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T ii.
4OMBRE: CÓRDOVA BARRIOS CLAUDIA
MATRICULA: 90338682
TELCFONO: 742-9921
/LICENCIATURA: BlOLOGlA EXPERIMENTAL.
JDIVISIÓN: CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD.
UNIDAD: IZTAPALAPA
TRIMESTRE LECTIVO: 98-0
NOMBRE DEL PROYECTO: ESTUDIOS BACTERIOLOGICOS, EPlDEMlOLOGlCOS Y DE BlOLOGlA MOLECULAR EN Salmonella enteritidis.
/TITULO DEL TRABAJO: UTILIZACIÓN DE PROTEINAS DE Salmonella enteritidis COMO ANTIGENOS EN LA PRUEBA DE WESTERN BLOT o ‘INMUNOTRANSFERENCIA”.
ic LUGAR DE REALIZACIÓN: CENID-MICROBIOLOGIA. INIFAPSAGAR (SECRETARIA DE AGRICULTURA Y GANADERIA RURAL).
FECHA DE INICIO: 29 DE JUNIO DE 1998.
/FECHA DE TERMINACIÓN: 29 DE DICIEMBRE DE 1 9 9
CLAVE DE REGISTRO: BE.015.98 JUNIO 29190
ALUMNA: CLAUDIA CbRDOVA BARRIOS
ic e /ASESOR INTERNO:QBP RAFAELA TAPIA A.
PROFA.ASOCIAD0 D TIEMPO COMPLETO DEPTO. CIENCIAS DE LA SALUD. i.
ASESOR EXTERNO: DR. VICTOR R. TENORIO GUTIERRU.
RESPONSABLE DEL PROYECTO DE ~~ -~
BIOTECNOLOG~A. CENID-MICROBIOLOGIA
2 3:
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r[' L l. UTILIZACIÓN DE PROTEíNAS DE Salmonella
enteritidis COMO ANTIGENOS EN LA e If
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INMUNOTRANSFERENCIA
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7-
JUSTIFICACIÓN Y NATURALEZA DEL PROYECTO.
Se ha incrementado el interés del papel que juegan las
proteínas de la membrana externa (PME) como agentes de
diagnóstico y como antígenos para elaborar vacunas.
Dada la significante incidencia en los países en vías de
desarrollo y el carácter invasivo de Salmonella enteritidis como
agente causal de gastroenteritis, resulta importante desarrollar
técnicas de diagnóstico rápidas y especificas, así como vacunas
contra esta enfermedad. Por tal motivo se ha sugerido que las
proteínas de la membrana externa (PME) de Salmonella enteritidis y
en particular las porinas puedan ser útiles para tales fines.
La industria pecuaria mexicana, se ha incrementado cada dia
mas, sin embargo existen algunos problemas que todavía no se
superan como son; la adquisición de animales mejorados
genéticamente y la compra de vacunas, así como, la falta de control
de algunas enfermedades (Rizo 1988).
El interés por incrementar el consumo de productos pecuarios
nacionales libres de agentes microbianos potencialmente patógenos
para el hombre como es el caso de Salmonella, obliga a la
adquisición de prácticas de producción adecuadas además de
técnicas de diagnóstico y tratamiento que generen productos libres
de Salmonella y así evitar la presencia de portadores.
Las Salmonellas ocasionan grandes pérdidas económicas en la
industria avícola, además de que ciertos serotipos son capaces de
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.a.
producir gastroenteritis en humanos entre otras enfermedades. En la
última década se han encontrado reportes que indican la presencia
de brotes de gastroenteritis en humanos por consumo de productos
pecuarios contaminados con Salmonella, incluso se ha reportado a
los serotipos de Salmonella enteritidis (Se.) como causantes de
gastroenteritis, siendo los productos alimenticios como son la
leche y los productos pecuarios las causas más comunes de
infección.
Las bacterias del género Salmonella son bacilos Gram
negativos relativamente gruesos. Por lo general no son
encapsulados y su envoltura celular esta constituida por una
membrana externa y una interna, entre estas se encuentra una fina
capa de peptidoglicanos.
El hábitat de las Salmonellas es normalmente el tracto intestinal
del hombre y otros animales.
A los microorganismos del género Salmonella comúnmente se
les describe como parásitos intracelulares facultativos, que crecen
primero dentro de los macrófagos que están fijos en el hígado y en el
bazo. Los animales infectados pueden presentar un cuadro agudo,
crónico o pasar inadvertido (portadores), en cualquiera de los casos
la Salmonella es eliminada en la excreta y es una fuente potencial
de contaminación para otros animales.
El género Salmonella está constituido por más de 2,200
serotipos la mayoria corresponde a Salmonella enteritidis,
microorganismo causante de una infección alimenticia que produce
gastroenteritis, los síntomas aparecen entre 6 y 8 horas después de
la ingestión de agua Ó alimentos contaminados y en el transcurso de
una semana son seguidos por dolor abdominal , diarrea y se puede
llegar a tener fiebre. La severidad del dolor y la diarrea varían
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ampliamente de una persona a otra, en unos casos apenas se
detecta diarrea con dolor parecido a la apendicitis que van desde
diarrea leve hasta diarrea con sangre. Si los síntomas persisten, la
infección continua y hay excreción de bacteria por más de 3 meses,
del 1 a 3 % de personas puede continuar excretando bacterias por
más de un año ( esto es, un portador crónico).
Recientemente se ha encontrado que las gallinas pueden
también transmitir Salmonella enteritidis antes y después de la
ovoposición, entonces la idea de que un huevo se encuentre integro,
no implica que no este contaminado. La gastroenteritis también
puede resultar de un inadecuado cocimiento del pollo ylo del huevo.
La mayoría de los casos de gastroenteritis ocurre en niños
menores de 10 años, en donde los síntomas tienden a ser más
severos. La infección puede llegar a ser sistémica en infantes y en
adultos inmunodeprimidos como son pacientes con cáncer y SIDA.
Para el diagnóstico de la salmonelosis aviar se utilizan métodos
comunes como el cultivo el cual toma de 24 a 36 hr, sin embargo por
este método los portadores no son detectados por lo que seria
necesario, encontrar otras técnicas más rápidas y seguras para
detectarlos.
Recientes estudios hechos por Verdugo- Rodríguez et.al, han
reportado que las Proteínas de la Membrana Externa de Salmonella
fyphi están involucrados en la inducción de protección al reto con la
bacteria homóloga, en el modelo murino (12).
*I Parece adecuado el interés que recientemente han adquirido
los antígenos de la membrana externa de las bacterias gram- I
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negativas, para ser empleados como inmunógenos protectores, ya
que por su naturaleza proteica y su localización inducen anticuerpos
de alta afinidad y favorecen la respuesta celular, la cual genera una
inmunidad prolongada, que es crucial en la defensa contra
patógenos intracelulares como Salmonella &phi , por otro lado, estas
pPME pueden ser una herramienta útil para el diagnóstico de
Salmonella enteritidis en aves (Vázquez et. al).
La separación de proteínas se logra mediante electroforésis
en gel de poliacrilarnida (EGPA), en la cual las proteínas se
mueven por acción de una corriente eléctrica aplicada a través de un
gel compuesto de molécula de acrilamida unidas mediante enlaces
transversos para formar una malla molecular. El movimiento relativo
de proteínas a través de un gel de poliacrilamida depende del
tamaño, forma y densidad de carga (carga por unidad de masa) de
las proteínas. Cuando mayor sea la densidad de carga, la proteína
avanza con mayor fuerza a través del gel y por lo tanto su velocidad
de migración es más rápida, mientras más grande sea la proteína se
queda retenida en la parte superior del gel y las de menor tamaño
migraran a la parte inferior del gel.
Una vez separadas las proteínas en el gel las áreas de las
bandas proteicas se pueden seccionar y aislar las proteínas
individualmente, o también presionar el gel contra un trozo de papel
filtro de nitrocelulosa y someter a tratamiento adicional de
electroforésis para desplazar las proteínas fuera del gel y
absorberlas sobre la superficie de la nitrocelulosa. Este último
procedimiento, llamado mancha Western, se puede emplear para
identificar bandas individuales de proteínas por su interacción con
anticuerpos específicos.
OBJETIVO GENERAL:
*[' i I4 1 1
Obtención de las proteínas de membrana externa de los tres
fagotipos de Salmonella enteritidis para utilizarlas como antígeno en
la prueba de Western Blot.
OBJETIVOS PARTICULARES:
I. Preparación de proteinas de Membrana Externa de Salmonella
enteritidis fagotipo 4, fagotipo 8 y fagotipo 13.
2. Análisis de las Proteínas de Membrana Externa (PME) de
Salmonella enteritidis en geles de Poliacrilamida -DSS.
3. Determinar la reactividad de la ,PME con Anticuerpos Específicos
mediante Inmunotransferencia.
MATERIAL:
MATERIAL BIOL~GICO:
CEPAS BACTERIANAS
Cepas de: Salmonella enteritidis fago 4, fago 8 y fago 13.
. ..
\ 111 ...
MEDIOS DE CULTIVOS:
Medios de mantenimiento con glicerol.
Medios de Luria-Bertani.
Medios Agar nutritivo.
Medio de Salmonella -Shigella.
COLORANTES:
-Cristal violeta.
-Safranins al 0.5%
-Azul de Coomasie.
REACTIVOS:
-Tris-OH (hidroximetil amina).
-SDS (dodecil sulfato de sodio).
-Glicerol
,-Pironina
- Alcohol-acetona.
-Acid0 acético.
-Tris (0.025 M)
-Gicina (0.192M)
-Metano1
SOLUCIONES:
-Solución de lugol.
-Amortiguador de Laemmli (buffer de muestra).
-Buffer de Lisis.
-Solución Temed (N,N,N',N'-Tetramethil Ethilenediamine) al 8.4%
-Solución destiñidora.
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-Acrilamida de 30%.
-Bis-acrilamida
-Persulfato de amonio al 12%.
-Stock 8X buffer de transferencia
-Buffer 2X.
INSTRUMENTAL:
-Microscopio
-incubadora
-Cámara electroforética (Mini V-8 Gibco)
-Vortex
-Mechero
-Centrifuga (BECKMAN MODELO J-6B)
-Jeringa de Hamilton.
-Baño maría
CRISTALERIA ESTÉRIL DE USO COMÚN EN
MICROBIOLOGí A:
-Matraz erlenmeyer de 250 ml.
-Cajas de petri
MICELANEOS: -Papel de Nitrocelulosa -Papel Whatman. -Fibras. -Portaobjetos
-cu breobjetos
METODOLOGíA
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Las cepas de S.enteritidis fagotipo 13, fagotipo 8 y
fagotipo 4 se sembraron en matraces erlen-meyer de 250 ml
que contenían 125 ml del medio BHI (caldo nutritivo A) que se
incubó a 37OC por 24 hrs, después del desarrollo de cada una
de las cepas de Salmonella enteritidis se les realizó una prueba
de pureza mediante una tinción de Gram, y además se
realizaron pruebas bioquímicas y serológicas.
Se obtuvieron las proteínas de la membrana externa por el
método de Laemmli (54, la suspención con las Proteínas de la
Membrana Externa se sometió a un corrimiento electroforético
para separar e identificar las proteínas por su peso molecular
se corrieron simultaneamente dos geles de poliacrilamida al
12%, uno se tiño con azul de Coomasie para detectar a las
proteínas (Gel No 1) y con el otro gel (Gel No 2) se realizo
inmunotransferencia para determinar la reactividad de las ,PME
con anticuerpos específicos de azul de Coomasie se procedió
al análisis y detección de ,PME especificas Sa/mone//a
enteritidis, este último gel se revélo con diaminobencidina la
reacción se para con abundante agua destilada fría de tal
forma que aquellas proteínas de membrana externa que
presentan reacción antigeno-anticuerpo se observaron como
bandas obscuras. Finalmente se procede al análisis de
resultados.
ESQUEMA DE TRABAJO S. enteritidis fago I 3 r-i Cepas S. enteritidis fago 8 S. enteritidis fago 4 1 1
Sembrar en 125 mi. de medio Luria Bertani.
Tinción de Gram
1 ml del
cultivo
I Centrifugar 5000 rpmll0
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TÉCNICAS UTILIZADAS:
a) Extracción de Proteínas de la Membrana Externa,
Método de Laemmli.
1.- Sembrar las cepas puras en 70 ml. Del medio BHI incubar a 37
“C por 24 hrs.
2.- AI cultivo de 24 hrs. Se les realiza prueba de pureza por medio de
la tinción de Gram . 3.- Obtener el paquete celular por centrifugación (beckman modelo J-
6B) a 5000 r.p.m. por 20 minutos.
4.- Separar el sobrenadante por decantación del paquete celular.
5.- Tomar 100 microlitros del paquete celular y depositarlos en tubos
eppendorff perfectamente identificados.
6.- Agregar 1 O0 microlitros del amortiguador de Laemmli y se mezcla
en un vortex.
7.- Hervir la mezcla a I OOc a baño maria por 5 minutos.
8.- Centrifugar la mezcla a 10,000 r.p.m. por 5 minutos.
9.- Rescatar el sobrenadante y desechar el paquete celular.
10.- Agregar al sobrenadante 2-p-mercaptoetanol al 10% de volumen
final poner en baño maria por 1 minuto.
11.- Utilizar de inmediato para separar las proteínas por
electroforésis.
b) Corrimiento Electroforético en geles de poliacrilamida
para análisis de Proteínas (EGPA-DSS).
La electroforésis se lleva a cabo por duplicado en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida (PAGE-SDS) de 14 x 10 cms. y
0.75 mm. de grosor en una cámara vertical (slab gel unit se-400). El
gel No. 1 se utiliza para determinar el peso molecular de las P.M.E.
después de teñirlo con azul de Coomasie. El Gel No. 2 se utiliza para
transferir a papel de nitrocelulosa (PNC) y realizar la transferencia.
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-I
El procedimiento es el siguiente:
1 .- Se ensamblan las placas de vidrio.
2- Se prepara el gel separador al 12% como se indica a
continuación: Buffer pH 8.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 mi.
Acrilamida-bisacrilamida al 30% ----------- 4 ml.
Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.75 ml.
Temed al 8.4% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 microlitros.
Persulfato de amonio al 12.5% -----------I O0 microlitros
Una vez preparado se vierte entre las placas de vidrio y se deja
polimerizar.
3.- Se prepara el gel
continuación:
concentrador al 4% como se indica a
Buffer pH 6.8 1 ml
Acrilamida-bisacrilamida al 30% ------- 0.66 mi Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.33 ml
Temed al 8.4% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 microlitros,
Persulfato de amonio al 12.5%-------- 40 microlitros.
Se adiciona con cuidado y rapidez sobre el gel de separación y
finalmente se coloca el peine, el cual se retira cuando el gel haya
polimerizado para que los carriles queden bien definidos.
4.- Tomar 1 rnl de la muestra y centrifugar 5 minutos en
microcentrífuga (5' x 10 O00 r.p.m.) y resuspender la pastilla en
62.5~1 de TRIS 0.0625 M a un pH de 6.8 con inhibidores de
proteasas (DIFP 5Mm, PMSF 2Mm, NEM 5Mm, PHMB 1OMm
Leupectina 2pM) mas 62.5 pI de buffer de muestra 2X para PAGE-
SDS e incubar 5' en agua hirviendo, centrifugar 5' X 10 O00 r.p.m. y
recuperar el sobrenadante.
5.- Colocar 20 microlitros de cada muestra con una jeringa
Hamilton dentro de los carriles del gel concentrador. Junto con las
muestras, se corre en los pozos adyacentes proteínas de peso r I“
molecular conocido (Marcadores de peso molecular).
6.- Las muestras en el gel concentrador se corren a 60 volts,
posteriormente el gel separador se corre a 100 volts. Se considera
que es tiempo suficiente de corrimiento cuando el colorante de
referencia (pironina) llega al final del gel de separación
ti-
k I* 7.- Obtener cuidadosamente los geles. El gel No 2 se utilizara para
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inmunotransferencia y el Gel No 1 es para determinación del Peso
Molecular
8.- A partir de este punto solo se trabaja con el Gel No 1 . El Gel se
coloca en azul de Coomasie (solución teñidora) por 30 minutos con I
agitación constante o 24 hrs sin agitación. * ,-
9.- Pasar a la solución destiñidora haciendo cambios de esta hasta
que el colorante se elimine parcialmente del gel, las bandas de
proteínas se observan perfectamente aproximadamente despues de
I:: *r *I- 1̂ 24 horas
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, b. . , 10.- Rehidratar en una solución de ácido acético al 10% por 10
minutos. .,...
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11 .- Se procede a la lectura. Se toma la fotografía y se analizan las
proteínas.
12.-Se construye una curva patrón que muestre la relación entre los
logaritmo natural (in) de los pesos moleculares de los marcadores de
Peso Molecular (ejes y) y la Movilidad Relativa de las proteínas
estándar (ejes x).
Esta relación es directamente proporcional y por tanto debe
formar una línea recta, la cual debe ser ajustada mediante el
tratamiento matemático de mínimos cuadrados y a través de
regresión lineal, determinar los valores de "Y" de las muestras
desconocidas.
PROTEINA
X= Rf de los Marcadores de Peso Molecular(MPM).
Y=Logaritmo Natural de pesos moleculares de los MPM
Donde:
Rf = Coeficiente de movilidad relativa.
PM (KDa) LnPM 1
Cálculo de Coeficiente de Movilidad Relativa.
La movilidad relativa de las proteínas contenidas en las muestras,
es el desplazamiento que tienen con respecto a la distancia total que
corre la muestra, dato que se obtiene con la siguiente fórmula:
-Miosina
-Fosforilasa p
-Alb. Sér. Bovina
-0voalbúrnina
a- chimiotripsinógeno
-p-Lactolobulina
-Lisozirna
Rf = Corrimiento de los MPM ( bandas o proteínas) cms.
Corrimiento de la muestra.
200 5.3
97.43 4.6
68 4.2
43 3.7
25.7 3.2
18.4 2.9
14.3 2.66
Valores de los coeficientes de movilidad relativa (Rf) y logaritmo
natural del peso molecular de las proteínas patrón.
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c) Técnica de Western Blot Ó Inmunotransferencia.
I.-Utilizando la técnica de Corrimiento electroforético en geles de
Poliacrilamida-SDS antes mencionada se corre cada uno de las
muestras de Proteína de Membrana Externa de Salmonella enteritidis
y se obtiene un gel que nombramos Gel No 2 sobre estos geles se
aplica la técnica de inmunotransferencia que se cita a continuación:
11.-TRANSFERENCIA
1 _- Se preparo una hoja de papel de Nitrocelulosa y 2 hojas de papel
Whatman de el tamaño del gel.
2.- Se Sumergio totalmente la membrana de Nitrocelulosa, el Papel
Whatman y las fibras en buffer de transferencia I X y eliminar las
burbujas de los soportes.
STOCK 8X buffer de transferencia:
Tris (0.025 M) --------------12.1 l g 1500 ml
Glicina (0.1 92M) ------------57.689/500 ml
BUFFER 2X
STOCK 8X ____________r-------- 400 ml
METANOL ...................... 800 ml
AGUA BIDESTILADA --------2800 ml
3000 ml
3.-Ensamblar el gel con el papel de Nitrocelulosa, el papel Whattman
y las fibras en forma de sandwich para la transferencia como se
muestra abajo. Deben permanecer todas los componentes húmedos,
y asegurarse de que el sandwich este bien ensamblado.
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4.-Se transfirió durante 1 horas a 1 O0 volts.
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5.- Cortar los carriles de los Marcadores de Peso Molecular (MPM) y
se tiñen durante 2 minutos con negro de amido al 0.1% en metanol-
agua-ac. Acético (5:4:1) y desteñir las tiras con solución metanol-
agua -ac. Acético (5:4:1) aproximadamente durante 1 minuto.
6.-Confirmada la transferencia las muestras se, bloquearan
durante tres horas a temperatura ambiente con una solución
bloqueadora de Albúmina serica bovina al 2-3% en TRIZMA-base
1 OmM.
7.- Lavar dos veces con PBS-TWEEN 20 0.05% durante 15
minutos, adicionar el suero de conejo contra Salmonella enteritidis
diluido 1:750 e incubar durante toda la noche a 4OC para que se
realice la reacción antigeno-anticuerpo.
8.- Lavar tres veces por 15 minutos con PBS-TWEEN 20 al
0.05%.
9.- Incubar durante dos horas a temperatura ambiente con la
proteína " A conjugada con peroxidasa diluida 1 : 1 O00 en trizma
base y albúmina serica-bovina 2%.
10.- Lavar tres veces por 15 minutos con PBS.
1 1 .- Revelar con diamino bencidina hasta que aparezcan bandas
negras.
12.- Detener la reacción lavando con abundante agua destilada. .L.
w.
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ACTIVIDADES REALIZADAS
El calendario de actividades estaba propuesta de la siguiente forma:
1, I. El Servicio Social se concluyo hasta el mes de agosto de 1999 debido a
dificultades que se presentarón en el manejo de material biólogico, manejo de las
técnicas disponibilida de reactivos y anticuepos.
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36 Kda
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS
36 Kda 37 KDa
De acuerdo al objetivo general y los objetivos particulares
planteados al principio este trabajo consideramos, por los resultados
obtenidos, que se cumplieron aci como las metas propuestas:
1.-Se logro la preparación de las PME de S. enteritidis fagotipo 4,
fagotipo 8 y fagotipo 13 lo que corresponde al primer objetivo
particular.
2.- Se lograron visualizar e identificar las proteínas principales como
fueron las de 37 KDa, 36 KDa y 24 KDa aproximadamente en las
cepas fago 4 I fago 8 y fago 13 de Salmonella enteritidis .
PESOS MOLECULARES DE LAS PROTEINAS ENCONTRADAS
EN LAS CEPAS DE Salmonella enteritidis
3.-AI analizar la inmunotransferencia se observo que las proteínas
con peso molecular de 36 KDa, 35 KDa y 25 KDa aproximadamente
son inmunogénicas ya que fueron reconocidas por los anticuerpos
específicos de Salmonella enteritidis fagotipo 4.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el perfil electroforético de el Gel de Poliacrilamida-SDS al
12% de las Proteínas de la Membran Externa de Salmonella enteritidis
susceptible al fagotipo 4, susceptible al fagotipo 8 y susceptible al
fagotipo 13 (Fotol), se muestran bandas de proteínas bien
definidas y con pesos moleculares de 36 KDa y 25 KDa en el fago 4
y en el fago 8 y una de 37 KDa aproximadamente en el fago 13.
Consideramos que las proteínas del rango de 36 KDa a 37 KDa
obtenidas pertenecen al grupos de las porinas Omp A, estos
resultados concuerdan con los reportados por Verdugo et.al. y
Pelayo R. quienes trabajando con Sulmonellu rhipy encontraron que
las proteínas de Peso molecular aproximadamente de 36 KDa
corresponden a las porinas
Los patrones electroforéticos de las Proteínas de la Membrana
Externa de las tres cepas trabajadas fueron transferidos a papel de
nitrocelulosa para realizar la inmunotransferencia, para esto se
hicieron reaccionar con sueros de conejo hiperinmunes contra
S.enteritidis que a la dilución de 1:750 sirvió para detectar
perfectamente bien las proteínas membranales. En la Foto 2 se
muestra el análisis de Western Blot, en donde se observa que las
proteínas que reaccionaron con el suero hiperinmune de conejo
fueron las de Peso Molecular de 35KDa en la preparación de
S.enteritidis fagotipo 4 y las de 36 KDa y 4 KDa en Salmonella
enteritidis fagotipo 13 por lo que se evidenciaron como bandas
obscuras. En Salmonella enteritidis fagotipo 8 se encontró una
proteína con peso molecular de 36 KDa (Foto 3).
Podríamos considerar que 1% proteínas de 36 KDa y 37 KDa
que se encontraron en mayor concentración en el corrimiento
electroforético (Foto I), corresponden a las proteínas de 35 y 36
KDa encontradas en el análisis de inmunotransferencia (Foto 2 Y 3)
por lo que además de encontrarse en altas concentraciones son
inmunogénicas, característica que se podría utilizar para el
diagnostico rápido de Sententidis e incluso estos resultados podrían
ser la base para que con posteriores estudios se pudieran utilizar
estas proteínas junto con otras en la preparación de una vacuna
contra tifoidea aviar.
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CONCLUSIONES:
1 .- Se obtuvo un patrón electroforético semejante en los fagotipos 4,
8 y 13 de Salmonella enteritidis (Foto I).
2.-En los patrones electroforeticos se encontraron bandas de
Proteínas de Membrana Externa (PME) en común entre Salmonella
enteritidis fago 4 y fago 8 (36 KDa y 25 KDa) otra muy semejante en
el fago 13 (37 KDa) Foto 1.
3.-La proteína con peso moleculares de 36 KDa se observa en
mayor Concentración (Fotol) en el fagotipo 4 y en el fagotipo 8,
mientras que en el fagotipo 13 se encuentra pero en menor
concentración.
4.-Las proteínas de 36 KDa y 37 KDa se podrían considerar como
porinas OMP A según Verdugo, et.al.
5.- En la lnmunotransferencia se encontró que en los tres fagotipos
de Sulmcmellu enteritidis estudiados se reconocieron a 4 proteínas
antigenicas:
En el fagotipo 4 se reconoció a las proteínas con pesos
molecular de 35 KDa y 26 KDa.
Fagotipo 8 se reconoció a la proteína con peso molecular de 36
KDa
Fagotipo 13 se reconoció a las proteínas con pesos molecular de
36 KDa y 4 KDa. (Foto 2 y 3)
6.- Las proteínas con Peso Molecular de aproximadamente 36 KDa
corresponden a las porinas, estas proteínas las encontramos en alta
concentración (36 y 37 KDa Foto 1 ) además de que encontramos
que son antigenicas lo cual concuerda con los trabajos realizados
por Verdugo et.al. en otra especie de Salmonela.
CRITERIOS DE EVALUACIÓN
El desempeño llevado por la alumna CLAUDIA CORDOVA
BARRIOS fue bueno en su trabajo desarrollado como en su aplicación ya
que logró obtener la preparación de proteínas de SuZmoneffu enteritidis fagotipo 4, fagotipo 8 y fagotipo 13 en geles de Poliacrilamida-SDS al 12%,
llegando a ser reconocidas algunas proteínas de peso moleculares como
las de 37 KDa, 36KDa y 25 KDa de los sueros hiperinmunes desarrollados
en el laboratorio, lo que significa que estas proteínas tienen un carácter
antigénico.
ATTENTAMENTE
Asesor externo: Dr .Víctor Ruben
Tenorio Gutíerrez.
Responsable del proyecto de
Biotecnologia.CENID-MICROBIOLOGIA
BlBLlOGRAFíA
Calnek , B.W. 1995 Enfermedades & las aves. Primera edición en
español. Manual moderno México D.F. pp. 81-119.
i.
". Y
I'
"
r L
tl
c:
Cárter, G.R. 1985 Fundamentos de bacierioloqía v micoloqía médica.
Ed.Acribia, Zaragoza
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