Identificación de levaduras presentes en el proceso de … · 2016-06-10 · 2016. Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan

Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen

corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares

Carla Yojana Portillo Carrascal

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Departamento de Producción Animal Bogotá, Colombia

2016

Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen

corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares

Carla Yojana Portillo Carrascal

Trabajo de investigación presentado como requisito para optar al título de: Magister en Producción Animal

Directora: PhD (c) Judith Figueroa Ramírez

Línea de Investigación: Microbiología de productos de la colmena

Grupo de Investigación: AYNI Grupo en Ciencia y Tecnología Apícola

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Departamento de Producción Animal Bogotá, Colombia

2016

A Dios Padre Celestial por regalarme siempre

bendiciones a lo largo de mi vida.

A mis hijos por ser mis motores de energía

en este mundo, a mi gran Amor por creer

siempre en mis ideas y su apoyo

incondicional en este camino, a Judith

Figueroa por su ayuda invaluable a lo largo

de este proyecto, a mi mamá porque siempre

me inculcó levantarme, sin importar cuantas

veces fuera necesario.

“Todo tiene su tiempo, y todo lo que se quiere debajo del cielo tiene su hora” Eclesiastés 3:1

Agradecimientos A la Universidad Nacional de Colombia y a la Facultad de Medicina Veterinaria y de

Zootecnia por enseñarme la diferencia entre el valor y el precio de la vida y por

permitirme soñar con un futuro mejor, a todos mis profesores que estuvieron a los largo

de este proyecto, especialmente a Judith Figueroa y Gregorio Piñeros, a todos los que

conforman el grupo AYNI, a Howard Junca por toda su asesoría, a Víctor Manuel Tibata

por el apoyo académico y moral en todo momento, al señor Jacobo Porras por el apoyo

en la obtención de las muestras, a Andrés y Dianita, sin la ayuda de ustedes esto no

sería una realidad hoy. Mil gracias.

Resumen y Abstract IX

Resumen El “pan de abejas” es un producto que las abejas elaboran en el interior de las colmenas

a partir del polen floral, posee características de interés en nutrición humana. Estudios

han demostrado que la transformación del polen apícola a pan de abejas es producto de

la fermentación desarrollada por microorganismos entre los que se destacan bacterias y

levaduras.

Las levaduras ha sido el grupo menos investigado. El presente estudio planteó el

objetivo general de identificar los géneros y las especies de levadura involucradas en la

transformación de polen en pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares.

Metodología. Se colectaron muestras de pan de abejas de Apis mellifera a partir de

celdas individuales y se separaron de acuerdo con el nivel aproximado de llenado de los

alveolos, así: 1. ≤ 2 mm de profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15 mm y 4. ≥ 15mm. Se

complementó el estudio mediante un muestreo exploratorio de pan de abejas en pote de

colonias de la Tribu Meliponini, correspondientes a los géneros Scaptotrigona, Plebeia y

Paratrigona, así como de la especie Tetragonisca angustula. Las muestras de pan de

abejas y polen de pote fueron procesadas mediante la técnica de siembra directa. Los

cultivos fueron incubados a 35°C durante 48 horas. Las placas con crecimiento se

resembraron, y se incubaron a 35°C durante 48 horas. Este procedimiento se repitió

hasta obtener colonias en cultivo puro. Las formas levadurales fueron caracterizadas en

cuanto al perfil bioquímico mediante el sistema Vitek2® y técnicas moleculares por

medio de PCR y de la secuenciación del ADN genómico de cada una de las cepas a las

cuales se les amplificó un fragmento ITS de la región 5,8S ribosomal.

Resultados. Se identificó en el pan de abejas de A.mellifera la presencia de los géneros

Candida, Kodamaea Metschnikowia y Zygosaccharomyces. Para los dos últimos se

presentó relación entre la detección y estadios específicos de llenado alveolar. También

se identificaron levaduras relacionadas exclusivamente con el pan de abejas de la Tribu

X Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares

Meliponini como Starmerella meliponinorun, Candida versatilis y Starmelera bombicola.

Igualmente se presentan levaduras asociadas por primera vez con los productos de las

abejas Yarrowia lipolytica. Los resultados en los perfiles bioquímicos del sistema Viek2®

presentan diferencia en las levaduras para la asimilación de compuestos según el origen

entomológico y según el volumen de llenado alveolar para el caso de la especie Apis mellifera, lo que permite un acercamiento a la cinética ocurrida en la maduración del pan

de abejas.

Como conclusión general del estudio se indica que existen diferencias entre las especies

de levaduras presentes en el pan de abejas de Apis mellifera y abejas de la Tribu Meliponini, asimismo, se identifica la presencia de diferentes tipos de levadura según el

volumen de llenado del alveolo. También se reconoce la importancia del género Candida en el proceso de maduración del pan de abejas, dado se recuperó en un alto número de

casos.

El presente trabajo representa un aporte importante para el entendimiento del proceso

de transformación del polen apícola al pan de abejas.

Palabras Clave: Apis mellifera, pan de abejas, polen, secuenciación, levaduras, abejas

nativas.

Resumen y Abstract XI

Abstract When bees collect pollen, they store it in individual comb cells and this creates a pellet

with layers as different loads are compacted in it. The pollen undergoes a fermentation

process that creates “bee bread” which has been found to have interesting properties for

human nutrition. Previous studies have shown that several bacteria and yeasts mediate

this transformation. Out of these, the yeasts group has been the least investigated.

The aim of the present study was to identify the yeasts genres and species involved in

this process by traditional and molecular means.

Methodology. Apis mellifera bee bread samples were collected from individual comb

cells and were classified according to the height of the pellet (which is interpreted as a

filling level) as follows: 1. ≤ 2 mm deep, 2. From 3 to 10 mm deep, 3. From 11 to 15 mm

deep and 4. Greater than 15 mm deep. The study was complemented using an

exploratory sampling of bee bread from colonies of the Meliponini Tribe (Stingless bees).

The sampled genera were Scaptotrigona, Plebeia and Paratrigona, and the Tetragonisca angustula species. All the bee bread samples were processed using the direct culture

technique. The cultures were incubated at 35ºC for 48 hours. The dishes that showed

growth were cultured again and incubated at the same temperature and for the same

length of time. This process was repeated until colonies in pure culture were obtained.

The yeast forms were characterized according to their biochemical profile using the

Vitek2® system and by means of genomic DNA PCR and sequencing for each one of the

strains obtained. The genome fragment amplified corresponded to the 5,8S – ITS region.

Results. The presence of Candida, Kodamaea, Metschnikowia and Zygosaccharomyces yeast genera in A. mellifera bee bread was found. For the latter two, a relation between

their presence and a specific cell filling level was detected. Yeasts that were exclusively

in the bee bread from colonies of the Meliponini Tribe were also identified. These

belonged to the Starmerella meliponinorun, Candida versatilis and Starmelera bombicola species. Likewise, there was identified for the first time in bee bread the yeast species

Yarrowia lipolytica. The results from the biochemical profiles of Vitek2® show a difference

in the yeasts for the assimilation of compounds according to the entomological origin and

for the cell filling level on A. mellifera, which allows to better understand the kinetics

XII Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares

involved on the maturation of bee bread.

Discussion. On this study we concluded that there are differences among the yeasts

species present on bee bread from A. mellifera and from colonies of the Meliponini Tribe.

There are also specific yeasts according to the cell filling level. The importance of the

Candida genera on the bee bread maturation process is also recognized, due to the fact

that it was identified in a high number of cases.

The present study represents an important contribution for the understanding of the

transformation process from pollen to bee bread.

Keywords: Apis mellifera, bee bread, pollen, sequencing, yeasts, stingless bees.

Contenido XIII

Contenido Pág.

Resumen ......................................................................................................................... IX

Lista de figuras ............................................................................................................. XV

Lista de tablas ............................................................................................................. XVI

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Objetivos ................................................................................................................... 9

2. Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia ..................................................................................................... 11

2.1 Polen apícola .................................................................................................... 14 2.1.1 Producción de polen apícola en Colombia ...................................................... 14 2.1.2 Características del polen apícola ................................................................... 16

2.2 Pan de abejas .................................................................................................... 19 2.2.1 Características del pan de abejas Apis Mellifera ............................................... 20 2.2.2 Características físico–químicas y nutricionales ................................................. 20 2.2.3 Microbiota del pan de abejas ........................................................................... 22 2.2.4. Técnicas de identificación y clasificación de levaduras ................................. 25

3. Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia ........... 35

3.1 Introducción .................................................................................................... 36

3.1.1 Polen corbicular y pan de abejas ............................................................. 36 3.2 Sistemas manuales y automatizados aplicados a la identificación de microorganismos asociados a las abejas ...................................................................................................... 44

3.3. Materiales y métodos .......................................................................................... 46 3.4 Resultados ............................................................................................................ 49 3.5 Discusión .............................................................................................................. 56 3.6 Conclusiones ........................................................................................................ 58 3.7 Referencias ........................................................................................................... 59

4. Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares ..................................... 67

4.1 Introducción .......................................................................................................... 68 4.2 Materiales y métodos ............................................................................................ 71

4.2.1 Muestreo de pan de abejas de A. mellifera ...................................................... 71

XIV Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares

4.2.2 Muestreo de pan de abejas nativas ..................................................................71

4.3 Cultivo y aislamiento microbiológico ...................................................................... 71 4.4 Identificación por biología molecular ...................................................................... 72 4.5 Resultados ............................................................................................................ 73 4.6 Discusión ............................................................................................................... 79 4.7 Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 81 4.8 Referencias ........................................................................................................... 83

5. Discusión .................................................................................................................87

6. Conclusiones y Recomendaciones .......................................................................91 6.1 Conclusiones ......................................................................................................... 91 6.2 Recomendaciones ................................................................................................ 92

Contenido XV

Lista de figuras Pág.

Figura 2-1. Exportaciones de polen colombiano, años 2001 a 2007

Figura 3-1. Proceso de colecta del pan de abejas de Apis mellifera Figura 3-2. Proceso de aislamiento de levaduras

Figura 3-3. Relación de las levaduras aisladas de pan de abejas con la respectiva

especie de abeja Figura 4-1. Levaduras aisladas en pan de abejas de apis mellifera según el

volumen de llenado del alvéolo

Figura 4-2. Árbol de distancias (nj tree) resultante del alineamiento de las

secuencias de ITS obtenidas de las cepas de levaduras aisladas a partir de pan de

abejas de apis mellifera y de la tribu meliponini

15

47

48

56

74

76

Contenido XVI

Lista de tablas Pág.

Tabla 2-1. Composición del polen apícola de tres países en América del Sur

Tabla 2-2. Composición proximal del polen apícola en cuatro sub-regiones del

altiplano Cundiboyacense

Tabla. 3-1. Mohos presentes en diferentes etapas del proceso de elaboración del

pan de abejas

Tabla 3-2. Levaduras asociadas con las abejas Apis mellifera

Tabla 3-3. Muestras de pan de abejas colectadas en el estudio

Tabla 3-4. Aislamientos de levaduras de pan de abejas de Apis mellifera

identificadas por el sistema VITEK ® Tabla 3-5. Resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas efectuadas por el

sistema Vitek2® para los aislamientos de abejas Apis mallifera y abejas de la Tribu

Meliponini.

Tabla 3-6. Aislamientos de levaduras de pan de abejas en pote de cuatro especies

de abejas sin aguijón, identificadas por el sistema VITEK ®

17

18

39

41

48

51

53

55

Introducción En Colombia actualmente la apicultura es una actividad productiva en crecimiento

que cuenta con cerca de 90.000 colmenas tecnificadas (CPAA, 2011). La

producción de polen se ha identificado como una importante ventaja comparativa

para Colombia en el sector apícola (Sánchez et al., 2013), dado que en los bosques

altoandinos del país se pueden obtener niveles de producción cercanos a los 40 Kg

por colmena al año (Martínez, 2006), lo que corresponde a más del doble de lo

reportado en otros países de importancia apícola como China, Argentina y Brasil,

que no superan los 15 Kg por colmena al año (Bogdanov, 2011), (Laverde et al.,

2010). Se estima que Colombia produce cerca de 150 toneladas de polen (CPAA,

2011) de las cuales alrededor del 90 % se obtienen en los departamentos de

Boyacá y Cundinamarca (Martínez, 2006).

El polen apícola posee características composicionales que lo hacen un alimento

interesante para la nutrición humana y animal. Estudios realizados específicamente

en polen de los departamentos de Boyacá y Cundinamarca destacan su alto

contenido de proteínas, equivalente al 23.8 %, de carbohidratos 39.8 % y la

presencia de fibra dietaria en un 14.5 % (Dominguez y Quicazán, 2014), sin

embargo existen investigaciones que sugieren que el aparato digestivo humano es

incapaz de utilizar la totalidad de los nutrientes contenidos en el polen, debido a que

estos se encuentran protegidos por una capa exterior o exina. Al respecto, estudios

de simulaciones in vitro muestran que de los nutrientes presentes en el polen se

aprovecharía máximo el 59 % (Campos et al., 2010).

La mencionada riqueza nutricional del polen apícola también lo hace un a limento

susceptible de ser degradado rápidamente por microorganismos cuando no se

realizan procesos de conservación poscosecha, asimismo es un alimento que puede

contaminarse con relativa facilidad al efectuar prácticas de manejo inadecuadas.

2 Introducción

Normalmente el polen es obtenido por medio de dispositivos denominados

“colectores de polen” o “trampas de polen” y posteriormente es sometido a un

proceso de deshidratación en el cual se disminuye su carga microbiológica y se le

confiere una mayor vida útil, sin embargo, investigaciones efectuadas al polen

apícola posterior al proceso de deshidratación demuestran que dicho mecanismo no

garantiza por completo que el polen presente una calidad microbiológica deseable,

por ejemplo, en un estudio efectuado en polen de cuba, de 28 muestras de polen

apícola deshidratado el 100 % presentó recuentos fuera de los límites tomados

como referencia para los microorganismos mesófilos, coliformes totales, hongos

filamentosos y levaduras, adicionalmente, en el 25 % de las muestras se aislaron

coliformes fecales (Leyva et al., 2010); en Colombia se valoró la calidad

microbiológica del polen apícola comercial de 90 muestras procedentes de los

departamentos de Boyacá y Cunidamarca; tomando como referencias las norma de

México 097 de 2007 y el artículo 785 del Código Alimentario Argentino, los análisis

mostraron que el 77 % de las muestras se encontraron por fuera de los valores

establecidos para al menos un parámetro de los estipulados en las normas de

referencia (Sánchez et al., 2013).

La baja digestibilidad de los nutrientes presentes en el polen apícola y los

problemas asociados con la calidad microbiológica del producto, han motivado el

desarrollo de estudios que permitan entender los mecanismos que utilizan las

abejas para mejorar la disponibilidad de los nutrientes y conferirle una mayor

estabilidad al polen, de este modo se sabe que las abejas no consumen el polen de

manera directa, en la forma en que normalmente se comercializa para el consumo

humano, sino que estos insectos transportan el polen al interior de las celdas donde

se mezcla con miel y con las secreciones salivares de las abejas, lo que

proporciona un ambiente anaeróbico que favorece la fermentación del polen hasta

transformarse en el producto denominado pan de abejas, el cual es finalmente

consumido por los insectos (del Risco Ríos, 2004).

Pese a que el pan de abejas se origina a partir del polen apícola, al comparar estos

dos productos como alimentos se observan características que los diferencian; se ha

reportado que el pan de abejas presenta valores de pH de 3.9, en tanto que el polen

apícola presenta valores de pH 4.7, asimismo se reportan variaciones en el contenido de

Introducción 3

proteínas solubles de 837 mg/ml para el polen y de 567 a 577 mg/ml para el pan de

abejas. En cuanto a la presencia de aminoácidos se reporta que de los 10 aminoácidos

esenciales para las abejas, todos a excepción de la histidina se encuentran tanto en el

polen como en el pan de abejas, sin embargo la concentración media de los mismos

varía en cada producto, por ejemplo las concentraciones de leucina y treonina son

aproximadamente 60 % más altas en el pan de abeja comparadas con el polen apícola,

de igual modo se ha encontrado que las concentraciones de valina son

aproximadamente 25 % más altas en el pan de abejas; este patrón se reporta en otros

aminoácidos como la alanina, el ácido aspártico y la glutamina a excepción del triptófano,

el cual presenta mayor concentración en el polen apícola (De Grandi-Hoffman et al.,

2013). En cuanto a la solubilidad de las proteínas, se reporta que el pan de abejas

presenta valores entre 2.9 % - 5.6 % superiores a las obtenidas en el polen apícola

(Campos et al., 2008) e igualmente el pan de abejas posee nutrientes no presentes en el

polen apícola, como vitaminas (Loper et al., 1980).

El proceso de trasformación del polen apícola al pan de abejas se genera por la

intervención de diversos microorganismos, entre estos se han identificado por métodos

tradicionales de cultivo bacilos como B.subtilis, B.megaterium, B.lincheniformis,

B.cirulans y B.pumilus, Lactobacilos como L. kunkeii, L. jenseneii, L.fructosus y L. plantarum así como la presencia de numerosas levaduras como Candida parapsilosis, Candida reukaufii, Candida tenuis, Torulopsis candida, Torulopsis etchellsii, Torulopsis famata, Torulopsis globosa, Torulopsis incospicua, Torulopsis sake, Torulopsis stellata

(Gilliam, 1979). Muchos de estos microorganismos provienen del tracto digestivo de la

abeja y son inoculados en el polen cuando la abeja adiciona el néctar que conserva en el

buche melario. Se sabe que los microorganismos efectúan un proceso de acidificación

que le confiere una mayor vida útil al pan de abejas, asimismo se ha descrito que los

microorganismos efectúan una pre-digestión del polen y que son importantes

generadores de enzimas como pectinasas, celulasas y proteasas, entre otras (del Risco

Ríos, 2004).

El pan de abejas se encuentra dentro de las celdas al interior de la colmena, por lo

tanto su cosecha es compleja y poco eficiente, lo que en consecuencia ha generado

que dicho producto no sea comercializado. Esta limitante ha motivado el desarrollo

de diversos ensayos en búsqueda lo que se ha denominado “pan de abejas artificial”,

4 Introducción

elaborado a partir del polen apícola. Los ensayos mencionados corresponden a

bioprocesos fermentativos que emplearon inóculos de bacterias acidolácticas

comerciales y cepas aisladas directamente del pan de abejas; entre las bacterias

evaluadas se reportan L. plantarum, L. coryniformis y L. delbrueckii L. casei y L. acidophilus (del Risco Rios, et al., 2012) (Fuenmayor et al., 2011). Para el caso

específico de Colombia se han realizado ensayos adicionando las enzimas Protamex,

Suberase y Viscoflow (Castro et al., 2014) y fuentes secundarias de nutrientes como

fosfato y miel (Domínguez et al., 2014).

Específicamente sobre el grupo de las levaduras se han efectuado aislamientos en el

pan de abejas correspondientes a los géneros Candida, Rhodotorula, Cryptococcus, Torulopsis, Zygosaccharomyces, Aureobasidium, Metschnikowia y Trichosporon (Gilliam,

1979b; Carvalho et al., 2010; Nogueira et al., 2012; Sinacori et al., 2014; Cadez et al.,,

2015).

El presente estudio buscó generar aportes en el conocimiento de las levaduras presentes

en el proceso de conversión de polen corbicular de Apis mellifera a pan de abejas,

mediante el uso de técnicas de cultivo tradicionales y técnicas de biología molecular.

Adicionalmente se realizó un trabajo exploratorio con el fin de establecer las levaduras

presentes en potes de pan de abejas de tres géneros de abejas sin aguijón.

La investigación se realizó en el marco del proyecto “Identificación de levaduras

presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por

métodos tradicionales y moleculares para su aplicación en el desarrollo de alimentos

apícolas”, el cual fue financiado por el Departamento Administrativo de Ciencia

Tecnología e Innovación COLCIENCIAS.

En cuanto al enfoque metodológico el estudio presentó una fase cualitativa

correspondiente a la observación en campo de los procesos de llenado de los alveolos

con pan de abejas, y una fase cuantitativa correspondiente al procesamiento en

laboratorio y análisis de las pruebas efectuadas.

Las muestras utilizadas en el estudio provinieron de dos colonias de abejas Apis mellifera

ubicadas en la ciudad de Bogotá (Cundinamarca) y correspondieron a polen alveolar en

Introducción 5

tres niveles de llenado: 1. equivalente a ≤ 2 mm de profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15

mm y 4. ≥ 15mm, que se relacionaron con alveolos con aspecto de llenado completo.

También se colectaron muestras de pan de abejas en pote de cuatro especies

pertenecientes a la Tribu Meliponini: Tetragonisca angustula, Paratrigona spp., Plebeia spp., Scaptotrigona spp, las cuales se encontraban ubicadas en el departamento de

Santander. En total se colectaron 198 muestras de Apis mellifera y 45 muestras

meliponinos. Las muestras de pan de abejas y polen de pote fueron procesadas

mediante la técnica de siembra directa, los cultivos fueron incubados a 35°C durante 48

horas para simular el proceso natural de las colmenas y las placas con crecimiento se

resembraron e incubaron a 35°C durante 48 horas; este procedimiento se repitió hasta

obtener colonias en cultivo puro. Las formas levadurales fueron caracterizadas en cuanto

al perfil bioquímico mediante el sistema Vitek2® y mediante técnicas moleculares por

medio de PCR y secuenciación del ADN genómico de cada una de las cepas a las cuales

se les amplificó un fragmento de la región 5,8S – ITS que codifica para la region rDNA.

El análisis bioinformático efectuado a los aislamientos obtenidos a partir de pan de

abejas de Apis mellifera, permitió establecer que las levaduras presentaron identidades

entre el 92 y el 100 % con cuatro especies diferentes: Candida apicola, Kodamea ohmeri, Mestchikowa pulcherrima y Zygosaccharomyces siamensis. Los tamaños de las

secuencias obtenidas variaron entre 500 pb y 700 pb. Las levaduras K. ohmeri y M. pulcherrima fueron las levaduras que se recuperaron en mayor proporción.

De este modo, se encontraron asociaciones entre levaduras y los volúmenes de llenado

específicos en los estadios de llenado alveolar; del uno al tres se detectó la presencia de

la levadura Zygosaccharomyces siamensis, y la levadura Metschnikowia pulcherrima fue

aislada exclusivamente en los segmentos de llenado alveolar tres y cuatro, cuando el pan

de abejas presenta mayor tiempo de maduración. El estudio también permitió identificar

especies de levaduras presentes solo en pan de abejas en pote de meliponinos, como es

el caso de Candida versatilis y Candida versatilis; para esta última es el primer reporte

que se genera asociado a los derivados de las abejas. Igualmente, para el caso de la

especie Paratrigona spp., abejas presentes de forma importante en los meliponarios del

departamento de Santander, los reportes de levaduras son los primeros generados en la

literatura científica.

6 Introducción

Los perfiles bioquímicos de los aislamientos generados por el Vitek2® ofrecen un primer

acercamiento para entender la cinética entre los microorganismos presentes en el

proceso de maduración del pan de abejas, dado que se encuentran grupos de

compuestos que para el caso de Apis mellifera, presentan asimilación solo en ciertas

etapas de llenado del alveolo, de la misma forma se presentan compuestos que solo

fueron asimilados por aislamientos obtenidos de abejas de la Tribu Meliponini, de lo cual

se infiere que existen diferencias asociadas al origen entomológico.

A partir del estudio se generó una colección de levaduras caracterizadas, las cuales

podrán ser utilizadas en estudios posteriores para la elaboración de pan de abejas

industrial u otras aplicaciones industriales, dado que la mayoría de las especies

identificadas presentan actividades de interés biotecnológico.

El alcance de los resultados obtenidos en el presente estudio se limita al pan de abejas

de las cuatro especies de insectos incluidos en el desarrollo de la investigación, no

obstante son comparables con resultados obtenidos en otros estudios similares en otras

abejas y en otros países, de la misma forma la técnica empleada para la valoración del

estado de maduración, teniendo en cuenta el llenado alveolar, puede ser utilizada en la

valoración de otros grupos de microorganismos o en el desarrollo de estudios asociados

a los compuestos presentes en cada etapa de llenado.

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microorganisms associated with honeys of different geographical and botanical origin.

Food Microbiology, 38, 284 – 294.

1. Objetivos

1.1 Objetivo general Identificar géneros y especies de levaduras involucradas en la transformación del polen

en pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares.

1.2 Objetivos específicos Aislar mediante métodos microbiológicos convencionales levaduras presentes

durante los 15 días del proceso de transformación de polen en pan de abejas de Apis mellifera.

Identificar las levaduras aisladas, mediante un método bioquímico automatizado y

mediante la secuenciación del gen que codifica para el ARN ribosomal de la

subunidad 18S.

Obtener información sobre las levaduras involucradas en la producion de pan de

abeja de Apis mellifera. con el objeto de contribuir al desarrollo de productos

industriales utilizando como materia prima el polen.

2. Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia

Las abejas son insectos de gran interés para la humanidad, dado que obtiene diversos

beneficios económicos y ambientales a partir de la cría y el manejo de dichos animales. A

nivel mundial se han identificado cerca de 17.000 especies de abejas, pero se estima que

existen más de 25.000 (Michener, 2007). De acuerdo con la clasificación efectuada por

Michener, las abejas se encuentran distribuidas en siete familias (Michener, 2007), de las

cuales cinco se encuentran presentes en Colombia: Colletidae, Andrenidae, Halictidae,

Megachilidae y Apidae (Vélez Ruiz, 2009). A nivel productivo la mayoría de especies de

abejas utilizadas provienen de la sub-familia Apinae, incluidas en la familia Apidae,

específicamente de las tribus Apini y Meliponini (Moure, 2012).

La especie Apis mellifera de la Tribu Apini, denominada comúnmente como abeja

doméstica o melífera, es la abeja más difundida a nivel mundial, ocupando grandes

extensiones en casi todos los continentes dada su alta capacidad de adaptación a los

diversos climas y nichos ambientales. Entre las abejas, Apis mellifera es la de mayor

desarrollo en cuanto a conocimiento de productos, mercado y normatividad, y es la única

especie de abeja que cuenta con norma CODEX internacional para la comercialización de

sus mieles (FAO, 1995), e igualmente es la única especie con parámetros definidos en

cuanto a sanidad animal, de reporte obligatorio ante la OIE (OIE, 2015).

En cuanto a la Tribu meliponini, cuenta con una variedad de especiesconocidas como

abejas sin aguijón, muchas de estas con características productivas de interés zootécnico.

A nivel morfológico poseen tamaños que varían entre los 2 mm y 1.5 cm, poseen aguijón

reducido, alas con venación débil o reducida, ojos desnudos y presentan corbícula aunque

en algunas especies esta estructura es reducida (Nates Parra, 2001). El trabajo productivo

con abejas de la mencionada Tribu ha venido creciendo paulatinamente en los últimos

12 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares

años, en lo que se puede denominar como un escenario mundial de expansión de la

meliponicultura (Nates Parra & Rozo Londoño, 2013), nombre con el que se denomina la

actividad productiva con estos insectos. Estas abejas producen miel, cera y otros productos

que pueden ser aprovechados tanto en el campo de la nutrición como en el de la medicina,

además, por su abundancia son especies importantes en los procesos de polinización de

cultivos y de plantas silvestres (González-Acereto & Quezada-Euán, 2010).

Se estima que Colombia posee entre 50.000 y 90.000 colmenas tecnificadas de la especie

Apis mellifera (CPAA, 2011), la mayoría en manos de pequeños productores, de este modo

la media de colmenas por apicultor en el país es de 19 (Martínez, 2006). Debido a que

estas abejas no son nativas y fueron introducidas inicialmente con linajes europeos, pero

posteriormente se dio un proceso de africanización, actualmente se desconoce con

exactitud cómo es la mezcla genética de las abejas Apis mellifera colombianas (Sánchez et

al., 2013), no obstante, un estudio efectuado en 14 departamentos (Antioquia, Bolívar,

Boyacá, Caldas, Cauca, Cesar, Cundinamarca, Huila, Nariño, Santander, Tolima, Valle del

Cauca, Casanare y Meta) concluye que el 90.5 % de las colmenas de Apis mellifera

valoradas poseen haplotipos de linaje africano, el 7,6 % linajes europeos y el 1.9 %

haplótipos de Europa del Este (Salamanca, 2009).

En el país se han identificado 120 especies de abejas sin aguijón, sin embargo sobre la

cantidad de colmenas productivas de estas abejas han sido realizados pocos estudios; se

reporta que para el año 2013 en 17 departamentos fueron identificados un total de 75

productores con abejas sin aguijón o meliponicultores, con un promedio de 12.3 colmenas

por productor, para un total de 927 colmenas, de las cuales el 57 % fueron de la especie

Tetragonisca angustula, el 11 % Melipona spp., el 8 % Scaptotrigona spp., y el 8 %

Nanotrigona spp (Nates Parra & Rozo Londoño, 2013).

En cuanto a los productos derivados de la actividad productiva con abejas, estos se

pueden clasificar en dos tipos, bienes y servicios (Sánchez et al., 2013) en el renglón de

los servicios el de mayor importancia corresponde a la polinización (Michener, 2007)

debido a su relación con la seguridad alimentaria de la humanidad, asimismo se reporta

entre los servicios el uso de abejas como bioindicadores (Reyes et al., 2009). Los bienes

obtenidos del manejo de las abejas se dividen en material biológico como núcleos,

paquetes de abejas y reinas (Laverde et al., 2010), bienes de segregación, que son

Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia

13

aquellos producidos directamente por glándulas propias de las abejas como la jalea real, la

cera y la apitoxina (Vit, 2005) y bienes de recolección-transformación, los cuales provienen

de materias primas colectadas de las plantas ubicadas en el entorno de la colmena, que

son mezcladas con sustancias propias de las abejas, entre este grupo de bienes se

encuentran la miel, el polen y los propóleos (Vit, 2004).

En Colombia el producto de mayor importancia comercial para las abejas Apis mellifera y

las de la Tribu Meliponini es la miel, la cual se encuentra definida en la normatividad del

país como un alimento de consumo humano producido por abejas obreras de diferentes

especies, a partir del néctar de las plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o

excreciones de insectos chupadores (Ministerio de Protección Social, 2010). La

composición de la miel varía de acuerdo con la flora en la cual la abeja recolecta el néctar,

no obstante para el caso de las mieles de Apis mellifera se cuenta con parámetros

estándar para las mieles independientemente de su origen geográfico, a diferencia de las

mieles de abejas nativas que muestran variaciones importantes entre especies, lo que ha

demostrado la necesidad de efectuar estudios más específicos para el desarrollo de una

normatividad (Vit et al., 2006; Domíngez et al., 2013). A pesar de ser un alimento, a la miel

se le atribuyen diversas propiedades terapéuticas, como la actividad cicatrizante (Shencke

et al., 2013) y antibacteriana (Gamboa y Figueroa, 2009), entre otras.

Actualmente se desconoce con exactitud el tamaño real del mercado colombiano para la

miel de abejas (Sánchez et al., 2013), se estima que el país produce alrededor de 1.600

toneladas de miel de abejas Apis mellifera (CPAA, 2011), que son consumidas

prácticamente en su totalidad al interior del país y abarcarían como máximo el 20 % del

consumo local, el restante 80 % del mercado es abarcado en su mayoría por mieles falsas

(Martínez, 2006). Para el caso de las mieles de abejas nativas solo se han realizado

estudios de mercado concretos para la especie T. angustula, la cual posee un potencial de

mercado estimado en 800.000 dólares para tiendas naturistas de la ciudad de Bogotá y

cuya miel es utilizada principalmente como tratamiento ocular, con precios hasta 10 veces

superiores que los pagados por la miel de Apis mellifera (Vargas e al., 2015).

Los propóleos corresponden a otro producto de importancia comercial derivado de la cría y

manejo de abejas, este se define como una sustancia resinosa de color pardo rojizo o

amarillo verdoso producido por las abejas a partir de resinas vegetales y que tiende a


oscurecerse (Bankova, 2005). Su composición se asocia con el origen vegetal de la resina.

En los propóleos se han identificado más de 300 compuestos que incluyen principalmente

grupos químicos como los ácidos aromáticos, ácidos ésteres aromáticos, flavonoides,

terpenoides, ácidos alifáticos (Mani et al., 2006). Se reportan como propiedades biológicas

del propóleo la actividad antibacteriana (Farré et al., 2004), la actividad antifúngica

(Burdock, 1998) y la actividad antiparasitaria (Pires Dantas et al., 2006). El comercio de los

propóleos se ha centrado exclusivamente en la especie Apis mellifera, sin embargo se

desconoce el tamaño de este mercado al interior del país, aunque se observan niveles de

adulteración superiores a los descritos en las mieles de Apis mellifera (Martínez, 2006).

El polen corresponde al segundo producto derivado de las abejas en cuanto a importancia

comercial. Para este, al igual que en el caso de los propóleos, el mercado se centra

exclusivamente en la especie Apis mellifera. Debido a que el polen es de especial interés

en el presente estudio, se hace especial énfasis en este producto.

2.1 Polen apícola El polen es el gameto masculino de las plantas, el cual es colectado por las abejas,

quienes lo transportan al interior de la colmena en estructuras especializadas denominadas

corbículas. Las mayoría de los requerimientos nutricionales de las abejas en cuanto a

proteína, minerales, lípidos y vitaminas, son suplidos mediante el consumo del polen

(Eckholm et al., 2014).

2.1.1 Producción de polen apícola en Colombia A nivel local la apicultura presenta diferentes enfoques productivos que varían de acuerdo

con la región en la cual se desarrolla; de este modo para las zonas cálidas los productores

se han especializado en la obtención de miel. Para las zonas frías como el altiplano

Cundiboyacense, los productores se han centrado en la producción de polen, debido a que

las condiciones medioambientales les permiten obtener producciones del orden de los 36

Kg por colmena/año (Martínez, 2006), siendo estos niveles productivos muy superiores a

los reportados en países como China, Argentina y Brasil que no superan los 15 Kg por

colmena al año (Bogdanov, 2011), dicho nivel productivo se entiende como una ventaja

comparativa del país (Sánchez et al., 2013), lo que en consecuencia promovió la

generación de organizaciones asociativas de productores especializadas en la obtención


15

del polen, como la Asociación de Apicultores de Cundinamarca ASOAPICUN o la

Asociación de Apicultores de Boyacá ASOAPIBOY (IICA, 2009).

Dado que el polen corresponde a un producto apícola menos desarrollado tanto a nivel

internacional como local comparado con la miel, su especialización ha requerido

desarrollos endógenos, entre los que se destacan los esfuerzos realizados en el diseño de

colectores por apicultores de Cundinamarca, así como los desarrollos en colectores de

techo generados en la Unidad Apícola del Centro Agropecuario Marengo CAM de la

Universidad Nacional de Colombia.

En cuanto al mercado, el polen apícola se puede considerar como un producto emergente,

con potencial de desarrollo (Martínez, 2006), el cual reporta ventas internacionales desde

el año 2004 con notables incrementos, siendo los principales destinos países

centroamericanos, especialmente Costa Rica, como lo muestra la figura 2-1 (Laverde et al.,

2010), y para el año 2010 se reportaron exportaciones de polen por ocho toneladas. Sin

embargo la mayoría del polen apícola producido es comercializado al interior del país, con

precios cercanos a $18.000 por kilogramo (3.17% Salarios Mínimos Legales Vigentes año

2012).

Figura 2-1. Exportaciones de polen colombiano, años 2001 a 2007

Fuente: (Laverde et al. , 2010)


2.1.2 Características del polen apícola El polen apícola se obtiene a través de colectores o trampas de polen que se ubican

normalmente en la parte inferior de la colmena, estos dispositivos impiden que las abejas

trasladen el alimento al interior de la misma, obligándolas a pasar por pequeños espacios

en los cuales se les desprenden los granos de polen (del Risco Ríos, 2004). Para el

consumo humano, el polen apícola es sometido a procesos de deshidratación, en los

cuales la humedad del producto se reduce a valores cercanos al ocho por ciento; este

proceso reduce la carga microbiana del producto y le proporciona una mayor estabilidad

(Barreto et al., 2005).

En Colombia se ha reportado que la mayoría de los apicultores colectan el polen en

campo cada 5 a 8 días, e inician el proceso de secado como máximo 10 horas

posteriores al proceso de cosecha, sin embargo existen productores que efectúan el

secado entre las 24 y 48 horas posteriores a la cosecha, pero en estos casos el producto

es sometido a un proceso de refrigeración a 4ºC (Sánchez et al., 2011).

Debido a que el polen posee un alto porcentaje de proteína, e igualmente puede

proporcionar carbohidratos, fibra dietaria y ácidos grasos, es considerado como un

alimento complejo con un amplio espectro de propiedades nutricionales y terapéuticas

para el ser humano (Bogdanov, 2011). No obstante, la composición del polen puede

variar de acuerdo con la ubicación geográfica de la de la colmena e incluso pueden

presentarse variaciones composicionales en un mismo espacio geográfico a lo largo del

año, debido a las fuentes florales a las que tienen acceso las abejas pecoreadoras

(Seeley, 2006). Estudios efectuados en Europa evidenciaron que las abejas visitan entre

35 y 56 especies de plantas en el proceso de pecoreo de polen (McLellan, 1976); para el

caso específico de Colombia un estudio realizado en apiarios de la Sabana de Bogotá

permitió establecer que dicho polen procedía de 103 especies de plantas, lo que

demuestra un alta riqueza botánica, siendo las familias de plantas más importantes en

este caso Asteraceae, Fabaceae, Brassicaceae, Rosaceae y Myrtaceae (Montoya

Pfeiffer, 2011).

Análisis proximales efectuados al polen apícola evidencian que los carbohidratos ocupan

un porcentaje importante de los nutrientes del polen, llegando a abarcar hasta el 75 % de


17

los componentes totales (Mendoza, 2014). De los azúcares presentes en el polen, la

mayoría corresponden a azúcares simples, debido a la agregación de néctar por parte de

la abeja para la formación del pelet (Stanley & Linskens, 1974).

El porcentaje de proteína presente en el polen puede alcanzar valores cercanos al 30 %,

lo que referencia al polen como un alimento altamente proteico (Mendoza, 2014), sin

embargo, de forma similar a lo que ocurre con algunas leguminosas secas, dicha

proteína solo puede ser digerida parcialmente; en cuanto a la presencia de aminoácidos

se reporta que el polen posee al menos 12 de los 20 aminoácidos esenciales para el ser

humano (Talpay, 1978).

Las grasas del polen se encuentran en proporciones que por lo general no superan el 10

% de la composición total (Díaz et al., 2009), el contenido de ácidos grasos libres es

considerable y puede abarcar el 55 % de los lípidos (Talpay, 1978). Las cenizas

representan entre el 2 % al 3.7 % de la composición del polen apícola, y poseen

minerales como el sodio, potasio, cobre y zinc entre otros (Mendoza, 2014). El polen

adicionalmente es una fuente de β-carotenos (Contreras, 2004), vitaminas E, B1 y B2,

ácido fólico y biotina (Oliveira et al., 2009). La Tabla 2-1 presenta la composición del

polen apícola de tres países.

Tabla 2-1. Composición del polen apícola de tres países en América del Sur

PARÁMETRO ECUADOR (Mendoza, 2014)

ARGENTINA (Baldi et al., 2004)

CHILE (Kelina et al., 2013)

Humedad % 6,69 - 9,75 5,82 8,8 - 11,9 Cenizas % 2,7 - 3,62 3,04 2,1 - 3 Proteína % 23,93 - 27,18 24,03 13,7 - 17,3 Grasa % 1,44 - 3,5 4,55 No reporta Fibra % 2,4 - 5,47 No reporta No reporta Carbohidratos % 33,47 - 75,67 No reporta 35 - 49,7 pH 4,93 - 5,79 5,46

Fuente: construcción propia a partir de los trabajos referenciados.

Para el caso específico del polen apícola colombiano se resalta el alto contenido de

proteínas que alcanza valores hasta del 31.2 % (Quicazán, 2010), que superan lo

reportado en la Tabla 1 para el polen de Ecuador, Argentina y Chile. El contenido de


vitamina E reportado para el polen colombiano es de 39,24 - 116,42 µg de a-tocoferol/g,

superior al reportado para el polen apícola procedente de Brasil, e igualmente supera

ampliamente los contenidos de la mencionada vitamina en otros alimentos como huevos,

cereales, granos, productos lácteos y productos del mar (Pulido et al., 2012).

El aporte de fibra dietaria del polen colombiano en promedio es de 13 %, del cual el

10.63 % es fibra dietaria insoluble y el 2.21 % es fibra dietaria soluble; dicho contenido de

fibra dietaria es similar al de otros alimentos tales como el trigo, el maíz y la avena (Díaz

et al., 2012). La Tabla 2-2 describe la composición proximal de 78 muestras de polen

apícola recolectadas en cuatro sub-regiones del altiplano Cundiboyacense.

Tabla 2-2. Composición proximal del polen apícola en cuatro sub-regiones del

altiplano Cundiboyacense

Sabana de Bogotá* Boyacá centro-oriente* Boyacá occidente* Boyacá sur*

Prom±SD1

2 Min

3 Max

Prom.± SD1

2 Min

3 Max

Prom.± SD1

2 Min

3 Max

Prom.± SD1

2 Min

3 Max

pH 4.77a ± 0.56 2.54 5.22 4.74a

± 0.32 4.23 5.56 4.47a ± 0.34 4.32 5.56 4.68a ±

0.25 4.21 5.37

Acidez (meq/Kg)

237.9a ± 38.7 179.0 317.3 240.1a

± 33.8 192.0 319.1 229.8a ± 45.5 154.5 302.3 258.7a

± 45.5 200.7 348.9

Humedad (g/100 g)

5.9a ± 1.7 3.4 9.7 5.4a ±

1.2 3.4 7.9 4.7a ± 1.7 1.8 8.6 6.0a ±

1.8 2.9 8.8

Cenizas (g/100 g)**

2.31a ± 0.39 1.62 2.93 2.40a

± 0.32 1.72 3.00 2.18a ± 0.45 1.53 2.90 2.51a ±

0.44 1.53 3.04

Grasa (g/100 g) **

5.8a,b ± 1.6 2.2 8.8 4.8b ±

1.6 2.5 7.0 6.3a,b ± 2.4 2.3 12.9 6.7a ±

1.3 4.6 9.2

Proteína (g/100g)**

23.8a ± 3.5 18.2 29.4 23.6a

± 3.6 18.8 30.2 22.5a ± 3.7 16.7 30.7 25.2a ±

3.4 18.7 31.2

Fibra dietaria Insoluble (g/100g)**

13.5a ± 3.0 10.9 18.5 11.8a

± 2.3 9.7 15.7 11.7a ± 3.0 7.5 16.3 13.1a ±

2.8 9.9 17.4

Fibra dietaria Soluble (g/100 g)**

1.83a,b ± 0.71 0.95 2.87 2.89b

± 1.23 0.96 4.26 3.05a,b ± 1.14 1.38 4.09 1.85a ±

0.62 0.51 2.57

1 Promedio, más o menos, desviación estándar, 2 Valor mínimo, 3 Valor máximo, *Número de muestras de la Sabana de Bogotá: 20; centro-oriente Boyacá: 19; Boyacá occidente: 17; Boyacá sur: 22, *Base seca, *** Letras diferentes al lado del promedio indican diferencias significativas.

Fuente: (Quicazán, 2010).


19

Si se tiene en cuenta la composición nutricional del polen apícola colombiano, así como los altos

volúmenes productivos reportados en los municipios de Boyacá y Cundinamarca, se puede

inferir que el polen apícola es un producto con un alto potencial económico para el país, sin

embargo aún presenta aspectos en el manejo poscosecha que deben ser mejorados (Sánchez

et al., 2013), dado que el proceso de secado convencional no garantiza en su totalidad la calidad

microbiológica del producto final, por ejemplo un estudio realizado en polen de Cuba mostró que

de 28 muestras de polen apícola deshidratado, el 100 % se encontró por fuera de los límites

tomados como referencia para los microorganismos mesófilos, coliformes totales, hongos

filamentosos y levaduras (Leyva et al., 2010). En Colombia el análisis de 90 muestras de polen

procedentes de los departamentos de Boyacá y Cundinamarca reportó que el 77 % de las

muestras se encontraron por fuera de los valores establecidos para al menos un parámetro de

los estipulados en la norma de México 097 de 2007 y el artículo 785 del Código Alimentario

Argentino, específicas para el polen apícola. Dichas limitantes han promovido el desarrollo de

estudios encaminados a mejorar los procesos poscosecha de polen, variando la posición del

colector en la colmena, valorando el efecto de la refrigeración, aplicando protocolos de limpieza

(Sánchez et al., 2011) y variando la temperatura de secado (Durán et al., 2014).

Una de las alternativas recientemente valoradas para superar los aspectos de calidad del polen

apícola, así como para mejorar la biodisponibilidad de los nutrientes en este producto, es la

aplicación de bioprocesos que simulen el manejo que le dan las abejas al polen en el interior de

la colmena para transformarlo en otro producto, denominado pan de abejas.

2.2 Pan de abejas El polen ingresado a la colmena por las abejas pecoreadoras no es consumido directamente,

sino que es transportado e introducido en celdas para el caso de las abejas Apis mellifera; allí el

polen es dispuesto en capas las cuales se mezclan con néctar transportado en el buche melario,

adicionando de este modo microorganismos propios de su tracto digestivo (Garcia et al., 2006).

Finalmente la celda es sellada con una capa delgada de miel (Gilliam, 1979) y de este modo se

genera al interior de esta un ensilaje anaerobio, a una temperatura aproximada de 35°C.

Después de 15 días de fermentación se presenta la conversión de polen a pan de abejas o polen

alveolar, donde cesa la actividad aparente de los microorganismos y se observa estabilidad en el

producto (Pain & Maugenet, 1966) (Loper et al., 1980).


Para el caso de las abejas de la Tribu Meliponini el polen colectado es almacenado en potes de

cera donde sufre un proceso de maduración similar al descrito para el pan de abejas de Apis mellifera, aunque se presentan diferencias en los microorganismos reportados (González-

Acereto & Quezada-Euán, 2010), asimismo existen algunas especie que no utilizan el polen

como fuente de alimento y suplen dicho producto con tejidos animales (Gilliam et al., 1985).

2.2.1 Características del pan de abejas Apis Mellifera Este producto es consumido por las abejas y es de suma importancia debido a que provee a

la colmena los requerimientos necesarios desde la etapa larvaria para el desarrollo y

funcionamiento metabólico de las abejas (Ament et al., 2008).

2.2.2 Características físico–químicas y nutricionales

El pan de abejas ha sido reconocido por muchas culturas ancestrales como una fuente

importante de alimento y de medicina alternativa, haciendo que los investigadores revaliden

su actividad nutricional y terapéutica. En general la composición nutricional del pan de abejas

es similar a la del polen. Sin embargo se espera que este último tenga un valor nutricional

más elevado debido a los cambios bioquímicos ejercidos por la acción microbiana durante

su almacenamiento (Gilliam, 1979) (Human & Nicolson, 2006).

Como alimento para el humano, el pan de abejas es considerado rico en proteínas de alto

valor biológico, y provee aminoácidos esenciales. Es también una buena fuente de potasio y

vitaminas del grupo B (Fuenmayor et al., 2011), asimismo se sabe que posee un contenido

de fenoles estimado entre 6.7 a 10.1 g/kg de materia seca (Tavdidishvili et al., 2014). Las

características nutricionales identificadas en el pan de abejas le confieren el potencial para

ser reconocido como un alimento funcional, capaz de servir como suplemento dietario e

incluso como nutracéutico (Fuenmayor et al., 2011).

Pese a que el pan de abejas se origina a partir del polen apícola, al comparar estos

dos productos como alimentos se observan características que los diferencian, por

ejemplo se reporta que el pan de abejas contiene comparativamente más azucares

reductores que el polen apícola procedente de un mismo origen floral (Gilliam, 1979),

de igual manera la acción de los microorganismos genera un descenso en el pH

(Foote, 1957), que le confiere al pan de abejas un pH de 3.9 en tanto que el polen


21

apícola presenta valores de pH 4.7 (DeGrandi-Hoffman et al., 2013).

La cantidad de agua presente en el polen apícola y el pan de abejas también presenta

variaciones: Para el caso del polen apícola se reportó un porcentaje de materia seca de 67.4

% y el pan de abejas colectado de las mismas colmenas presentó un porcentaje de materia

seca de 78.8 %, lo que corresponde a una disminución en la cantidad de agua del 11 %

(sobre la composición total), asimismo se observa que la materia seca del polen apícola

presenta variaciones significativas a través del año y alcanza valores entre 55.65 % a 74.31

%, en tanto que la materia seca del pan de abejas se mantiene estable durante todo el año y

solo presenta pequeñas variaciones de 78.2 % a 79.46 % (Hatsue Modro, 2010).

En cuanto a la cantidad de proteína del polen apícola y el pan de abejas, se reporta que en

dichos productos de un mismo origen floral, este último posee un mayor contenido de

proteínas (Songokun et al., 2015), sin embargo para un estudio efectuado en Brasil no se

observaron diferencias significativas entre la cantidad de proteína presente en el polen y el

pan de abejas (Hatsue Modro, 2010). Así también se reportan variaciones en el contenido de

proteínas solubles de 837 mg/ml para el polen y de 567 a 577 mg/ml para el pan de abejas.

También se encuentran reportes que indican que las proteínas de pan de abejas presenta

valores entre 2.9 - 5.6 % superiores a las reportadas en el polen apícola (Campos et al.,

2008).

En cuanto a la presencia de aminoácidos se reporta que de los 10 aminoácidos esenciales

para las abejas, todos a excepción de la histidina se encuentran tanto en el polen como en el

pan de abejas, sin embargo la concentración media de los mismos varía en cada producto,

por ejemplo las concentraciones de leucina y treonina son aproximadamente 60 % más altas

en el pan de abeja comparadas con el polen apícola, asimismo se ha encontrado que las

concentraciones de valina son aproximadamente 25 % más altas en el pan de abejas, este

patrón se reporta en otros aminoácidos como la alanina, el ácido aspártico y la glutamina a

excepción del triptófano, el cual presenta mayor concentración en el polen apícola

(DeGrandi-Hoffman et al., 2013).

La presencia de vitaminas también puede variar entre el polen apícola y el pan de abejas, de

este modo un estudio efectuado en Chile que comparó los niveles de vitaminas en los dos


productos, reportó para las muestras de pan de abeja contenidos de vitamina A entre 1,3 –

9,7 μg/g y para las muestras de polen multifloral de 0,6 – 3,5 μg/g. El contenido de vitamina

E en las muestras de pan de abeja varió entre 65,0 – 1046,6 μg/g, que superó

significativamente los valores obtenidos en polen multifloral de 40,6 – 166,0 μg/g (López

Casanova, 2013), sin embargo también existen reportes que indican para pan de abejas de

almendras una disminución de las vitaminas C, B3, B5, B6 y B8 frente a polen corbicular de

la misma procedencia botánica (Loper et al., 1980).

Desde la perspectiva de alimento humano el pan de abejas también representa una fuente

interesante de ácidos grasos, pues se reporta en este producto la predominancia del ácido

araquidónico, equivalente al 16 % y, la presencia del ácido α-linolenico en proporción del 8 %

de los ácidos grasos, ambos del grupo de los omega 6 (Čeksterytė et al., 2008).

Pese a que el pan de abejas presenta un valor nutricional más elevado que el polen apícola,

no es comercializado con regularidad en ninguna parte del mundo debido a que el proceso

de extracción se realiza de forma manual, siendo dispendioso y de alto costo (Domínguez et

al., 2014), existen algunas investigaciones orientadas a facilitar la extracción del pan de

abejas (Akhmetova, et al., 2012) sin embargo la mayoría de estudios recientes se centran en

comprender el proceso de maduración del pan de abejas para poder simular dicho proceso a

partir de polen apícola como materia prima.

Al igual que en el caso de las abejas melíferas, las abejas sin aguijón colectan el polen

directamente de las anteras de las flores, el polen se aglutina con néctar y sustancias

salivares hasta formar gránulos (cargas de polen) que son depositadas en las corbículas

para su transporte hacia la colmena, en donde son utilizados como alimento para las mismas

abejas (Menezes et al., 2013).

2.2.3 Microbiota del pan de abejas Los miroorganismos hacen parte fundamental del ciclo de vida de los animales, incluidas las

abejas, e influyen sobre el desarrollo y la salud de las mismas. Se conoce que en el tracto

digestivo de las abejas existen nueve filotipos de bacterias los cuales se reportan en estudios

de diversos orígenes geográficos, lo que sugiere que estos han sido mantenidos por la

transmisión entre individuos y no por la adquisición del ambiente (Martinson et al., 2012). Un


23

estudio efectuado sobre los microorganismos del tracto digestivo de las abejas

evidenció que el 63 % de las bacterias aisladas correspondieron a Lactobacillus, de las

cuales el 28 % fueron L. Kunkeei; el segundo género de microorganismos aislados, con

una frecuencia de 23 %, fueron las Acetobacterias; en tercer lugar se encontraron los

Fructobacillus y en menor proporción bacterias del género Bacillus y Bifidobacterium

(Vojvodic et al., 2013). Estudios efectuados sobre las heces de las abejas reportan la

presencia de bacterias, de las cuales la mayoría corresponden a bacilos, aunque

también se reportó la presencia de mohos y levadura entre otros microorganismos

(Gilliam & Prest, 1987).

El proceso que se da para la transformación del polen en pan de abejas implica la

presencia de múltiples géneros microbianos que cumplen diferentes funciones, ya sea

como responsables directos de la fermentación o como proveedores del medio

necesario para la misma, entre estos microorganismos se han identificado por métodos

de cultivo los Lactobacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Escherichia, Bacillus y en

los grupos levadurales Torulopsis y Sacharomyces, dentro de los más importantes

(Guillian, 1979).

La microbiota presente en el pan de abejas puede provenir de la floración de la cual

procede el polen, o del medio de la colmena, pero mayoritariamente es inoculada por

las abejas durante el proceso de pecoreo e introducción del polen en las celdas (Pain

& Maugenet, 1966). Gilliam en 1979 reportó que la única especie de Bacillus que

obtuvo del polen floral (almendra) fue Bacillus subtilis y sin embargo en el polen apícola

y pan de abejas de la misma procedencia floral aisló Bacillus subtilis, B. megaterium, B. licheniformis, B. pumilus y B. circulans, lo que implica que las abejas pueden haberlos

agregado al polen., De esta forma, los microorganismos reportados en el polen apícola

y en el pan de abejas, no están presentes en el polen floral, por tanto se asume que

son el resultado de la inoculación microbiana por las abejas. (Gilliam, 1979), sin

embargo estudios moleculares efectuados recientemente establecieron que solo el 10%

de las bacterias presentes en el pan de abejas fueron comunes con bacterias del tracto

digestivo, equivalentes a 207 especies de bacterias (Mattila et al., 2012)

Se reporta que los géneros Lactobacillus y Streptococcus son considerados como


importantes en la fermentación láctica, Pseudomonas probablemente contribuyen al

requerimiento anaeróbico para el proceso (Pain & Maugenet, 1966). Un estudio

efectuado por técnicas moleculares identificaron en el pan de abejas, bacterias

reportadas como importantes en procesos de fermentación las cuales fueron

Succinivibrio asociado al rumen de los bovinos Oenococcus, importante para la

fermentación del vino; Paralactobacillus, importante en la fermentación de los alimentos

y Bifidobacterium, asociado con yogur; estas bacterias representaron más del 67 % de

la comunidad activa de bacterias, siendo las ácido lácticas Oenococcus y

Paralactobacillus los microbios más activos en el pan de abejas, pues comprendieron el

52 % y 60 % las bacterias representadas en esas comunidades (Mattila et al., 2012).

Entre el grupo de lactobacilos aislados en el pan de abejas, se destaca la presencia del

L. kunkeei, dicho microorganismo se reporta como uno de los responsables de la

fermentación del polen apícola, adicionalmente desde una perspectiva de alimento para

el humano, este lactobacilo ha demostrado características que le confieren potencial

como probiótico (Moreno, 2012), y se ha demostrado que su presencia promueve la

producción de inmunoglobulina A (Asama et al., 2015).

En especies de abejas que no realizan procesos fermentativos del polen como los

abejorros (Bombus spp.), se han descrito menos filotipos de bacterias

comparativamente con abejas Apis mellifera, por lo que se infiere que tienen menor

necesidad que las abejas de una extensa flora bacteriana del ácido láctico (Olofsson &

Vásquez, 2009).

Los estudios de identificación de microorganismos en el pan de abejas se han centrado

en el grupo de bacterias, sin embargo en dicho proceso también intervienen levaduras,

éstas proporcionan factores de su propio metabolismo que contribuyen a las

características organolépticas del producto (Pain & Maugenet, 1966). Gilliam, en su

trabajo de 1979, así como en el realizado en conjunto con sus colaboradores en 1989,

encontró que a medida que aumentaba el tiempo de almacenamiento del polen en las

celdas disminuía el número de microorganismos aislados, y que asimismo la mayor

parte de las especies de levaduras provenientes del polen floral no se encontraron en

el pan de abejas. Entre las especies de levaduras reportadas se encuentran Candida parapsilosis, Candida reukaufii, Candida tenuis, Torulopsis candida, Torulopsis


25

etchellsii, Torulopsis famata, Torulopsis globosa, Torulopsis incospicua, Torulopsis magnoliae, Torulopsis sake y Torulopsis stellata (Guillian, 1979).

Para el caso del polen de pote de las abejas nativas, se conoce la presencia de diez

géneros de levaduras, de las cuales las de mayor relevancia son Candida y Starmerella

(Menezes et al., 2013) (Teixeira et al., 2003). Un estudio orientado a la identificación de

la microbiota con potencial toxigénico presente en el polen de abejas de la especie

Tetragonisca angustula, evidenció la presencia de 124 cepas pertenecientes a seis

géneros, Aspergillus spp., Cladosporium sp., Penicillium ssp., Mucor sp., Curvularia sp.

y Fusarium sp (Andrade et al., 2008).

También se reportan especies de abejas que efectúan cultivos de hongos, los cuales

consumen como parte de su dieta pese a que los mismos presentan un menor valor

proteico que el polen (Menezes et al., 2013).

De acuerdo con las investigaciones realizadas, se plantea de forma universal que el

proceso de transformación de polen alveolar a pan de abejas está dado por la dinámica

propia de los microorganismos que interactúan durante el almacenamiento del polen en

los alveolos de la colmena.

2.2.4. Técnicas de identificación y clasificación de levaduras

Las levaduras se definen en términos amplios como hongos unicelulares que se

reproducen predominantemente de forma asexual por gemación. Forman un complejo y

heterogéneo grupo formado por tres clases de hongos, que se clasifican según su

modo de reproducción: Ascomycetes, Basidomycetes y Deuteromycetes u hongos

imperfectos.

La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran número de

medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiología (agar

sangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, existen agares nutritivos como el

Agar nutritivo Walerstein Laboratory (WL) (Condalab ®), que permiten observar más

detalladamente diferencias macroscópicas entre las colonias (Freydière & Guinet,

1997).


No existen criterios estáticos acerca de la taxonomía y entre un grupo de

microorganismos, como las levaduras, con una asombrosa variedad de propiedades

fisiológicas y taxonomía diferente a pesar de morfologías similares, aún los nombres de

géneros y especies bien conocidos pueden cambiar al descubrirse nuevas

características (Cárdenes Perera, 2000). El desarrollo de la taxonomía de las levaduras

ha sido vertiginoso, el número de especies aprobadas se ha incrementado de 700

agrupadas en 93 géneros a cerca de 1500 en 148 géneros en los reportes taxonómicos

emitidos entre 1998 y 2011 (Deák & Péter, 2013).

Tradicionalmente, las levaduras han sido clasificadas e identificadas según sus

características morfológicas y sus propiedades fisiológicas y bioquímicas. Entre los

criterios morfológicos se contaba con su reproducción vegetativa, sexual, esporulación,

morfología celular y aspecto de colonia. Entre los criterios fisiológicos y bioquímicos, la

fermentación y asimilación de azúcares, el poder fermentativo, y la asimilación de

nitratos (Giusiano & Mangiaterra, 1998). Estas técnicas se basan principalmente en el

estudio del fenotipo y este depende de las condiciones ambientales del desarrollo y del

estado vegetativo o amorfo.

La identificación de las levaduras según sus condiciones morfológicas es laboriosa,

pues debe estudiarse el estado vegetativo (anamorfo) y el estado sexual (teleomorfo),

lo cual ha generado para algunas levaduras la llamada dualidad de la nomenclatura

binomial, lo que genera dúos como Bullera/Bulleromyces, Cryptococcus/Filobasidiella y

Brettanomyces/Dekkera,

complejo (Ratón, 2004).

En relación con aspectos fisiológicos, se ha podido determinar que los caracteres de

fermentación y asimilación de fuentes de carbono, asimilación de compuestos

nitrogenados, requerimientos vitamínicos, resistencia a cicloheximida y termotolerancia,

no siempre son estables ni reproducibles. Estas dificultades han hallado soluciones con

la aplicación de las técnicas moleculares para la identificación de especies levadurales

(Ratón, 2004).

Actualmente la descripción de los microorganismos experimenta un gran avance


27

gracias a la utilización de la información que proporcionan los genes que codifican para

RNA ribosomal, y en particular el gen que codifica para la subunidad menor del

ribosoma bacteriano, 16S rRNA (y su equivalente en eucariotas, 18S rRNA). Este

marcador molecular presenta una serie de ventajas para su utilización, complementaria

a diferentes, técnicas permitiendo el estudio en profundidad de la diversidad, estructura

y dinámica de comunidades microbianas en general. Su aplicación como herramienta

molecular fue propuesta por Carl Woese a principios de la década de los 70. Los

análisis de ARNr se han utilizado ampliamente para establecer las relaciones

filogenéticas dentro del mundo procariota y eucariota, causando un profundo impacto

en nuestra visión de la evolución y, como consecuencia, en la clasificación e

identificación de microorganismos (Ferrer et al., 2009).

Los eucariotas tienen ribosomas de 80S con una subunidad de 40S y otra de 60S. La

subunidad de 40S está formada por 33 proteínas y un RNA ribosómico de 18S (18S

rRNA). La subunidad de 60S consiste de 49 proteínas y 3 tipos de moléculas de rRNA:

5S, 5.8S y 28S (5S rRNA, 5.8S rRNA y 28S rRNA). Para el estudio de los eucariotas

es muy utilizada la región intergénica ITS entre 18 y 28S, que presenta más variabilidad

y permite diferenciar especies más cercanas, pero para la descripción taxonómica de

levaduras diversas se realizan también estudios sobre 18S permitiendo una

especificidad mayor.

El desarrollo de las técnicas moleculares para el análisis de genomas completos vino

aparejado con un desarrollo igualmente importante en el área bioinformática, este

desarrollo implicó la creación de software adecuado para editar, alinear, analizar,

ensamblar y anotar los genomas. Los progresos en la biología molecular han

proporcionado un gran número de marcadores para la caracterización e identificación

de levaduras. Esta técnica se basa en la identificación rápida y precisa por análisis de

secuencias de ADN que sirvan como indicadores y clasificadores taxonómicos (Ferrer

et al., 2009); estos métodos han demostrado ser una técnica para una identificación

precisa de muchos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras, algas, hongos,

virus, etc.


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3. Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia

Carla Portillo Carrascal 1, Judith Figueroa Ramírez 2

1 Zootecnista, candidata MC, Universidad Nacional de Colombia.

[email protected] 2 Microbiologa MC. Docente Universidad Nacional de Colombia Facultad de

Medicina Veterinaria y de Zootecnia

- Grupo de Investigación en Ciencia y Tecnología Apícola AINY.

[email protected].

Resumen En el proceso de maduración del polen colectado por las abejas en las flores, hasta

transformarlo en pan de abejas, producto que finalmente es consumido por dichos

insectos, intervienen una variedad de microorganismos que interactúan en cinéticas

complejas. Con el objetivo de realizar aportes para comprender este proceso de

maduración, se aislaron en cultivos in vitro levaduras a partir de alveolos con

presencia de polen en cuatro estadios de llenado, provenientes de colmenas de

Apis mellifera ubicadas en el departamento de Cundinamarca (Colombia). También

fueron colectadas muestras de pan de abejas en polen de la tribu Meliponini,

conocidas como abejas sin aguijón, correspondientes a los géneros Tetragonisca, Paratigrona, Plebeia y Scaptotrigona, presentes en meliponarios del departamento

de Santander (Colombia). Las muestras de polen de abejas sin aguijón provenían

de potes cerrados. Los aislamientos de levaduras fueron identificados por perfiles

bioquímicos empleando 46 sustratos del sistema Vitek2 ®. Las levaduras más

frecuentes en los aislamientos, identificadas por el sistema para Apis mellifera,

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]


fueron Kodamaea ohmeri, Candida pulcherrima y Candida famata; para los

aislamiento de abejas nativas las cepas de levaduras encontradas fueron Candida famata, Kodamaea ohmeri y Candida parapsilosis.

Palabras Claves: Pan de abejas, ensilaje, perfil bioquímico, levaduras

fermentadoras, polen de abejas.

3.1 Introducción 3.1.1 Polen corbicular y pan de abejas El polen alveolar o pan de abejas de la especie Apis mellifera y el pan de abejas en

pote de las abejas de la Tribu Meliponini pertenecen al grupo de productos de

recolección y transformación de las abejas, son elaborados a partir de polen floral y

corresponden a la principal fuente de proteínas, minerales y grasas dentro de la

dieta de las abejas (Vit, 2004). Para el caso de la especie Apis mellifera existen

colectores capaces de atrapar los granos de polen antes de que la abeja los ingrese

al interior de la colmena, estos granos son cosechados y comercializados como

complemento nutricional bajo el nombre de polen apícola (Durán et al., 2014). Para

el polen de las abejas de la tribu Meliponini no se reportan colectores de polen.

La composición del pan de abejas es similar a la del polen apícola y se sabe que es

rico en proteínas de alto valor biológico, en carbohidratos e igualmente es una

fuente de potasio y vitaminas del grupo B (Fuenmayor et al., 2011), sin embargo,

debido a los cambios bioquímicos causados por el efecto de enzimas aportadas por

la abeja y por la acción de microorganismos en el proceso de maduración del

producto al interior de la colmena, el pan de abejas presenta mayor

biodisponibilidad y por ende un mejor valor biológico que el polen apícola (Gilliam,

1979a; Domínguez et al., 2014).

El alto valor biológico observado en el pan de abejas ha promovido el interés en su

valoración como alimento funcional, pese a esto, el producto no ha sido

comercializado regularmente debido a que la extracción es dispendiosa y en

Colombia se realiza de forma manual (Domínguez et al., 2014). Esta limitante ha

generado el desarrollo de estudios orientados a simular el proceso de maduración

Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia

37

del polen en condiciones controladas con la inclusión de bacterias acido-lácticas

comerciales utilizadas en la industria láctea (Fuenmayor et al., 2011), bacterias

nativas aisladas a partir de polen corbicular (del Risco-Ríos et al., 2012) así como la

inclusión de cepas puras de los microorganismos Lactobacillus plantarum (ATCC

14917) y Lactobacillus acidophillus (ATCC 43

comercial CHOOZIT MY800, el cual contenía Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii sub sp. Lactis y Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus

(Domínguez et al., 2014).

Dado que en el proceso de maduración del polen interviene una amplia variedad de

microorganismos con diversas funciones, ya sea como responsables directos de la

fermentación o como proveedores del medio necesario para la misma (Gilliam, 1979a;

del Risco-Ríos et al., 2012) se hace necesario desarrollar investigaciones encaminadas a

la comprensión de la microflora responsable de este proceso.

La mayoría de los estudios reportados en la literatura corresponden a pan de

abejas o polen alveolar de la especie Apis mellifera, en los cuales se ha observado

una disminución en la variabilidad de microorganismos a medida que el polen se

madura en el interior de la colmena, coincidiendo con un proceso de acidificación

del sustrato (Babendreier et al., 2007; Gilliam, 1979a).

La caracterización de la microflora presente en el pan de abejas se ha centrado en

la identificación de las especies bacterianas, encontrándose principalmente cepas

pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Escherichia y Bacillus, (Moreno & Figueroa, 2012; Gilliam, 1979a). De estos

géneros los que se consideran de mayor importancia son los Lactobacillus y los

Streptococcus, responsables de la fermentación láctica. A las Pseudomonas se les

atribuye la contribución al requerimiento anaeróbico para el proceso (Audisio et al.,

2011).

El origen de la microflora presente en el polen alveolar es diverso, pues se

encuentran especies de origen floral y del medio ambiente, sin embargo, con el

proceso de maduración tienden a prevalecer los microorganismos aportados por la


abeja; esto fue demostrado en un estudio efectuado en colonias de Apis mellifera

ubicadas en cultivos de almendros. En la investigación se observó para el pan de

abejas maduro la presencia de las bacterias B. subtilis, B. megaterium, B. licheniformis, B. pumilus y B. circulans, las cuales también habían sido aisladas del

intestino de abejas obreras, a diferencia de las cepas de origen floral, de las cuales

solo perduró la bacteria B.subtilis (Gilliam, 1979a). En un estudio reciente realizado

en Colombia, se identificó en el pan de abejas a la bacteria Lactobacillus kunkei como una de las cepas de mayor persistencia durante el proceso de maduración del

producto, con características que la hacen candidata para ser empleada como

probiótico (Moreno & Figueroa, 2012).

En cuanto al grupo de los hongos, se han detectado mohos y levaduras asociados a

las abejas Apis mellifera y sus productos, sin embargo, los mohos se aíslan con

menor frecuencia (Gilliam, 1997). Se conoce que estos microorganismos generan

compuestos antimicrobianos importantes en el proceso de maduración del polen

(Gilliam, 1997), y estos se han asociado a las abejas A. mellifera y a sus productos,

entre estos se encuentran mohos principalmente de los géneros Penicillium, Mucor y Aspergillus (Gilliam et al., 1988). La Tabla 3-1 presenta las especies de mohos

identificadas en polen floral, polen corbicular y pan de abejas de una, tres y seis

semanas de almacenamiento.


39

Tabla. 3-1. Mohos presentes en diferentes etapas del proceso de elaboración del pan de

abejas

De los microorganismos presentados en la anterior tabla, estudios efectuados en mieles

procedentes de Arabia Saudita identificaron la presencia de los mohos A.flavus, A. niger,

PROCEDENCIA DE LA MUESTRA

MOHO Polen floral

Polen corbicular

Pan de abejas 1*

Pan de abejas 3*

Pan de abejas 6*

Mucor sp. Mucor racemosus Alternaria tenuis Cladosporium cladosporioides Cladosporium herbarum Cladosporium sphaerospermum Aspergillus niger Aspergillus versicolor Aspergillus flavus Aspergillus amstelodami Aspergillus ustur Penicilium brevi–compactum Pinicilium cyclopium Penicilium corylophilum Penicilium crustosum Penicilium chrysogenum Penicilium janthinellum Aureobasidum pullulans Rhizopus nigricans Peyronelia sp. Scytalidium sp. Arthrinium phaeospermun Scopulariopsis brevicaulis Paecilomyces varioti Thielavia sepedonium Xylohypha bantiana Chaetomium elatum Chaetomidum pilosum

Presencia del microorganismo.* =Semana


A. versicolor, C. cladosporioides, y P. corylophilum (Nasser, 2004).

El grupo de las levaduras se encuentra altamente relacionado con todos los procesos

efectuados por las abejas. Se ha comprobado que la presencia de levaduras en el néctar

floral puede alterar la composición y concentración tanto de azúcares como de

aminoácidos del néctar, e igualmente contribuyen a la emisión de volátiles florales

(Herrera, 2014). De este modo, un estudio reciente efectuados con abejorros de la

especie Bombus terrestris comprobó que la presencia de levaduras en el néctar floral

generaba alteraciones en el comportamiento de dichos insectos, de tal forma que

mostraban preferencia por el néctar con presencia de levaduras sobre el néctar sin

formas levadurales, lo cual se explica por los cambios bioquímicos en el sustrato (Herrera

et al., 2013).

En el pan de abejas se reporta la presencia de levaduras en todo el proceso de

maduración al interior de la colmena. Se sabe que un gran número de las especies de

levaduras del pan de abejas son capaces de fermentar la glucosa y la sucrosa y que

proporcionan factores de su propio metabolismo, los cuales contribuyen a las

características organolépticas del producto (Gilliam, 1979b), igualmente se reconoce que

intervienen en el proceso de deshidratación del polen, lo cual tiene implicaciones sobre la

estabilidad del producto (Camargo et al., 1992).

Coincidiendo con lo ocurrido con las bacterias, las levaduras del origen floral disminuyen

a medida que el polen se madura al interior de la colmena. Estudios efectuados entre

1967 y 1979 detectaron en el pan de abejas de Apis mellifera con una semana de

almacenamiento en la colonia, la presencia de las levaduras Torulopsis magnoliae,

Cryptococcus flavus, Cryptococcus laurentii y Rhodotorula glutinis, pero a las tres y seis

semanas de almacenamiento se aislaron solamente las especies Torulopsis magnoliae y

Cryptococcus albidus; estas levadura no fueron aisladas del polen floral del cual se formó

el pan de abejas, lo que sugiere que fueron inoculadas por los insectos (Gilliam, 1979b).

La Tabla 3-2 presenta un resumen de las especies de levaduras asociadas a las abejas

Apis mellifera.


41

Tabla 3-2. Levaduras asociadas con las abejas Apis mellifera

LEVADURA

PROCEDENCIA DE MUESTRA

FUENTE N PF P

C PA M IA

Candida humícola (Nasser, 2004) Candida parapsilosis (Gilliam, 1979b) (Carvalho et al., 2010) Candida guillermondii (Gilliam M., 1979b) Candida magnoliae

(Carvalho et al., 2010; Nogueira et al.,

2012) Candida sorbosivorans (Carvalho et al., 2010)

Candida blankii (Dhanwant & Manjit, 1985) Candida cacaoi (Dhanwant & Manjit, 1985)

Candida gelsemii (Manson et al., 2007) Candida racoensis (Manson et al., 2007) Candida tropicalis (Misra et al., 2012)

Candida norvegensis (Nogueira et al., 2012) Candida tilneyi

(Lachance et al., 2001)

Candida powellii (Lachance et al., 2001) Rhodotorula glutinis (Gilliam, 1979b) Rhodotorula rubra (Gilliam, 1979b) Rhodotorula palida (Gilliam, 1979b)

Rhodotorula pilimanae (Gilliam, 1979b) Rhodotorula mucilaginosa

(Carvalho et al, 2012)

Cryptococcus albidus (Gilliam, 1979b) Cryptococcus laurentii (Gilliam, 1979b) Cryptococcus flavus (Gilliam, 1979b)

Cryptococcus humicola

(Nogueira et al., 2012)

Cryptococcus uzbekistanensis

(Sinacori et al., 2014)

Torulopsis novergica (Gilliam, 1979b) Torulopsis magnoliae (Gilliam, 1979b) Zygosaccharomyces

rouxii (Carvalho et al., 2010; Sinacori et al.,

2014) Zygosaccharomyces

melis (Carvalho et al., 2010; Nogueira et al.,

2012; Sinacori et al., 2014) Zygosaccharomyces

favi

(Cadez et al., 2015) Aureobasidium

pullulans

(Sinacori et al., 2014) Kloeckera apiculata (Gilliam, 1979b) Hansenula anómala (Gilliam, 1979b)


Metschnikowia

pulcherrima

(Gilliam, 1979b) Metschnikowia

reukaufii

(Manson et al., 2007) Saccharomyces

cerevisiae (Carvalho et al., 2010; Nogueira et al.,

2012; Dhanwant & Manjit, 1985) Trichosporon

mucoides

(Carvalho et al., 2010) Pichia

membranifaciens

(Carvalho et al., 2010) Debaryomyces

hansenii

(Sinacori et al., 2014) N=Néctar, PF= Polen floral, PC=Polen corbicular, PA= Pan de abejas, IA= Tracto

digestivo de abejas. Fuente: Construcción propia, 2015, a partir de las fuentes citadas.

El pan de abejas en potes corresponde al sistema de maduración del polen utilizado por la

mayoría de las abejas de la tribu Meliponini o abejas sin aguijón, en el cual el producto es

obtenido por los insectos de forma similar al polen apícola, mediante la colecta del polen

floral, al cual la abeja le adiciona sustancias propias y lo traslada a la colmena. Pero para

este caso el polen es depositado en vasijas o potes de cera que están dispuestos de forma

horizontal en la colonia, los que son finalmente sellados para el proceso de maduración.

El polen de pote ha sido un producto poco estudiado, no obstante, en cuanto a su

composición se reportan algunos casos con porcentajes de proteína y cenizas mayores con

respeto al pan de abejas de A. mellifera. En relación con sus usos, para el caso colombiano

es popularmente empleado para el tratamiento de enfermedades respiratorias, migrañas y

como afrodisiaco (Cepeda, 2009).

La composición microbiana del pan de abejas en pote no ha sido determinada

completamente, sin embargo se sabe que el producto final difiere en sus características

organolépticas dependiendo de la especie de abeja (Camargo et al., 1992), lo cual sugiere

una vía de fermentación diferente. Igualmente se ha podido establecer que algunos hongos

son esenciales para la supervivencia de las abejas, por ejemplo para las especies

Scaptotrigona aff. depilis, Scaptotrigona bipunctata y Scaptotrigona postica, se presenta un

hongo filamentoso que crece en la provisión del alimento larval, el cual es consumido por las

larvas y que al ser retirado disminuye drásticamente la supervivencia de las mismas

(Menezes, 2010).


43

Las especies de levaduras Aureobasidium pullulans, Pseudozyma antarctica y Starmerella meliponinorum se han asociado con la microflora presente en los intestinos de abejas de las

especies Frieseomelitta varia (Rosa et al., 2003), Teragonisca angustula, Melipona quadrifasciata y Melipona rufiventris. En especial S. meliponinorum fue detectada

adicionalmente en el pan de abejas, miel, propóleos y desechos de las abejas T. angustula,

M. quadrifasciata y M. rufiventris (Teixeira et al., 2003; Rosa & Lachance, 2005). Las

especies de levaduras Candida etchellsii, Cryptococcus albidus, Issatchenkia scutulata, y

Zygosaccharomyces bisporus se han identificado en intestinos de abejas T. angustula,

asimismo la Zygosaccharomyces machadoi se aisló en las heces obtenidas de esta abeja.

(Rosa & Lachance, 2005).

Las levaduras Candida apicola, Candida catenulata, Candida floricola, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus macerans, Kodamaea ohmeri y Starmerella meliponinorum, fueron

detectadas en muestras de intestino de la especie de abejas Melipona quadrifasciata, de las

cuales C. apicola y K. ohmeri también fueron aisladas del pan de abejas. En abejas de la

especie Melipona quinquefasciata y su pan de abejas se aisló la levadura Starmerella neotropicalis (Daniel et al., 2013). La levadura Candida versatilis fue identificada en el

intestino de la abeja Frieseomelitta (Rosa et al., 2003).

Se han efectuado aislamientos de levaduras para el caso de las abejas solitarias, es así como

se ha asociado la levadura Candida cellae con la abeja Centris tarsata (Pimentel et al., 2005), y

la levadura Candida batistae con las especies de abejas Diadasina distincta y Ptilotrix plumata. También se asocian las levaduras Candida riodocensis y Moniliella megachiliensis con abejas

del género Megachile (Pimentel et al., 2005; Douglas & Lyne, 1992).

Para el caso de los abejorros de origen europeo Bombus terrestris y Bombus pascuorum, se

conoce que las especies de levaduras Metschnikowia reukaufii, Metschnikowia gruessii, Metschnikowia pulcherrima, Candida bombi, Zygosaccharomyces rouxi y Debaryomyces maramus se encuentran asociadas con los tractos digestivos y el alimento de dichos

insectos. La levadura Metschnikowia kunwiensis se detecta en los tractos digestivos de los

abejorros (Brysch-Herzberg, 2004). Asi como Candida kunwiensis se ha detectado en

Bombus terrestris, Bombus cryptarum, Bombus hortorum, Bombus lapidarius y Bombus pascuorum (Gyu Hong et al., 2003).


Los trabajos citados anteriormente demuestran la importante relación que existe entre las

abejas y los microorganismos, en específico con las levaduras, sin embargo para

Colombia no se reportan investigaciones que identifiquen dichos organismos.

3.2 Sistemas manuales y automatizados aplicados a la identificación de microorganismos asociados a las abejas Convencionalmente la caracterización de las levaduras se realiza a partir de la morfología y

la fisiología de los aislamientos, no obstante estos métodos pueden requerir la

implementación de hasta 90 pruebas, proceso que puede resultar dispendiosos y demorado

(Deák, 1995). La complejidad de estos mecanismos se ha simplificado mediante el desarrollo

de sistemas que permiten la aplicación simultánea de pruebas bioquímicas de fácil lectura;

los sistemas se clasifican de manera general en sistemas de identificación manual, del cual

se resalta el API 20C AUX de BioMerieux y por otro lado existen los sistemas de

identificación automatizada, entre los que se destacan los sistemas Vitek de BioMerieux y

MicroScan de Qumilab (Truant, 2002). De este modo los sistemas de identificación han sido

importantes para el desarrollo de estudios relacionados con los microorganismos asociados

a los insectos (Giliam, 1997; Mankowski & Morrel, 2004) y la tipificación de microorganismos

de importancia médica, utilizados en la valoración de las propiedades antibióticas de mieles

de abejas Apis mellifera (Kwakman et al., 2014; Brudzynski & Lannigan, 2012) así como de

mieles de abejas de la tribu Meliponini (Kwapong et al., 2013; Gabriel et al., 2015).

Específicamente el sistema Vitek de BioMerieux utiliza una placa o tarjeta con

pequeños compartimientos en los que se encuentran sustratos deshidratados para una

amplia variedad de pruebas bioquímicas (Truant, 2002). De tal forma, para la

identificación de un microorganismo, este se debe preparar en una suspensión que se

dispone en ductos de la tarjeta, y posteriormente es succionado al interior de la misma

por vacío, a través de un conducto estéril. La tarjeta es luego introducida en un equipo

que se constituye en la unidad de incubación-lectura, la cual mantiene un ambiente

controlado y rota las tarjetas para que pasen por la unidad láser y el fotodetector, los

resultados luego son analizados por comparación frente a una base de datos interna,

que arroja la identificación del microorganismo en un periodo de 24 a 48 horas (Rangel,

2011). El sistema Vitek cuenta con la tarjeta YST, diseñada para la identificación de

levaduras mediante la aplicación de 47 pruebas bioquímicas fluorescentes que incluyen


45

la asimilación de carbohidratos, ácidos orgánicos y la detección de oxidasas y

arilamidasas (Ochiuzzi et al., 2014).

Debido a que la capacidad de identificación acertada del sistema Vitek® se limita a la

serie de combinaciones alojada en su base de datos, para el caso del Vitek2® se

presenta una base de al menos 51 especies de levaduras, y algunas requieren el

desarrollo de pruebas adicionales para la identificación (Linares & Solís, 2007), sin

embargo en la base de datos se prioriza la identificación de microorganismos

relacionados con la salud humana (Arias et al., 2002), en consecuencia, la probabilidad

de tipificar adecuadamente un microorganismo depende en gran medida del origen del

mismo, por ejemplo un estudio reportó que para la identificación de 178 levaduras con

importancia clínica de aislamiento frecuente, el sistema Vitek2 ® presentó concordancia

con la identificación por los método tradicionales para el 90 % de los aislamientos, en

tanto que para 20 levaduras con importancia clínica pero de aislamiento poco

frecuente, la concordancia entre el sistema Vitek2 ® y la identificación por métodos

tradicionales se redujo al 75 % de los aislamientos (Ferrara et al., 2014).

En cuanto al uso de los sistemas de identificación manuales y automatizados para la

caracterización de microorganismos relacionados con las abejas o sus productos, se

reporta que la aplicación del sistema permitió la caracterización parcial del hongo

Trichosporonoides megachiliensis, posteriormente clasificado como Moniliella megachiliensis

(Rosa et al., 2009), el cual fue detectado como asociado al polen de la especie de abeja

Megachile rotundata. En la descripción inicial del hongo se empleó el sistema de clasificación

Vitek ®, lo que permito obtener un perfil fisiológico (Douglas & Lyne, 1992).

Sistemas de identificación similares, como el API 20C AUX, fueron utilizados para la

identificación de bacterias asociadas con la especie de abeja Melipona fasciata, lo que

permitió detectar en muestras de abejas, miel y pan de abejas, los microorganismos Bacillus alvei, Bacillus circulan y Bacillus megaterium (Gilliam et al., 1990).

Para el caso de las abejas de la especie Apis mellifera, el sistema API fue utilizado para la

valoración de levaduras de mieles con Denominación de Origen Protegida, procedentes de

Portugal, y permitió identificar con éxito las especies de levaduras del género Rhodotorula,


Candida y Saccharomyces, sin embargo, el sistema no tuvo la capacidad de detectar

aislados del género Zygosaccharomyces, que fueron posteriormente identificados por

técnicas moleculares, asimismo clasificó erróneamente las especies de levaduras

Trichosporom mucoides, Candida magnoliae, Pichia membranifaciens y Candida sorvosivorans (Carvalho et al., 2010). El sistema API también fue utilizado en la

clasificación de 28 mohos aislados a partir de muestras de polen floral, polen corbicular

y pan de abejas de una, tres y seis semanas de almacenamiento (Gilliam et al., 1988).

Actualmente no se han efectuado estudios relacionados con la cinética microbiana del

proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas mediante la utilización

de sistemas de clasificación automatizados como el Vitek, sin embargo, el sistema se

ha utilizado para la comprensión inicial de la microbiota en diversos procesos de

fermentación, como es el caso del Zhijiang-flavor liquor, originario de China (Chen et

al., 2010), de cereales fermentados tradicionales de origen búlgaro (Gotcheva et al.,

2000) y de embutidos de origen español (Encinas et al., 2000), entre otros.

Con este estudio se buscó establecer las cepas de levaduras cultivables presentes en

el pan de abejas alveolar de Apis melliferas y pan de abejas en pote de especies

pertenecientes a la tribu Meliponini de Colombia.

3.3. Materiales y métodos El estudio se realizó a partir de muestras de pan de abejas de Apis mellifera y pan de

abejas en pote, de abejas de la Trubu Meliponini. Para el primer caso, las muestras

provenían de un apiario ubicado en el Campus de la Universidad Nacional de Colombia

en la ciudad de Bogotá (Cundinamarca), perteneciente al Laboratorio de Abejas de la

Universidad Nacional LABUN. En las colmenas se identificaron panales que tuvieran al

menos el 50 % de los alveolos con pan de abejas, los cuales fueron depositados en

bolsas estériles y trasladados al laboratorio de microbiología para la extracción del

producto bajo condiciones controladas. El traslado de los panales de la colmena al

laboratorio se realizó de forma inmediata, con un intervalo de tiempo máximo de una

hora entre la apertura de la colonia y la extracción del pan de abejas en laboratorio

(Figura 3-1).


47

Figura 3-1. Proceso de colecta del pan de abejas de Apis mellifera

Fuente: Portillo, C. 2012

Para la extracción de las muestras de pan de abejas en los panales se tuvo en cuenta el

proceso que realizan las abejas para fermentar el polen, y se estandarizó el muestreo a

partir del nivel de llenado del alveolo como un indicador del estado de maduración del

producto; de este modo se emplearon cuatro niveles, así: 1. equivalente a ≤ 2 mm de

profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15 mm y 4. ≥ 15 mm, que correspondió a alveolos con

aspecto de llenado completo. En total se valoraron 198 muestras. El pan de abejas fue

extraído de los alveolos empleando una cucharilla de uso odontológico en cabina de flujo

laminar, y posteriormente fue procesado.

Para el caso del pan de abejas en pote se incluyeron muestras provenientes de colonias

de abejas nativas de cuatro especies, dispuestas en cajas racionales y pertenecientes a

meliponicultores de la Asociación Apícola Comunera ASOAPICOM, ubicados en el

departamento de Santander. La muestra fue una sección completa de potes con pan de

abejas sellado, que fueron dispuestos en frascos de vidrio estériles y posteriormente

trasladados bajo refrigeración hasta el laboratorio donde se efectuó la apertura del pote y

la extracción del pan de abejas bajo cabina de flujo laminar. La identificación de las

abejas empleadas en el estudio fue realizada por el LABUN mediante claves

taxonómicas, de este modo las especies de abejas fueron Tetragonisca angustula,

Paratrigona spp., Plebeia spp., Scaptotrigona spp. La Tabla 3-3, resume el muestreo

efectuado en el estudio.


Tabla 3-3. Muestras de pan de abejas colectadas en el estudio

ESPECIE DE ABEJA

NIVEL APROXIMADO DEL LLENADO DEL ALVEOLO (mm) O

ESTADO DEL POTE No. DE

MUESTRAS

Apis mellifera ≤ 2 31 ≤10 40 ≤15 55 ≥ 15 72

Tetragonisca angustula Pote cerrado 21 Paratrigona spp. Pote cerrado 15

Plebeia spp. Pote cerrado 6 Scaptotrigona spp. Pote cerrado 4

TOTAL 244 Fuente: Construcción propia, 2015.

Las muestras de pan de abejas fueron procesadas en laboratorio mediante la técnica de

dilucion y siembra directa por agotamiento, en el proceso se empleó 0,5 g de cada

muestra. Se empleron los agares Papa Dextrosa Agar (PDA) (Oxoid ®) y Agar nutritivo

Walerstein Laboratory (WL) (Condalab ®) para detección de organismos fermentadores.

Los cultivos fueron incubados a 35°C durante 48 horas, para simular el proceso natural

de temperatura fisiologica de la colmena; pasado este tiempo, las placas con crecimiento

se resembraron en agar Sabouraud cloranfenicol (Oxoid ®) mediante el método de

agotamiento en estrías, y fueron incubadas a 35°C duante 48 horas, este proceso se

efectuó de forma repetitiva hasta lograr obtener colonias aisladas en cultivo puro (Figura

3-2).

Figura 3-2. Proceso de aislamiento de levaduras

Fuente: Portillo, 2016.


49

Las colonias puras fueron resembradas en el medio WL y observadas en láminas teñidas

con Gram al microscopio, con el objeto de definir si correspondían a formas levadurales y

si eran diferentes entre sí. Las características morfológicas macroscópicas que se

tuvieron en cuenta fueron: textura, color, intensidad del color y presencia de halo micelial.

Cada colonia morfológicamente distinta (Macro y microscópicamente) fue preservadas

mediante congelación (- 70oC) en caldo Sabouraud (Oxoid).

Los aislamientos obtenidos a partir del de pan de abejas fueron caracterizados en cuanto a

su perfil bioquímico frente a 46 compuestos, mediante el sistema Vitek ® 2 Systems: 04.01.

3.4 Resultados A partir del pan de abejas de Apis mellifera fueron obtenidos inicialmente 198

aislamientos de levadura, sin embargo despues de efectuar el segundo repique solo

sobrevivieron 29 aislamientos de levaduras, muy posiblemente debido a requerimientos

nutricionales exixtentes en su medio natural y que nos estaban presentes en el cultivo

invitro. De las levaduras cultivables el 14 % provenían del nivel de llenado uno, el 24 %

del dos, el 28 % del tres y el 34 % del cuatro.

La valoración del perfil bioquímico de las levaduras procedentes del pan de abejas de

Apis mellifera efectuada por el sistema Vitek 2® evidenció que ninguna de las levaduras

aisladas presenta resultados positivos frente a la presencia de las enzimas L-Lisina-

arilamidasa y Tirosina-arilamidasa, capaces de catalizar la hidrólisis de un aminoácido N-

Terminal de péptidos (Acosta & Tabatabi, 2001). Sin embargo se presentaron respuestas

positivas en los aislamientos de los cuatro estadios de llenado alveolar valorados ante la

presencia de la enzima Leucina-arilamidasa.

Frente a la presencia de las enzima Ureasa, Gamma-Glutamil-Transferasa, Beta-n-acetil-

Glucosaminidasa y PNP-N-acetil-BD-galactosamidasa, todos los aislamientos

presentaron resultados negativos. Lo mismo se evidenció frente a la asimilación del

Monosacárido L-Ramnosa, los disacáridos D-Melibiosa y Lactosa, y el alcohol Eritritol, e

igualmente las levaduras no presentaron asimilación de Nitratos, Lactato, Amigdalina y

del compuesto Metila-A-D-glucopiranósido. La asimilación del monosacárido L-Arabinosa

se presentó solamente en un aislamiento que provenía de pan de abejas en el segundo


estadio de llenado.

La mayoría de los aislamientos obtenidos en los cuatro estadios de llenado fueron

capaces de asimilar los monosacáridos D-glucosa y D-galactosa, los alcoholes Xilitol y D-

Sorbitol, así como el compuesto L-Malato. El disacárido Sacarosa fue asimilado por el 80

% de las levaduras aisladas.

Los azúcares D-Rafinosa, D-Turanosa, D-Trehalosa, D-Xilosa, D-Manosa, D-Celobiosa,

D-Melocitosa, Gentiobiosa, D-Maltosa y L-Sorbosa, fueron asimilados de forma exclusiva

en aislamientos de muestras de pan de abejas provenientes de alveolos con niveles con

estadios de llenado alveolar tres y cuatro, en los cuales el pan de abejas presenta

mayores procesos de maduración. La asimilación de los compuestos acetato, 2-Acetado-

D-Gluconato, Arbutina, N-Acetil-Glucosamina, D-Gluconato, Citrato de sodio, Glicerol, así

como la valoración de la presencia de la enzima Alfa Glucosidasa, también presentaron

resultados positivos en los segmentos de llenado mencionados.

Todos los aislamientos obtenidos en los estadios de llenado uno y dos mostraron

resultados positivos frente a la presencia de Arginina GP y la asimilación de Glucuronato

y D-Galacturonato, sin embargo este valor se redujo al 50 %, 25 % y 25 %

respectivamente en los aislamientos obtenidos en los segmentos de llenado tres y cuatro.

La asimilación de Prolina se presentó en alrededor del 80 % de los aislamientos en los

estadios de llenado tres y cuatro, así como en el 14 % de los aislamientos obtenidos en

estadio de llenado dos.

Las correlación de las pruebas bioquímicas efectuada por el sistema Vitek ® permitió

identificar el 31 % de los aislamientos con nivel de confianza excelente (91% al 96%) y el

24% con nivel de confianza bueno (85% al 90%), el restante 45 % de los aislamientos no

fue identificado.

Para los alveolos con pan de abejas correspondientes al segmento de llenado uno se

obtuvieron cuatro aislamientos de levaduras, de las cuales el sistema Vitek ® identificó una

con nivel de confianza bueno y tres no fueron identificadas. En los alveolos con volumen de

llenado en el estadio dos fueron aisladas siete levaduras, de las cuales seis fueron

agrupadas como una sola especie y un aislamiento no fue identificado. Las muestras


51

provenientes de alveolos con volumen de llenado en el nivel tres presentaron ocho

aislamientos de levaduras, de las cuales dos fueron agrupadas como una sola especie y seis

no fueron identificadas. En los alveolos con el mayor grado de maduración se efectuaron 10

aislamientos de los cuales el perfil bioquímico permitió identificar tres aislamientos como una

sola especie y tres aislamientos como diferentes especies; cuatro aislamientos no fueron

identificados.

A partir de los aislamientos obtenidos fue posible establecer por el sistema Vitek ®. la

presencia de cuatro especies de levaduras, de las cuales dos pertenecen al género

Candida, una al género Kodamaea y una al género Rhodotorula. La Tabla 3-4 describe los

resultados obtenidos en la identificación de los aislamientos mediante el sistema Vitek ®.

Tabla 3-4. Aislamientos de levaduras de pan de abejas de Apis mellifera identificadas por

el sistema VITEK ® NIVEL DE

LLENADO DEL ALVEOLO

CEPA IDENTIFICADA PROBABILIDAD DE IDENTIFICACIÓN

NIVEL DE CONFIANZA

≤ 2 mm Rhotodorula glutinis 89 % Bueno 2.1-10 mm Rhotodorula glutinis 89 % Bueno

10.1-15 mm Candida pulcherrima 96 % Excelente Candida famata 91 % Excelente

≥ 15.1 mm

Kodamaea ohmeri 91 % Excelente Candida pulcherrima 96 % Excelente Rhodotorula glutinis 89 % Bueno Candida famata 91 % Excelente

Fuente: Elaboración propia, 2016.

Para el caso del pan de abejas en pote, las pruebas bioquímicas evidenciaron que los

aislamientos de las cuatro especies de meliponinos incluidos en el estudio presentan

levaduras con resultados negativos para las valoraciones ante la presencia de las enzimas L-

lisina-arilamidasa, Beta-N-acetil-glucosaminidasa y Gamma-glutamil-transferasa, e

igualmente presentaron resultados negativos para la asimilación del Monosacárido L-

Ramnosa, el alcohol Eritritol, así como los compuestos DL-Lactato y Glucuronato. Estos

resultados son similares a los obtenidos en los aislamientos obtenidos a partir de pan de

abejas de Apis mellifera. La asimilación de los monosacaridos D-Xilosa y L-Sorbosa tampoco

se presentó en los aislamientos obtenidos a partir del pan de abejas en pote, a diferencia de


lo observado en los aislamientos de pan de abejas de Apis mellifera, que presentaron

asimilación del azúcar.

Un aislamiento procedente de pan de abejas de la especie Tetragonisca angustula se

comportó de forma atípica con respecto a los resultados de las demás levaduras, dado que

correspondió al único aislamiento que presentó resultados positivos para la valoración ante la

asimilación de L-malato, Lactosa, Arbutina, Nitrato, D-Melocitosa y D-Melibiosa, así como la

presencia de las enzimas Tirosina-arilamidasa y Ureasa. El mencionado aislamiento también

fue la única levadura de pan de abejas en pote incapaz de asimilar Metil-A-D-

Glucospiranósido, D-Manosa, Sacarosa, D-Maltosa y Gricerol, e igualmente presentó

resultados negativos ante la presencia de Arginina GP.

La totalidad de los aislamientos levadurales obtenidos en el pan de abejas en pote asimilaron

los compuestos D-Glucosa, D-Turanosa, L-Glutamato, L-prolina, D-Trealosa, 2-Ceto-D-

Gluconato, D-Sorbitol, Acetato y Citrato de sodio, e igualmente fueron positivos ante la

presencia de Leucina arilamidasa.

Resultados positivos frente a la asimilación de N-acetil-Glucosamina y la presencia de la

enzima Alfa-glucosidasa se presentaron en más del 80 % de los aislamientos obtenidos en el

pan de abejas en pote de las cuatro especies incluidas en el estudio. La asimilación del

azúcar L-arabinosa se presentó en más del 85 % de los aislamientos para las especies de

abejas Tetragonisca angustula, Paratrigona spp., y Plebeia spp. Para la especie

Scaptotrigona spp. la asimilación del compuesto se presentó en el 75 % de los aislamientos.

La asimilación de D-Galactosa se presentó en el 77 % de los aislamientos obtenidos de pan

de abejas en pote de la especie Teragonisca angustula, el 83 % de los aislamientos de

Paratrigona spp., 71 % de los aislamientos de Plebeia spp., y el 100 % de los aislamientos

de Scaptotrigona spp. La asimilación de D-rafinosa se presentó entre el 42 % y 75 % de los

aislamientos y la asimilación de D-galacturonato se presentó entre 25 % y el 38 % de los

aislamientos dependiendo de la especie de abejas. Se obtuvieron resultados positivos frente

a la presencia de la enzima PNP-N-acetil-BD-galactosaminidasa en el 38 % de los

aislamientos obtenidos en muestras procedentes de colonias de Tetragonisca angustula, 50

% de Paratrigona spp., 43 % de Plebeia spp., y 25 % de Scaptotrigona spp.


53

Los aislamientos obtenidos en el pan de abejas en pote de las especies Plebeia spp., y

Scaptotrigona spp. no presentan asimilación de los compuesto Xilitol y Amigdalina. Para las

especies Tetragonisca angustula y Paratrigona spp. se presenta asimilación de los

compuestos en el 8 % de los aislamientos.

La asimilación de D-Celobiosa solo se presentó en el 15 % de los aislamientos de la especie

de abeja Tetragonisca angustula y el 14 % de los aislamientos obtenidos de la especie de

abeja Plebeia spp. La asimilación de D-gluconato solamente de presentó en un aislamiento

de las especies de abeja T.angustula y Scaptotrigona spp.

La Tabla 3-5., resume los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas efectuadas por el

sistema Vitek2® para los aislamientos de abejas Apis mallifera y abejas de la Tribu

Meliponini. Apis mellifera (nivel de

llenado) ABEJAS SIN AGUIJÓN

C TEST 1 2 3 4 T.A Pa Pl Sc A L-Lisina-ARILAMIDASA 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

Asimilación de L-RAMNOSA 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% BETA-N-ACETIL-

GLUCOSAMINIDASA 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

Asimilación de DL-LACTATO 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% Asimilación de ERITRITOL 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

GAMMA-GLUTAMIL-TRANSFERASA

0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

B Asimilación de D-XILOSA 0% 0% 25% 30% 0% 0% 0% 0% Asimilación de

GLUCURONATO 100% 100% 0% 30% 0% 0% 0% 0%

Asimilación de L-SORBOSA 0% 0% 25% 30% 0% 0% 0% 0% C Tirosina ARILAMIDASA 0% 0% 0% 0% 15% 0% 0% 0%

Asimilación de LACTOSA 0% 0% 0% 0% 8% 0% 0% 0% PNP-N-acetil-BD-

galactosaminidasa 1 0% 0% 0% 0% 38% 50% 43% 25%

Asimilación de METIL-A-D-GLUCOPIRANÓSIDO

0% 0% 0% 0% 8% 100% 100% 100%

Asimilación de AMIGDALINA 0% 0% 0% 0% 8% 8% 0% 0% Asimilación de D-

MELIBIOSA 0% 0% 0% 0% 8% 0% 0% 0%

Asimilación de NITRATO 0% 0% 0% 0% 8% 0% 0% 0% UREASA 0% 0% 0% 0% 8% 0% 0% 0%

D Asimilación de D-GLUCOSA 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Asimilación de L-

GLUTAMATO 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Asimilación de D-SORBITOL 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% E Asimilación de L-MALATO 100% 100% 100% 100% 8% 0% 0% 0%


Asimilación de D-

GALACTOSA 100% 100% 100% 100% 77% 83% 71% 100%

Asimilación de XILITOL 100% 100% 50% 100% 8% 8% 0% 0% ARGININA GP 100% 100% 50% 50% 92% 100% 100% 100% Leucina ARILAMIDASA 100% 86% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Asimilación de D-

GALACTURONATO 100% 86% 0% 30% 31% 38% 29% 50%

Asimilación de SACAROSA 25% 71% 88% 80% 92% 100% 100% 100% F Asimilación de L-PROLINA 0% 14% 75% 70% 100% 100% 100% 100%

Asimilación de L-ARABINOSA

0% 14% 0% 0% 85% 92% 100% 75%

Asimilación de D-RAFINOSA 0% 0% 50% 30% 69% 42% 43% 75% Asimilación de D-

TURANOSA 0% 0% 88% 70% 100% 100% 100% 100%

Asimilación de D-TREALOSA 0% 0% 50% 70% 100% 100% 100% 100% Asimilación de 2-CETO-D-

GLUCONATO 0% 0% 88% 70% 100% 100% 100% 100%

Asimilación de D-CELOBIOSA

0% 0% 88% 70% 15% 0% 14% 0%

Asimilación de D-MANOSA 0% 0% 75% 70% 8% 100% 100% 100% Asimilación de ACETATO 0% 0% 75% 70% 100% 100% 100% 100%

Asimilación de D-MALTOSA 0% 0% 88% 80% 92% 100% 100% 100% ALFA-GLUCOSIDASA 0% 0% 88% 70% 92% 92% 100% 100%

Asimilación de ARBUTINA 0% 0% 25% 30% 8% 0% 0% 0% Asimilación de GLICEROL 0% 0% 50% 70% 92% 100% 100% 100% Asimilación de CITRATO

(SODIO) 0% 0% 50% 30% 100% 100% 100% 100%

Asimilación de D-GLUCONATO

0% 0% 35% 30% 8% 0% 0% 50%

Asimilación de D-MELOCITOSA

0% 0% 35% 30% 8% 0% 0% 0%

Hidrólisis de ESCULINA 0% 0% 35% 30% 8% 0% 14% 25% Asimilación de GENTIOBIOSA

0% 0% 25% 30% 8% 0% 0% 0%

Asimilación de N-ACETIL-GLUCOSAMINA

0% 0% 0% 30% 92% 83% 86% 100%


Especies de abejas sin aguijón T.A= Tetragonisca angustula, Pa= Paratrigona spp.,

Pl= Plebeia spp., Sc=Scaptotrigona spp. C= clasificación del aislamiento según perfil

bioquímico. A= Pruebas bioquímicas con resultados negativos para la totalidad de los

aislamientos del estudio. B= Pruebas bioquímicas con resultados positivos

exclusivamente para aislamientos de Apis mellifera. C= Pruebas bioquímicas con

resultados positivos exclusivamente para aislamientos de abejas de la Tribu

Meliponini. D= Pruebas bioquímicas con resultados positivos para la totalidad de los

aislamientos del estudio. E= Pruebas bioquímicas con al menos un aislamiento

positivo para abejas Apis mellifera y de la tribu Meliponini. F= Pruebas bioquímicas


55

con resultados negativos de Apis mellifera en el estadio de llenado alveolar uno, con

resultados positivos para estadios superiores y que también fueron positivos para

aislamientos de abejas de la tribu Meliponini.

Para las abejas de la tribu Meliponini, la correlación de los resultados de las pruebas

bioquímicas aplicadas a las levaduras obtenidas del pan de abejas en pote mediante

el sistema Vitek ® identificaron nueve de los 12 aislamientos asociados con las

colonias de la especie T. angustula, los cuales fueron agrupados como tres especies

de levaduras. Para el pan de abejas en pote de la especie de abeja Paratrigona spp., se aislaron 16 levaduras, de las cuales 12 se agruparon como tres especies

diferentes de acuerdo con el perfil bioquímico y cuatro no fueron identificadas. En el

pan de abejas de la especie Plebeia spp. se aislaron siete levaduras cuyo perfil

bioquímico agrupó seis levaduras en dos especies y una no fue identificada. Para la

especie de abeja Scaptotrigona spp. fueron aisladas cuatro levaduras agrupadas en

dos especies. Los aislamientos obtenidos a partir del pan de abejas en pote se

resumen en la Tabla 3-6.

Tabla 3-6. Aislamientos de levaduras de pan de abejas en pote de cuatro especies de

abejas sin aguijón, identificadas por el sistema VITEK ®

ESPECIE CEPA IDENTIFICADA PROBABILIDAD

DE IDENTIFICACIÓN

NIVEL DE CONFIANZA

Tetragonisca angustula

Candida parapsilosis 95 % Excelente

Candida famata 93 % Excelente

Kodamaea ohmeri 94 % Excelente

Paratrigona spp. Candida parapsilosis 95 % Excelente



Plebeia spp. Candida parapsilosis 95 % Excelente


Scaptotrigona spp. Candida famata 93 % Excelente




En total fueron identificadas por el sistema Vitek ® cinco especies de levaduras, de las

cuales el 50 % pertenecen al género Candida. La levadura Candida famata estuvo

presente en el pan de abejas de todas las especies de abejas incluidas en el estudio, la

especie Kodamaea ohmeri fue detectada en el pan de abejas de Apis mellifera y en el

pan de abejas en potes de todas las especies de abejas incluidas en el estudio, a

excepción de la Plebeia spp. La levadura Candida parasilopsis se aisló exclusivamente

de pan de abejas en pote de abejas de la tribu Meliponini. La levadura Rhodotorula glutinis fue aislada exclusivamente en pan de abejas de la especie Apis mellifera y la

levadura Candida pulcherrima se aisló exclusivamente de pan de abejas en pote de la

especie Tetragonisca angustula. Los resultados obtenidos se resumen en la Figura 3-3.

Figura 3-3. Relación de las levaduras aisladas de pan de abejas con la respectiva

especie de abeja


3.5 Discusión Los hallazgos obtenidos en el estudio muestran la diversidad de formas levadurales que

utilizan las abejas para transformar el polen floral al pan de abejas que emplea en su dieta.

En el sistema Vitek ® se identificó solamente el 60 % de los aislamientos procesados

con un nivel de confianza excelente, por lo cual se puede inferir que la capacidad de

identificación del sistema es reducida para levaduras presentes en pan de abejas si se

compara con estudios efectuados en aislamientos clínicos, en los cuales se tienen

niveles de identificación entre el 70 % y el 90 % (Ferrara et al., 2014). Dicho

comportamiento se presenta debido a que la base de datos alojada en el sistema prioriza

los microorganismos relacionados con la salud humana, lo que limita su capacidad en


57

muestras de otras procedencias (Arias et al., 2002).

Pese a que las pruebas bioquímicas efectuadas por el Sistema Vitek2® no permitieron

identificar la totalidad de los aislamientos, el perfil fisiológico obtenido en las pruebas es

importante para el entendimiento de la cinética microbiana durante el proceso de

maduración del pan de abejas, pues de este modo es posible evidenciar que la presencia

de levaduras con asimilación específica de ciertos compuestos solo se presenta al final

del proceso de maduración del pan de abejas. Asimismo el estudio permitió detectar

diferencias grandes en cuanto a la asimilación de los compuestos L-malato, L-arabinosa,

L-sorbosa, D-Melocitosa, Gentiobios, Xilitol, Metil-A-D-Glucopiranósido y Glucuronato

entre los aislamientos obtenidos de pan de abejas de Apis mellifera y el pan de abejas en

pote de especies de abejas de la tribu Meliponini.

El pan de abejas de la especie Apis mellifera presentó variabilidad en la flora microbiana

a medida que se registran cambios en la altura de llenado de las celdas, donde el polen

es procesado hasta la obtención de un producto estable. La especie de levadura

Rhotodorula glutinis fue detectada en el pan de abejas maduro, dicho microorganismo

fue aislado de polen floral, polen corbicular y pan de abejas (Gilliam, 1979b), otros

reportes de aislados del género Rhotodorula se asocian al intestino abejas adultas de T. angustula y de Mellipona cuadrifeciata, así como también se ha hallado su presencia en

mieles de T. angustula (Rosa et al., 2003). La especie Rhodotorula muscilaginosa (muy

cercana bioquímicamente a R. Glutinis) se ha aislado en mieles de Apis mellifera con

denominación de origen procedentes de Portugal (Carvalho et al., 2010).

La levadura Kodamaea ohmeri estuvo presente en el pan de abejas de Apis mellifera y de

abejas de la tribu Meliponini; dicha levadura se ha asociado con abejas en diversos estudios

y ha sido aislada de intestinos de abejas de la especies Melipona cuadrifasciata (Daniel et

al., 2013; Rosa et al., 2003), Apis cerana (Basikriadi et al., 2012), Bombus impatiens y

Bombus pensylvanicus (Graham et al., 2011). K ohmeri también fue asociado con la plaga

Aethina tumida, que afecta las colonias de Apis mellifera (Benda et al., 2008).

El 50 % de las levaduras identificadas por el sistema Vitek2® pertenecen al género

Candida, el cual ha sido ampliamente reportado en diversos estudios asociados con las


abejas Apis mellifra (Nasser, 2004; Gilliam, 1979b; Carvalho et al., 2010; Dhanwant &

Manjit, 1985; Manson et al., 2007; Nogueira et al., 2012; Lachance et al., 2001) y abejas

de la tribu Meliponini (Rosa et al., 2003; Daniel et al., 2013). La levadura Candida famata

fue aislada del pan de abejas de todas las especies de abejas incluidas en el estudio;

esta levadura ha sido aislada frecuentemente de muestras medioambientales, se ha

reportado como productora de riboflavina y se asocia a la producción industrial de esta

vitamina (Stahmann et al., 2000).

La levadura Candida parapsilosis estuvo presente en el pan de abejas en pote de las

especies de abeja Paratrigona spp., Plebeia spp., y T. angustula. Esta levadura ha sido

reportada como asociada a Apis mellifera, en pan de abejas por Egorora en 1967 citada

por Gilliam, 1979b, en polen floral (Gilliam, 1979b), en el intestino de abejas adultas

(Giliam, 1997) y en mieles (Carvalho et al., 2010).

A partir del pan de abejas de Apis mellifera se aisló la levadura Candida pulcherrima, la

cual no fue detectada en el pan de abejas en pote de la tribu Meliponini. La presencia de

la levadura se observó en el pan de abejas en estadios con alto grado de maduración.

Esta levadura fue aislada de polen corbicular de Apis mellira (Gilliam, 1979b) y se

reconoce como un microorganismo de utilidad en los proceso de fermentación para la

producción de vinos (Zohre & Erten, 2002; Jolly et al., 2003) con efectos sobre su aroma

(Rodríguez et al., 2010).

La variabilidad de levaduras cultivables presentes en los pólenes acondicionados por las

abejas y los cambios en los perfiles bioquímicos muestran la importancia que tienen los

mencionados microorganismos sobre el proceso de maduración, de los cuales se conoce

que aportan factores antimicrobianos, vitaminas y otros componentes de importancia

nutricional. También muestra una compleja cinética microbiana al interior de los alveolos

y los potes en las distintas especies de abejas estudiadas.

3.6 Conclusiones La totalidad de las levaduras cultivables presentes en el pan de abejas de Apis mellifera y

abejas de la tribu Meliponini presentan coincidencias en cuanto a la asimilación de D-

glucosa, L-Glutamato y D-Sorbitol, e igualmente coinciden en la no asimilación de L-


59

Ramnosa, DL-Lactato y Eritritol.

La asimilación de D-Xilosa, Glucuronato y L-Sorbosa se presenta exclusivamente en

aislamientos provenientes de Apis mellifera.

Se presentan cambios de las respuestas a las pruebas bioquímicas entre los

aislamientos obtenidos en los diferentes niveles de llenado alveolar del pan de abejas de

la especie Apis mellifera.

A partir del pan de abejas de Apis mellifera y del pan de abejas de potes de las especies

T. angustula, Paratrigona spp., Scaptotrigona sp y Plebeia sp, se aislaron e identificaron

por perfiles bioquímicos cinco levaduras diferentes.

El género Candida estuvo presente en las muestras de todas las especies de abejas del

estudio, particularmente C. famata. La levadura C. parapsilosis correspondió a abejas

nativas y C. pulcherrima a Apis mellifera.

Rhodotorula glutinis estuvo presente solo en aislamientos provenientes de pan de abejas

de Apis mellifera.

Kodamaea ohmeri se halló en muestras de Apis mellifera y abejas nativas con excepción

de Plebeia spp.

3.7 Referencias Acosta-Martínez, V., & Tabatabi, M. A. (2001). Arylamidase activity in soils: effect

of trace elements and relationships to soil properties and activities of

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4. Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares

Portillo CY, V. Tibata, Figueroa J, Junca H

Resumen El presente estudio se propuso aislar por el método molecular de secuenciación del ADN

de la región ARNr 5.8S-ITS que codifica para la región rDNA, las levaduras cultivables

presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas en Apis mellifera y en cuatro especies de abejas nativas de Colombia pertenecientes a la tribu

Meliponini (Tetragonisca angustula, Paratrigona sp., Plebeia sp. y Scaptotrigona sp). De

A. mellifera, se analizaron 198 muestras de polen tomadas de los alvéolos de la colmena

a cuatro diferentes porcentajes de llenado. El estudio permitió la identificación de cuatro

especies de levaduras del pan de abejas de A. mellifera: Zygosaccharomyces mellis, Candida apicola, Metschnikowia pulcherrima y Kodamea ohmeri. Sobre las abejas

nativas se colectaron 48 muestras de polen de pote, a partir de las cuales fueron aisladas

y caracterizadas seis especies de levaduras, entre estas Starmerella bombicola, Kodamea ohmeri, Metschnikowia pulcherrima, Candida magnoliae, Candida apícola, y Candida cellae; estas dos últimas especies fueron predominantemente aisladas en

Plebeia sp y Scaptotrigona sp., mientras que los otros cuatro géneros de levaduras solo

fueron aisladas en T. angustula y Paratrigona sp. Los resultados obtenidos amplían la

información sobre la microbiota responsable del proceso natural de maduración del polen

al pan de abejas como un aporte al desarrollo de alimentos apícolas para el consumo

humano.

Palabras Claves: Abejas, Abejas nativas, levaduras, secuenciación, polen y pan de

abejas.


4.1 Introducción Colombia es un país que presenta condiciones botánicas favorables para la obtención de

altas cantidades de polen apícola (Martínez, 2006), producto cuya composición nutricional

lo hace un alimento interesante para el consumo humano.Se resalta su alto porcentaje de

proteína, así como la presencia de vitaminas y de minerales (Domínguez et al., 2014). No

obstante, las abejas no consumen el polen de forma directa, estos insectos lo utilizan

como materia prima para la elaboración de otro producto denominado pan de abejas, el

cual presenta mejor estabilidad y mayor disponibilidad de los nutrientes (Fuenmayor et al.,

2011). Los altos volúmenes productivos de polen por colmena que presenta Colombia

pueden ser aprovechados para su transformación en pan de abejas industrial (Fuenmayor,

2009).

El pan de abejas es la única fuente de proteínas y ácidos grasos de la colonia, es un

producto de fermentación elaborado por las abejas en alveolos o potes de cera dentro de

la colmena a partir del polen colectado de las flores, con participación de una simbiosis de

levaduras y bacterias lácticas (Moreno, 2012).

Para simular el proceso de maduración del polen al interior de la colmena en condiciones

industriales, es necesario comprender la compleja cinética de los microorganismos

involucrados en dicha transformación, entre los que se destacan las bacterias acidolácticas

y las levaduras (Gilliam, 1979).

Investigaciones recientes han buscado establecer la microbiota presente en el pan de

abejas de Apis mellifera por técnicas moleculares, lo cual ha permitido identificar las

bacterias ácidolacticas Oenococcus y Paralactobacillus como los microorganismos más

activos en el pan de abejas (Mattila et al., 2012) Asimismo se destaca la presencia del L. kunkeei como uno de los microorganismos responsables de la fermentación del polen

apícola (Asama et al., 2015; Moreno, 2012). Para el caso de las formas levadurales

actualmente los estudios de identificación y filogenia utilizan técnicas mediante la región

del rDNA 5,8S y los espaciadores transcritos internos ITS 1 e ITS 2 (5,8S – ITS). La región

5.8S es codificadora y conservada, por lo tanto muestra una baja variabilidad que no

permite la delimitación entre cepas de una misma especie; sin embargo la zona de los ITS,

que es una región no codificadora, sí es hipervariable y por tanto permite el reconocimiento

Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares

69

a nivel interespecífico; por tal razón ha sido empleada para la identificación y diferenciación

de especies de levaduras en diferentes substratos, alimentos y bebidas. Una de las

técnicas más empleadas es la PCR – RFLP, que consiste en la amplificación enzimática

del ADN de esta región por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa;

posteriormente los amplificados se someten a digestión con enzimas de restricción y son

visualizados en geles de agarosa (Esteve-Zarzoso et al., 1999).

La mayoría de los estudios moleculares efectuados en el pan de abejas se han centrado

en la valoración de los grupos de bacterias, sin embargo se sabe de la existencia de

levaduras asociadas con el proceso de maduración del polen, que proporcionan factores

de su propio metabolismo, los cuales contribuyen a las características del producto (Pain &

Maugenet, 1966). Los métodos tradicionales de cultivo han permitido la clasificación de

levaduras, como especies de los géneros Candida y Torulopsis, entre otras (Guilliam,

1979).

En relación con estudios específicos de levaduras asociadas a las abejas y sus productos

mediante técnicas moleculares, se cuenta con pocos reportes al respecto. Existen

valoraciones mediante técnicas que utilizaron la secuencia parcial del gen rRNA 26S

(rDNA) y los patrones de restricción generados

internos (ITS1 e ITS2) del gen rRNA 5.8S (rDNA), permitieron identificar en las mieles de

abejas Apis mellifera originarias de Portugal, la presencia de las especies de levaduras

Candida magnoliae Candida sorbosivorans, Rhodotorula mucilaginosa, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces melis, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon mucoides y Pichia membranifaciens (Carvalho et al., 2010). Otro estudio

efectuado en mieles de abejas Apis mellifera de diversos orígenes que empleó la

secuencia parcial de los genes rRNA 26S (rDNA) y rRNA 16S describió la presencia de las

especies Cryptococcus uzbekistanensis, Aureobasidium pullulans y Debaryomyces hansenii (Sinacori et al., 2014). Un estudio reciente efectuado por técnicas moleculares

asoció la levadura Zygosaccharomyces favi con la miel y el pan de abejas de Apis mellifera

(Cadez et al., 2015).

La aplicación de técnicas moleculares también se ha utilizado para identificar aislamientos

de levaduras provenientes de abejas de la tribu Meliponini. Específicamente en la especie


Tetragonisca angustula, permitió detectar en tracto digestivo las levaduras Aureobasidium pullulans, Pseudozyma antárctica, Starmerella meliponinorum (Rosa, et al., 2003), Candida etchellsii, Cryptococcus albidus, Issatchenkia scutulata, y Zygosaccharomyces bisporus

(Rosa & Lachance, 2005). En la miel y el pan de abejas en pote de la misma especie se

detectó la levadura S. Meliponinorum (Teixeira et al., 2003) y en los desechos se aisló la

especie Zygosaccharomyces machadoi.

Para las especies de abejas del género Melipona, M. quadrifasciata y M. Rufiventris fueron

aisladas del tracto digestivo las levaduras Aureobasidium pullulans, Pseudozyma antárctica

y Starmerella meliponinorum. Para M. quadrifasciata, adicionalmente se aislaron las

especies Candida apicola, Candida catenulata, Candida floricola, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus macerans y Kodamaea ohmeri (Rosa, et al., 2003). Para esta especie de

meliponino también se detectaron las formas levadurales C. Apicola y K. Ohmeri en el pan

de abejas. La levadura Starmerella neotropicalis fue aislada de tractos digestivos y pan de

abejas de la especie Melipona quinquefasciata (Daniel et al., 2013).

En tractos digestivos de la especie de abejas Frieseomelitta varia fue posible establecer

mediante técnicas de identificación molecular, la presencia de las levaduras Aureobasidium pullulans, Pseudozyma antárctica, Starmerella meliponinorum y Candida versatilis (Rosa et

al., 2003). Para abejas del género Bombus la aplicación de técnicas moleculares ha permitido asociar

con tracto digestivo de estos insectos, las levaduras Metschnikowia reukaufii, Metschnikowia gruessii, Metschnikowia pulcherrima, Candida bombi, Zygosaccharomyces rouxi Debaryomyces maramus (Brysch-Herzberg, 2004) y Metschnikowia kunwiensis (Gyu

Hong et al., 2003).

En Colombia no existe a la fecha ningún reporte de caracterización de levaduras presentes

en el pan de abejas por secuenciación del ADN, ni aún por PCR-RFLP, que permita su

identificación; por tal razón este estudio se propuso aislar por cultivo e identificar por

secuenciación de la región ARNr 5.8S-ITS, las levaduras presentes en el proceso de

transformación de polen corbicular a pan de abejas en Apis mellifera y en especies de

abejas nativas de Colombia.


71

4.2 Materiales y métodos

4.2.1 Muestreo de pan de abejas de A. mellifera Los análisis fueron efectuados a partir de 198 muestras de polen alveolar de Apis

mellifera, colectadas en un apiario ubicado en las ciudad de Bogotá (Cundinamarca),

propiedad del Laboratorio de Abejas de la Universidad Nacional LABUN. En la obtención

de estas muestras, se efectuó el seguimiento del proceso que realizan las abejas para

madurar el polen alveolar y se estandarizó el muestreo, teniendo en cuenta el volumen

de llenado del alveolo como un indicador del estado de maduración del producto, de este

modo se tomaron muestras de cuatro niveles de llenado de los alveolos, así: 1.

equivalente a ≤ 2 mm de profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15 mm y 4. ≥ 15 mm. La

extracción del pan de abejas de los alveolos se realizó en cabina de flujo laminar con una

cucharilla de uso odontológico estéril.

4.2.2 Muestreo de pan de abejas nativas Para la toma de las muestras de abejas nativas correspondientes a la tribu Meliponini, el

estudio se realizó en seis meliponarios ubicados en el departamento de Santander

(Colombia), pertenecientes a productores de la Asociación Apícola Comunera

ASOAPICOM. La identificación de las abejas empleadas en el estudio fue realizada por

el LABUN (Laboratorio de Biología Universidad Nacional de Colombia) mediante claves

taxonómicas. Se obtuvo un total de 46 muestras de polen en pote provenientes de

colonias de cuatro especies de abejas nativas: 21 muestras de T. angustula, 15 de

Paratrigona sp., seis de Plebeia sp., cuatro de Scaptotrigona sp. Para la colecta de la

muestra se retiraron los potes con polen completos y se depositaron en frascos estériles

refrigerados hasta su transporte al laboratorio donde se realizó la apertura del pote y la

extracción del polen bajo cabina de flujo laminar.

4.3 Cultivo y aislamiento microbiológico Las muestras de pan de abejas fueron procesadas en laboratorio mediante la técnica de

dilucion y siembra directa por agotamiento, en el proceso se empleó 0,5 g de cada

muestra. Se empleron los agares Papa Dextrosa Agar (PDA) (Oxoid ®) y Agar nutritivo

Walerstein Laboratory (WL) (Condalab ®) para detección de organismos fermentadores.


Los cultivos fueron incubados a 35°C durante 48 horas, para simular el proceso natural

de temperatura fisiologica de la colmena; pasado este tiempo, las placas con crecimiento

se resembraron en agar Sabouraud cloranfenicol (Oxoid ®) mediante el método de

agotamiento en estrías, y fueron incubadas a 35°C duante 48 horas, este proceso se

efectuó de forma repetitiva hasta lograr obtener colonias aisladas en cultivo puro. Una

porción de cada cepa aislada fue teñida con Gram y observada al microscopio, con el

objeto de definir si correspondían a formas levadurales y si eran diferentes unas de otras.

Las características morfológicas macroscópicas de las colonias que se tuvieron en

cuenta fueron: textura, color, intensidad del color y presencia de halo micelial. Las

especies levadurales fueron caracterizadas en cuanto a su perfil bioquímico frente a 46

compuestos, empleando el sistema Vitek2® Systems: 04.01. Las colonias

morfológicamente distintas (macro y microscópicamente) fueron preservadas mediante

congelación (-70oC) en caldo Sabouraud (Oxoid).

4.4 Identificación por biología molecular Las levaduras aisladas fueron identificadas molecularmente por medio de la técnica de PCR

y secuenciación, en la que a partir de ADN genómico de cada una de las cepas de levaduras

se amplificó un fragmento de la región 5,8S – ITS. La extracción de ADN se realizó mediante

el método de ebullición de una colonia de cada levadura en 100 uL de agua destilada estéril

(Colony – PCR). Esta suspensión de levadura fue calentada a 100°C durante 10 minutos en

un termociclador PxE 0.2 (ThermoElectron Corporation, USA).

Para la PCR, los iniciadores usados fueron ITS1 (5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3') e

ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') (White y col. 1990). Se tomaron 5 μL de ADN

extraído y se suspendieron en 45 uL de la mezcla de PCR que contenía: 1X de solución

tampón de PCR, 1.5 mM de MgCl2, 0.8 μM de cada iniciador IST1 e ITS4, 10 μM de

dNTPs, 1 unidad de Taq ADN polimerasa (TucanTaq ADN polimerasa, Corpogen, Bogotá

Colombia) y agua destilada ultrapura hasta completar un volumen final de 50 uL. La PCR

se realizó en un termociclador PxE 0.2 (ThermoElectron Corporation, USA) con las

siguientes condiciones: Desnaturalización inicial a 94°C durante 3 minutos, seguidos de

30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, apareamiento de los

iniciadores a 57°C durante 1 min, extensión 72°C durante 1 minuto y extensión final 72°C

durante 3 min (Esteve-Zarzoso et al., 1999).


73

Alícuotas de 5 uL de cada amplificado fueron mezclados con 5 uL de solución tampón de

carga y sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1 %, teñidos con bromuro de

etidio, en solución tampón TBE 1X (90 mM Tris, 90 mM Borato y 2 mM EDTA, pH 8.3).

Los fragmentos fueron corridos a 70 voltios en una hora y luego visualizados en un

transiluminador UV (Spectroline USA). El tamaño de los amplificados fue comparado con

un marcador molecular de 100 pb (Promega WI, USA). El volumen restante de todos los

productos de PCR (45 uL), fueron enviados a MACROGEN (Corea del Sur) para que

fueran secuenciados por el método capilar. Una vez obtenidas las secuencias se

compararon con la base de datos del GenBank, usando la herramienta BLASTn, y se

recuperaron aquellas secuencias de referencia encontradas que estuvieran más

relacionadas con las secuencias obtenidas. Con las secuencias de las cepas

identificadas se realizó un análisis basado en similitud por medio de alineamientos

múltiples sobre cepas de referencias relacionadas utilizando el programa MUSCLE en el

servicio online del EMBL http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/en y se utilizó

paralelamente un método de asociación taxonómica bayesiano (Liu, Porras-Alfaro, kuske,

Eichorst, & Xie, 2012): Fungal LSU

Classifierhttps://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp.

4.5 Resultados De las 48 muestras que se tomaron de polen alveolar de colmenas de A. mellifera, se

aislaron 29 levaduras a partir de los diferentes tipos de llenado. A cada levadura se le

extrajo el ADN genómico y posteriormente se amplificó un fragmento de la región 5.8s-

ITS del ARNr. Los amplificados obtenidos fueron polimórficos en tamaño, obteniéndose

bandas entre 400 y 750 pb, lo cual indicaba la presencia de levaduras que pertenecían a

géneros diferentes. De los 29 aislamientos cinco presentaron secuencias de baja calidad,

por lo cual no se incluyen en el reporte de resultados. El análisis bioinformático, realizado

por alineamiento de las secuencias obtenidas en el programa BLASTn del Genbank,

permitió determinar que los 24 aislamientos presentaron identidades entre el 92 y el 100

% con cuatro especies diferentes de levaduras: Candida apicola (diez aislamientos),

Kodamea ohmeri (ocho aislamientos), Mestchikowa pulcherrima (tres aislamientos) y

Zygosaccharomyces siamensis (tres aislamientos). Los tamaños de las secuencias

obtenidas variaron entre 500 pb y 700 pb.

https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp


Respecto a la relación de las levaduras aisladas con el nivel de llenado del alvéolo, en el

estadio de llenado uno se obtuvieron cuatro aislamientos de los cuales el 50 %

correspondieron a la especie C. apícola, el 25 % a K. ohmeri y el 25 % a Z. siamensis. En

el nivel de llenado dos se obtuvieron seis aislamientos de los cuales el 83 % se

identificaron como C.apicola y el 17 % como Z. siamensis. Para el tercer estadio de

llenado se obtuvieron cinco aislamientos de los cuales el 40 % correspondieron a K. ohmeri, el 40 % a M. Pulcherrima y el 20 % a Z. siamensis. De los alveolos con volumen

de llenado completo se obtuvieron nueve aislamientos de los cuales el 56 % fueron

identificados como K. ohmeri, el 33 % como C. Apícola y el 11 % como M. pulcherrima.

La Figura 4 resume las especies de levaduras obtenidas en cada etapa de llenado del

alveolo.

Figura 4-1. Levaduras aisladas en pan de abejas de apis mellifera según el volumen de

llenado del alveolo

Fuente: Construcción propia, 2016.

≤ 2 mm

≤10 mm

≤15 mm

≥ 15mm Candida apicola

Candida apicola

Kodamaea ohmeri

Kodamaea ohmeri

Kodamaea ohmeri

Metschnikowia pulcherrima

Metschnikowia pulcherrima

Zygosacharomyces siamensis



VOLU

MEN

APR

OXI

MAD

O D

E LL

ENAD

O D

EL

ALVE

OLO

ESPECIE DE LEVADURA AISLADA


75

A partir de las 48 muestras de pan de abejas en pote procedentes de los meliponinos, T. angustula, Paratrigona sp., Plebeia sp. y Scaptotrigona sp., fueron aisladas y

caracterizadas 43 levaduras. La amplificación de la región 5.8s-ITS del ARNr de los

aislamientos generaron diferentes tamaños de bandas entre 400 y 800 pb.

Mediante el alineamiento de las secuencias de las 43 especies de levaduras de abejas

nativas, se pudo establecer que había identidad entre el 91 y el 100 %, con seis especies

de levaduras reportadas en GenBank: Candida apícola (21 cepas, 49 %), Candida cellae

(10 cepas, 23 %), Starmerella bombicola (7 cepas, 16 %), Kodamea ohmeri (2 cepas, 5

%), Candida magnoliae (2 cepas, 5 %) y Metschnikowia pulcherrima (1 cepa, 2 %).

En cuanto a una posible asociación entre géneros de abejas nativas y de levaduras, se

estableció que para las muestras analizadas las dos especies de Candida (apícola y cellae), fueron predominantemente aisladas en el polen de pote de los géneros Plebeia sp y Scaptotrigona sp., mientras que los otros cuatro géneros de levaduras (S. bombicola, K. ohmeri y M. pulcherrima) solo fueron aisladas en muestras de abejas T. angustula y Paratrigona sp.

Para describir las relaciones representadas en un dendrograma resultante de las

distancias calculadas entre las secuencias alineadas, se realizó un alineamiento conjunto

de las secuencias obtenidas a partir de las levaduras aisladas de pan de abejas de A. mellifera y de abejas nativas. Como se pudo observar, existen levaduras que representan

grupos solo encontrados en la colección proveniente de los panes de abejas nativas,

dichos aislamientos presentan una similitud y tamaño relacionados con los ITS

encontrados en cepas de referencia de cultivos de diversas especies del género

Zygosaccharomyces spp. Sin embargo, los resultados muestran que no presentan la

misma relación con las cepas reportadas en bases de datos, y por lo tanto pueden ser

aislados de especies aún no descritas dentro de este género. No obstante, las

secuencias dentro de dicho género de la familia Saccharomycetaceae son las más

cercanas, y dada la distancia observada, es incluso equivalente a la observada entre

representantes de distintos géneros, por lo tanto, la taxonomía de esa levaduras

exclusivamente encontradas en abejas nativas, pueden también estar representando

aislamientos de cepas en géneros no reportados (Figura 4-2).


Figura 4-2. Árbol de distancias (nj tree) resultante del alineamiento de las secuencias de its obtenidas de las cepas de levaduras aisladas a partir de pan de abejas de apis mellifera y de la tribu meliponini


77

Apis mellifera= A, en azul seguido del número de la cepa y del porcentaje de llenado de

la celda en porcentaje, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %) y del tamaño del ITS comparado.

Abejas de la tribu Meliponini = N, en color rojo, seguido del número asignado a la cepa

aislada, y del tamaño del ITS comparado. Para abejas nativas las siglas corresponden a

TA= Tetragonisca angustula, P= Paratrigona sp, Pl= Plebeia sp. y S= Scaptotrigona sp.

Ambigüedades no resueltas (N), se indican con MQ (calidad media) o LQ (baja calidad).

Para corroborar los resultados obtenidos por métodos de distancia (alineamiento de las

secuencias y matriz de similitud), adicionalmente se realizó la clasificación de cada uno

de los datasets de secuencias de levaduras de pan de Apis mellifera o de abejas nativas,

utilizando la nueva herramienta disponible en RDP Classifier

https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp (Liuet al., 2012; Wanget al., 2007).

Para tal fin, se utilizó la base de datos Warcup ITS fungal training set. Los resultados con

el set UNITE de Kessy Abarenkov fueron idénticos (Australian Bioinformatic Network,

2014).

Los resultados de clasificación por este método se muestran a continuación:

Clasificación de secuencias de levaduras de pan de abejas A. mellifera» »

domain Fungi (24)

» » » phylum Ascomycota (24)

» » » » subphylum Saccharomycotina (24)

» » » » » class Saccharomycetes (24)

» » » » » » subclass Saccharomycetidae (24)

» » » » » » » order Saccharomycetales (24)

» » » » » » » » family Metschnikowiaceae (1)

» » » » » » » » » genus Metschnikowia (1)

» » » » » » » » » » species Metschnikowia pulcherrima (1)

» » » » » » » » family Saccharomycetaceae (3)

» » » » » » » » » genus Zygosaccharomyces (3)

» » » » » » » » » » species Zygosaccharomyces siamensis (3)

» » » » » » » » family Saccharomycetales_Incertae sedis (18)

https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp

https://rdp.cme.msu.edu/classifier/hierarchy.jsp?root=2&depth=0&confidence=0.8














» » » » » » » » » genus Candida (10)

» » » » » » » » » » species Candida apicola (10)

» » » » » » » » » genus Kodamaea (8)

» » » » » » » » » » species Kodamaea ohmeri (8)

» » » » » » » » unclassified_Saccharomycetales (2)

Clasificación de secuencias de levaduras de pan de abejas nativas » » domain Fungi (46)

» » » phylum Ascomycota (45)

» » » » subphylum Saccharomycotina (42)

» » » » » class Saccharomycetes (42)

» » » » » » subclass Saccharomycetidae (42)

» » » » » » » order Saccharomycetales (42)

» » » » » » » » family Saccharomycetaceae (4)

» » » » » » » » » genus Zygosaccharomyces (4)

» » » » » » » » » » species Zygosaccharomyces mellis (3)

» » » » » » » » » » species Zygosaccharomyces siamensis (1)

» » » » » » » » family Saccharomycetales_Incertae sedis (36)

» » » » » » » » » genus Kodamaea (2)

» » » » » » » » » » species Kodamaea ohmeri (2)

» » » » » » » » » genus Candida (24)

» » » » » » » » » » species Candida metapsilosis (3)

» » » » » » » » » » species Candida versatilis (1)

» » » » » » » » » » species Candida apicola (19)

» » » » » » » » » » unclassified_Candida (1)

» » » » » » » » » genus Starmerella (6)

» » » » » » » » » » species Starmerella bombicola (1)

» » » » » » » » » » unclassified_Starmerella (5)

» » » » » » » » » unclassified_Saccharomycetales_Incertae sedis (4)

» » » » » » » » unclassified_Saccharomycetales (2)

» » » » unclassified_Ascomycota (3)

» » » unclassified_Fungi (1)

Los resultados sugieren que existe una relación entre la presencia de un determinado





https://rdp.cme.msu.edu/classifier/hierarchy.jsp?root=-224&depth=0&confidence=0.8



























79

género de levaduras y el nivel de llenado de los alvéolos en colonias de A. mellifera,

como es el caso de M. Pulcherrima, lo cual puede ser generado por cambios en el

microambiente de cada etapa de llenado, que conllevarían a favorecer el crecimiento de

un tipo en particular de levadura. De forma similar, los datos generados en este estudio

permiten suponer que se presenta una asociación entre el género de abeja nativa y las

especies de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen a pan de

abejas. Estos hallazgos deben ser corroborados y tenidos en cuenta, para imitar el

proceso de elaboración de pan de abejas con fines industriales.

4.6 Discusión En el caso de Apis mellifera para la colección de aislamientos generada, se observó una

mayor recuperación de levaduras altamente relacionadas con la especie Candida apicola, especialmente en la tercera etapa de llenado alveolar. Dicha levadura fue aislada

inicialmente en tractos digestivos de la mencionada especie de insecto (Hajsig, 1958;

citado por Vega y Blackwell, 2005) y se ha aislado también en el intestino de abejas del

género Melipona (Rosa et al., 2003). C. apícola es una levadura osmotolerante

reconocida como productora de ácidos grasos y enzimas de interés biotecnológico como

reductasas y proteasas (Vega-Alvarado et al., 2015).

La especie Kodamaea ohmeri se presentó como la segunda levadura con mayor

frecuencia de recuperación. K. ohmeri se aisló de intestinos de abejas de la especie

Melipona cuadrifasciata (Daniel et al., 2013; Rosa et al., 2003), Bombus impatiens y Bombus pensylvanicus (Graham et al., 2011). Esta levadura se ha reportado como un

patógeno emergente en humanos inmunocomprometidos, y sus hábitats o muestras

desde donde se ha aislado son muy variados: sedimentos marinos, chiles, pepinos en

conserva, escarabajos, entre otros, y de hecho, su presencia en miel o en derivados de

abejas se asocia con afectaciones por invasión de escarabajos predadores de abejas y

sus productos (Torto et al., 2007).

En los estadios de llenado alveolar del uno al tres se detectó la presencia de la levadura,

Zygosaccharomyces siamensis, la cual fue reportada en mieles procedentes de Tailandia

(Saksinchai et al., 2012), aislamientos del género Zygosaccharomyces se ha asociado a

la miel y el polen corbicular de abejas Apis mellifera (Carvalho et al., 2014) y de intestinos


de abejas de la especie T.angustula; igualmente levaduras del género

Zygosaccharomyces se asocian con procesos de producción vinagres tradicionales de

Italia (Solieri et al., 2013).

La levadura Metschnikowia pulcherrima fue aislada exclusivamente en los segmentos de

llenado alveolar tres y cuatro, en los cuales el pan de abejas presentaba mayor grado de

maduración. La levadura se ha reportado en muestras de polen corbicular de Apis mellifera (Guillian, 1979) y en tractos digestivos de los abejorros de origen europeo

Bombus terrestris y Bombus pascuorum (Brysch-Herzberg, 2004). M. pulcherrima corresponde a una especie con alta capacidad de colonización, lo que ha generado su

utilización como biocontrolador de hongos entomopatógenos (David et al., 2002),

adicionalmente se ha comprobado que esta forma levadural presenta actividad

antagonista frente a una diversidad de levaduras, entre estas Brettanomyces,

Hanseniaspora y del género Pichia, sin embargo no muestra ningún efecto sobre

aislamientos del género Saccharomyces. Debido a este comportamiento la levadura es

utilizada en los primeros estadios de los procesos de fermentación de mostos, como un

organismo co-fermentador (Oro & Comitini, 2014). Para el caso del pan de abejas,

posiblemente la M. pulcherrima desempeña un papel similar, facilitando el crecimiento de

un grupo específico de levaduras.

También se encontraron de manera específica aislamientos exclusivos de pan de abejas

en pote de la tribu Meliponini, como es el caso del aislado N24 obtenido de Plebeia spp.,

altamente relacionado con una cepa de referencia de Yarrowia lipolytica, especie

importante en procesos de fermentación de productos lácteos; La muestra N15 obtenida

exclusivamente de abejas T. Angustula, se encuentra altamente relacionada con cepa

tipo de Candida versatilis un arquetipo de levadura resistente a condiciones halófilas e

importante por esa característica en procesos de fermentación y curado (Hou et al.,

2014), con importancia industrial por su capacidad de degradar compuestos hidrofóbicos.

Dicha levadura, no presenta reportes que la asocien con aislamientos desde abejas o

derivados, como en este caso.

Los aislamientos N26 y N27 de pan de pote de Plebeia spp., así como el aislado N21 de

T. angustula, se asociaron con el clúster de Candida ortho-, meta- y parapsilosis, que se


81

relacionan con procesos infecciosos con diferentes grados de virulencia (Vega &

Blackwell, 2005), pero que también se han encontrado en suelos y asociadas a insectos,

e incluso se plantea su uso como biocontroladores. Si bien hay otros casos de tipos de

cepas exclusivas de pan de abejas nativas, como N25 y N28, obtenidos de colonias de

Plebeia spp., con ITS altamente relacionados con C. stigmatis y C. atakaporum; o N14,

asociado con ITS reportados para cepas de M. pulcherrima, hay casos de alta repetición

y mayor abundancia, notablemente las cepas que presentan ITS idénticos en la

secuencia comparada (10 aislamientos de levaduras de abejas nativas), que pueden ser

clasificados como de la especie Starmerella meliponinorum (Teixeira et al., 2003), dado

que no presentan diferencias con el ITS reportado para las cepas de referencia. Esta

levadura fue inicialmente aislada y fue la primera especie reportada a partir de cepas

aisladas de material proveniente de abejas sin aguijón, tanto de material fecal, como de

polen y miel. Asimismo, para el caso de cepas relacionadas con C. apícola, aunque se

presenta una microheterogeneidad del ITS, se observa una clara afiliación de un número

alto de levaduras provenientes de polen de pan de abejas tanto de Apis mellifera como

de nativas; sin embargo, se ven que son poblaciones altamente relacionadas pero con

una separación intraespecie que diferencia aquellas que provienen de Apis mellifera de

aquellas que provienen de las abejas nativas. La diferencia en ITS sugiere que no son

exactamente el mismo tipo de C. apícola, por lo cual es posible que existan diferencias

funcionales y de adaptación a cada tipo de abeja o a la asociación con el polen de

preferencia, situaciones que no son evidenciables por los métodos genéticos.

4.7 Conclusiones y recomendaciones Como se puede observar en estas clasificaciones, los resultados de afiliación son

análogos a los que se pueden concluir a partir de los resultados del árbol de

distancias, esto es, similitud entre secuencias obtenidas de ITS vs. secuencias

reportadas para las cepas de referencia. Esto da soporte a las observaciones que

sugieren: 1. Presencia de tipos específicos de mayor abundancia de las levaduras

aisladas a partir de cada tipo de pan de abeja, ya sea originario de Apis o de

nativas. 2. Grupos de levaduras que son compartidos en los procesos de

fermentación y maduración que ocurren en el pan de abejas. 3. Posible evidencia de

levaduras introducidas por predadores escarabajos en el caso de apicultura con

Apis mellifera, que adicional al efecto sobre la producción de miel, son reportados


como patógenos oportunistas de humanos. 4. La presencia de levaduras que de

acuerdo con la evidencia de variabilidad de ITS con respecto a las cepas de

referencia, pueden representar nuevas especies o incluso géneros no reportados. 5.

La posibilidad de contar con una colección caracterizada de cultivos de levaduras

con identidad genética conocida, lo cual permite diseñar modelos mixtos de

inoculación que podrían iniciar el desarrollo de fermentaciones aceleradas de polen

con cepas seguras y en condiciones controladas. 6. La presencia generalizada de

C. apícola con cepas que presentan un patrón de selección intraespecie según el

tipo de abeja, nativa o Apis, de la que provenga el material del pan de abeja.

La utilidad de la colección de cepas caracterizadas puede ser evaluada con la

experimentación de material polínico de composición constante y de fácil

recolección, que permita evaluar fermentaciones controladas para obtener

sucesiones de poblaciones de levaduras que logren las propiedades del pan de

abejas de una manera estandarizada. El conocimiento de las nuevas variedades de

cepas que posiblemente representan nuevos géneros o especies puede ser

profundizado para llegar a esa descripción completa. La util idad del uso de

clasificación por secuencias que sirven de barcoding molecular en la colección de

las cepas permite tener una mayor discriminación y precisión en la agrupación de

los fenotipos observados en la colección de levaduras. Este camino puede ser

extendido a más microorganismos de aislamientos nuevos. Asimismo, esta

información permitirá tener una línea base desde la cultivabilidad de levaduras en

estudios posteriores que se realicen por métodos independientes de cultivo

evaluando las poblaciones eucariotas totales en los productos y subproductos de

abejas. Adicionalmente, dadas las características, usos y bioactividades de los

productos derivados de la apicultura, y la influencia en su generación por parte de

los microorganismos asociados con la abeja y el polen, esta colección cuenta como

un insumo inicial para propuestas que busquen bioprospecciones específicas a

partir de este recurso de diversidad, de una manera sistemática y

compartimentalizada, iniciando por organismos aislados a partir de dichas

relaciones.


83

4.8 Referencias Asama, T., Arima, T. H., Gomi, T., Keishi, T., Tani, H., Kimura, Y., ... & Hashimoto, K.

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5. Discusión

Al analizar los resultados obtenidos por los dos sistemas de identificación de levaduras

empleados en el estudio se observan coincidencias en algunos aspectos generales, por

ejemplo en los dos métodos se identificaron especies de levaduras exclusivas de las

abejas nativas y de Apis mellifara lo que soporta la hipótesis de que se presentan

asociaciones específicas entre levaduras y géneros o especies de abejas. Para el caso

de las abejas Apis mellifera, los dos métodos de identificación empleados, coinciden en

detectar especies de levaduras que aparecen solo en etápas específicas del llenado

alveolar. Igualmente los dos sistemas de identificación coinciden en presentar a las

levaduras del género Candida como el aislado más frecuente.

La identificación de las especies de las levaduras cultivables presentes en los procesos

de conversión del polen floral, en el alimento finalmente consumido por las abejas, no

resultó ser idéntica por los dos métodos empleados en el estudio.

En la caracterización de los aislamientos por métodos bioquímicos mediante el uso del

Sistema automatizado Vitek2 ®, se reportó la presencia de tres especies de candidas, C. pulcherrima, C. parasilopsis y C. famata, así como también de Rhodotorula glutinis y Kodamaea ohmeri; de estas levaduras, se confirmaron por métodos moleculares, la

presencia de C. pulcherrima, C.parasilopsis y K.ohmeri. Para los aislamintos identificados

inicialmente por el Vitek2 ® como C. famata y R. glutinis el análisis molecular presentó

diferencias, al ser identificadas como Candida apicola. El 45% de las levaduras aisladas

en el pan de abejas de Apis mellifera no fueron clasificadas por el sistema Vitek2 ®, entre

las cuales el método molecular detectó la presencia de Candida apicola, y Zygosacharomyces siamensis.

Para las muestras de pan de abejas de meliponinos, el Vitek2 ® detectó la presencia de

las levaduras Candida pulcherrima, Candida Parapsislosis y Kodamaea ohmeri que

fueron confirmadas por el método molecular utilizado en el estudio. Adicionalmente el


sistema detecto la presencia de aislamientos de Candida famata, que posteriormente se

identificaron por el método molecular como Candida apícola, Starmerella meliponinorum y Starmerella bombicola, igualmente se presentaron aislamientos no identificados por el

sistema Vitek2 ® , los cuales fueron detectados por el método molecular como Candida apícola, Candida pulcherrima, Starmerella meliponinorum, Zigosaccharomyces mellis,

Zigosaccharomyces siamensis y Yarrowia lipolytica.

Las diferencias en la identificación de las levaduras por los dos métodos utilizados,

evidencian que, si bien el sistema Vitek2®, es un método de gran valor, para la

detección de levaduras de interes en salud humana, presenta limitantes para el

desarrollo de estudios efectuados en otro tipo de muestras como el pan de abejas, dado

que en la base de datos de éste sistema de identificación solo se encuentran alojados

patrones para la detección de 51 levaduras de origen clínico. Al comparar la base de

datos de todas las levaduras identificadas por técnicas moleculares en el estudio, contra

la base de datos del Sistema Viek2®, se evidencia en el pan de abejas, la presencia de

los géneros Starmerella, Zigosaccharomyces y Yarrowia, los cuales no se encuentran en

la base de datos del sistema bioquímico, asimismo al efectuar la misma comparación a

nivel de especies se observa que solo el 27% de las levaduras detectadas por métodos

moleculares se encuentran en el sistema Vitek2®.

Los resultados obtenidos bajo los dos métodos de identificación utilizados en el estudio,

muestran claramente las ventajas del uso de técnicas moleculares, sobre los métodos

bioquímicas en cuanto a la capacidad de identificación de los aislamientos procedentes

de pan de abejas, dado que dicha técnica permitió reconocer la totalidad de las levaduras

obtenidas en el estudio, así mismo, se presenta coherencia entre la identificación

molecular y las características morfológicas de las colonias, lo que no ocurrió en todos

los casos con la identificación efectuada por el sistema Vitek2®.

Para la levadura C. apícola el análisis molecular identificó un alto número de

aislamientos, sin embargo existen diferencia que sugieren que no son exactamente el

mismo tipo, por lo cual es posible que existan adaptaciones funcionales a cada tipo de

abeja o a la asociación con el polen de preferencia, situaciones que no son evidenciables

por los métodos moleculares, pero que indican que aún con la misma especie del

hospedero hay variedad específica seleccionada intraespecie de levadura, en

consecuencia se hace relevante el análisis bioquímico efectuado por el sistema Vitek2 ®,

Discusión 89

dado que dichos resultados permiten inferir diferencias en la fisiología de los

microorganismos independientemente del nivel de certeza en la identificación, lo que

genera aportes importantes para el entendimiento del proceso de transformación del

polen corbicular a pan de abejas.

A pesar de las ventajas descritas para los métodos moleculares en cuanto a

identificación de los aislamientos, estos ofrecen poca información sobre el

entendiemiento del metabolismo de las levaduras asociadas al proceso de maduración

del polen, lo cual correspondió a un hallazgo relevante detectado en el presente estudio,

al encontrarse por el sistema Vitek2 , sustratos que eran asimilados por levaduras

obtenidas solo en etapas específicas del llenado o sustratos asimilados por levaduras de

una especie de abeja en particular, en consecuencia se puede inferir que para el

entendimiento del proceso de transformación del polen corbicular al pan de abejas, se

requiere del uso conjunto de técnicas macroscópicas, microscópicas, moleculares y de

actividad metabólica en un sustrato de prueba, que permitan identificar los aislamientos,

también es deseable incluir estudios de metagenómica y metabolómica que permitan

comprender que microorganismos participan en el proceso, incluidos los no cultivables y

cómo ocurre el proceso fermentativo al interior de las colmenas en las diferentes

especies de abejas.

Le metodología empleada para valorar las levaduras presentes en la transformación de

polen a pan de abejas en Apis mellifera, mediante la separación de las muestras en

diferentes etapas de llenado del alveolo, aporta información anteriormente no descrita

para el proceso de maduración del polen, y por lo tanto puede ser utilizada como

metodología para entender los cambios en la microflora durante el mencionado proceso,

dado que existen estudios previos efectuados incluso por técnicas de metagenómica, que

reportan una variedad de microflora asociada al pan de abejas, pero se desconoce si los

microorganismos aperecen o desaparecen en una etapa específica del proceso de

maduración.

Los resultados obtenidos en el presente estudio confirman la presencia de las levaduras

en los procesos de transformación del polen a pan de abejas, tanto en la especie Apis mellifera como en abejas de la tribu Meliponini. Sin embargo, se desconoce cuál es la

actividad particular que ejerce cada especie de levadura dentro del polen; el


entendimiento de su metabolismo sobre este sustrato vegetal puede posibilitar el uso de

estos microorganismos para la elaboración de pan de abejas industrial, y la

transformación de materiales vegetales que se destinen a consumo animal e incluso

otros usos industriales, dado que entre las levaduras obtenidas del pan de abejas,

diversas especies reportan actividades de interés en procesos aplicados a la industria,

principalmente en fermentación.

6. Conclusiones y Recomendaciones

6.1 Conclusiones La metodología de muestreo utilizando cuatro niveles de llenado de los alveolos en el

proceso de conversión del polen a pan de abejas de Apis mellifera, permitió diferenciar

los microorganismos durante los 15 días que se realiza el proceso de fermentación de

forma natural.

Se identificó la presencia de levaduras asociadas a etapas específicas de llenado del

alveolo en pan de abejas de Apis mellifera, como Z. siamensi, que se detectó en los

tres primeros estadios de llenado, y Metschnikowia pulcherrima, que fue aislada

exclusivamente en los dos estadios finales de llenado.

La presencia de diversos tipos de levadura en las etapas de llenado del polen alveolar

probablemente indican variadas funciones de las mismas en el proceso de conversión

del polen corbicular al pan de abejas.

La identifiacación mediante el sistema automatizado Vitek2®, no permitio la

caracterización de todos los aislamientos obtenido a partir del pan de abejas de Apis mellifera y el polen de pote de abejas de la tribu Meliponini., debido a que este

sistema solo cuenta hasta el momento con una base de datos de 51 especies de

levaduras principalmente de interés clínico.

Los resultados obtenidos a partir de los análisis bioquímicos efectuados por el sistema

Vitek2® aportaron información importante para entender la cinética del proceso de

maduración del polen corbicular a pan de abejas.


Para Apis mellifera se aisló mayor diversidad de levaduras en los estadios de mayor

maduración del polen apícola.

Se presentaron aislamientos frecuentes de la especie Candida apícola en pan de

abejas de Apis mellifera y pan de abejas en pote de la tribu Meliponini, lo que sugiere

que es de gran importancia para el proceso de maduración del polen.

La especie de levadura Starmerella meliponinorun se identificó en el polen de pote de

abejas de las especies T.angustula, Paratrigona sp., y Plebeia sp; la especie de

levadura Yarrowia lipolytica se encontró de forma exclusiva en el polen de potes de

abejas de la especie Plebeia sp., mediante la identificación molecular.

Las levaduras Candida versatilis y Starmelera bombicola fueron identificadas de forma

exclusiva en el polen de pote de abejas de la especie Tetragonisca angustula. Para el

caso de C. versatilis, este reporte corresponde al primero conocido que asocia dicha

levadura con los productos de las abejas, por lo cual se sugiere realizar estudios

evaluando otro métodos fenotípicos y moleculares.

Las levaduras Candida metasilosis, Candida orthopsilosis y Candida Parasilopsis se

encuentran asociadas con el pan de abejas en pote de la tribu Meliponini T.angustula

y Plebeia sp.

La existencia de levaduras exclusivas del polen de pote en abejas de la tribu

Meliponini indican que se presentan procesos fermentativos diferentes entre estas

abejas y las Apis mellifera.

6.2 Recomendaciones A partir de los hallazgos del presente estudio se recomienda ampliar la investigación en

los siguientes aspectos.

Evaluar otros metodos de identificación fenotipos y genotípicos de levaduras

obtenidas a partir de pan de abejas de Apis mellifera y polen de pote de abejas de la

tribu Meliponini, así como en las diferentes etapas de llenado durante el proceso de

Conclusiones y Recomendaciones 93

transformación natural de polen a pan de abejas para garantizar la identificación

completa de los aislamientos, en consideración al posible potencial de uso de estos

microorganismos en la transformación de polen a pan de abejas de forma industrial.

Caracterizar la función de las levaduras reportadas, para conocer el rol que estas

desempeñan en las las diferentes etapas de la fermentación natural del polen, con el

objeto de poder generar estudios encainados al aislamiento de procesos industriales

para la elaboración del pan de abejas, utilizando las levaduras que se encuentran

presenten naturalmente en el proceso.

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Identificación de levaduras presentes en el proceso de … · 2016-06-10 · 2016. Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan