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Ref.: S2009/AGR-1464
III REUNIÓN CIENTÍFICA
ANALISYC-II
Instituto de Química Orgánica General, (CSIC). Madrid, 12 de Junio de 2012
GRUPO UCM-QA
Principales hitos:
1. Alimentos funcionales (Se)
2.Nanopartículas: su problemática analítica, determinación, bioacumulación y su efecto. (Se, Ag y TiO2)
3.Contaminantes orgánicos: clásicos y emergentes (metodologías analíticas y bioacumulación)
GRUPO UCM-QA
Objetivo principal: Evaluación y estudio sobre la posible incorporación y/o biotransformación de
selenio a proteínas, en productos lácteos por la acción de Lactobacillus Lactis.
Seinorgánico
Seorgánico
Procedimiento experimental: A través del enriquecimiento de yogurt con
Se(IV), se ha procedido a la extracción y precipitación de proteínas,
determinación de selenio y/o selenoproteínas por SDS-PAGE y Asymmetric
Flow-Field-Flow-Fractionation (AF4) usando UV e ICP-MS como técnicas de
detección.
GRUPO UCM-QA
RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Se ha demostrado la capacidad de biotransformación y,
la incorporación de selenio a proteínas mediante la acción de L. Lactis. Tras la optimización
del proceso de extracción proteica, se comprobó como el Se se une/bioincorpora de forma
mayoritaria a proteínas de 20-37kDa (Caseínas, proteínas mayoritarias en la leche) y
biomoléculas de alto peso molecular.
AF4-ICPMS
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
cp
s,
78S
e
> 200kDa 20-30kDa
UV ICP-MS
Congresos:
-7º Workshop Hispano-Francés sobre Química Analítica Bioinorgánica (Gijón 2012)
- XXIII Reunión Nacional Espectroscopía (Córdoba 2012)
GRUPO UCM-QA
Fermentación de coles con Selenio Objetivo: Evaluar la transformación de Se(IV) en el proceso de fermentación de coles y
estudiar el efecto de la adición de selenito en los productos de hidrólisis de los indol-
glucosinolatos (GLS) (considerados anticancerígenos), la vitamina C, la actividad antioxidante
de las coles fermentadas, y la biotransformación del Se.
Col blanca (Brassica oleácea) Coles fermentadas Fermentación láctica
Na2SeO3
7 días, 22ºC
Procedimiento experimental: se desarrolló la metodología analítica necesaria utilizando
las técnicas HPLC-ICP-MS, HPLC-PAD, EC.
GRUPO UCM-QA
Resultados: Las col enriquecida con 0,14µg Se/g
incorporó 0,11µg Se/g (80-100%),
biotransformándose a SeMeSeCys en su totalidad.
La adición de selenito aumentó la formación de
algunos compuestos derivados de la hidrólisis de
GLS. Se observó un aumento en la actividad
antioxidante (163 mmol trolox/g). 05000
100001500020000250003000035000
0 5 10
cp
s
time / min
SeMeSeCys
PRP-X100
Publicaciones y Congresos Peñas E., Martinez-Villaluenga C., Frias J., Sánchez-Martínez M.J., Pérez-Corona M.T., Madrid Y., Camara C. and Vidal-Valverde C.
Se improved indole glucosinolate hydrolysis products content, Se-methylselenocysteine content, antioxidant capacity and potential anti-
inflammatory properties of sauerkraut. Food Chemistry 132 (2012) 907-914
M. J. Sánchez Martinez, M T: Perez Corona, C. Cámara and Y. Madrid . Selenite Biotransformation during brewing. Evaluation by
HPLC-ICP-MS Talanta 88 ( 2012) 272-276
M. Sanchez, M. T Pérez-Corona, C. Cámara and Y. Madrid. Se Biotransformation by Saccharomyces cerevisiae and S. bayanus
during white wine manufacture: Lab-scale experiments Food Chemistry 124 (2011)1050-1054
Euro Food Chem XVI. Translating Food Chemistry into Health Benefits. 6-8 Julio 2011. Polonia
7º Workshop Hispano-Francés sobre Química Analítica Bioinorgánica, 1-3 Julio 2012. Gijón, España.
GRUPO UCM-QA
NANOPARTÍCULAS
Se, TiO2 y Ag
Objetivos: Desarrollar métodos analíticos
para la determinación de nanopartículas, su
estabilización y caracterización
GRUPO UCM-QA
Nanopartículas de TiO2 en productos de consumo humano
ANTECEDENTES & OBJETIVOS
El actual desarrollo de la nanotecnología en el área de la alimentación está
estrechamente relacionado con la seguridad de la salud humana y medio ambiente
Por qué es importante llevar a cabo la
identificación/caracterización de
nano-TiO2 en productos alimenticios
En función del tamaño y estructura,
presentan diferentes efectos biológicos.
Riesgos para la salud del consumidor:
Daño oxidativo celular
Acumulación de nano-TiO2 en intestino
nano-TiO2
Nano-TiO2 presentes en…
ADITIVOS. Agente colorante (E 171)
AGENTES “ANTI-CAKING” (anti-coagulantes) en polvos.
TiO2 en azúcar glass, café en crema…
PROTECCIÓN frente RADIACIÓN UV.
TiO2 en envases de plástico, cremas solares…
GRUPO UCM-QA
Nanopartículas de TiO2 en productos de consumo humano
(Fase desarrollo)
AZÚCAR GLASS
Ti TOTAL: 938 ± 83 mg Ti /Kg
Ti EXTRAÍDO: (3.48 ± 0.09)·10-2 mg Ti /Kg
¿¿NANOPARTÍCULAS??
Digestión ácida-ICP MS
USP-ICP MS
AF4-ICP-MS
0
5000
10000
15000
20000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo (min)
CPS 47Ti
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN
de TITANIO
PRESENCIA DE NANOPARTÍCULAS
RUTILO
ANATASA
0
20000
40000
353637383940414243444546
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tiempo (min)
Nano-TiO2 (rutilo) ~ 100 nm
Nano-TiO2 (anatasa) ~ 25 nm
CPS 47Ti
Presencia de
vacuolas vesículas
PROLIFERACIÓN CELULAR
FASES CICLO CELULAR
Estudio de la EXPRESIÓN PROTEÍCA
mediante Inmunofluorescencia
Inhibición del desarrollo celular Bloqueo de la síntesis de proteínas y replicación de ADN
GRUPO UCM-QA
EFECTO de NANOPARTÍCULAS de Se en células humanas Los efectos antioxidantes, biodisponibilidad y toxidad de SELENIO dependen de su
FORMA QUÍMICA
LOCALIZACIÓN nanoSe en células HepG2
mediante TEM
CONGRESOS:
III Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica
(2012 Santiago de Compostela, España). Tipo de participación: Póster
13as Jornadas de Análisis Instrumental (2011 Barcelona, España).
Tipo de participación: Comunicación Oral
I Simposio de Jóvenes Investigadores en Espectroscopía Aplicada
(2011 Madrid, España). Tipo de participación: Comunicación Oral
7º Workshop Hispano-Francés sobre Química Analítica
Bioinorgánica (Gijón 2012)
Inhibición de la expresión factores de iniciación
eucariotas
Células de hepatocarcinoma humano HepG2 mitocondria
GRUPO UCM-QA
Objetivos realizados
- Estabilidad de las suspensiones de AgNPs:
- Se consigue su estabilidad (48h) en un medio de HAc y almidón al 0,1%.
- Se han realizado ensayos de bioacumulación en larvas del pez cebra. (No se ha detectado bioacumulación
en los ensayos)
Objetivos en fase de desarrollo
- Desarrollo de método de análisis de especiación de AgNP y Ag+ mediante ultrafiltración a 10KDa y
determinación por ICP-MS en productos de herbolario y cervezas
- Estudios de caracterización del tamaño y forma de suspensiones de nanopartículas en estos productos,
mediante el fraccionamiento en flujo con campo de flujo asimétrico (AF4) acoplado con ICP-MS.
- Logros: Se ha comprobado la presencia de nanopartículas de plata en algunos productos y la de plata iónica.
Publicaciones Zebrafish larvae as a Model for the Evaluation of Inorganic Arsenic and Tributyltin Bioconcentration. Ana López-
Serrano; Jon Sanz Landaluze, Riansares Muñoz-Olivas, Joaquín Guinea, Carmen Cámara. Water Research, 45
(2011) 6515-6524
DETERMINACIÓN y CARACTERIZACIÓN de AgNPs
GRUPO UCM-QA
ESTUDIO DE LOS MECANISMOS BIOMOLECULARES
IMPLICADOS EN LA TOXICIDAD INDUCIDA POR MeHg
Objetivo principal: Identificación de proteínas y mecanismos celulares implicados en los
efectos tóxicos inducidos por MeHg en células y organismos en desarrollo (larvas de pez
cebra).
MeHg Hepatocitos Larvas de pez
cebra
Procedimiento experimental: Empleo de dos estrategias de proteómica cuantitativa (SILAC y iTRAQ)
para la identificación de proteínas de-reguladas. Validación de los datos proteómicos mediante análisis
bioinformáticos, morfológicos e histológicos.
GRUPO UCM-QA
Resultados y Conclusiones: Se han identificado diversas proteínas de-reguladas como
consecuencia de la exposición a MeHg permitiendo, por un lado, profundizar en los
mecanismos de toxicidad y de detoxificación de este compuesto, y por otro identificar
potenciales biomarcadores de toxicidad. Los resultados de los análisis morfológicos e
histológicos han corroborado los datos proteómicos obtenidos.
Publicaciones:
- Trends in Analytical Chemistry 30 (2011) 703.
- Talanta. 89 (2012) 169– 177
- Analytical and Bioanalytical Chemistry (DOI 10.1007/s00216-012-6042-3)
- Analytica Chimica Acta (Enviado)
Congresos:
-III Jornadas de Jóvenes Investigadores en Proteómica (Santiago, 2012).
-13ª Jornadas de Análisis Instrumental (Barcelona, 2011)
-3rd International Symposium on Metallomics (Munster, 2011)
GRUPO UCM-QA
Objetivo: Determinación de estaño inorgánico y de especies organoestánnicas en larvas de
pez cebra.
La medida de Sn total se realiza mediante ICP-MS y de especies de Sn mediante GC-FPD. Además se desarrolla un polímero de impresión molecular para la determinación de especies de Sn.
BIOACUMULACIÓN DE ESPECIES ORGANOESTÁNNICAS
Las muestras de larvas se exponen a 2 ppb de TBT en 45h y 48h, y depuración de 12h y 24h.
45h 48h dep 12h dep 24h
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
2400
GC FPD
ICP MS
GF AAS
ng g
-1 S
n
Time
Resultados:
Figura 1: Comparación de tecnicas para determinar Sn total
45h 48h dep 12h dep 24h
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
ng g
-1
Time
MBT
TBT
Figura 2: Concentración de MBT y TBT (GC FPD)
GRUPO UCM-QA
Diferentes estrategias de polimerización:
Mejores resultados:
Porogen: C6H5CH3
Emulsión: 1.5 g PVA y 0.1 g SDS en 75 mL de agua caliente
Etapas de limpieza y elución
Limpieza: MeOH
Elución
(%)
HCl 0.3M/MeOH 10
CH2Cl2/MeOH 1:1 50
CHCl3 60
MeOH/CH3COOH 9:1 100
Publicaciones:
- Water Research. 45 (2011) 6515-6524
Congresos:
- 5th Iberoamerican congress on Anaqlytical Chemistry
GRUPO UCM-QA
TRICLOSAN Triclosan es un agente antibacteriano y antimicrobiano de amplio espectro que puede
estar presente en el medio ambiente, en envoltorios de alimentos, superficies y máquinas
cortadoras utilizadas en la industria alimentaria. Es tóxico para organismos acuáticos y
se bioacumula en los tejidos del pescado (BCF = 2000-5000).
OBJETIVO: evaluación y comparación de métodos de extracción
miniaturizados para triclosan y su metabolito en muestras derivadas del
pescado mediante GC-MS.
MUESTRAS DE AGUAS DE CONSUMO Y HUEVAS DE PESCADO EXTRACCIÓN CON EtOAc Y MICROSONDA DE ULTRASONIDOS
PURIFICACIÓN MEDIANTE FLORISIL
C, mg V, µL
A/A
IS
1.2-1.26 1.26-1.32 1.32-1.38 1.38-1.44 1.44-1.5 1.5-1.56 1.56-1.62 1.62-1.68 1.68-1.74
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1 -1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8
Optimización mediante diseño experimental de las condiciones de la microsonda (tiempo,
amplitud y temperatura) y de la relación cantidad de muestra/volumen de extractante
PRECISIÓN RSD < 6.5 %
R > 94%
Aplicaciones: huevas de lumpo comerciales
Ensayos de bioacumulación con larvas de pez cebra
Optimización de la etapa de limpieza
GRUPO UCM-QA
Trabajo en fase de desarrollo: MUESTRAS DE SURIMI
EXTRACCIÓN CON ACET Y SONDA DE ULTRASONIDOS
PURIFICACIÓN MEDIANTE FLORISIL + PSA
Optimización de la etapa de limpieza empleando distintos sorbentes y cartuchos comerciales
PRECISIÓN RSD < 12 % R > 92%
MÉTODO QUECHERS
Optimización de la extracción empleando distintos disolventes (EtOAc y ACN, con y sin fase
acuosa) y sorbentes para dSPE
Mejores resultados: MÉTODO QUECHERS CON ACN Y dSPE: PSA + C18 + FLORISIL
PRECISIÓN RSD < 10 % R > 97%
Publicaciones:
- Anal Bioanal Chem (2012) 403:927–937
-Congresos:
- 16th European Conference of Analytical Chemistry. Euroanalisis. Belgrade, Serbia.
GRUPO UCM-QA
FÁRMACOS: REGULADORES LIPÍDICOS Y
ANTIINFLAMATORIOS Problemática: Los reguladores lípidos y los antiinflamatorios son ampliamente usados para el tratamiento humano y animal, respectivamente. Por ello, hay una preocupación creciente sobre su estudio y determinación en diferentes matrices tales como leche materna, leche animal y leche en polvo. Según la Directiva de la Comisión Europea 96/23/EC, los residuos de estas drogas deben ser controlados debido al riesgo potencial que supone para la salud humana.
Objetivo: Desarrollo de metodologías para la determinación de ácido clofíbrico (regulador
lipídico) y diclofenac (antiinflamatorios), en muestras de leche comercial mediante HPLC-DAD.
LECHE COMERCIAL: precipitación de las proteínas empleando AcN (1:1). El extracto
obtenido se hace pasar por un MIP comercial, selectivo para cuatro fármacos (ácido clofíbrico,
diclofenac, ibuprofeno, naproxen) HPLC-DAD
% R, CFB %R, DC
76 ± 5 95 ± 14
Extracto de leche comercial enriquecida con 400 mg/L de cada analito
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 Retention Time [min]
0
2000
4000
6000
Inte
nsity
[µV]
0512-4 - CH6CFB
DC
Congresos:
- I Simposio de Jóvenes Investigadores en
Espectroscopía Aplicada
GRUPO UCM-QA
BIOACUMULACIÓN DE FÁRMACOS Problemática: Debido al elevado consumo de fármacos, la legislación europea “REACH” (Registration,
Evaluation and Authorisation of Chemicals) ha propuesto la necesidad de evaluar los parámetros toxicológicos
(persistencia, capacidad de bioacumulación, etc) de compuestos químicos con producción superior 100
toneladas/año a través del TEST 305 empleo de numerosos peces adultos, elevada duración de los
ensayos y costes amplios.
Objetivo: Determinar los factores de bioacumulación de diclofenac y ácido clófibrico en larvas de pez cebra
Puesta a punto de un método de extracción de ácido clofíbrico y diclofenac en los medios de crecimiento y
larvas de pez cebra empleando como técnica analítica HPLC-DAD.
En fase de desarrollo: Alternativa al Test 305 Exposición de 48h a larvas de pez cebra a diferentes
concentraciones de los compuestos objeto de estudio + 24h adicionales a un sistema de depuración
Análisis
1) Extracción con ácido cítrico en AcN 0.1M
2) Empleo de sonda de ultrasonidos focalizada (A = 40%, 1 min)
3) Evaporación hasta sequedad con corriente de N2
4) Reconstitución en 150 mL de fase móvil
5) Centrifugación a 14 rcf, 15 minutos a Tª ambiente
6) HPLC-DAD
LARVAS MEDIOS
CFB HPLC-DAD
DC
2x500mL AcOEt Vórtes 30s HPLC-DAD
% R, CFB %R, DC
98 ± 20 89 ± 8
GRUPO UCM-QA
DETERMINACIÓN DE PAHs Ensayos de bioacumulación de los PAHs: antraceno y fluoreno
Se ha desarrollado un método por HPLC-FL para determinar antraceno y fluoreno en muestras
complejas y muy pequeñas.
Se ha aplicado a larvas de pez cebra para ensayos de bioacumulación
Durante la fase de bioconcentración se alcanzaron condiciones de “steady-state”.
Los BCFs obtenidos están de acuerdo con los de la base de datos METI-NITE Japan.
Publicaciones:
- Rapid Determination of PAHs in Zebrafish Eleutheroembryos as a Model for the Evaluation of PAHs
Bioconcentration S. El-Amrani, J. Sanz-Landaluze, J. Guinea, C. Cámara. Submitted to Journal of
Environmental Monitoring
Congresos:
-23rd International Symposium on Polycyclic Aromatic Compounds (ISPAC 23), Münster (Alemania)
-EuroTox (The 47th Congress of the European Societies of Toxicology), Paris (Francia).
- En el 2nd CEFSER workshop "Persistent organic pollutants in food and environment", Novi Sad (Serbia)
GRUPO UCM-QA
Trabajo en fase de desarrollo: Ensayos de bioacumulación de 8 PAHs en células humanas
DETERMINACIÓN DE PAHs
Objetivos: Determinación de la bioacumulación de PAHs en células humanas. Efectos sobre
el proteoma humano
Desarrollo:
• Ensayos de estabilidad en medios de cultivo celular
• Contaminación de las células con 8 PAHs, ensayos de bioacumulación
Trabajo en fase de desarrollo: Ensayos en alimentos para 16 PAHs
Los PAHs se pueden encontrar en alimentos ahumados artesanalmente. Estos alimentos se
quedan impregnados básicamente con PAHs reconocidos como ligeros
Objetivo: optimización de métodos de extracción miniaturizados de PAHs en salchichas
ahumadas con reducción del tiempo de extracción para su posterior análisis por HPLC-FL.
Tipos de Muestras: salchichas ahumadas
Procedencia: Portugal
Colaboraciones: Azti
GRUPO UCM-QA
DETERMINACIÓN DE PAHs
Trabajo en fase de desarrollo: Ensayos en alimentos para 16 PAHs
Evaluación de métodos de extracción en salchichas ahumadas:
1.- Sonda de ultrasonidos y limpieza con cartuchos de SPE: C18.
Optimización de la etapa de limpieza.
2.- QuECheRs: ACN + dSPE (PSA + C18)
1
8
9
7
6
5
4
3
2
µg/kg
1.-Acenaphtene 193,52
2.- Fluorene 302,71
3.- Phenatrene 221,49 Σligeros= 749,45 µg/kg
4.- Antracene 31,73
5.- Benzo(a)antracene 12,21
6.- Chrysene 58,43
7.- Benzo(b)fluorene 290,61 Σpesados= 1775,04 µg/kg
8.- Benzo(k)fluorene 314,62
9.- Benzo(a)pyrene 1099,17
GRUPO UCM-QA
RESUMEN DE PUBLICACIONES
Food Chemistry . 124 (2011) 1050-1054 JAAS 26(1) 116-122, (2011) JAAS 26(1) 178-186 (2011) TRAC 30, 5, 703-716 (2011) Water Research 45 (2011) 6515-6524 Talanta 88( 2012) 272-276) Food Chem. (2011) 11: 64 Anal. Bioanal. Chem. 403, 4 (2012), 927-937 Talanta. 89 (2012) 169– 177 (2011) Anal. Bional. Chem. (2012) 403:927–937. Science of Total Environment (2012) 425 184–190