IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE

ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

ANÁLISIS BIONFORMÁTICO

Mª Luisa Hernáez

ESTRATEGIAS PROTEÓMICAS

Proteómica TradicionalEscuela Europea

en gel

Proteómica ¨Shotgun¨Escuela Americana

En solución

–Separación de Proteínas (1D-2D)

–Digestión de cada proteína

–MS y MS/MS

–Digestión de las proteínas

–Separación cromatográfica de péptidos

–LC-MS/MS

Muestras complejas. Extractos proteicos: proteomas, subproteomas...

Espectrometría de masas

MALDI-TOF

Matrix-assisted laser desortion-ionization (MALDI).

Time of flight (TOF).

Identificación de proteínas mediante

huella peptídica (MS, PMF)

MassAnalysis

peptidesprotein peptides+

+

+

+

++++

IonizationDigestion

m/z

MS

Single Stage Mass Spectrometry

Identificación de proteínas por huellapeptídica

Enzymaticdigestion

In-silicodigestion

Protein Peptides840.6950861676.960631498.82831045.5642171.967066861.107346842.514581456.727405863.268365

Mass spectrumPeaklist

…MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV …

- MAIILAGGHSVR- FGPK- AFAEVNGETFYSR- VITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFK- YPNVVIDDENHNDK…

Sequence database entry

861.107346838.6950861676.960631498.82831045.5642171.967066842.514581457.827405863.268453

Theoretical peaklist

Theoretical proteolytic peptides

MatchResult:

ranked list of protein candidates

699.0 1459.4 2219.8 2980.2 3740.6 4501.0

Mass (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nten

sity

1243.6374

1096.5587

1016.4729

1743.8941

1236.2092

1516.72922877.4563

877.02261264.6347 3072.5583

2200.1761716.38223229.66131079.5393 1843.8121 2520.2926

804.3498 2860.98972134.09591566.7863

Separation of proteins by 2-D gel electrophoresis.Excision of protein spots from 2 -D gel

PROTEIN IDENTIFICATION BY MALDI-TOF MS

In-gel trypsin digestionExtraction of peptides mixture

Peptide mass fingerprint byMALDI-TOF Mass Spectrometry

Database searching

Protein identification:triose phosfate isomerase

?

Tratamiento de las manchas proteícas

Destinción

Reducción y alquilación

Deshidratación

Hidratación con tripsina y digestión

Extracción de los péptidos

¿Concentración y limpieza?

Corte del gel

• Evitar contaminaciones• Digerir la proteína eficientemente• Recuperar la mayor cantidad de péptidos• Minimizar las pérdidas por manipulaciones

?

IODOACETAMIDADTT

37ºC O/N

Espectro de MALDIA

bund

anci

a re

lativ

a

Masa (m/z)

1981.84

1982.84

1983.84

No 13C atoms (all 12C)

One 13C atom

Two 13C atoms

“Masa monoisotópica”

Resolución isotópica: Capacidad para separar dos picos quese diferencian en una unidad de masa.

Tolerancia: es la diferencia entre el valor de la masa medidaexperimentalmente y el valor teórico

absoluta (Da) = [M exp-M teórica]

relativa ( %, ppm) = [M exp-M teórica]/ M teórica

Análisis de péptidos trípticos

TRIPSINA: corte muy específico (lisina y arginina)

K-X, R-X excepto K-P, R-P

En proteínas de mamífero el contenido en Arg es 6% y en Lys es un 5%, (cada 100 aminoácidos hay 11 sitios de corte de tripsina)

Tamaño medio de los péptidos trípticos es de 9 aminoácidos: fácil extracción de péptidos del gel.

En este intervalo de masas (800 Da –2000 Da) la resolución es buena

Más restrictivos en la búsqueda para que aumente la puntuación

No hay éxito en la identificación?????

1. Número de péptidos en la huella peptídica es insuficiente para una coincidencia estadística (digestión, glicosilación)

2. Mezcla de proteínas: supresión iónica, HPLC acoplado a MALDI-TOF

3. No está anotada en la base de datos de proteínas

Necesitamos más información

Tandem Mass Spectrometry

Ionization Isolation Fragmentation MassAnalysis

proteinpeptide

fragments

Digestion

peptides++

+

+

++

++ ++

+++

++

++++ +

m/zm/z

MS MS/MS

m/z

Isolation

MS/MS usa 2 analizadores de masa (combinados en un instrumento) para seleccionar un analito (ion) de una mezcla, entonces genera fragmentos del ion aislado para obtener información estructural.

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0Mass (m/z)

3.9E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity4700 Reflector Spec #1[BP = 1101.6, 38875]

1101

.553

7

987.

5242

849.

3844

2140

.083

0

1973

.013

7

929.

4982

1592

.735

4

1115

.620

0

2509

.260

0

1044

.549

6

832.

3645

970.

4844

1224

.587

611

58.5

745

M,a

lf,p

1764

.900

0

tbp 1429

.712

9

2216

.106

9

1514

.734

1

2096

.083

7

2376

.157

0

p 1826

.840

2

3025

.460

0

tb1656

.809

115

76.2

291

kab

2889

.547

9

2744

.417

0

2566

.279

1

3222

.707

8

2800

.486

6

3077

.677

7

3325

.762

0

69.0 287.8 506.6 725.4 944.2 1163.0Mass (m/z)

2.5E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

4700 MS/MS Precursor 1101.55 Spec #1[BP = 701.4, 24936]

701.39

175.09

473.28159.07

72.05

286.1486.07401.17

1101.54

258.15112.06170.0587.06130.05

303.16

269.11 602.31456.26 816.41272.15 399.22

987.51

Fragmentación del ión precursor:

288.14

H 2 N CH

R1

NH CH C

OCH2CH C

OR2

y3

b3

C NH NH CH COOH

R4 H+

H+

b1b2

y1y2

Los iones se fragmentan frecuentemente por los enlaces peptídicos dando lugar a una “escalera” de iones peptídicos característica de la secuencia del péptido. La diferencia de masa entre iones consecutivos define un residuos aminoacídico.

b1y3

y2

y1

b2 b3

Peptide Identification by MS/MS

340.695086676.96063498.8283545.5641171.967066261.107346342.51458456.727405363.268365

…MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV …

- MAIILAGGHSVR- FGPK- AFAEVNGETFYSR- VITLESTNMFNEIIIK- YPNVVIDDENNDK…

361.107346338.695086676.96063498.82831045.5641171.967066342.51458457.827405263.268453

-MAIILAG-MAIILA-MAIIL-MAII-MAI-M-M-AIILAG

Enzymaticdigestion

In-silicodigestion

Protein(s) Peptides MS/MS spectra of peptides

Ions peaklists

Sequence database entry Theoretical

peaklistTheoretical

proteolytic peptides

Match

Result: ranked list of peptide and

protein candidates

Theoretical fragmented peptides

In-silicofragmentation

MS/MS database matching using fragment ion masses

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS

?

699.0 1459.4 2219.8 2980.2 3740.6 4501.0

Mass (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nten

sity

1243.6374

1096.5587

1016.4729

1743.8941

1236.2092

1516.72922877.4563

877.02261264.6347 3072.5583

2200.1761716.3822 3229.66131079.5393 1843.8121 2520.2926804.3498 2860.98972134.09591566.7863

69.0 287.8 506.6 725.4 944.2 1163.0Mass (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

701.39

175.09

473.28159.07

72.05

286.1486.07401.17

1101.54

258.15112.06170.0587.06130.05

MPGDVEGLR

Separación y excisiónde la proteina

Digestión con tripsina en gel.Extracción de péptidos.

Búsqueda en bases de datos

Búsqueda en bases de datos

Obtención de la huella peptídica por espectrometría de masas MALDI-TOF

Espectrometría de masasen tandem

Fragmentación del ión peptídico precursor

Secuenciación de novo

La información de la secuencia es más discriminatoriaque la masa molecular.

Un único péptido de una determinada longitud es suficiente para identificaruna proteína de un genoma secuenciado.

Secuencia de novo, se pueden identificar proteínas homólogas de otrosorganismos.

Ventajas de espectrometría de masas en tandemrespecto a huella peptídica.