IDENTIFICACIN CUALITATIVA DE FLAVONOIDES

Alfaro Molina Willy Javier1, Choque Alegre Devora Lizeth1, Paredes Aari Melanie Shirley1, Uztegui Ibez Mara del Rosario1.1Programa Profesional: Farmacia y Bioqumica, Facultad de Ciencias Farmacuticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas, Campus U.C.S.M., Arequipa Per.

1. RESUMENEsta prctica se puede observar y consultar algunas propiedades de los flavonoides presente en la rosa, crisantemo asi mismo el inters biolgico asi como su uso. Tambin vimos cmo es la extraccin de flavonoides con el disolvente orgnico adecuado que es el alcohol etlico y cloroformo, el producto obtenido del extracto, un poco se utiliz para la identificacin de flavonoides en la rosa y crisantemo y la otra parte ser utilizada en cromatografa.La identificacin de cumarinas presentes en la muestra extrada a partir de las flores de rosas, crisantemo, quercetina y rutina por medio de cromatografa de capa fina; como fase estacionaria (silicagel) y fase mvil (acetato de etilo, cido actico, cido formico y agua destilada) este proceso sea realiza en la pera de decantacin para poder obtener el extracto con flavonoides para realizar el sembrado y su colocacin en la cmara cromatogrfica ser despus de la saturacin de la fase mvil y el secado del sembrado de la muestra luego utilizamos una lmpara UV a254 nm o 356 nm, observamos las manchas a diferentes grados y marcamos para tener registro de sus Rf y pasamos a su revelacin con vainillina sulfurica o sal de boro para realizar comparacin en la lmpara UV. Palabras clave:identificacin, flavonoides, quercetina, silicagel, crisantemo y cromatografa.

2. ABSTRACT This practice can be seen and see some properties of the flavonoids present in the pink, chrysanthemum the biological interest as well as its use. We also saw such as is the removal of flavonoids with the organic solvent which is appropriate though ethyl alcohol and chloroform, the product obtained from the extract, a little is used for the identification of flavonoids in the pink and chrysanthemum and the other part will be used in chromatography. Key words:Identification, flavonoids, quercetin, silica gel, chrysanthemum and chromatography.

3. INTRODUCCION Los flavonoides, uno de los grupos ms numerosos y ampliamente distribuidos de constituyentes naturales, conocidos algunas veces como antoxinas, aparecen frecuentemente revisados bajo diferentes aspectos. Como caractersticas generalesde estos compuestos debemos sealar su solubilidad en agua y en etanol, su carcter fenlico y su intensa absorcin en la regin ultravioleta y visible del espectro debido a la presencia de sistemas aromticos y conjugados. Una clasificacin preliminar del tipo de flavonoide en un extracto de planta, puede hacerse basada inicialmente en un estudio de sus propiedades de solubilidad y comportamiento ante reacciones de color; esto, seguido por un examen cromatogrfico directamente del extracto y/o del extracto hidrolizado. La separacin puede hacerse por procedimientos cromatogrficos, y la identificacin de los componentes individuales por comparaciones cromatogrficas.Los flavonoides se durante mucho tiempo como colorantes de lana, y actualmente se usan en la conservacin de grasas o jugos de frutas debido a las propiedades antioxidantes de algunas polihidroxiflavonas.En la extraccin y purificacin de flavonoides veremos que los disolventes empleados en la extraccin de estos compuestos son muy variados y pueden ser desde muy polares como agua y etanol para glicsidos o agliconas muy hidroxiladas, hasta menos polares como ter y cloroformo para flavonas altamente metoxiladas. Es recomendable emplear una sucesin de dos o ms solventes, usualmente en el orden de lipoflico a hidroflico;por ejemplo: ter de petrleo, benceno, ter etlico, acetato de etilo, alcoholes y finalmente agua, aunque en este ltimo caso se presenta la desventaja de su alto punto de ebullicin y presin de vapor que dificultan luego el ser removido rpida y completamente del extracto; por otro lado, podran ser extrados otros compuestos de alto peso molecular que usualmente interfieren en las subsiguientes etapas de purificacin del flavonoide.La reaccin ms usual para la detencin de los flavonoides en un extracto de planta es la reaccin de shinoda: al extracto alcohlico incoloro o ligeramente amarillo se le coloca un pequeo trozo de magnesio y unas pocas gotas de HCl concentrado, el desarrollo inmediato de coloracin es indicativo de la presencia de flavonas y flavonoides (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta), flavonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo).Lacromatografaes unmtodo fsico o de separacin para la caracterizacin demezclascomplejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.Las tcnicas cromatogrficas1son muy variadas, pero en todas ellas hay unafase mvilque consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de unafase estacionariaque se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separndose, pasan por undetectorque genera una seal que puede depender de laconcentraciny del tipo decompuesto.Diferencias sutiles en elcoeficiente de particinde los compuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en funcin de lostiempos de retencinde cada componente de la mezcla.La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente: Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis). Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeas.Clasificacin de la cromatografaTiposFasemvilFaseestacionaria

Cromatografa en papelLquidoLquido (molculas de agua contenidas en la celulosa del papel)

Cromatografa en capafinaLquidoSlido

Cromatografa de gasesGasSlido o lquido

Cromatografa lquidaen fase inversaLquido(polar)Slido o lquido(menos polar)

Cromatografa lquidaen fase normalLquido(menos polar)Slido o lquido(polar)

Cromatografa lquidade intercambio inicoLquido (polar)Slido

Cromatografalquidade exclusinLquidoSlido

Cromatografalquidade absorcinLquidoSlido

Cromatografa defluidossupercrticosLquidoSlido

Cromatografa en capa finaLa cromatografa en capa fina (CCF), TLC (Thinlayerchromatography) es unatcnica cromatogrfica. La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte.En cromatografa en capa fina se utiliza una placa cromatogrfica inmersa verticalmente en un eluyente apolar; La placa cromatogrfica consiste en una fase estacionaria polar (comnmente se utiliza slica gel) adherida a una superficie slida con algn agente cementante. El eluyente debe ser un compuesto lquido apolar, generalmente orgnico. Para realizar la CCF, se debe apoyar la placa cromatografica sobre algn recipiente o cmara que contenga la fase lquida a aproximadamente 1 cm (la distancia entre el principio de la placa y la muestra que se desea analizar). la cromatografa en capa fina es la combinacin de todos los colores en un papel.Aplicacin de las muestras Los productos a examinar se disolvern, cuando sea posible, en un disolvente orgnico que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore despus de la aplicacin, lo ms comn es usar acetona. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 l resulta en la carga 20 g de producto slido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 g de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas.Existen una gran variedad de micro pipetas y micro jeringuillas para realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. Tambin pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micro pipeta, etc.) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centmetro aproximadamente. El punto de aplicacin de la muestra se denomina toque.Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedar la muestra a analizar.Desarrollo de la cromatografiaEl desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el mtodo ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la accin de lacapilaridad. La cromatografa se realiza en una cubeta. Para conseguir la mxima saturacin posible de la atmsfera de la cmara, las paredes se impregnan del eluyente.Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografa cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografa preparativa puede llegar a un par de horas.Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece ser la ms conveniente para medir valores de RF. Despus del desarrollo, las placas pueden secarse rpidamente con una corriente de aire caliente.La mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.Localizacin de las sustanciasSi los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:Mtodos qumicos. Mtodos fsicos.Mtodos fsicos.El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.Constantes de Rf y R xLa constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Se define como: RF= Distancia de la muestra desde el origen/Distancia del eluyente desde el origenLa distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El mximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.55 y 0.7.Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo.Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separacin mnima. En este caso no se pueden usar reveladores qumicos, ya que alteraran los compuestos, sino indIcador ultravioleta.Tambin se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X), que tenga una posicin de desarrollo conveniente; todos los dems compuestos sobre la placa se relacionan con ste. De esta manera se tiene el, RX, ya que: Rx= Distancia recorrida por el compuesto de referencia(X)/Distancia recorrida por el eluyente. Rosas:Los rosales son arbustos o trepadoras (a veces colgantes) generalmente espinosos, que alcanzan entre 2 a 5 metros de alto, en ocasiones llegan a los 20 m trepando sobre otras plantas. Tienen tallossemileosos, casi siempre erectos (a veces rastreros), algunos de textura rugosa y escamosa, con notables formaciones epidrmicas de variadas formas, persistentes y bien desarrolladas (aguijones).Las hojas pueden ser perennes o caducas, pecioladas e imparipinnadas con entre 5 a 9 fololos de borde aserrado y estpulas basales. Es frecuente la presencia de glndulas anexas sobre los mrgenes, odorferas o no.Las flores, que surgen en inflorescencias racimosas, formando corimbos, son generalmente aromticas, completas y hermafroditas; regulares, con simetra radial (actinomorfas). El perianto est bien desarrollado. El hipanto o receptculo floral prominente en forma de urna (tlamo cncavo y profundo). El cliz es dialispalo, de 5 piezas de color verde. Los spalos pueden ser simples, o a veces de forma compleja con lobulaciones laterales estilizadas. Corola dialiptala, simtrica, formada de 5 ptalos regulares (o mltiplos de 5), a veces escotados, y de variados colores llamativos, tambin blancos. La corola suele ser "doble" o "plena" por transformacin de los estambres en ptalos, mayormente en los cultivares. El androceo est compuesto por numerosos estambres dispuestos en espiral (varios verticilos), generalmente en nmero mltiplo de los ptalos (5x). El gineceo apocrpico (compuesto por varios pistilos separados). Nectario presente, que atrae insectos para favorecer la polinizacin, predominantemente entomfila. Perigina (ovario medio), numerosos carpelos uniovulados (un primordio seminal por cada carpelo), as cada carpelo produce un aquenio.El fruto de la flor es una infrutescencia conocida como cinorrodn o escaramujo, un "fruto" compuesto por mltiples frutos secos pequeos (poliaquenio) separados y encerrados en un receptculo carnoso (hipantio) y de color vistoso cuando est maduro.FitoqumicaEl aceite esencial de Rosa damascena se compone de terpenos y derivados de cidos grasos, tales como citronelol (30.31%), geraniol (16.96%), alcohol fenetlico (12.60%), nerol (8.46%), hexacosano (3.70%), nonadecano (2.7%), linalol (2.15%), -Ionona (1.00%), eicosano (1.65%), docosano, (1.27%), farnesol (1.36%), acetato de nerilo (1.41%), propionato de citronelilo (1.38%), geranial (1.35%), -pineno (0.60%), mirceno (0.46%), xido cis rosa (0.55%), decanal (0.51%), terpinen-4-ol (0.55%), -cariofileno(0.81%), isoborneol (0.57%), y heptadecano (0.92%)[3]El fruto de la Rosa, el escaramujo, tiene un alto contenido en Vitamina C: entre 1700-2000 mg por cada 100 g de producto seco, lo que lo convierte en una de las fuentes vegetales ms ricas de esta vitamina. Tambin contiene vitaminas A, D y E, y flavonoides antioxidantes. Su alto contenido en taninos hace que causen estreimiento. Crisantemo: Hojas: Pueden ser lobuladas o dentadas, lisas o rugosas y de color variable entre verde claro y oscuro. Estn recubiertas de un polvillo blanco que les dan un tono grisceo. Son aromticas. Flores: Tiene grandes cabezas florales de color blanco o de tonos vivos como amarillo, naranja y rosa. Las hay de dos tipos: femeninas y hermafroditas. Si se les cambia el agua a menudo duran entre dos y tres semanas.Estilo: Se trata de una planta ornamental con flores muy vistosas de la que existen diferentes especies de interior y de exterior. Altura: Est comprendida entre 20 y 150 cm.El uso de los crisantemos como plantas medicinales en China se encuentra ampliamente documentado.La mayora de los crisantemos contienen un glucsido llamado crisanthemina que es capaz de inhibir el crecimiento de bacterias, especialmente estafilococos y estreptococos, por lo que sus preparados la hacen muy til contra el tratamiento de heridas para prevenir posibles infecciones. Adems de este componente los crisantemos contienen muchos otros componentes antibacterianos, como el mirceno, el borneol, el etanol, los cidos urslicos o benzoicos y el betasitosterol.Su riqueza en cineolborneoly timol les otorga propiedades antibronquitica. Poseen mas de 15 componentes con propiedades antiinflamatorias y mas de 10 componentes con propiedades sedantes.Segn la medicina, podemos utilizar las siguientes especies de crisantemos con als siguientes propiedades: El Chrysanthemum X grandiflorum se utiliza para la curacion de heridas, es capaz de rebajar la fiebre y resulta para el tratamiento de la gripe y el refriado. Posee propiedades depurativas de la sangre. Es un buen sedante y carminativo. Parece ser muy eficaz en el tratamiento de las migraas, el vrtigo y los zumbidos en los odos. El Chrysanthemumsegetum posee propiedades similares y se utiliza tambin en la curacin de la gonorrea. El chrysanthemumcoronarium, adems de poder ser utilizado como un buen vulnerario en el tratamiento de heridas, abscesos, furnculos y otras afecciones de la piel, es un buen amargo y estomacal, capaz de despertar el apetito y evitar la indigestin. Posee propiedades expectorantes, tiles para el tratamiento de las enfermedades del pecho, como la bronquitis y purgantes, para tratar el estreimiento. Las propiedades del Chrysanthemumindicum son muy variadas. Por ejemplo: heridas, tumores, furnculos, ojos irritados, inflamaciones, falta de apetito y malas digestiones, paperas, gusanos intestinales o dolor de cabeza.

Quercetina:La quercetina (frmula molecular: C15H10O7) es un flavonol que se encuentra presente en altas concentraciones tanto en frutas como en verduras. Es el flavonoide ms abundante y el ms habitual en la dieta humana, destacando por su elevada actividad antioxidante. A partir de l se obtienen otros flavonoides, como la naringenina o la rutina.Muchas plantas, ya sean consideradas medicinales o no, deben gran parte de sus beneficios a los altos niveles de quercetina que presentan. Por ejemplo, algunas clases de cebolla (como la roja) contienen tanta quercetina que el compuesto representa el 10% de su peso seco, siendo de este hecho de donde derivan sus mltiples propiedades teraputicas. Otros alimentos con niveles elevados de quercetina son las manzanas, las uvas, el brcoli o el t.Sus aplicaciones teraputicas son diversas, siendo especialmente efectivo en el tratamiento y prevencin de las enfermedades cerebrovasculares, la obesidad o el cncer. Debido a su actividad antihistamnica hace que sea til para la prevencin de ataques alrgicos y de asma.Fue descubierta por J. Rigaud en el ao 1854.Un estudio realizado in vitro mostr que la quercetina y el resveratrol combinados inhiben la produccin de clulas adiposas. MetabolismoEn las plantas, la quercetina se encuentra unida a azcares, formando glucsidos hidroflicos muy difciles de absorber. stos ltimos son hidrolizados en el intestino delgado. As, tras la hidrlisis, la quercetina aglicada es absorbida eficientemente.Propiedades de la quercetina: es otro flavonoide muy interesante dado que es de los principios que presentan ms propiedades: analgsicas, antiagregantes, vasodilatadoras, antiartrticas, antibacteriales, antiherpticas, antigripales, antiespasmdicas, antiulcricas, hepatoprotectivas, antidiabticas, antiasmticas, etc. Como buen flavonoide no hemos de olvidar sus valores antioxidantes y anticancerosos especialmente en lo que al desarrollo de tumores cancerosos en el pecho, piel, ovarios, pulmones o vescula.Dnde puede encontrarse? El t verde es una planta que posee cantidades muy grandes de quercetina, pero est superado por la cebolla, de ah que comer cebolla sea una manera muy inteligente de adquirir este componente tan interesante. Podramos considerar la cebolla como una autentica medicina preventiva casera. El aparato circulatorio se beneficia mucho de uso al prevenir enfermedades tan corrientes como arteriosclerosis, colesterol, hipertensin, angina de pecho; ayuda a mejorar las enfermedades asmticas, combate las alergias, la urticaria y disminuye el azcar de la sangre.Otras plantas que contienen en sus frutos mucha quercetina son el manzano, el cerezo o el peral. Tambin se puede encontrar en las espinacas, la aronia, las coles, las coles de Bruselas, la avena, los mangos o los ajos.La quercetina tambin se vende en forma de comprimidos. Muchas veces se aconseja tomarla junto con la hesperidina y rutina porque parece ser que estos tres componentes se complementan. Las dosis diarias suelen establecerse entre los 200 y 1100 mg diarios.Toxicidad: no debera administrarse en mujeres embarazadas o lactantes. Se han descrito casos de reacciones adversas estomacales. Usada intravenosamente puede producir nausea, sudoracin, problemas respiratorios y enrojecimiento. Puede inhibir la absorcin de ciertos antibiticos. Rutina:Propiedades de la rutina: muchas son las propiedades de la rutina. Entra todas cabe mencionar su capacidad para combatir las alergias, las infecciones bacterianas y el herpes. Posee, entre otras, propiedades antiinflamatorias y antiespasmdicas, previene el cncer y protege al hgado, mejora la circulacin por sus propiedades vasodilatadoras, previene la fragilidad capilar, disminuye la hipertensin, incluida la de los ojos o glaucoma, evita el riesgo de derrames cerebrales. Se han realizado estudios que parecen confirmar la accin protectora de la rutina contra la agresin celular que produce el amianto.Parece ser que la rutina ayuda a la absorcin de la vitamina C, impidiendo la oxidacin de la misma.Dnde se puede encontrar la rutina? Podemos encontrar este componente en plantas como las moras, las frambuesas, los albaricoques, el sauco, el t, las espinacas, los berros o el limn.La rutina tambin se vende en comprimidos. Muchas veces se aconseja tomarla junto con la hesperidina y la quercetina, porque parece ser que estos tres componentes se complementan.En forma de suplementos se vende en capsulas, bien sola o con otros flavonoides. Se debe tomar de acuerdo a las condiciones del prospecto, que normalmente se establece en unos 100 o 500 mg al da, con la posibilidad de aumentar la dosis si el especialista lo considere oportuno.Toxicidad de la rutina: no debe administrarse a personas embarazadas o alrgicas a este componente. Se han dado casos en que se han producido dolores de cabeza o temblor de piernas. Parece ser que existe la posibilidad de que este componente pueda potenciar la accin negativa de los nitritos o nitratos que se utilizan en algunos productos envasados, especialmente de naturaleza crnica. No debera tomarse este complemento en caso de sospecha de ingestin de estos productos.La ingestin de este complemento puede neutralizar la accin de ciertos antibiticos. OBJETIVOS: Reconocer los flavonoides en distintas plantas (rosas y crisantemo). Extraccin y purificacin de Flavonoides usando disolventes variados ya sea polares o no polares. Apreciar los resultados de identificacin, extraccin y purificacin de flavonoides. Ampliar nuestros conocimientos sobre la cromatografa en capa fina. Determinar por medio de la cromatografa de capa fina la presencia de flavonoides en nuestras muestras. Determinar el Rf (Ratio of Front) de varias sustancias.

4. MATERIALES Y REACTIVOS

Micropipeta de 10 ml Pipetas volumtricas de 5, 10, 25 ml Vaso beaker 5 gr del material seco y pulverizado (Ptalos de Rosa) ter de petrleo Equipo de soxhlet Etanol Acetato de Etilo Cinta de Magnesio cido Clorhdrico Tricloruro de Aluminio Pera de decantacin Frasco mbar Papel filtro Tubos de ensayo Etanol Agua destilada cido formico Vainillina sulfurica Sal de boro 1% Soportes Balonesvolumtricos Cpsulas de porcelana Campana de desecacin Mortero y piln, Placa de cromatografa Capilares Lmpara UV Muestras de flores de rosas y crisantemo EQUIPOS: Balanza analtica Rotaevaporador Cmara de cromatografa Estufa

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Contamos con 5 gramos del material seco y pulverizado 10 a 20 gramos de material trozado (fresco). Seguidamente se realiz la extraccin con ter de petrleo. Armamos el equipo de Soxhlet (figura N1), el cual extrae grasas, ceras, carotenoides, xantofilas, etc., al que sometemos el material envuelto en papel filtro. Como podemos apreciar en la siguiente figura:

FIGURA N1: equipo de soxhlet

A continuacin la extraccin con etanol, ste disuelve Geninas (flavonoides), hetersidos, etc.

El resultado es sometido al equipo de Rotavapor (figura N2), donde se observa un residuo suspendido con H2O (agua) con 250 mililitros, seguidamente, filtramos, en lo que se observa partculas grandes, colocamos esa suspensin acuosa con Acetato de Etilo por 3 veces de 5 mililitros cada uno, (Geninas). A continuacin se muestra en la siguiente imagen:

FIGURA N2: equipo de rotavapor

Precipitamos con cloroformo (flavonoides); Centrifugamos y se disuelve en Etanol.

Reacciones de Identificacin:

Reaccin de Shinoda:El extracto alcohlico incoloro o ligeramente amarillo se le coloca un pequeo trozo de magnesio y unas pocas gotas de HCl concentrado, el desarrollo inmediato de coloracin es indicativo de la presencia de flavonas y flavonoides (amarillo a rojo); es decir, 1 ml del extracto Etanlica + Trozo de cinta de Magnesio + 0,5 ml de HCL cc (10 gotas).Seguidamente se puede apreciar el cambio de color. Como se muestra en la FIGURA N3:

FIGURA N3: reaccin shinoda

Reaccin con Tricloruro de Aluminio:

En esta prueba los flavonoides reaccionan con el cloruro de aluminio en etanol produciendo un complejo de color amarillo. Como podemos apreciar en la siguiente figura N4:

FIGURA N4: 1 ml del extracto + 0,5 ml de Al Cl3

Primero en una cromatografa de capa fina se procede a cortar la placa de cromatografa, estamos utilizando una placa con base de aluminio as q podremos cortarla y consecutivamente medimos un centmetro desde la base de la placa haciendo una lnea paralela, con cuidado de no desprender la fase estacionaria.

Figura N5: Proceso de cortar placas de cromatografaUna vez hecha las medidas y separados los espacios de las cuatro muestras (primera muestra: extracto de hojas de ruda; segunda muestra: extracto de las flores de ruda.) se procede con el sembrado, cada una de las muestras sern colocada cuidadosamente y en cantidades aproximadamente iguales con ayuda de los capilares.

Figura N6: Sembrado de los extractos de hojas y semillas de la ruda.Se repite el sembrado de las muestras hasta quince veces por cada una de las muestras procurando tener un sembrado homogneo de todas las muestras de la placa de cromatografa, una vez realizado el sembrado se espera unos minutos a que seque, para posteriormente pasar a la cmara de cromatografa.

La cmara de cromatografa contiene en su interior 5 ml. De un eluyente. Solventes no polares y medianamente polares respectivamente. Se coloca en forma vertical inclinada hacia las paredes y con las muestras sumergidas en el solvente.

Figura N7: Separacin de fases y uso de cmara de cromatografaSe retira la placa despus de unos minutos o hasta que se alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen.Terminado esto se procede a la localizacin de las muestras por medio del mtodo fsico. Para ello utilizamos un gabinete de visualizacin de cromatgramas de capa fina. Incluye lmpara UV 254 nm o 365nm.

Figura N8:Presencia de cumarinas en distintos Rf y en distintos nanmetros de la lmpara UV.Se hecha a la placa de cromatografa por medio de un aspersor, hidrxido de potasio y se le lleva de nuevo hacia la lmpara UV 254 nm o 360 nm y el resultado es el que se aprecia en las imgenes. Por ultimo procedemos a marcar las con un lpiz cada una de las manchas que se aprecian en la placa de cromatografa. Pero este no es el nico revelador tambin tenemos la vainillina sulfnica y sal de boro 1%.

Figura N9:El uso de un sellador para intensificar la presencia de flavonoides.

6. RESULTADOS Y DISCUSION

Se identificaron, extrajeron y purificaron los flavonoides de ptalos de Rosa, con el mtodo de extraccin con solventes orgnicos como Etanol, convencionalmente usada en la extraccin de flavonoides. Las reacciones detectadas fue un cambio de color intenso. Se obtuvieron extractos intensos de flavonoides. Se identificaron y cuantificaron los principales flavonoides obtenidos en los extractos. De acuerdo a su estructura y propiedades qumicas los compuestos flavonoides poseen de moderada a alta polaridad. La extraccin result altamente efectiva para la obtencin de flavonoides. Los resultados obtenidos en el trabajo experimental permitieron identificar los principales flavonoides obtenidos con los diferentes mtodos de extraccin. De acuerdo a ellos, con la tcnica de extraccin con solventes Etanol, el cual disuelve geninas, es posible obtener extractos con mayores cantidades de flavonas, en tanto que como en la tcnica de extraccin con ter de Petrleo, el cual extrae grasas, ceras, xantofilas, etc. Se precipit con Cloroformo, el cual es un disolvente empleados en la extraccin de estos compuestos, poco polar, a continuacin se centrifug, y disolvi en Etanol. El extracto de Flavonoides del material usado obtenido con solventes orgnicos, en la experimentacin, present un mayor contenido de estos compuestos, obtenidos con el mismo sistema de solventes. El contenido de flavonoides en frutos o plantas de la misma especie y variedad, puede variar en funcin del origen, y el estado de la planta, entre otros factores. Los ptalos de Rosa usados en el trabajo experimental fue una buena base de geninas.

FIGURA N10: Extraccin de flavonoides en el rosas.

FIGURA N11: Extracto de rosas para su identificacin de flavonoides.

Despus de obtenido el extracto pasamos a su identificacin con diferentes reacciones:

Primero reaccin de shinoda la cual nos da coloraciones caractersticas segn el tipo de ncleo de los flavonoides.

TABLA N1: Coloracin de los flavonoides frente a la reaccin shinoda

TIPO DE FLAVONOIDECOLOR DE REACCION DE SHINODA

ChalconasNo hay coloracin

AuronasNo hay coloracin

IsoflavononasNo hay coloracin

IsoflavonasAmarillo rojizo

FlavononasAzul magenta, violeta, rojo

FlavanonolesRojo a magenta

Flavonas y FlavonolesAmarillo a rojo

Con esta tabla nos podemos dar cuenta que nuestras muestras dan una coloracin amarillo a rojo dando nos a identificar la presencia de flavonas y flavonoles dentro de nuestra muestra de rosa y crisantemo.Como se muestra en la figura N12.

FIGURA N12: Identificacin de flavonoides con reaccin de shinoda

Segunda reaccin con tricloruro de aluminioes una reaccin de identificacin para todo tipo de flavonoides, presentando fluorescencia.Reaccin de color para comprobar la existencia de sustituyentes en orto. Como se muestra en la figura N13.

FIGURA N13: Reaccin de AlCl3, presencia de fluorescencia.

Al finalizar nuestra practica nos hemos dado cuenta de que son abundantes las manchas que se pueden apreciar en nuestra placa de cromatografa despus de que hemos marcado cada una de estas manchas utilizamos la frmula del Rf para la identificacin de cada una de estas manchas y axial poder saber de qu compuesto se trata valindonos de una escala que nos proporcion el doctor encargado de dirigir esta prctica. Tenemos distintas muestras una de hojas de la rosa, hojas de crisantemo, quercetina (flavonoide) y rutina.La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Se define como:

Rf= Distancia de la muestra desde el origen/Distancia del eluyente desde el origen.

Hojas de rosas:

Hojas de crisamento:

Quercetina:

Rutina:

7. CONCLUSIONES

Se reconoci la presencia de flavonoides en la rosa y crisantemo dando nuestras reacciones positivas tanto de shinoda y de AlCl3. Pudimos hacer una comparacin de nuestras muestras (rosa y crisantemo) con flavonoides puros (quercetina y rutina) mediante la comparacin de Rf. Se optimizo nuestro trabajo en cromatografa de capa fina para poder realzar este proceso, desde la preparacin de la fase mvil hasta la identificacin de los flavonoides de las muestras. Pudimos obtener varios Rf tanto de nuestras muestras como de los flavonoides puros.

8. BIBLIOGRAFIA a. http://www.google.com.pe/webhp?hl=es&tab=iib. http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa Pg. 1.c. 1Tcnicas analticas de separacin.Miguel Valcrcel Cases. Editorial Reverte, 1994. ISBN: 8429179844. Cap. 12: Introduccin a la cromatografa. Pg.333d. http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_capa_fina Pg. 2 hasta la Pg. 4.e. http://es.wikipedia.org/wiki/Flavonoide Pg.5, 6.f. http://es.wikipedia.org/wiki/Flavonoideg. http://www.elergonomista.com/fitoterapia/cumarinas.htm