IO a12 ml de caldo y depositar suficiente hígado picado para que ocupe una altura de !4 pulgada del fondo del tubo. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

c) Caldo extracto de malta Exiracto de malta ................................................. Agua destilada ................................................... 1000 g

15.0 g

Disolver el extracto en el agua, ajustar el pH a 4.7 f 0.2 y envasar en tubos de 22 X 175 mm en volúmenes de 12-15 ml. Esterilizar a 12loC durante 15 minutos. Exponer al calor el menor tiempo posible.

d) Caldo ácido ..................................................... Proteosa peptona 5 g

Extracto de levadura 5 g Glucosa 5 g Fosfato dipotásico ................................................... 4 g Agua destilada ...... : ................................................. 1000 mi

............................................... ...................................................................

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y envasar en tubos de 22 X 175 mm en volúmenes de 12 a 15 ml. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. pH fmal5.0

2. Agares

a) Agar APT Extracto de levadura ............................................ 7.5 g Triptona ............................................................... 10.0 g Glucosa ................................................................ 10.0 g Citrato de sodio .................................................... 5.0 g Clorhidrato de tiamina ......................................... 0.0001 g Cloruro de sodio ................................................... 5.0 g Fosfato dipotbico ................................................. 5.0 g Cloruro de manganeso .......................................... 0.14 g . Carbonato de sodio ............................................... 1.25 g Sulfato de magnesio .. Sulfato ferrosa ........... Polisorbato 80 .................. Agar ........................... Agua destilada .................. pH final: 6.7 i 0.2

90

, -

i

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, hasta disolución completa. Enfriar a 6OoC y ajustar el pH. Distribuir en frascos o tubos, según se requiera y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. O

b) Agar papa dextrosa Infusión de papa .................................................... 200.0 g Glucosa .................................................................. 20.0 g Agar ....................................................................... 15.0 g Agua destilada ....................................................... 1000.0 ml

Lavar, pelar y rebanar papas blancas de tarnaflo medio (250 g). Hervir durante 30 minutos en 250 mi de agua destilada. Filtrar varias veces a traves de gasa y algodón. en esta infusión, disolver los demás ingredientes. Afíadir agua destilada hasta completar el volumen (1000 mi). Calentar a ebullición, hasta la disolución total de los ingredientes. Ajustar el pH a 5.6 it 0.3. Distribuir en volúmenes de 100 ml y esterilizar en autoclave por I5 minutos a 12IoC. Enfriar a 45-48)C y acidificar a pH 3.5 con solución estéril de ácido tartárico al 10% (aproximadamente 1.4 ml de ácido por cada 100 ml de medio). Una vez que se ha agregado el ácido tartárico, no se vuelva a calentar el medio.

Solución estkril de ácido tartárico la 10% Acido e c o .............................................................. 10 g Agua destilada .............................................................. 100 ml

Disolver esterilizar a 12loC durante 15 minutos

c) Agar higado de ternera Infusión de hígado ........................................................ 50.0 g Infusión de ternera ........................................................ 500.0 g Roteosa peptona ........................................................... 20.0 g Neopeptona .................................................................... 1.3 g

Glucosa ..................... .............................................. 5.0g Almidón soluble ....... ............................................... 10.0 g Caseha isoelécirica ....................... ............................ 5.og Cloruro de sodio ............................................................. 5.0 g Nitrato de sodio .............................................................. 2.0 g Gelatina .......................................................................... 20.0 g Agar ................................................................................ 15.0 g Agua destilada ................................................................ 1000 ml

Triptona .................... ............................................... 1.3g

pH fmal 7.3 f 0.2

Mezclar los ingredientes con agua destilada y calentar a ebullición hasta su disolución total.

E l medio existe en forma deshidratada.

d) Agar nutritivo con manganeso

Esterilizar a 12IoC durante 15 minutos.

Extracto de carne ............................................................ 3.0 g Peptona ........................................................................... 5.0 g Agar ................................................................................ 15.0 g Agua destilada ................................................................ 1000.0 mi

Suspender los ingredientes en agua destilada y disolverlos por ebullición. Distribuirlo en volúmenes adecuados en matraces o botellas y esterilizar a 12IoC durante 15 minutos. El pH final debe ser 7.3 f 0.2.

91

Solución de manganeso Sulfato de manganeso ......................................... Agua destilada .................................................... 100.00 ml

3.08 g

Agregar un mililitro de esta solución al medio de cultivo antes de al esterilización,

e) Agar termoacidurans Exiracto de levadura ........................................... 5.0 g Proteosa peptona ................................................. 5.0 g Glucosa ............................................................... 5.0 g Fosfato dipotásico ............................................... 4.0 g Agar .................................................................... 20.0 g Agua destilada ................................................... 1000.0 ml

Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar a ebullición hasta disolución. Ajustar el pH. Esterilizara 121OC durante 15 minutos.

F'reparación de la mues!ns

Llevar un registro en el laboratorio en donde se anoten:

a) El numero de lote ( o si este no existe o esta incompleto). b) Todos los datos importantes para la identificación del producto que aparezcan en la etiqueta;

c) Los defectos físicos que se observen en la lata como abolladuras, golpes que la deformen, identificar la muestra en forma indeleble, antes de removerla. Conservarla.

oxidación, derrames, defectos aparentes de las cerraduras, abombamiento, etc.

Según su apariencia externa clasificarlas como sigue:

a) Latas planas o normales. b) Abombamiento ligero (Flipper), Grado I. Únicamente uno de los extremos de la lata se encuentra

c) Abombamiento elástico (Springer), Grado 11. Uno de los extremos se encuentra abombado; al

d) Hinchazón (Soft swell), Grado 111. Ambos extremos se encuentran abombados, pero pueden

e) Hinchazón (Hard swell), grado IV. Ambos extremos se encuentran abombadas y no pueden

ligeramente abombado, pero puede comprimirse fácilmente.

presionarlo el exirerno opuesto se abulta.

comprimirse o ceden ligeramente a la presión.

comprimirse: la lata puede reventar.

Incubación de las latas

I . Incubación de las latas normales La pruelia mas confiable para determinar la esterilidad comercial es la incubación del producto a

temperaturas apropiadas y por un tiempo suficiente para que cualquier microorganismo que se encuentre pueda desarrollarse bajo las condiciones del enlatado, dando origen a manifestaciones ya sea en el envase o en el producto.

Para productos de baja acidez, incubar de 30 a 35OC por 10 a 14 días y a 55% por 5 a 7 días. Para alimentos ácidos incubar de 25 a 30% por I O días. Cuando se sospeche que el alimento no esta estéril, se puede prolongar la incubación hasta por 30

días de 30 a 35OC.

92

' ..... --.< .. ,.. , .....

Observar periódicamente los envases. La manifestación de crecimiento es la hinchazón en diferentes grados y en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la formación de burbujas.

AI final del periodo de incubación, abrir las latas para descubrir descomposición ácida (flat sour), por cambios en el color, olor, consistencias y pH del alimento. Preparar extensiones, teiíirlas con azul de metileno y observaras microscópicamente. El hallazgo de cualquier anormalidad indica que le producto no esta comercialmente estéril y se debe proceder como para latas alteradas.

2. lncubación de latas sospechosas o alteradas Analizar de inmediato una o varias unidades de la muestra e incubar el resto de las latas que no

presenten alteración evidente o con abombamiento de grado Y a 3SoC por 14 días, de acuerdo al pH. La incubación a 5SoC solo se hará se el alimento va a ser enviado a zonas tropicales. Las latas con abombamiento muy evidente no deben incubarse.

/

Apertura de latas

a) Area de trabajo Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un ambiente ultra-

limpio, clase 100'. La desinfección de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o sales cuatemarias de amonio

a la conceníraci6n recomendada por el fabricante. Posteriormente se debe poner a trabajar el flujo, treinta minutos antes do efecíuar el trabajo.

Para controlar la eficacia del flujo, se deben poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los lados y al centra del área de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operación.

Si no se tiene el equipo necesario, se puede utilizar un cuarto o cublculo perfectamente limpio, lavado con agua y jabón, desinfectándolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajar entre don mecheros Bunsen.

b) Personal El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene el pelo largo, debe usar turbante. el uso de

mascarillas quinírgicas es opcional. el personal enfermo con gripe o cualquier otro problema infeccioso no debe intervenir en el análisis.

Preparación de latas normales Lavar el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabón; enjuagar y dejar secar. Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 minutos, la tapa contraria a donde esta grabado el lote.

Destapar con un abridor de latas sanitario estéril. En las lata de cierre de anillo o dispositivos abre fácil, abrir por l a m opuesta.

Frascos de vidrio Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 minutos en una solución sanitizantc, de manera que

quede cubierta la tapa; esta solución puede ser cloro 100 p.p.m. Colocar un algodón estéril en tomo a la tapa y con un punzón estéril hace un orificio en el centro, a fin de que se pierda el vaclo y pueda abrirse con facilidad. Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo.

Escurrir el liquido y secar con la flama de un mechero.

93

I 3 !

Preparación de latas alteradas Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y jabón; enjuagar y secar. Si la lata esta muy

inflada, guardarla en el refrigerador antes de abrirla. Limpiar y sanitizar la tapa con una solución de cloro 100 p.p.m. o yodo al 2% en alcohol al 70%; limpiar con una gam estéril.

En latas muy infladas de pH muy hcido, es necesario hacer una prueba para hidrogeno, con objeto de conocer si el gas se debe a la acción del ácido sobre el metal.

Para ello, practicar una pequeña puntura en el centro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensaye invertido; inmediatamente ponerlo sobre la flama. Una pequeño explosión indica la presencia de hidrogeno. No debe flamearse directamente el orificio de la lata.

Par abrir latas infladas, colocar un embudo invertido sobre la tapa y picar con un picabielo estéril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata.

Procedimiento

Abrir la lata entre 2 mecheros Bunsen o en el gabinete de flujo laminar vertical. Tomar porciones tanto del contenido sólido como del liquido; si es posible, homogeneizar. Utensilios adecuados a la naturale- del producto (esphtulas, piruas, tubos de vidrio, pipetas, etc.) transferir aproximadamente 2 gramos o 2 ml del r>roducro a los tubos con el medio aue se va a utilizar, devendiendo del vH del alimento.

'I I - .

Conservar una muestra en un frasco estéril, para cualquie; aclanicidn o para efectuar pruebas biológicas. Hacer una extensión en un portaobjetos del contenido de la lata, ya que muchas veces los gérmenes causantes del deterioro mueren durante el almacenamiento y solo el examen microsc6pico puede dar una idea de los organismos involucrados en la descomposición. Preparar las extensiones mediante un asa de platino. Si el alimento es sólido o muy espeso, agregar una pequella cantidad de agua. Si es muy grasoso, depositar sobre la extensión una pequeña cantidad de xilol con posterioridad a su fijación por calor.

Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento: su olor, cambios en su color, consistencia, etc. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el contenido de la lata. Observar su intenor, anotando el estado del barniz, la presencia de manchas, etcttera.

Examen de alimentos enlatado de baja acidez @H superior a 4.6)

inocular aproximadamente 2 g o 2 ml, en cada uno de 4 tubos con caldo hlgado, previamente calentado a 100°C para expulsar el oxigeno disuelto, y enfriado a temperaiura ambiente. Estratificar, después de la inoculación, con agar a 45OC.

Inocular asimismo 4 tubos de caldo púrpura de bromocresol. Incubar según el siguiente esquema.

Medio de cultivo Tubos Temperatura Tiempo Investigación

Caldo hlgado 2

Caldo hlgado 2

Caldo púrpura de bromocresol 2

Caldo púrpura de bromocresol 2

35OC 96 h MesofIlicos anaerobios

55OC 72 h Termoíilicos anaerobios

Mesofilicos 35OC 96 h aerobios

Termoíilicos 55OC 48 h aerobios

Transferir los alimentos llquidos por medio de una pipeta, utilizando un bulbo para succionar, nunca la boca.

94

CUADOR I

ANALISIS DE PRODUCTOS ENLATADOS DE BAJA ACIDEZ (pH no mayor de 4.6)MUESTRA

Caldo de carne pica d a (hígado o coraz6n) I Caldo glucosa púrpura de bromocresol

(Anaerobios) I

30-35°C/96 A horas 5S0C/48 horas 30-35°!!hs horas 5SoCi71 horas

I Tennofilicos anaerobios

Crecimiento + examen Crecimiento + examen Crecimiento +examen Crecimiento con esporas

Interpntaci6n 2.4

I microsc6pico

I microsc6pico

I microsc6pico

Continuar según cuadro 111

I I

Bacilos Bacilos

Continuar según Continuar según Cuadro 111 cuadro IV

Flora mixta que contenga bacilos o cultivos puros

de cocos, hongos y

Descontinuar Interpretación 2. I b

En ausencia de bacilos, descontinuar

Interpretación 2.1 b levaduras. Los microorganismos

encontrados pueden ser anaerobios facultativos

7

95

I

Lecturas de los resultados

1. Aerobias Observar lo tubos de caldo glucosa púrpura de bromocresol despuCs del tiempo de incubación

seflalado en el esquema. Un resultado positivo lo indica tanto el vire del indicador de violeta a amarillo, como el entubamiento del medio. Preparar extensiones. Hay alimentos que por su color y consistencia no permiten distinguir claramente si hay cambio de color o turbidez, cuando se observa el caldo púrpura de bromocresol, despu6s del periodo de incubación, dando resultados falsos positivos. en este caso además de preparar una extensión y observar al microscopio, se puede efectuar una resiembra, transfviendo una pequeña porción del cultivo, por medio de un asa, a otro tubo con caldo púrpura de bromocresol e incubado el tiempo indicado.

Resembrar en agar nutritivo manganeso por duplicado e incubar a 30-35OC una caja y a 55OC otra. Continuar como se indica en los Cuadros I1 y 111.

, ,

CUADRO I1

MESOFfLICOS AEROBIOS

Caldo glucosa púrpura de bromocresol

I Crecimiento de bacilos

Placas de agar nutritivo con manganeso 30-35°C/10 días

I Crecimiento

Observación microscópica. Si se observan esporas, calentar a SOOC/IO minutos

Placas de agar nutritivos con manganeso

I Incubar

I horas

I 30-35OC196 horas

Crecimiento i Mesofilicos aerobios Bacillus sp. Interpretación 2. I a

Crecimiento + Termofllicos aerobios Bacillus sp. Interpretación 2.3

96

;

30-35OG96 horas 5S°C/S6

I

horas

CUADRO 111

TERMOFíLlCOS AEROBIOS

Mesofílicos aerobios TermoRlicos aerobios

Bacillus sp. Bacillus sp.

Interpretación 2. I a Interpretación 2.1 a

2. Anaerobios Observar los tubos de caldo hígado desputs del tiempo de incubación indicado en el esquema. Los tubos que presentan gas, lo que se pone de manifiesto por el desplazamiento de la capa de agar,

Resembrar en agar nutritivo manganeso por duplicado e incubar una caja en aerobiosis a 3OoC o

Continuar según el cuadro 1V.

se consideran positivos.

35OC y otra en anaerobiosis a la misma temperatura.

91

, -

CUADRO IV

MESOFILICOS ANAEROBIOS

Caldo de came picada (higado o corazón) 30-35°C/10 dias

I Crecimiento de bacil s con o sin esporas

Agar hlgado de ternera 30-35OC/96 horas

I Incubación en Aerobiosis Incubación en Anaerobiosis

I b Crecimiento + de bacilos esporulados Crecimiento + de aciloa con esporas

características del genero Clostridium

Bacillus sp. Interpretación 2.1 a Hacer prueba para determinar toxina botulínica Interpretación 2.2.

Cuando se presente crecimiento microbiano durante las pruebas para esterilidad comercial en un enlatado y no haya evidencia de descomposición del alimento, efeciuar la confirmación de la siguiente forma:

a) Obtener cultivos puros de la cepa o cepas encontradas. b) Seleccionar otro enlatado del mismo producto y el mismo lote que el anterior. c) En condiciones asépticas, practicar una pequeña perforación en el extremo de la lata o cerca del

d) Inocular el producto con la cepa por abajo de la superficie. e) Flamear el orificio para crear vacio y sellar askpticamente con soldadura o un material similar. 0 Después de inocular, incubar a 30-35OC durante I O dias. g) Abrir el enlatado y examinar el producto.

El aspecto del producto debe ser igual al que se observo en el envase de donde se obtuvo el cultivo. Si en el primer enlatado el producto fue de apariencia normal, pero se obtuvo crecimiento y en el

segundo, inoculado con la flora microbiana aislada del primero, se encuentra el producto alterado (gas, consistencia diferente, olor, etc.), debe considerarse que el primer enlatado era comercialmente estkril y que el crecimiento fue el resultado de un procedimiento deficiente por el laboratorio.

cierre.

Examen microbiológico de alimentos enlatados de acidez alta (pH menor de 4.6)

Inocular 1 g o I ml de alimento en 4 tubos de caldo acid0 y 2 tubos de caldo extracto de malta. Incubar según el esquema.

98

. -

Medio de cultivo Caldo acido

Caldo ácido

Tubos 2

2

Caldo extracto de 2 malta

Temperatura Tiempo Investigación 3ooc 96 h Lactobaci los,

hongos y levaduras

3 5% 48 h Termofilicos de descomposición acida

30% 96 h Lactobacilos, hongos y levaduras

Si se observa enturbamiento o cualquier evidencia de crecimiento, al final del tiempo de incubación, hacer extensiones a partir de los tubos. Anotar los resultados. Resembrar los tubos positivos según el siguiente esquema.

CALDOEXTRACTODEMALTA

I APT

30°C/72 horas Lactobacilos

Interpretación 3.1 a

I Agar apa dextrosa

35 C196 horas Hongos y levaduras

Interpretación 3.1 b y c

8

CALDO ÁCIDO 30°C196 horas

I Siembra profunda

en iubo de Agar termoacidurans

30-35OCI 6 horas P Anaerobios butiricos

C. pasteurianum Interpretación 3.2

APT 30°C172 horas Lactobacilos

3.1 a

I Agar papa dextrosa

3O0CI4 días Hongos y levaduras

3.1 b y c

CALDO ÁCIDO 55OCI48 h

Siembra profunda en tubo de

Agar termoacidurans 55°C/48 h

I Anaerobios butiricos

Interpretaci6n 3.4

Placas de Agar termoacidurans

55OCI48 h

B. coagulans o B. termoacidurans Interpretación 3.3

Interpretación de resultados

1. Latas normales Conviene extremar los cuidados al efectuar los ensayos, seleccionar las muestras e interpretar los

resultados de las pruebas para demostrar la esterilidad comercial, ya que cualquier error basado en fallas de manipulación o interpretación, puede originar la destrucción de un lote comercialmente estéril, como contaminado. AI incubar el enlatado o al recibirse la lata, la presencia de hinchazón, principalmente cuando es muy acentuada, indica contaminación microbiana. Estas condiciones deben ser confirmadas demostrando la presencia de un gran numero de microorganismos en las extensiones preparadas directamente a partir del alimento, descubriendo cambios en el aspecto del producto (consistencia, olor, coloración anormal) o variaciones en el pH, en comparación siempre con un producto normal. Los cultivos se practican por duplicado; cuando hay contaminación, en ambos tubos se debe hallar una flora similar a la encontrada en las extensiones de la muestra original. Encontrar solo uno de los tubos de cultivo positivo y otro negativo, puede indicar una contaminaci6n por manipulación en el laboratorio, amenos que se compruebe que existe el mismo tipo de flora que en la extensión de la muestra original.

A veces existe alguna dificultad en diferenciar partículas del alimento de microorganismos. Otras veces las levaduras o lactobacilos participan en la producción del alimento, como sucede en algunos productos obtenidos por fermentación. En estos casos, aunque ya no sean viables, los microorganismos pueden aparecer en la extensih, y solo la experiencia y el conocimiento de los procesos, permite interpretar correctamente los resultados.

2. Latas alteradas, con pH mayor de 4.6

2.1 Presencia de mesofilicos aerobios La flora presente en este caso, puede estar constituida por bacilos o ser mixta

a)-Presencia de bacilos esporulados. Generalmente consiste en esporas termorresistentes de diferentes especies de bacilos. Regularmente

el alimento no presenta alteraciones, ya que las esporas no pueden desarrollarse en condiciones de

.

I

I

1 I

I I

I ,

c I

L g 2 I

anaerobiosis; sin embargo, se han encontrado alteraciones producidas por bacilos con esporas resistentes (Bacilliis iiiesenrericus y Bacillus subtilis), en alimentos de acidez media. con tratamiento térmico adecuado, pero con vacío incompleto. También se ha encontrado Bacillus beio nigrijicans. en conservas de betabeles con ennegrecimiento del producto.

b)-Presencia de flora mixta La presencia de flora mixta se debe generalmente a la penetración de gérmenes, con posterioridad al

proceso de esterilización, actuando como vehículo el agua de enfriamiento. La flora que se observa puede ser muy variada.

La penetración de los gérmenes se debe a defectos en las cerraduras, que permiten el paso de los microorganismos. Las litas generalmente se encuentran infladas y pueden mostrar defectos o derrames.

El pH y el aspecto del producto varían.

2.2. Presencia de mesofilicos anaerobios Consiste de anaerobios del genero Clostridium, entre los que se encuentran C. sporogenes, C.

putrificans, C. hystoliticum, C. bifermetans, C. perfringens y C. botulinum; este ultimo es el de mayor importancia sanitaria, por producir una toxina muy potente. Las latas pueden estar parcialmente infladas y el producto parcialmente digerido; el olor es pútrido. el pH aumenta. En este caso, es necesario practicar la prueba en animales, tanto del producto como del filtrado del cultivo, para investigar la presencia de la toxina.

2.3. Presencia de termofilicos aerobios Consta de bacilos termofilicos estrictos o facultativos, que poseen esporas muy resistentes al calor

(especie tipo B. stearothermophilus, causante de la descomposición tícida flat sour). Las latas son planas, sin alteración y con marcado aumento de la acidez del producto; puede haber olor anormal o enturbamiento del liquido.

2.4. Termofilicos anaerobios Pertenecen también al genero Clostridium, con esporas muy resistentes al calor. La especie tipo, C. thennosaccharolyticum, es un anaerobio estricto no productor de sulílldnco; las

Otro tipo de descomposición poco común, puede ser causada por C. nigrificans, que produce latas se encuentran infladas.

sulfhídrico con ennegrecemiento del producto.

3.Interpretación de resultados en alimentos de acidez alta.

3.1. Presencia de mesofilicos aerobios a)-Presencia de Lactobacillus. La descomposición por bacterias acidúricas no formadoras de esporas,

puede deberse a varias especies del genero Lactobacillus. Se han aislado L. lycoperci, L. pentoaceticus, I. meniiopolum y L. pleofrucri.

b)-Presencia se levaduras. El hallazgo de levaduras indica falta de procesamiento. Las latas contaminadas generalmente se presentan muy hinchadas y el olor del producto es característicos de levadlira (olor bcido). Entre las levaduras se han aislado esporas del genero TONh

c)-Presencia de hongos. Otro tipo de descomposición puede ser causada por hongos como Eyssochlamysfulva, que forma esporas muy resistentes al calor. Se han encontrado también algunas cepas de Penicillium; en estos casos generalmente las latas se encuentran planas, sin alteración y el hongo crece en la superficie del producto.

i el,

101

3.2. Mesofilicos anaerobios Closlridium pasteurlanum causa una descomposición poco frecuente, en que las latas se encuentran

infladas y con olor butirico. Si se sospecha este tipo de contaminación, sembrar un tubo con medio caldo acid0 en anaerobiosis a 35°C.

3.3. Termofilicos aerobios. La descomposición por termofilicos aerobios produce el tipo flat-sour. o sea la descomposición

ácida. Las latas se encuentran planas y se observan cambios en el vaclo; entre los gérmenes causantes está E. coagulans, que es el responsable de la descomposición de productos derivados del jitomate, y de la producción de grumos en leche evaporada.

3.4.. Termofllicos anaerobios La descomposición por termofilicos anaerobios es poco frecuente en productos ácidos. La producen

anaerobios butiricos. En productos de acidez muy alta, con pH inferior a 3.7, como col agria, encurtidos, etc., la

descomposición puede deberse a las bacterias ya señaladas, pero generalmente la acidez inhibe el desarrollo de gérmenes. En muchos casos, la hinchaz6n de la lata se debe a causas químicas, por formación de hidrogeno.

4.Observaciones generales Algunas veces se pueden encontrar cultivos negativos, procedentes de latas anormales, o de latas

normales con productos descompuestos. Esto puede deberse a que la alteración ocurri6 antes del procesamiento térmico del enlatado y han muerto los microorganismos que la originaron, o bien a que en un producto contaminado, los gérmenes murieron al agotarse el oxigeno o los nutrientes.

En estos casos, un examen microscópico del producto puede ayudar al diagnostico.

BIBLIOGRAFIA - A . O . A . C . W ' , 13 th edition, 1980. -Laboratorio Nacional de Salud P u b l i c a v a s v Proced imi -, México, D.F., 1989. -Lopez, A, , ,Qcm&te Course in Cauung , Books I y 11, I I th edition, The Canning Trade, USA, 1981.

. < . . . . .

' W t

102

I-

,% .,

IX. HUEVO


DE LA

I . Cascaron

Procedimiento

Observar las características del cascaron, como son: tamaflo, forma, color, limpieza, grietas, asperezas, etc. anotarlas.

2. Alumbrado.

Material.

Conexión eléctrica con foco Cámara oscura

Procedimiento

Colocar el huevo frente a un foco dentro de la cámara oscura, observar la cámara de aire y marcarla con un lápiz, para medirla posteriormente, así como también la posición y apariencia de la yema.

3. Densidad del huevo.

Material

El propio laboratorio.

Reactivos

Solución de cloruro de sodio al 10%

Procedimiento

Introducir el huevo en una solución de cloruro de sodio al 10% y observar si se va la fondo, queda en una posición intermedia o sobresale en la superficie.

I

I

AClON DE LA CAL-

I , Prueba de extendido.

Material

El propio laboratorio Recipientes planos Abanico de Roche

Procedimiento

PREPARACIÓN de la muestra. Romper el huevo y colocarlo sobre una superficie plana y llevar a cabo las siguientes observaciones:

a) Calidad de la clara. Observar y anotar las siguientes características de la clara. Firmeza. Cantidad relativa y superficie de clara espesa. Cantidad relativa y superficie de clara delgada. Longitud aproximada de las chalazas.

b) Calidad de la yema. Observar las siguientes características de la yema y anotarlas. Forma. Elevación. Firmeza. Color (comparado con el abanico de Roche). Presencia de defectos (Manchas de sangre u otros).

NOTA: inmediatamente después de realizarse estas pruebas, efectuar la determinación de pH, con el tin de evitar que el huevo cambie sus propiedades de frescura.

2. C h a r a d e aire en huevo cocido.

Material

El propio laboratorio Baflo María Vernier

Procedimiento

a) Colocar en un recipiente, la muestra de huevo (en la que previamente ha sido marcada la cámara de aire apartado 1.2), añadir la cantidad de agua suficiente para cubrir la muestra y calentar a ebullición, cerca de 30 minutos. Después de este tiempo sacar el huevo del agua y dejar enfriar.

I04

b) Medir con el Vernier el huevo entero en forma longitudinal, además medir el espesor de dos pedazos de cascaron juntos y restar este valor al anterior. expresar el resultado en mm.

c) Quitar cuidadosamente el cascaron del extremo marcado e introducir en el sitio mas profundo de la cámara de aire el vástago del Vernier hasta el extremo opuesto, teniendo la precaución de no oprimir el huevo y anotar la medida en mm. P Cálculos

1

18

a

C h a r a d e aire = A - B

Donde: A = Medida del huevo entero en mm. B = Medida del huevo sin cámara de aire en mm.

3. Posición de la yema en huevo cocido

Material

El propio laboratorio Cuchillo

Procedimiento

Terminar de quitar el cascaron a la muestra ya cocida (apartado 2.2.3), cortarlo con un cuchillo a lo ancho cerca del exiremo donde se encontraba la c h a r a de aire y anotar si la yema esta o no centrada y se es esférica.

- Material y equipo

El propio laboratorio Potenciómetro Potenciómetro digital Termómetro Espátula de plástico

Reactivos

Soluciones reguladoras de pH 4.0 y 7.0

I05

>~

Procedimiento

a) Separar la yema y clara de la muestra utilizada en el apartado 2.1. Prueba de Extendido, auxiliándose de la espátula de plástico, evitando romper la membrana que rodea la yema y transferir a sendos vasos de precipitados cada uno de los componentes del huevo.

b) Determinar la temperatura de cada muestra, tras agitarlas lentamente para homogeneizar.

c) Determinar el pH por medio del potenciómetro, a cada una de las muestras, a la temperatura que

Tener cuidado en el manejo de los electrodos y recordar que estos deberán estar perfectamente presentan.

limpios, así como el aparato bien calibrado, para obtener datos confiable.


P

Preparar como se indica en 1. del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

Seguir las indicaciones señalas en I1 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

NOTA: Incubación a 32°C por 72 horas

MONELLB

Seguir las indicaciones señaladas en VI1 del apartado de Técnicas Generales Para Análisis Microbiológico.

I06

F Seguir las indicaciones señalas en VI del apartado de Técnicas Generales Para Andlisis

Microbiológico.

BIBLIOGRAFIA

- C O N A S U P O P ,México, D.F., 1961. -Dirección General de Normas, Noma Oficial Mexicana, Noma para Huevo y sus Productos. -Pearson, D., , 6 th edition, J. and A. edition Churchill, LTD, London, 1962.

I07 =m

X. ACEITES

DETERMI SACIÓN DEL INDICE DE SAPO NlFlCAC ION

Material y equipo

Bureta Pinzas para bureta Pipeta volumetrica de 50 ml Placa de calentamiento

Reactivos

KOH en solución alcohólica, aproximadamente 0.5 N. Acido clorhidrico 0.5 N. Fenolfialeina al 1% en solución alcohólica.

Procedimiento

a) Pesar de 1 a 5 g de lipidos; esta cantidad se obtiene fácilmente por diferencia de pesos, colocando la muestra en un vaso de precipitados de 100 ml y dentro de el un gotero, ambos se pesan exactamente. Se toma cierta cantidad de la muestra y se deposita en un matraz erlenmeyer de 250 ml, se regresa el gotero el vaso y se pesan nuevamente para conocer por diferencia la cantidad de aceite depositada en el matraz.

b) Añadir 50 ml de hidróxido de potasio 0.5 N medido con bureta o con pipeta volum6trica y

Calentar a reflujo durante 30 minutos, agitando ocasionalmente.

c) Efectuar a la vez una prueba testigo en las mismas condiciones que el problema. Añadb'a ambos 1 ml de solución de fenolfialeina y valorar, cuando la solución este tibia todavía, con ácido clorhldrico k0.5 N, antes que solidifique la muestra.

adaptarlo la refrigerante, cuidar que no haya fugas pues el etanol es inflamable.

Cálculos

Por definición "el indice de Saponificación es igual a mg de hidróxido de potasio necesarios para saponificar completamente un gramo de Ilpido" por lo tanto:

I.S. = ((T - P)N * meq] / m

Donde:

T = Mililitros de HCI utilizado en titular al testigo. P = Mililitros de HCI utilizado en titular el problema. N =Normalidad de HCI. meq = Miliequivalentes del KOH, 56.1 mg. m = Masa de la muestra en gramos.

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C16N DEL 1-

Material y equipo

Parrilla Baño Marla Bureta Pinzas para bureta

Reactivos

Hidróxido de potasio 0.25 N o O. 1 N. Etanol recién neutralizado a la fenlftaleina. Solución alcohólica de fenolftaleina al I%.

Procedimiento.

a) Pesar IO g de muestra en un matraz de erlenmeyer, como se indico en el apartado 9.1. ARadir 75 ml de etanol previamente neutralizado y calentar en b a o de agua en ebullición. agitando

durante 2 minutos.

b) Tiiular en caliente agitando vigorosamente, con el hidróxido de potasio 0.1 N en presencia de 5 gotas de fenolflaleina, hasta la aparición de un color ligeramente rosa permanezca durante 1 minuto.

Calculos

Por defmición “el Indice de Acidez es la cantidad de hidróxido de potasio expresada en miligramos necesario para neutralizar los ácidos libres, contenidos en un gramo de Ilpido”.

LA. = (A * N * meq) I m

Donde:

A = mililitros de KOH empleados en la titilación N =Nomalidad del KOH. meq = miliequivalentes de KOH, 56.1 mg. m = masa de la muestra en gramos.

Expresar el resultado en porciento de ácido oleico

% Acido Oleico = (A N * meq * 100) I m

Donde:

meq = miliequivalentes del ácido oleico, 0.282 g

DE INDICE

Este índice se determina por calculo.

Calculos

Por definición ” el lndice de ésteres son los miligramos de hidróxido de potasio necesarios para sapodficbr los ésteres contenidos en un gramo se lípido”, por lo tanto se obtiene restando el índice de acidez al índice de saponificación.

Material y equipo

Matraz para yodo Bureta Pinzas para bureta

Reactivos

Tiosulfato de sodio 0.1 N. Yoduro de potasio 15%. Almidón al 1%. Cloroformo o tetracloruro de carbono. Reactivo de Hanus.

Preparación del reactivo de Hanus.

a) en un matraz erlenmeyer de 2 litros conteniendo 133.61 g de yodo, aiíadir poco a poco 825 ml de ácido acético glacial (libre de materia oxidable), dentro de una campana de extracción y caleniar suavemente. Evitar el calentamiento brusco y la inhalación de los vapores pues son muy irritantes.

b) Decantar poco a poco, lo que se vaya disolviendo y pasarlo a un frasco ambar con tapón esmerilado, hasta su disolución total.

c) Pasar 25 ml de esta solución a un matraz para yodo y adicionar 10 ml de yoduro de potasio al 15% y 50 ml de agua.

d) Valorar con la soluci6n e tiosulfato de sodio 0.1 N, al observar el cambio de color de café rojizo a amarillo paja, aiíadir 1 ml de almidón al I%, como indicador y continuar la valoración hasta la completa desaparición del color.

e) Por otra parte disolver 8 ml de bromo en 200 ml de ácido acético glacial. Recordar que el bromo se encuentra protegido por una capa de agua, por lo que se recomienda introducir la pipeta hasta el fondo del frasco y evitar la entrada de agua. NOTA; LOS VAPORES DE BROMO Y DE ACID0 ACÉTICO SON EXTREMADAMENTE IRRITANTES.

f) Tomar 5 ml de esta solución añadir 10 ml de yoduro de potasio, 50 mi de agua y proseguir como se indica en el apartado 12.4

g) Apartir de los datos anteriores calcular la solución de bromo que es necesario aiíadir, para que reaccione con los 800 mi restantes de yodo, según la siguiente relación:

A = (B * 800) /C

donde:

A = mi de solución de bromo. B= ml de tiosulfato equivalente a 1 ml de solución de yodo. C = ml de tiosulfato equivalentes a I ml de solución de bromo.

Si es necesario, diluir la mezcla con ácido acético. La concentración de la solución de Hanus resulta aproximadamente 0.2 N.

Procedimiento

a) Pesar de 0.5 g a 1 .O g de muestra si esta es sólida, o 250 mg si es liquida, en la forma que se indico en el apartado 9. I .

b) Afladu I O ml de cloroformo o de tetracloruro de carbono y 25 mi del reactivo de Hanus, medido con bureia. Efectuar una prueba testigo en las mismas condiciones. Reposar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.

c) Ai cabo de este tiempo añadir 1 O ml de cloruro de potasio al 15% y 75 ml de agua destilada. Valorar con solución de tiosulfato de sodio y seguir el procedimiento indicado en el apartado 12.4.

Cálculos

El Indice de Yodo se define como “los gramos de yodo fijados por 100 g de lípido”, por lo que este valor se obtiene con la siguiente formula:

I.Y. = [(T * P) * N * meq * 1001 / m

donde:

T = ml de tiosulfato empleados en titular el testigo. P = ml de tiosulfato empleados en titular el problema N =Normalidad del tiosulfato de sodio. meq = miliequivalentes de yodo, O. 127 g. m =masa de la muestra en gramos.

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I6N DEL INDICE DE PEROXUQ,

Material y equipo

Matraz para yodo Bureta

Reactivos

Mezcla de ácido acktico-cloroformo 3:2. Solución saturada de yoduro de potasio. Tiosulfato de sodio 0.02 N. Almidón al 1%.

Procedimiento

a) Pesar exactamente alrededor de 5 g de la muestra en estudio, en un matraz para yodo o en n frasco de tapón esmerilado de 500 ml, utilizando el procedimiento indicado en el apartado 9.1.

b) Afladir 25 ml de la mezcla achtico-cloroformo para disolver la muestra. Mezclar hasta disolver, agregar I ml de solución saturada de yoduro de potasio recien preparada,

reposar durante 1 minuto.

c) Adicionar 50 ml de agua destilada y titular el yodo liberado con tiosulfato de sodio 0.02 N, utilizando 1 ml de almidón como indicador. Agitar fuertemente el frasco despuCs de cada adición, con el fin de remover las trazas de yodo que puedan quedar en la capa de cloroformo.

d) Realizar una prueba testigo con todos los reactivos en las mismas condiciones que le problema, en este caso el gasto de tiosulfato de sodio no deberá ser mayor a 0.1 ml cuando los reactivo se encuentran puros.

Calculos

Expresar los resultados en miliequivalentes de peróxido por 1000 g de aceite, utilizando la siguiente ecuación:

meq = [(P-T) * N * 10001 / m

donde:

P = ml de tiosulfato de sodio utilizados en el problema. T = ml de tiosulfato de sodio utilizados en el testigo. N =Normalidad de tiosulfato de sodio. rn = masa de la muestra en gramos.

I12

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BlBLlOGRAFlA

' , 35 East Wecker Drive, Chicago, Illinois, 1951. h, Enciclopedia de la Química Industrial, Ed. Urna, Bilbao,

-AOCS, Ex&ki&WMethods of the A m x i c a n Oil ChWltSU Mehrlenbacher V.C., -asas Y Ace EspaRa, 1970.-Britis Standards Institution, British SbdmiMXbods of Oil EUIdhtS , London, 1960.-Pearson, D., --is of Foods , 6 th edition, J. and A. edition Churchill, LTD, London, 1962.

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COMENTARIOS

El resultado de esta revisión bibliográfica es el presente manual, el cual contiene aproximadamente 50 técnicas para el análisis de alimentos, tanto para un examen Físico-Químico como microbilógico. Las técnicas contenidas son las de uso más común. así como fácilmente repetibles en las instalaciones de la Universidad, ya que no se necesita de equipo muy sofisticado para llevarlas a cabo, ni tampoco de reactivos dificiles de conseguir.

r .\ El manual se dividio en 10 capítulos, de los cuales uno corresponde a tecnicas para análisis

microbiológico de los diversos grupos de alimentos exclusivamente. En cada uno de los nueve capitulos restantes se aborda un grupo de alimentos diferentes para su análisis Físico-Qutmico, y se especifican las condiciones a las cuales se tienen que trabajar con esos alimentos para su examen microbiológico.

Los análisis que se practiquen en base a las técnicas presentadas van a mojar datos que indicarán la calidad de los al ientos . Ya que se escogieron la menor cantidad de análisis, pero también los suficientes para cada grupo de a l i e n t o , y así dar un diagn6stico de la calidad del producto.

Se tuvieron que omitir algunas técnicas, ya que para su realización se tiene que contar con equipo muy específico, además de reactivos de dificil acceso y caros, por lo que no se iba a poder llevarlas a cabo en las instalaciones de la Institución. Por esta raz6n se considero adecuado no incluirlas, pero en cada capitulo se incluye bibliografía para la búsqueda de cualquier tecnica si se considera necesaria en un análisis de alimentos.

I14

Bi bliografia.

1 .- Egan Harold, Kirk S. Ronald, Sawyer Ronald. Edit. CECSA, México, 1987.

la. edición,

2.- Jameson Michael, Jolober Peter. M.@& de los Alimentos. Vol. 1 Ec- 1 a. edición, Edit. Pax- México, México, 1975.

3.- Osbome D.R., Voogt P. &-&isis de los Zaragoza, España, 1986.

de los alimentos. la. edición, Edit. Acribia, S. A,,

4.- Pelczar J. Michael, Reid D. Roger, Chan E.C.S., MicrobioloPv. 4a. edition, Mc Graw-Hill Book Company, USA, 1977.

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DMSION DE CIENCIAS BlOLOGlCAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el (la): DR. JORGE SORIANO SANTOS

del Departamento de: BIOTECNOLOGIA

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Servicio Social:

TITULO. Manual de análisis para el control de la calidad de los alimentos de la cafetería de la UAMl

ALUMNO: Martínez Lar8 Pedro

LICENCIATURA Ingeniería de los Alimentos

PERIODO: Junio 6, 1995-Diciembre 9, 1995

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México. D.F. a los catorce días del mes de Mayo de mil novecientos noventa y Seis.

Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo"

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacan y La Purísima lztapelepa 09340 México. D.F. A.P. 55-535 Fax: (5) 612-80-83 Tels. 724-46-81 y 85

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I Ciencias Biológicas Iztapalapa.148.206.53.84/tesiuami/UAM21492.pdf · JUSTIFICACION ... a A la cafetería de la Unidad asiste un considerable numero de personas, ... Licuadora