REVISTA (2017) 4–5, 25-28. ISSN 2395-8510

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CONAMTI  2017  Mecatrónica-Energías Renovables-Sistemas Computacionales-Innovación Agrícola

Identificación preliminar de microorganismos endófitos presentes en cladodios de xoconostle (Opuntia joconostle Weber)

Ibañez Vazquez D. A1, Ramírez Sánchez S. E1,*, Guerrero Andrade O2, Olivares Orozco J1

1 Departamento de Producción Agrícola y Animal, Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco. Calzada del Hueso 1100, Colonia. Villa Quietud. Del Coyoacán. Ciudad de México. *correspondencia elyrasjoalney@gmail.com 2División de Ingeniería en Innovación Agrícola Sustentable. Instituto Tecnológico Superior de Huichapan. Conocido s/n El Saucillo, Huichapan, Hgo. C.P, 42411, México.

A R T ÍCULO

Acceptado 30 Octubre 2017

Palabras clave:

Cladodio, Hongos, Levaduras, Microorganismos endófitos, Opuntia joconostle cv. Burro.

RESUMEN El término endófito se utiliza para los microorganismos que habitan entre los tejidos de las plantas, éstos, tienen potencial agronómico como fuente de control biológico y generadores de sustancias bioactivas. Algunos pueden comportarse como patógenos o no, en distintas etapas del ciclo de vida, debido a esto, el objetivo del trabajo es determinar la presencia de endófitos asociados a Opuntia joconostle c.v Burrro, éstos, se aislaron a partir de cladodios sanos estableciendo dos tratamientos de desinfestación, uno somero (testigo) y otro más fuerte. Para el aislamiento de microorganismos se utilizaron tres medios de cultivo, Se encontraron ocho hongos filamentosos endófitos y tres levaduras. En el caso de los hongos, se realizó una caracterización en medio Papa Dextrosa Agar, los hongos con mayor presencia fueron Alternaria sp, Cladosporium sp y Penicilium sp. Aunque son considerados patógenos, en algunos estudios se les atribuyen características antagónicas a enfermedades o resistencia a la sequía.

1.  INTRODUCCIÓN

Dentro de la familia de las cactáceas, las Opuntias son de las plantas más exitosas y ampliamente distribuidas, estas producen frutos dulces (tunas) y/o ácidos (xoconostles), estos últimos son utilizados de la siguiente manera: Los cladodios juveniles del nopal son utilizados como verdura en la alimentación humana y como remedio de muchas afecciones. Las plantas son utilizadas en prácticas agroforestales, asociadas con cultivos de especies agrícolas y/o forrajeras, sin que se tenga registro del número o área en la que son utilizadas, aunado a esto, en Guanajuato se tiene registro del sistema agroforestal llamado “Huamil”, que incluye varias especies de xoconostle [1]. Las flores son utilizadas en guisos especiales, así como sopas aguadas. Los frutos poseen gran valor nutritivo y medicinal superior al de otras frutas en varios de sus componentes [2]. En México, los xoconostles se encuentran distribuidos a lo largo del país, aunque con mayor presencia en las zonas áridas y semiáridas. Se considera que existen hasta dieciocho especies de xoconostles, entre las más comunes se encuentran Opuntia joconostle conocido como cuaresmeño o burro y Opuntia matudae, variedades blanco y rosa. Estos tipos crecen de forma silvestre, aunque ya se cultivan con fines comerciales [3]. Entre los principales estados productores de xoconostle se encuentran San Luis Potosí, Estado de México, Puebla, Querétaro e Hidalgo [4]. De acuerdo con Referencia [3], los Estados de Hidalgo y México sumaron

una superficie cosechada de 1256 hectáreas con una producción de 12 mil 298 toneladas. Históricamente el xoconostle se ha consumido en fresco, sin embargo, día a día se incrementa su industrialización. De acuerdo con Referencia [13], el término endófito se utiliza para referirse a aquellas bacterias y hongos que en un momento particular de su ciclo de vida habitan dentro de los tejidos aparentemente saludables de las plantas hospederas, sin causarles síntomas de enfermedad o algún efecto negativo. Los microorganismos endófitos viven en los espacios inter e intracelulares de las plantas, sin llegar a causar síntomas en las mismas. Algunos endófitos pueden comportarse también como organismos facultativos en una parte de su ciclo de vida [5]. Debido a la importancia que representan los microorganismos endófitos en las plantas, en este trabajo se tuvo como objetivo identificar los microorganismos endófitos presentes en cladodios de Opuntia joconostle cv. Burro.

2.  MATERIALES Y MÉTODOS

“A. Descripción del área de estudio y colecta del material vegetal” El Municipio de Chapantongo se encuentra dentro de los paralelos 20°17’ de latitud norte, 99°24’ longitud oeste, con una altitud de 2120 msnm,

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situado en el Estado de Hidalgo, en la parte central presenta un clima seco a semiseco, en las partes altas de la sierra el clima es templado subhúmedo y en las serranías semifrío húmedo. En el Municipio de Chapantongo se encuentra la Ex Hacienda el Márquez; en donde se realizó la colecta de cladodios de xoconostle de 20 cm de longitud en un cultivo orgánico (O. joconostle cv. Burro), se colectaron siete muestras de cladodio de xoconostle que fueron etiquetadas con lugar, punto de referencia y fecha, las muestras fueron llevadas al laboratorio de Fitopatología de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, en donde éstos, se limpiaron superficialmente retirándole las espinas y gloquidios con pinzas de disección. Posteriormente se realizaron dos tratamientos de desinfestación. “B. Tratamientos de desinfesacion” Las siete muestras colectadas, fueron disectadas por mitad, de forma transversal y se formaron dos grupos, a los que se les aplicaron los siguientes tratamientos: Grupo I o T0 El primero (T0) se llevó a cabo de la siguiente manera, las muestras colectadas se les dio un lavado superficial con una solución jabonosa de detergente comercial durante veinte minutos y se enjuagó con agua corriente durante diez minutos, para ser llevados y procesados en la campana de flujo laminar Grupo II o T1 El segundo (T1), se lavaron las muestras con una solución jabonosa de detergente comercial durante veinte minutos, se enjuagaron con agua corriente durante diez minutos, posteriormente en la campana de flujo laminar se sumergieron en etanol al 70% y se enjuagaron tres veces con agua desionizada estéril (ADE), cada enjuague fue de cinco minutos. Posteriormente, se sumergieron en una solución que contenía hipoclorito de sodio comercial al 3%, Microdín® y Tween 20 al 0.01%, en donde estuvieron en agitación 18 minutos y se enjuagaron tres veces con ADE durante cinco minutos por cada enjuague. Cada una de las partes de cladodios diseccionados, se cortó con bisturí estéril siguiendo la disposición de las areolas, en donde se obtuvieron sub-fragmentos por mitad de cladodio suficientes para establecer 4 repeticiones por tratamiento y tres diferentes medios de cultivo, dando un total de 168 observaciones. Estos, fueron sembrados en Agar Agua (AA), Papa Dextrosa Agar (PDA) y Saboraud-Malta Agar (SMA) y se incubaron durante 21 días a 27°C. El experimento completo, solo se realizó una sola vez. “C. Caracterización morfológica de los aislamientos” La caracterización morfológica de las colonias se realizó teniendo en cuenta los siguientes parámetros: color de anverso, reverso, tinción del medio, superficie de la colonia, forma de la colonia, margen de la colonia, elevación de la colonia, textura de la colonia, disposición del micelio, presencia de anillos (Figura 1), producción de exudados en gotas en la colonia. Estos fueron aislados, para posteriormente, con ayuda de claves taxonómicas [7], se identificaron a nivel de género. Para la descripción de las características macroscópicas de las colonias encontradas, se tomó como referencia las características visuales mostradas en la figura uno, lo cual ayudó a clasificar a las colonias por sus características para facilitar su identificación microscópica.

3.  RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De acuerdo con las muestras sembradas en los diferentes medios de cultivo el T0 fue el que presentó un desarrollo del 90% de microorganismos en las placas, mientras que el T1 mostró una disminución en el crecimiento de estos, dentro de los microorganismos que se observaron fueron hongos y levaduras. En las placas de agar de ambos tratamientos se visualizó un cambio de color, que fue resultado de una oxidación de los explantes (Figura 2).

Figura 2 Oxidación de los medios de cultivo provocado por los

fragmentos de xoconostle.

Tabla 1. Contabilización de microorganismos encontrados en los diferentes medios de cultivo.

Tratamiento T 0 T1 T0 T1 T0 T1

Medio PDA SMA AA

Hongos 20 5 15 3 9 2 Bacterias 0 0 0 0 0 0 Levaduras 5 2 12 4 0 0

En el caso de levaduras mostraron un mejor desarrollo en el medio SMA en ambos tratamientos y se obtuvo una respuesta positiva para T1 ya que disminuye la cantidad de colonias en crecimiento lo que es un indicador de que se estaría tratando con levaduras endófitas en Agar Agua su desarrollo fue nulo, Para el caso de hongos las cajas presentaron mejor desarrollo en PDA y SMA para los dos tratamientos, de la misma manera el crecimiento de estos en T1 fue menor que en T0. Para facilitar la identificación se realizó una selección de las muestras de los hongos. En la que se obtuvieron un total de 45 hongos de los dos tratamientos, algunos se encontraban en un estado vegetativo, por lo que

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se realizó una selección de estos, posteriormente se realizó una selección con base en sus características macro y microscópicas obteniendo un total de 35 hongos diferenciados. Cabe mencionar que durante esta selección los hongos no se encontraban en esporulación. A partir de la primera resiembra, se obtuvieron cultivos monospóricos, esto con la finalidad de poder realizar una identificación taxonómica con mayor precisión. Se obtuvieron un total de 25 aislamientos de los cuales solamente ocho fueron endófitos (Tabla 2). A pesar de que los microorganismos superficiales no eran el objetivo, se logró identificar hongos como Alternaria sp. Y Penicillium sp. Los hongos que produjeron micelio estéril no se caracterizaron o clasificaron, solamente se observó que mientras fueron cultivados tuvieron una coloración blanca con micelio esponjoso filamentoso.

Tabla 2. Géneros de Hongos encontrados y su frecuencia de aparición Taxón Frecuencia Phoma sp 1 Alternaria sp 3 Cladosporium sp 2 Fusarium 1 Rizopus sp 1 Penicilium sp 2 Rizoctonia sp 1 Epicoccum sp 1

Tratamiento uno Los microorganismos de este tratamiento fueron nuestro objetivo, ya que resultaron ser los endófitos, por el tratamiento utilizado; se observó una disminución en cuanto al crecimiento de microorganismos en los diferentes medios de cultivo, dentro de los cuales, los hongos filamentosos fueron los que tuvieron más prevalencia, mientras que el crecimiento de levaduras fue un número reducido de colonias. Con lo que se obtuvo una respuesta positiva al aplicar este método de desinfestación. Dentro de los hongos que se identificaron, el que tuvo mayor presencia fue Alernaria sp, siguiendo Penicilium sp y Cladosporium sp.; algunos de estos hongos están asociados a enfermedades dentro del género de las opuntias; y dentro de los hongos identificados como endófitos fueron Alternaria sp (Figura 4), Seguido de Cladosporium sp, Fusarium sp (Figura 5), Phoma sp.

Figura 4 Alternaría sp 40X

Figura 5 Fusarium sp 40X Para el caso de levaduras, sólo se pudieron diferenciar por sus características macroscópicas como su forma, color y su olor. Para la clasificación de estas, se realizó con base en su color, obteniendo tres grupos: rosa, transparente y amarilla. En las levaduras rosas (figura 6) se observaron formas arriñonadas con un color inicial blanco y conforme pasó el tiempo, se tornaron de color negro.

Figura 6 Levadura rosada tomada con el estereoscopio.

De acuerdo con estudios realizados en otras especies vegetales, como es la rosa y el cacao para la identificación de microorganismos endófitos, no son considerados como organismo patógenos, Sin embargo, en el caso de cacao [8] se encontraron cepas de Penicillium sp, Cladosporium sp y Fusarium sp.

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Figura 7 Levadura amarilla viscosa

Para el caso del cultivo de rosa [13], se identificaron hongos como Alternaria sp, Cladosporium sp, Phoma sp.; los cuales no fueron considerados patógenos y les atribuyen características antagónicas hacía algunas enfermedades que se presentan en el cultivo, además de que también le confieren resistencia a la sequía. La presente investigación muestra aspectos interesantes ya que algunos hongos, en diferentes géneros vegetales son considerados tanto benéficos, como patógenos. Algunos hongos identificados en este estudio, han sido reportados dentro del género Opuntia como causantes de enfermedades, tales como, la mancha negra o el mal del oro, cuyos agentes causales han sido identificados como Alternaria sp. y Fusarium sp., quienes generan grandes pérdidas económicas [9] en el caso de las Opuntias, el principal afectado es O. ficus-indica comúnmente conocido como Nopal Verdura. Sin embargo, también podrían estar asociadas a conferirles su resistencia a la sequía o su alta adaptabilidad a distintas condiciones ambientales [10] Se ha observado que los hongos endófitos pueden contribuir a la protección de su hospedera contra factores bióticos (patógeno y herbívoros) y abióticos (estrés salino, térmico, presencia de metales , etc.), por medio de tres mecanismos: la generación de enzimas y/o metabolitos con actividad anti-patógeno, producidos por los hongos; Indirectos induciendo la expresión de mecanismos de defensa químicos o fisiológicos intrínsecos a su planta hospedera y ecológicos a través de la ocupación del nicho ecológico hiperparasitismo y predación[14]. Esta última observación puede deberse a la capacidad de algunos endófitos para producir metabolitos secundarios [12], bioactivos [13], lo que plantea la posibilidad de estudiar a algunos de estos hongos y sus metabolitos secundarios aleloquímicos, es decir, influyen sobre el crecimiento y desarrollo de otras especies que crecen a su alrededor. Los hongos endófitos que se lograron identificar se preservaron en glicerina al 10% [12] por lo cual resulta conveniente realizar identificaciones taxonómicas basadas en pruebas moleculares usando secuencias del ADN, tanto en los hongos identificados como en los que presentaron esterilidad.

4. CONCLUSIONES

Los tratamientos de desinfestación probados permitieron diferenciar entre los microorganismos superficiales y los presumiblemente endófitos asociados al cultivo de xoconostle, a que solo se obtuvo el 9 % de similitud de hongos presentes, entre tratamientos.

De acuerdo con los hongos identificados como Alternaria sp, Cladosporium sp y Phoma sp, resulta conveniente hacer un estudio para verificar su comportamiento endófito y la generación de metabobolitos secundarios.

REFERENCES

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