IBGM DraCGarcia 08 VanessaIglesiasfacultadbiologia.usal.es/documentos/practicasempr/... · Extracción del RNA de las células ... Los frascos sin ningún tipo de medio se llevan

Memoria Prácticas de Empresa 2008 Instituto de Biología y Genética Molecular - CSIC

Vanessa Iglesias Fernández 2

AGRADECIMIENTO Antes de nada me gustaría dar las gracias a la Dra. Carmen García por haberme dado la oportunidad de realizar las prácticas en su laboratorio. Gracias a todo el equipo del laboratorio (Patricia, Maribel y Ana), por la calurosa bienvenida con la que me recibieron y por la amabilidad y cordialidad con la que me trataron desde el comienzo. En especial, gracias a Patricia, mi instructora, por su ayuda y sus indicaciones, por preocuparse tanto en explicarme tan bien cada cosa y por el agradable ambiente de trabajo que creaba. Ha sido un verdadero placer haber hecho prácticas con vosotras. ¡Gracias!



ÍNDICE

INTRODUCCIÓN……………………………………………………….………4 - Estenosis Aórtica: ¿Qué es y cómo se produce?.................................................4

- Receptores TLRs: Toll-like Receptors…............................................................5 · Definición y características............................................................................5 · Papel de los receptores TLRs en la estenosis……………………………….5

EXTRACCIÓN DE CÉLULAS HAVICs.............................................................7

INMUNOFLUORESCENCIA…………………………………………………..7

CULTIVOS CELULARES……………………………………………………...8 Extracción del RNA de las células………………………………………………8

EXPERIMENTO………………………………………………………………...9 - Determinación de la concentración de proteína………………………………..9 - Western Blot 1.- Preparación del soporte del gel…………………………………………..10 2.- Preparación del gel de poliacrilamida…………………………………...11 - Transferencia a la membrana 1.- Tratamiento de las membranas: Hidratación……………………………..12 2.-Preparación del “sándwich”………………………………………………13 3.- Proceso de transferencia………………………………………………….13 - Revelado de membranas………………………………………………………14 - Stripping………………………………………………………………………15

RESULTADOS………………………………………………………………...16

EXTRACCIÓN DE MONOCITOS HUMANOS DE SANGRE DE DONANTES……………………………………………………………………17

BALANCE PERSONAL……………………………………………………….18



INTRODUCCIÓN ESTENOSIS AÓRTICA: ¿Qué es y cómo se produce? La estenosis aórtica es una malformación de la válvula aórtica del corazón, que se caracteriza por el estrechamiento anormal del orificio de la válvula aórtica, produciendo una obstrucción al flujo de salida de la sangre desde el ventrículo izquierdo hacia la aorta. La válvula aórtica está localizada entre el ventrículo izquierdo y la aorta.

Tiene tres valvas o cúspides que funcionan como una compuerta de una sola dirección, es decir, que permiten que la sangre avance hacia la aorta pero no que retroceda hacia el ventrículo izquierdo. La estenosis aórtica se produce cuando aparecen solo dos valvas y la válvula aórtica no se abre o cierra completamente. En este caso el ventrículo izquierdo tiene que bombear más fuerte para impulsar la sangre por la válvula y el esfuerzo excesivo puede agrandar el ventrículo izquierdo y originar una insuficiencia cardíaca. La válvula aórtica puede funcionar mal por diversas razones: puede ser una válvula anormal por nacimiento (enfermedad congénita), o puede enfermarse con los años (enfermedad adquirida). A medida que envejecemos se va depositando calcio en esta válvula y esta deposición de calcio interrumpe parcialmente la función valvular, apareciendo así una calcificación de la válvula aórtica, que deriva en su estenosis. La calcificación de la válvula aórtica es la indicación más común para el reemplazamiento quirúrgico de la válvula. La inflamación aparece para ser uno de los mecanismos involucrados en la calcificación de la válvula aórtica, y las células intersticiales de la válvula parece que contribuyen a este proceso.

Normal Estenótica



RECEPTORES TLRs: Toll- Like Receptors Definición y Características La mayoría de los organismos tienen un sistema de defensa inmune innato que es mediado por un grupo de receptores relacionados evolutivamente, llamados Toll-like receptors. Estos receptores o proteínas juegan un papel crucial en la respuesta inmune innata temprana de vertebrados e invertebrados, frente a la invasión de patógenos. Los TLRs son un tipo de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), que reconocen moléculas o motivos estructurales altamente conservados que solo son expresados por patógenos microbianos, y que se conocen con el nombre de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). PAMPs incluye varios componentes de la pared celular de bacterias como el lipopolisacárido (LPS) y el peptidoglicano(PGN). La estimulación de los receptores TLRs por PAMPs inicia cascadas de señalización que involucran un gran número de proteínas, entre ellas la cascada de MAP- kinasas. Estas cascadas de señalización permiten la activación de factores de transcripción como AP-1 y NF-kB, induciendo así la secreción de citocinas pro-inflamatorias y citocinas efectoras que dirigen la respuesta inmune adaptativa. Los TLRs se expresan predominantemente en los tejidos que participan en la función inmune como el bazo y los leucocitos de la sangre periférica. En mamíferos, hay 11 TLRs que reconocen una gran variedad de ligandos de patógenos y que desencadenan respuestas inmunológicas. Papel de los receptores TLRs en la estenosis Además del importante papel que llevan a cabo los receptores TLRs en la respuesta inflamatoria celular, se sabe que las células intersticiales de la válvula aórtica humana (células HAVICs) expresan receptores TLRs funcionales. Nosotros examinamos la expresión de TLR2 y TLR4 en las valvas de la válvula aórtica y en células HAVICs aisladas, y analizamos la respuesta de las HAVICs cultivadas a los agonistas de TLR2 y TLR4: peptidoglicano y lipopolisacárido. Ambos receptores fueron detectados en la membrana y el citoplasma de HAVICs cultivadas. - TLR2: reconoce lipoproteínas asociadas con bacterias Gram- positivas y Gram- negativas y el peptidoglicano de las bacterias Gram- positivas. - TLR4: el principal ligando es el LPS de las bacterias Gram-negativas.



El lipopolisacárido (LPS) es un importante componente de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, que contribuye enormemente a la integridad estructural de la bacteria, y que protege a la membrana de ciertos tipos de ataques químicos. Esta molécula también incrementa la carga negativa de la membrana celular y ayuda a estabilizar toda la estructura membranal. El LPS es una endotoxina que induce una fuerte respuesta del sistema inmune. Cuando el LPS se une a su receptor promueve la secreción de citocinas pro-inflamatorias en muchos tipos celulares, especialmente en macrófagos.

La estimulación por el peptidoglicano o el lipopolisacárido provoca la activación de la ruta de señalización del NF-κB y de MAP- Kinasas, así como la producción de múltiples mediadores pro- inflamatorios, incluidos IL-6, IL-8 e ICAM-1.

Estudios recientes han mostrado que cuando las células HAVICs cultivadas son expuestas a citocinas como TNF- α y IL-1β in vitro, exhiben cambios fenotípicos como los osteoblastos. Otros estudios han mostrado que TNF- α induce la formación de hueso en células vasculares, y que promueve la calcificación de células del músculo liso de la aórtica bovina.



EXTRACCIÓN DE CÉLULAS HAVICs

Las células intersticiales de la válvula aórtica son miofibroblastos, y para extraerlos se utiliza Colagenasa que destruye las otras células que hay en la válvula pero no los miofibroblastos. Procedimiento:

- Se recogen las válvulas aórticas de los corazones explantados a pacientes sometidos a un transplante de corazón.

Las válvulas son delgadas, con la superficie lisa. - Las valvas se aclaran en EBSS ( Earle’s balanced salt solution) y se digieren en

colagenasa( 2,5mg/ml) durante 30 min a 37ºC - Se extraen las células endoteliales por vórtex y las valvas se digieren aún más

con una solución más suave de colagenasa (0,8mg/ml) durante 3 horas a 37ºC. - Centrifugado breve para quitar el tejido restante. Del “pellet” se obtienen los

explantes que se pasan a placas de 6 pocillos y el sobrenadante se pasa a eppendorfs

- Centrifugado breve a 4ºC - Por último, las células se resuspenden en medio M199 y se pasan a frascos T25.

INMUNOFLUORESCENCIA

La inmunofluorescencia se aplica para caracterizar las células HAVICs aisladas y para detectar y localizar los receptores TLRs y el factor NF-kB. Pasos: - 2 lavados con PBS, 3 min - Permeabilizar con metanol 6 min a -20ºC - 2 lavados con PBS - Bloqueo con PBS+ 5% BSA durante 30 min - Incubación con el anticuerpo primario (diluido 1:50 en PBS+5% BSA), agitando

1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo primario es α -actina y se unirá a aquellas células que tengan α-actina, es decir, a los miofibroblastos. De esta forma se comprueba que se trata de células HAVICs

- 3 lavados con PBS y 2 lavados con PBS+5% BSA - Incubación con el anticuerpo secundario(diluido 1:100 en PBS+5%BSA)

durante 1 hora en agitación y a temperatura ambiente El anticuerpo secundario está marcado con fluorescencia verde y es específico para el anticuerpo primario

- 3 lavados con PBS - Colocar en los portaobjetos para observar al microscopio. Se observan los miofilamentos de actina de un color verde



CULTIVOS CELULARES

Cambios de frascos: Cuando las células ocupan toda la base de los frascos donde están creciendo, se pasan a otros frascos más grandes para que sigan creciendo. Se utilizan frascos de 25ml y 75ml. - Se elimina el medio de los frascos - Se añade 2ml de EBSS a cada frasco para lavar - Se elimina el EBSS - Se añade 1,5ml de Tripsina para lisar las células y despegarlas de la placa - Por último, se añade el medio M199 necesario y se pasan las células a los nuevos frascos. Todos estos pasos se llevan a cabo bajo campana para mantener en todo momento condiciones de esterilidad

Congelar: - Las células se tripsinizan - Se diluyen con medio M199 y se pasan a un tubo Falcon de 15ml - Se centrifugan - Nos quedamos con el pellet y se añade 1ml: FBS+ 10% DMSO - Finalmente se congelan para conservarlas.

EXTRACCIÓN DEL RNA DE LAS CÉLULAS DE LAS PLACAS O TUBOS 1. Se elimina el medio de cultivo con una pipeta 2. Se añaden 2 ml de EBSS a cada frasco para lavar 3. Se elimina el EBSS 4. Los frascos sin ningún tipo de medio se llevan a la campana de gases y se echa

1ml de Trizol para lisar las células 5. Se raspan los frascos 6. Lo que se obtiene se pasa a eppendorfs específicos de RNA 7. Se mide la cantidad de RNA en el espectrofotómetro utilizando una cubeta de

cuarzo

Se obtienen 2 medidas a 2 longitudes de onda: 260nm y 280nm Se utiliza la fórmula:

[RNA] (μg/ml) = A 260 ×40 ×Dilución × 10 3−



EXPERIMENTO

Reactivos: - Buffer de lisis, que contiene: · 2ml TNE · 20μl NaFl · 10μl NaV0 2 · 8μl PMSF · 2μl LP · 2μl Apoproteína

Procedimiento:

Las células están en placas de 6 pocillos: 1. Se succiona el medio de las placas con un chupón, bajo campana y en

condiciones estériles. 2. Se añade 1 ml de suero al 2% a cada pocillo para inactivar las células 3. Las placas se dejan incubando 1h 4. Se estimulan las células, añadiendo a cada pocillo de la placa: - LPS, Lipopolisacárido

- Pam - S, Esfingosina - S+ LPS - S+ Pam a distintos tiempos: 10’, 30’ y 1h

5. Se recogen las células raspando con una espátula y se pasan a eppendorfs 6. Centrifugado rápido a 4ºC y el sobrenadante se pasa a otros eppendorfs. El pellet se tira DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA

Materiales y Reactivos: - Placa multipocillo de 96 pocillos - Reactivo “Bradford (lleva el colorante azul de Comassie), para medir la concentración de proteína por cambios de color - Estándares - Espectrofotómetro



Método de Bradford

1. El reactivo Bradford se pone en todos los pocillos que se van a utilizar de la placa multipocillo

2. Los estándares se añaden en la primera fila de la placa por duplicado 3. Después se añaden las muestras, también por duplicado, para hallar la media

4. Se mide la concentración de proteína en un espectrofotómetro El colorante se une irreversiblemente a la proteína de modo que existe una relación directamente proporcional entre el color y la concentración de proteína.

5. Cálculos: se utiliza el programa “Excel” para transformar las medidas de absorción obtenidas en el análisis espectrofotométrico en medidas de concentración y también para calcular la cantidad de proteína que hay que cargar en cada uno de los pocillos del gel.

WESTERN BLOT El método de Western Blot (inmunoblot) permite detectar proteínas específicas en una muestra dada o tejido. En primer lugar, las proteínas se separan en un gel de electroforesis y posteriormente se transfieren desde el gel a una membrana aplicando un campo eléctrico, donde son detectadas utilizando anticuerpos específicos para las proteínas que buscamos. SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) 1.- Preparación del soporte del gel Material por gel: · 2 cristales, uno de ellos con balcón · 1 goma · 2 separadores (del grosor requerido) · 3 pinzas grandes que cierren del todo · 1 peine de 7 o 10 pocillos - Antes de nada hay que limpiar todo el material con etanol. - Colocar la goma en el borde del cristal sin balcón, estirándola muy bien. - Colocar los separadores en los laterales del cristal junto a la goma. - Colocar el otro cristal encima ajustando a los costados y a la base, y sujetar todo con las pinzas. - Por último, colocar el peine para marcar la altura del gel running y quitarlo.



2.- Preparación del gel de poliacrilamida El porcentaje de acrilamida define el tamaño de poro del gel: mayor tamaño de poro Cuanto menor % mayor distancia entre los fragmentos (Pm) Por tanto, el % de acrilamida del gel depende del tamaño de las proteínas a separar. La polimerización de la acrilamida se consigue por la adicción de: - catalizadores: APS, persulfato amónico - propagadores: TEMED

Gel Stacking (Concentrador)

Gel Running (Separador)

Para cada soporte se requiere:

Gel Running al 10% ( 10 ml)

Gel Stacking al 5% ( 4ml)

30% Acrilamida 2 0,68 Tampón Tris 1M 2,5 1

H 2 O milli Q 5,3 2,2 10% SDS 0,1 0,04 10% APS 0,1 0,04 TEMED 0,008 0,004

Se mezclan los componentes según las cantidades y el % del protocolo: - En primer lugar se añade la mezcla del gel running entre los cristales del soporte con una pipeta, evitando la formación de burbujas. Se rellena hasta la marca del cristal - A continuación se añade agua con suavidad (por un lateral) encima del running hasta cubrirlo. - Se deja polimerizar - Al polimerizar el gel running aparece una línea entre el gel y el agua. Entonces se retira el agua volcando el soporte - Se añade el gel stacking hasta que alcance el borde superior del cristal. - Inmediatamente, se coloca el peine, centrado y evitando burbujas. - Se deja polimerizar al menos 20 minutos.



Materiales y Reactivos: - Cubeta de electroforesis - Gel de poliacrilamida - Buffer o tampón de running 1X Procedimiento:

1. Montar la cubeta de electroforesis con el gel de poliacrilamida y rellenarla con buffer running.

2. Cargar las muestras en los pocillos 3. Conectar el aparato a la corriente y dejar correr las muestras en el gel

Duración: 1 hora

TRANSFERENCIA A LA MEMBRANA Consiste en transferir las proteínas del gel, después de la electroforesis, a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF (Inmobilón) 1.- Tratamiento previo de las membranas: Hidratación Para poder transferir las proteínas del gel a la membrana, hay que hidratar la membrana previamente. Ésta se pasa por 3 cubetas: ·15 seg en metanol · 3 min en agua destilada · 5 min en Buffer de Transferencia Todas las membranas son hidrofóbicas y por ello requieren un tratamiento previo con metanol antes de sumergirlas en soluciones acuosas. Hay que evitar cualquier contacto con la superficie a transferir de la membrana.



2.- Preparación del “sándwich” Material (para un gel): - 1 membrana - 1 “casete”: son 2 tapas de plástico perforadas unidas por un lateral - 2 esponjillas - 4 papeles de filtro “Whatman” - Rodillo - Cubeta de transferencia Reactivos: - Buffer de Transferencia El procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre el casete abierto una esponjilla previamente remojada en el tampón, 2 papeles de filtro húmedos, el gel, la membrana en contacto directo con el gel, los otros 2 papeles de filtro y finalmente la otra esponja. Este conjunto se recoge entre las dos tapas de plástico perforado y es a lo que denominamos sandwich.

Las proteínas del gel están cargadas negativamente (por el SDS), de modo que el gel se dispone de forma que quede hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+). 3.- Proceso de transferencia - Colocar el sándwich en el soporte de la cubeta, atendiendo a la polaridad. - Llenar la cubeta con Buffer de Transferencia. - Colocar un agitador en el fondo para comprobar su movimiento. - Poner la tapa a la cubeta teniendo en cuenta el polo y conectar a la fuente de alimentación, a 100voltios y 400 mA Duración: 2 horas El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solución por lo que se recomienda refrigerar el sistema y recircular el tampón. Para ello se pone hielo alrededor de la cubeta consiguiendo así que esté bien frío



REVELADO DE MEMBRANAS 1.- Bloquear la membrana con aproximadamente: 30ml de TTBS (0,05% Tween) + 5% de leche en polvo (bien disuelta) 2.- Incubar agitando durante 1 hora a Tª ambiente 3.- Lavar la membrana con TTBS (0,05% Tween) 4.- Incubar con el anticuerpo primario, agitando durante 1 hora a Tª ambiente ó 4ºC toda la noche. El anticuerpo 1 ario es de rabbit anti-human, es específico. Este anticuerpo está disuelto en: TTBS 3% de leche 0,02% azida sódica (conservante) Se reutiliza y se guarda a 4ºC 5.- 3 lavados con TTBS cada 10 minutos 6.- Incubar con el anticuerpo secundario, agitando durante 45 min a Tª ambiente El anticuerpo 2 ario es de donkey anti- rabbit (para detectar el anticuerpo 1 ario ), es inespecífico y está diluido 1/200 en TTBS + 3% leche. No lleva azida sódica porque no se reutiliza, es de un solo uso. 7.- 3 lavados con TTBS cada 10 minutos 8.- Revelado con ECL: ECL kit comercial contiene 2 soluciones Se mezclan a partes iguales en un tubo protegido de la luz. · Se cubre la membrana con la solución de ECL durante 1 min y se deja secar · Se coloca en un cassette de revelado, dejando la cara que estuvo en contacto con el gel hacia arriba. En el cuarto oscuro (con la luz roja encendida o a oscuras): · Se corta una película fotográfica a medida y se coloca en el cassette, justo encima de la membrana · La película se expone durante el tiempo adecuado. Dependiendo del anticuerpo con el que se haya incubado la membrana el tiempo de exposición de la película será mayor o menor: Anticuerpo Tiempo de exposición P-ERK ……………………………..3-5’ P-JNK……………...................….…15’ P-IKB………………....................….45’ · Por último, la película se revela en la máquina.



STRIPPING Materiales y Reactivos

- Baño a 72º - Buffer Stripping - β- mercaptoetanol Método de Stripping

Por cada membrana se necesitan: 20ml buffer Stripping + 100μl β- mercaptoetanol Cada membrana se coloca en una cubeta con tapa y se deja en el baño durante 1h. Después se lavan las membranas al grifo durante 1minuto Se dejan 5 min con agua destilada en el balancín 15-30 min con TTBS Se bloquean al 5% de leche

El bloqueo permite prevenir la unión no específica del sistema de detección a la membrana, evitando así la aparición de falsos positivos. Las soluciones que más se utilizan para bloquear son leche en polvo y BSA (solución de albúmina sérica bovina) Este método “Stripping” permite reutilizar las membranas con otro anticuerpo distinto



RESULTADOS

TLR2 y TLR4 son detectados y localizados en las válvulas aórticas humanas Usando inmunofluorescencia, las dos proteínas receptoras son localizadas en las células intersticiales entre las fibras de colágeno.

Las células HAVICs expresan los receptores TLR2 y TLR4 Cuando se cultivan las células HAVICs, éstas adoptan un fenotipo similar a un miofibroblasto. La identificación de miofibroblastos en células aisladas, se realiza aplicando una doble tinción inmunofluorescente para detectar estas dos proteínas. La expresión de TLR2 y TLR4 en HAVICs fue demostrada por inmunoblot, siendo comparables los niveles de receptores en células recién aisladas y en células cultivadas. Los efectos de los agonistas de los receptores sobre los niveles de proteínas de receptores fueron calculados en células aisladas. Mientras los niveles de TLR4 no están influidos por la estimulación con LPS o con PGN, la estimulación de LPS durante 24 horas incrementa los niveles de TLR2. Usando anticuerpos específicos, observamos que todas las células tienen niveles detectables de TLR2 y TLR4. Ambos receptores están distribuidos en la membrana y en el citoplasma.

TLR2 y TLR4 median la señalización pro-inflamatoria en HAVICs cultivadas Para determinar si los receptores TLR2 y TLR4 detectados en las células HAVICs son funcionales, calculamos la respuesta de los agonistas de los receptores, LPS y PGN respectivamente, usando la activación del factor NF-kB. La estimulación de las células con LPS y PGN resulta en una rápida fosforilación de NF-kB y en la translocación intranuclear de este factor.

TLR2 y TLR4 regulan la producción de los mediadores pro- inflamatorios en HAVICs cultivadas

En condiciones basales, las células HAVICs liberan bajos niveles de IL-6 y IL-8. Sin embargo, al tratarlas con LPS o PGN incrementan considerablemente estos niveles de citocinas. Para examinar la expresión de ICAM-1 se llevaron a cabo inmunoblots. Las HAVICs cultivadas expresan un nivel bajo de ICAM-1 antes de la estimulación pero los niveles de ICAM-1 también incrementan tras la estimulación con LPS o PGN, siendo mucho mayores en las células tratadas con LPS. Así mismo, al comparar los niveles relativos de estos dos receptores en células normales y en células estenóticas, comprobamos que los niveles de TLR4 son mayores en las células estenóticas mientras que en los niveles de TLR2 no se aprecian cambios.

Estos resultados sugieren que TLR2 y TLR4 pueden jugar un papel en la inflamación y la estenosis de la válvula aórtica. Para un futuro, se ha propuesto llevar a cabo el estudio de la expresión de los genes implicados en este proceso usando “microarrays”.



EXTRACCIÓN DE MONOCITOS HUMANOS DE SANGRE DE DONANTES

Preparamos 3 tubos Falcon con 25 ml cada uno de PBS(suero) al 10% - Dilución 1:2

Y 4 tubos con 15 ml de Ficol - Dilución 1:3 La sangre se diluye en los 3 tubos de PBS al 10% con ayuda de una pipeta

(Para hacer los experimentos se utiliza suero al 2 %) La sangre diluida se pasa a los tubos con Ficol Se centrifuga a 1900 r.p.m durante 30’

Las células se separan por gradiente de densidad

Se extrae con mucho cuidado el anillo de monocitos y linfocitos con una pipeta Pasteur y se pasa a otro Falcon. Se añade PBS

Se centrifuga a 1500 r.p.m 10’ , 3 veces En cada centrifugado se elimina el sobrenadante y se añade PBS

Se cuentan las células con una cámara de contaje “Malassez” Las células se plaquean en placas con medio de cultivo para que se diferencien los

monocitos de los linfocitos Los monocitos son adherentes y se quedarán pegados a la placa mientras que los linfocitos se quedan flotando en el medio. A los 15 días los monocitos se diferenciarán a macrófagos.

Una vez que obtenemos los macrófagos, se realiza el mismo experimento que a las células HAVICs para estudiar también en ellos los receptores de inmunidad innata de tipo Toll.



BALANCE PERSONAL La realización de las prácticas en el centro IBGM ha sido una experiencia realmente interesante y satisfactoria, que me ha servido para introducirme un poco más en el mundo de la investigación, un tema en el que estoy realmente interesada. He podido ver distintas técnicas muy utilizadas actualmente en el campo de la Biología, pudiendo poner en práctica muchos de los conocimientos teóricos que he adquirido a lo largo de la carrera. También me ha servido para valorar la dedicación y el esfuerzo personal que requiere este trabajo así como para conocer las distintas opciones que puedo encontrar ante un futuro profesional. Por último, mencionar lo agradecida y contenta que estoy con haber podido hacer las prácticas en este centro, donde me han tratado estupendamente.



BIBLIOGRAFÍA - Xianzhong Meng, Departments of Surgery and Medicine, University of Colorado Health Sciences Center.Expression of Functional Toll-like Receptors 2 y 4 in Human Aortic Valve Interstitial cells: Potential Roles in Aortic Valve Inflammation and Stenosis.October 2007 - Balk, R.A, The systemic inflammatory response syndrome. JAMA, 1995 - en.wikipedia.org - www.invivogen.com

Documents

IBGM DraCGarcia 08 VanessaIglesiasfacultadbiologia.usal.es/documentos/practicasempr/... · Extracción del RNA de las células ... Los frascos sin ningún tipo de medio se llevan