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Identificación de los Espectros de antocianinas del Fruto del Cerezo Dulce (Prunus Avium) variedad sweetheart, en diferentes condiciones de extracción.

Cedillo-López, Daniel Coatzin, Cruz-Salgado María de la Paz, Beltrán-Orozco María del Carmen. Departamento de Graduados e Investigación en Alimentos, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. Prolongación de Carpio esquina Plan de Ayala Col. Sto. Tomás. 11340, México D. F.

Resumen

Se comparo la extracción con dos disolventes (metanol al 0.01% HCl y mezcla

cloroformo-acetona) en la determinación de los espectros de absorción mediante el

método del pH-diferencial en las antocianinas extraídas del fruto del cerezo dulce (Prunus

Avium) encontrándose que no hay alguna diferencia significativa en la determinación del

pigmento monomérico de la antocianina calculada como cianidina-3-glucósido en el fruoto

completo, la piel y pulpa, así también se midió en el extracto del fruto completo el

porcentaje del color polimérico como índice de degradación y formación del complejo

antocianina-tanino en presentes en el fruto.

Abstract

It compares the extractions with two solvents (methanol acidified with 0.01% HCl and a

mixture of chloroform-acetone) in the determination of absorption spectra in the total

monomeric anthocyanin by the pH-differential method in the anthocyanin extracted from

the fruit of the sweet cherry (Prunus Avium). It founds some significant difference in the

determination of the monomeric anthocyanin pigment calculated as cyanidin- 3- glucoside

in the whole fruit, the skin and the flesh, in the other hand it was measured in the extract

of the fruit the percentage of polymeric color as index of degradation and the formation of

complex anthocyanidin-tannin present in the whole fruit.

Introducción La Familia el Rosaceae es extensa, abarca 2000 pertenecientes del especies un

aproximadamente 100 Géneros. La Familia incluye muchas cultivadas, plantas

productoras de frutas que son importantes como comestibles, a saber: manzanas, peras

ciruelas, chabacano durazno, frambuesa, mora, y fresa. También incluyen, pero quizás

en menor importancia, la zarzamora, la endrina y el membrillo (Timberlake y Bridle

1982). Las antocianinas son comúnmente encontradas en la capas epidermales de un

gran numero de frutas, como las manzanas (Malus pumila), ciruelas (Prunus domestica) y

peras (Pyrus communis), las antocianinas también han sido encontradas en la pulpa. Por

ejemplo si en las cerezas dulces (P. avium), la epidermis contiene cantidades

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significativas de antocianinas, la pulpa podría tener algunas pequeñas concentraciones

del mismo compuesto, pero con las cerezas ácidas (P. cerasus) hay algunas variedades,

como la Montmorency, con antocianinas solo en la piel (Van Buren, 1970).

La cianidina es la más omnipresente antocianidina en la Familia, pelargonidina es rara,

mientras que la delfinidina esta completamente ausente. La sustitución glicosidica es

relativamente simple, con la excepción de ciertas especies de Rubus y Prunus; no hay

evidencia certera de la acilación de frutas comestibles de la Rosaceae. Las azúcares

encontradas son glucosa, galactosa, xilosa, rutinosa, y soforosa. Los triglicósidos

glucosilrutinosa y xilosilrutinosa previamente encontradas en especies de Ribes están

presentes en la frambuesa y bayas (Timberlake y Bridle, 1982).

Las bayas tienen una distribución más uniforme de antocianinas que las demás frutas.

En contraste a las flavonas, la concentración de las antocianinas se incrementa

rápidamente en frutas a medida que van madurando (Van Buren, 1970).

Kuhnau (1976, citado por Prior y Cao, 2000) estima que la ingesta promedio diaria de

todos los flavonoides combinados es de ≈ 1 g•d-1. Estos resultados han sido

cuestionados, estudios recientes (Hertog et.al, 1993 citado por Prior y Cao, 2000)

sugieren que esos valores podrían ser ≈ 5 g•d-1 o más altos. En los últimos años, se ha

dado una gran atención a la posible protección ejercida por antioxidantes naturales

presentes en las plantas comestibles, particularmente los flavonoides y polifenoles, y la

reducción del riesgo de enfermedades coronarias, esta asociación ha sido parcialmente

explicada basada en el hecho que los polifenoles interrumpen la peroxidación lipídica

inducida por las ROS (Virgli, et. al, 2001). Las antocianinas están incluidas en la lista de

compuestos naturales conocidos por su mecanismo de poderosos antioxidantes. La

cianidina y sus glucósidos representan uno de los mayores grupos de antocianinas

naturalmente existentes que por sus propiedades biológicas y antioxidantes han sido

profundamente investigados y recientes hallazgos, indican la posibilidad que las

antocianinas son absorbidas como glucósidos, por lo que se tiene un renovado interés en

los estudios de su biodisponibilidad, incluyendo su absorción, destino metabólico y

excreción (Galvano, 2004).

Materiales y Métodos

Preparación de la muestra. Se obtuvo la cereza de la Central de Abastos de la Ciudad

de México, aproximadamente una caja con 5 Kg, de la variedad sweetheart, importada de

Chile, en el Mes de Febrero del 2005, se realizo una selección separando la fruta dañada

físicamente y con ataque de microorganismos, la fruta seleccionada se lavó con una

solución desinfectante a base de plata coloidal en proporción 10 mL en cada litro de

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agua, se sumergieron durante 10 minutos y posteriormente se elimino el agua secandose

el exceso de agua en papel. Se almacenó hasta su uso en congelación a 0º C.

Obtención de extracto. Se utilizo el método descrito por Wrolstad (2001), en el cual se

realizo la extracción mediante mortero y pistilo en baño de hielo, empleando alrededor de

50g de muestra fresca; se realizaron extracciones empleando la técnica descrita y una

variación de la extracción con metanol al 0.01% HCl, seguido de ambas extracciones se

filtro con Papel No. 1 (Whatman) al vacío (0.66 – 0.79 atm) 3 veces, posteriormente se el

filtrado se concentro en un Rotavapor (Yamato, Modelo ME-200) entre 10 y 15 minutos a

40ºC, en completa oscuridad, el concentrado se resuspendió en agua acidificada con

0.01% de HCl y se almaceno a 4ºC para su uso en los siguientes 2 días. Las muestras

que se extrajeron fueron: cereza completa con extracción con acetona-cloroformo (CCA),

piel de la cereza extraída con la mezcla acetona-cloroformo (PCA), piel de la cereza

extraída con metanol al 0.01% HCl (PCM), pulpa de la cereza extraída con la mezcla

acetona-cloroformo (PuCA), pulpa de la cereza extraída con metanol al 0.01% HCl

(PuCM).

Se realizó el espectro de absorción en un Espectrofotómetro UV/VIS/NIR (Perkin Elmer

Modelo Lambda 19), para obtener el índice de la degradación del pigmento, índice del

color del polímero (Wrolstad, 1993).

Resultados y Discusión

Se obtuvieron los espectros de absorción, obteniéndose los valores de acuerdo al Cuadro

1, en donde se calculo el pigmento de antocianina monomérica (mg/L) donde se calculo

A, de acuerdo a la fórmula A= (A � vis-max – A 700)pH 1.0 - (A � vis-max – A 700)pH 4.5, y

sustituyendo el valor de A en la ecuación se obtiene el pigmento de antocianina

monomérica (mg/L) = (A x PM x FD x 1000) / (� x1) , donde el PM, es el peso molecular,

que se tomo el de la cianidina – 3 - glucósido que es de 449.2; FD el factor de dilución

para cada muestra y el � es la absortividad molar que para la cianidina – 3 – glucósido es

de 26, 900, en las Figuras de la 1 a la 8, se observan estos espectros.

Cuadro 1. Valores para la determinación de pigmento de antocianina monomérica a diferentes tratamientos.

pH 1.0 pH 4.5 Muestra � vis-max A �vis-max A 700 � vis-max A �vis-max A 700

A Pigmento de antocianina monomerica (mg/L)

CCA 511 1.6968 0.0555 479 0.6366 0.0452 1.0499 4.38 PCA 508 0.0821 0.0032 493 0.1430 0.0205 0.0436 0.12 PCM 519 0.1607 0.0503 540 0.2707 0.1959 0.0356 0.11 PuCA 511 0.2090 0.0041 515 0.0897 0.0143 0.1295 0.07 PuCM 517 0.1360 0.0071 529 0.0728 0.0181 0.0742 0.08

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CCA pH

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Longitud de Onda nm

Ab

sorb

anci

a

pH 1.0pH 4.5

CCA

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

Longitud de Onda nm

Abs

orb

anci

a

Para el fruto de la cereza se calculo el índice de degradación del pigmento, índice del

color del polímero de acuerdo a Wrolstad (1993), que se resume en el Cuadro 2.

Cuadro 2. Valores para la determinación del % del color del pigmento. Densidad de Color 0.50 Color del Polímero 0.17

% del color del Polímero 35.09

La comparación del método de extracción en la determinación de las antocianinas, el más

común reportado en la literatura es la extracción con Metanol al 0.01% HCl, por su

facilidad al trabajar, sin embargo la evaporación del metanol al reducir el extracto puede

resultar en una hidrólisis de enlaces acilo débiles, los cuales se agravan en la presencia

de HCl (Wrolstad, 1993) en el fruto completo, para lo cual por facilidad del trabajo se

comparo en la piel y pulpa de la cereza, pues es más difícil trabajar con una serie más de

etapas como la extracción de acetona-cloroformo lo es, además que esta mezcla es

altamente reactiva y peligrosa.

Figura 1. Espectro de Absorción del fruto completo extraído con acetona-

cloroformo (CCA).

Figura 2. Espectro de Absorción del fruto completo extraído con acetona-

cloroformo (CCA) mediante el método de pH-Diferencial (pH 1.0 y pH 4.5).

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PCA pH

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Longitud de Onda nm

Ab

sorb

anci

a

pH 1.0pH 4.5

PCM pH

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Longitud de Onda nm

Ab

sorb

anci

a

pH1.0pH4.5

PIEL CEREZA EXTRACCIONES

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Longitud de Onda nm

Abs

orb

anci

a

PCAPCM

Figura 3. Espectro de Absorción de la piel de la cereza extraída con acetona-

cloroformo (PCA) y extraído con Metanol 0.01% HCl (PCM).

Figura 4. Espectro de Absorción de la piel de la cereza extraída con acetona-

cloroformo (PCA) mediante el método de pH-Diferencial (pH 1.0 y pH 4.5).

Figura 5. Espectro de Absorción de la piel de la cereza extraída con metanol al

0.01% (PCM) mediante el método de pH-Diferencial (pH 1.0 y pH 4.5).

�

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PULPA DE CEREZA EXTRACCIONES

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

Longitud de Onda nm

Ab

sorb

anci

a

PuCAPuCM

PuCA pH

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Longitud de Onda nm

Abs

orba

ncia

pH1.0pH4.5

PuCM pH

0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Longitud de Onda nm

Ab

sorb

anci

a

pH1.0pH4.5

Figura 6. Espectro de Absorción de la pulpa de la cereza extraída con acetona-

cloroformo (PuCA) y extraído con Metanol 0.01% HCl (PuCM).

Figura 7. Espectro de Absorción de la pulpa de la cereza extraída con acetona-

cloroformo (PuCA) mediante el método de pH-Diferencial (pH 1.0 y pH 4.5).

Figura 8. Espectro de Absorción de la pulpa de la cereza extraída con metanol al

0.01% (PCM) mediante el método de pH-Diferencial (pH 1.0 y pH 4.5).

�

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De acuerdo al Cuadro 1, no se observan diferencias significativas en la determinación de

pigmentos de antocianina polimérica entre las extracciones de la pulpa y de la piel, sin

embargo en la Figura 5 el espectro no es tan definido como en la Figura 4, no se

determino en el fruto de la cereza, para este se determino de acuerdo al Cuadro 2 los

índices de degradación de las antocianinas donde los complejos de las antocianinas –

taninos son más resistentes al tratamiento por el bisulfito y la medición de estos (a 420

nm) sirve como un índice de oscurecimiento , así la relación entre el color del polímero y

de la densidad de color nos da como resultado el % de color que contribuye al material

polimerizado en este caso es de alrededor del 35%.

Por lo que se puede concluir que durante la extracción de las antocianinas utilizando

disolventes como el Metanol al 0.01% HCl y de la mezcla de cloroformo-acetona, no

existe alguna diferencia al menos en el extracto de la cereza, por otra parte el método de

pH-diferencial es útil para conocer el pigmento más abundante en el fruto, y los índices

de degradación como lo es el % del color polimérico habla de la cantidad del complejo

antocianina-taninos que puede presentar la muestra.

Bibliografía

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