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UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA
SEDE TALCAHUANO
“REY BALDUINO DE BÉLGICA”
“IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICA EN DETECCIÓN Y
ENUMERACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN
ALIMENTOS”
TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE
TÉCNICO UNIVERSITARIO EN CONTROL DE ALIMENTOS
ALUMNO : ANGÈLICA GUANTIANTE MUÑOZ
PROFESOR GUÍA : SRA. GLORIA BARRIA ESPINOZA
2009
INDICE
PÁG.
INTRODUCCIÓN 1
CAPÍTULO I
DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA
1.1. La Empresa 3
1.1.1. Generalidades 4
1.1.2. Organigrama General de Gestión de Calidad y Laboratorio 5
1.2. Áreas de Servicio 6
1.2.1. Organigrama de Servicios de Laboratorio Sede Concepción 8
1.3. Identificación del Departamento en cual se realizó la Práctica Controlada 9
1.3.1. Laboratorio de microbiología físico-organoléptico 9
1.4. Funciones y Trabajos Específicos Asignados 10
1.4.1. Descripción de las funciones asignadas 10
CAPÍTULO II
CONSIDERACIONES GENERALES LISTERIA MONOCYTOGENES
2.1. Introducción 14
2.2. Revisión Bibliográfica 15
2.3. Listeria Spp 16
2.4. Especies del Genero Listeria 16
2.5. Listeria Monocytogenes 17
2.5.1. Características Microbiológica 17
2.5.2. Epidemiología 18
CAPÍTULO III
IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS PRODUCTOS
DESTINADO AL CONSUMO HUMANO Y ANIMAL
3.1. Objetivo 21
3.1.2. Objetivo General 21
3.1.3. Objetivos Específicos 21
3.2. Metodología 22
3.3. Desarrollo de las Técnicas Microbiológicas 24
3.3.1. Muestras Analizadas 24
CAPÍTULO IV
DETECCIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGNES NCH 2657 OF. 2001
4.1. Materiales 26
4.1.1 Aparatos y equipos 26
4.2. Reactivos 27
4.3. Desarrollo del Análisis 28
4.3.1 Requisitos generales 28
4.3.2 Homogeneización de la muestra 28
4.3.3 Incubación y aislamiento 28
4.3.4 Confirmación de Listeria spp 30
CAPÍTULO V
DETECCIÓN Y ENUMERACION DE LISTERIA MONOCYTOGNES NCH 2657/2-2007 ISO 11290-2:1998
5.1. Materiales 32
5.1.1 Aparatos y equipos 32
5.2. Reactivos 33
5.3. Desarrollo del Análisis 34
5.3.1 Procedimiento 34
5.3.2 Inoculación e incubación 34
5.3.3 Enumeración de colonias características 34
CAPÍTULO VI
CONFIRMACIÓN EN PARALELO DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE
LISTERIA MONOCYTOGNES
6.1. Confirmación de Listeria ssp 37
6.1.1 Confirmación de Listeria ssp 37
6.1.2 Reacción de Catalasa 37
6.1.3 Tinción Gram 38
6.1.4 Prueba de Movilidad 39
6.2. Confirmación de Listeria Monocytogenes 40
6.2.1 Prueba de hemólisis 40
6.2.2 Utilización de Carbohidratos 41
6.2.3 Prueba CAMP 42
6.3. Expresión de resultados 43
6.3.1 Resultados obtenidos por el método Nch 2657.Of2001 43
6.3.2 Resultados obtenidos por el método Nch 2657/2-2007 ISO11290-2:1998 44
6.3.3 Cálculos para recuento en 0,1 ml de muestra 45
CONCLUSIÓN 46
BIBLIOGRAFÍA 47
GLOSARIO 48
ANEXOS 50
INTRODUCCIÓN
Por medio de este Trabajo de Título, se podrá observar en forma clara y concisa lo
desarrollado en la Practica controlada realizada entre el 07 Abril y el 22 de Agosto del año
2008, en la Empresa Gestión de Calidad y Laboratorio S.A. (GCL), ubicada en Marco Polo
9038 Of. A en la Comuna de Hualpén.
Durante la permanencia en la empresa tuve la oportunidad de trabajar en el
Laboratorio de Microbiología Físico y Organoléptico, el cual esta encargado de servicios que
satisfagan las necesidades de sus clientes con un sistema de gestión concerniente a la calidad
de los muestreos y de los ensayos con su buena practica profesional de acuerdo a los métodos
establecidos en el tiempo acordado y con la oportunidad requerida.
En el primer Capítulo se relata la Descripción de la empresa, los diferentes
departamentos que la constituyen y finalmente las funciones del departamento en el que me
tocó realizar la práctica controlada. También en este capítulo se detallan las funciones que se
me asignaron durante la permanencia en la empresa y además, los distintos trabajos realizados.
El segundo Capítulo se refiere a las consideraciones generales y así dar una visión
general de Listeria, fundamentalmente entender la naturaleza del riesgo que presenta para los
alimentos y a los medios para controlarlas.
El Tercer Capítulo señala los pasos que fueron realizados para poder implementar las
técnicas.
El Cuarto y Quinto Capitulo se refiere a la primera etapa de los métodos aplicado en la
detección y enumeración de Listeria monocytogenes.
El Sexto Capitulo se refiere es la segunda etapa donde se lleva acabo su confirmación
de ambos métodos que se realizaron en forma paralela.
Finalmente se concluye con los Anexos, que contempla documentos aclaratorios de los
capítulos anteriores
CAPITULO I
“DESCRIPCION DE LA EMPRESA"
1.1 LA EMPRESA
GCL S.A., es una Empresa filial de Fundación Chile, que nació en Enero del 2003
con el fin de fortalecer y reforzar capacidades. Transformándose así el Área de Calidad y
servicios de Laboratorios en “Gestión de Calidad y Laboratorio S.A.”.
GCL S.A., mantiene sus actividades de prestación de servicios de laboratorio,
capacitación y asesorías; en las actuales dependencias de Fundación Chile tanto en Santiago
como en su sede de Concepción.
GCL S.A., esta situada en la VIII región, Marco Polo 9038 Of. A en la Comuna de
Hualpén.
1.1.1. Generalidades de la Empresa
En 1998, a fin de potenciar los servicios integrados y, además, orientar la labor del
Centro Tecnológico sólo a la innovación y transferencia tecnológica, Fundación Chile
concentró las actividades de inspección, certificación de calidad y servicios de laboratorio en
el Área Calidad y Servicios de Laboratorio.
En Enero del año 2003, Fundación Chile y la Corporación de Investigación
Tecnológica (INTEC) integraron sus actividades, convirtiéndose en la más importante
plataforma tecnológica del país en el ámbito de la innovación, negocios y la investigación
aplicada. Como parte de este proceso se desarrollaron cambios organizacionales internos, para
fortalecer equipos y reforzar capacidades.
De este modo, el Área de Calidad y Servicios de Laboratorio se transforma en una
empresa filial de Fundación Chile, Gestión de Calidad y Laboratorio S.A., manteniendo su
estructura organizacional y sus instalaciones.
Actualmente, GCL - Fundación Chile, cuenta con un equipo multidisciplinario de
técnicos y profesionales, con oficinas en la Región Metropolitana (Vitacura y Huechuraba),
VIII y IX Regiones (Talcahuano y Temuco respectivamente), con actividades en Chile, desde
la I a la IX Región, y también a nivel latinoamericano.
1.1.2. Organigrama General de Gestión de Calidad y Laboratorio
Gerente Gestión de calidad y Laboratorio
Secretaria
Gerente Administrativo y
Finanzas Gerente Aseguramiento
De Calidad
Nuevas Metodologías
Sede Concepción
Laboratorio Santiago
Laboratorio Concepción
Asesorias y
Proyectos
Certificación de Productos Procesados
Certificación de Producto
Frescos
Certificación de Productos
Madera
Sede Concepción
Sede Concepción
Certificado De Producto UCP
1.2 ÁREAS DE SERVICIO
La empresa tiene como principal objetivo apoyar en el mejoramiento de los estándares de
calidad de la industria, tanto en Chile como en el extranjero.
El cumplimiento de este objetivo se realiza a través de las siguientes líneas de
negocio:
• Servicios de laboratorio: Los Laboratorio cuentan con un moderno instrumental y
profesionales altamente especializados en el área alimentaría, lo cual permite cumplir
con un sistema de gestión de calidad acreditado por el instituto Nacional de
Normalización (INN) y autorizado por el servicio Agrícola y Ganadero (SAG),
Servicio Nacional de Pesca (Sernapesca) y por la Superintendencia de Servicios
Sanitarios (SISS).
• Los servicios de laboratorio cuenta con las unidades de Cromatografía, Química,
Microbiología y Físico-organoléptico.
• Certificación de productos: En productos frescos y /o procesados una amplia gama
de servicios destinados al apoyo constante de la gestión de las empresas.
• Certificación de la calidad de madera: Esta unidad tiene como misión consolidarse
como la principal entidad certificadora de productos madereros chilenos.
Dentro de las líneas de trabajo destaca el programa de certificación, ensayos
en laboratorio y certificación por lotes.
• Asesorías y proyectos: El objetivo es apoyar a la industria alimentaría chilena e
industria relacionada con ella, en el mejoramiento de estándares de calidad e
inocuidad.
Dentro de las líneas de trabajo, se realizan diagnostico, auditorias de
precertificación, auditoria a proveedores internas, desarrollo e implementación de
sistemas de gestión de calidad e inocuidad, charlas de sensibilización y tutorías.
• Capacitación a empresas: Cuenta con una estructura institucional orientada a formar
y perfeccionar las habilidades y conocimientos de las personas de la industria, clientes
y proveedores.
Dentro de las líneas de trabajo se desarrollan capacitaciones en las áreas de
calidad, medioambiente, seguridad y salud ocupacional, además del desarrollo de personas,
entre otras.
1.2.1 Organigrama de Servicios de Laboratorio Sede Concepción
Gerente Gestión de Calidad y Laboratorio
Jefe de Servicios de Laboratorio
Asesorías y Proyectos
Capacitación a Empresas Jefe de
Administración
Gerente Gestión de Calidad y Laboratorio
Gerente Gestión de Calidad y Laboratorio
Gerente Sede Concepción
Nuevas Metodologías
Secretaria
Jefe de Laboratorio de Química
Jefe de Servicios de Laboratorio
Jefe de Servicios de Laboratorio
Microbiología/ Físico-organoléptico
Analista 2
Personal Apoyo
Auxiliar
Encargado Aseguramiento de
Calidad
Analista 1
Analista 2
Personal Apoyo
Auxiliar
Analista 1 Muestreador
Personal Apoyo
Encargado Aseguramiento de
Calidad
Encargado Aseguramiento
de Calidad
1.3 IDENTIFICACIÓN DEL DEPARTAMENTO EN EL CUAL SE
REALIZÓ LA PRÁCTICA CONTROLADA
Nombre del departamento: Laboratorio de microbiología físico-organoléptico
1.3.1 Laboratorio de microbiología físico-organoléptico
Los laboratorios cuentan con un moderno instrumental y profesionales altamente
especializados en el área alimentaría, lo que permite cumplir con un sistema de aseguramiento
de calidad, según la norma chilena oficial NCh ISO 17025 Of. 2001.
Cuentan además con la autorización del Servicio Agrícola y Ganadero SAG, Servicio
Nacional de Pesca SERNAPESCA, Superintendencia de Servicios Sanitarios SISS y
acreditados según la norma chilena oficial NCh ISO 17025 Of. 2001 por el Instituto Nacional
de Normalización.
Esta unidad se constituye por un grupo especializado fundamentalmente en las áreas de
muestreo y análisis microbiológico de alimentos, aguas y bebidas.
•
Servicios
Análisis de microorganismos indicadores de patógenos en alimentos, aguas y bebidas.
•
Programa de Control a Servicios de Alimentación Institucional e Industria Alimentaría
•
•
Análisis de aguas, según norma chilena 409
Muestreo
1.4 FUNCIONES Y TRABAJOS ESPECÍFICOS ASIGNADOS
1.4.1. Descripción de las Funciones Asignadas.
• Preparación de medios de cultivo: Se preparan los medios necesarios cada día, se
debe disolver los gramos indicados del medio deshidratados (caldo y agares), en un
volumen determinado de agua desionizada, según requerimientos del fabricante. En el
caso de los agares se necesita aplicar calor (baño maría) para facilitar la disolución del
gel que los compone. Posteriormente se ajusta el pH y se dosifica. Finalmente, se
esteriliza a través de calor húmedo (autoclave) en la mayoría de los medios de cultivos,
en el caso de los medios de cultivo sensibles a las altas temperaturas se filtran por
membrana (0,2 um). Sin embargo existen otros medios de cultivos selectivos que no
requieren esterilización, el cual su preparación es con agua desionizada y frasco estéril,
como por ejemplo: Selenito Cistina, (determinación de salmonella).
• Siembra de muestras de alimentos, productos hidrobiológicos, aguas y riles: Se toma
una cantidad conocida de muestra (gramos o ml, según su naturaleza) el cual se pesa en
un ambiente aséptico y posteriormente se diluye para luego traspasar al medio
correspondiente, de acuerdo al ensayo realizado. En algunos casos se necesito realizar
diluciones seriadas para obtener un número de microorganismos cuantificables. Luego
se incuba en estufa o baño termorregulador a una temperatura y tiempo determinado.
• Traspaso de muestras: es el traspaso de las colonias desde medios de cultivos de
enriquecimiento a medios de cultivos selectivos, se realizo en la mayoría de los análisis
microbiológicos y para ello se tomo una cantidad de muestra (o inóculo) desde el
medio de enriquecimiento con un asa (punta redonda en el caso de caldos, en punta
recta en el caso de los agares) y se traspaso a un segundo medio selectivo, el cual
nuevamente se incubo a una temperatura y tiempo determinado.
• Confirmación de muestras a través de baterías bioquímicas: esta etapa es requerida
como confirmación de algunos análisis y en la mayoría de los casos, la ultima. Aquí se
tomó una o varias colonias sospechosas con el asa de cultivo y se traspaso a los tubos
que conforman la batería bioquímica. Las baterías bioquímicas aportan información
acerca del comportamiento especifico de las bacterias en su metabolismo, a través de,
reacciones enzimáticas, fermentación de azucares, etc.
• Monitoreo ambiental: el monitoreo ambiental se realiza semanalmente colocando una
placa de agar Plate Count (APC), para recuento total y otra agar Patata Dextrosa (APD)
para recuento de hongos, e cada una de las salas del laboratorio (mesones y campanas).
Estas placas se expusieron durante 15 minutos, posteriormente se cerraron e incuban:
para el caso de las placas APC se incubaron a 35º C y las placas de APD a 22º C por 5
días.
• Registro de temperaturas de las muestras de aguas y riles: Al ingresar las muestras de
agua y riles al laboratorio se tomo la temperatura de recepción con un termómetro y se
registro. En el caso que la muestra ingrese una temperatura sobre 10º C se informa de
la situación, siguiendo el conducto regular de la empresa.
• Registro de temperaturas de equipos (estufa, baños, refrigeradores, balanzas y
congeladores) Se reviso las temperaturas de los equipos dos veces al día, una en la
mañana y la otra en la tarde, para verificar que los equipos funcionen correctamente.
En el caso que no cumpla con los límites permitidos es necesario ajustar temperatura,
registrar en la planilla y monitorear el comportamiento del equipo, en las balanzas se
registra una vez al día y se calibra con las masas patrones.
• Preparación y entrega de envases para muestreo de aguas y riles: Los envases se
etiquetaron, registrando es estos los ciclos de descontaminación, esterilización. Lote
(fecha de lavado), numero del envase y si lleva o no tiosulfato, dependiendo el uso del
envase. Estos registros deben quedar en las planillas del laboratorio, llamada cadena de
custodia. Esta información permite hacer trazabilidad de la muestra.
• Preparación y entrega de neveras para muestreo del SAG.: En la nevera oficial
contiene: 8 gel pack, 10 tubos de ATP SAG. ,10 plantillas y 10 esponjas (material
estéril) y la interna 5 tubos de APT SAG., 5 plantilla y 5 esponjas, el cual queda todo
registrado en su planilla antes de salir.
CAPITULO II
“CONSIDERACIONES GENERALES
LISTERIA MONOCYTOGENES”
2.1 INTRODUCCIÓN
Listeria monocytogenes es un microorganismo que no era considerado como
importante patógeno transmitido a través de los alimentos hasta hace relativamente poco
tiempo y, en consecuencia, no había recibido mucha atención por parte de la industria
alimentaría.
Los índices de listeriosis en la población humana siempre habían estado enormemente
ensombrecidos por otras enfermedades transmitidas a través de los alimentos como la
salmonelosis o la campilobacteriosis, y la confirmación de brotes transmitida a través de los
alimentos era poco frecuente.
Sin embargo, los brotes de listeriosis vehiculados por los alimentos ocurridos al
principio de la década de los 80, demostraron la grave naturaleza de la enfermedad que
excepcionalmente cursaba con altos índices de mortalidad, en particular, sobre los miembros
más vulnerables de la población ,“Listeria monocytogenes es un contaminante ambiental
ampliamente distribuido cuyo medio primario para la transmisión al hombre es a través de la
contaminación de los alimentos en cualquier punto de la cadenas alimentaría, desde el origen
hasta la cocina.
La eliminación total de Listeria monocytogenes de todos los alimentos es impracticable
y puede ser imposible.” Esta cita esta sacada de la conclusión y las recomendaciones del
informe elaborado por un grupo informal de trabajo de la Organización Mundial de la Salud
reunido en 1988 para tratar sobre la listeriosis transmitida a través de los alimentos.
En Chile hay poca información sobre la presencia de L. monocytogenes en alimentos y
no existe notificación obligada de listeriosis, razón por la cual no es posible establecer el nivel
de riesgo de brotes. Nuestro país no estará ajeno a estas restricciones después de los tratados
de libre comercio suscritos. Habiéndose establecido que en Chile se carece de amplia
información epidemiológica de base así como de métodos estandarizados de detección rápida
que permitan tomar decisiones rápidas y adecuadas.
2.2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) constituyen uno de los problemas
más importantes de salud pública en el mundo contemporáneo y, además, afectan
negativamente a la productividad económica.
Las enfermedades transmitidas por alimentos, entre las que se consideran las
toxiinfecciones alimentarías, resultan de la ingestión de una gran variedad de alimentos y /o
agua, contaminados con microorganismos patógenos, toxinas microbianas o agentes químicos
en cantidades que afecten la salud del consumidor.
Se han descrito aproximadamente 250 enfermedades con agente causal conocido. Estos
agentes incluyen virus, bacterias, parásitos, toxinas, metales. Entre ellas cabe mencionar el
cólera, la salmonelosis, la listeriosis, infecciones debidas a Eschericcia coli enterohemorrágica
y las intoxicaciones alimentarías causadas por contaminantes químicos.
Dentro de las enfermedades infecciosas bacterianas de origen alimentario cabe destacar
a la “Listeriosis” como una rara pero severa enfermedad con una tasa de mortalidad de
aproximadamente un 30%. Ésta enfermedad es causada por la bacteria Listeria
monocytogenes, y estudios recientes muestran que el origen de casos esporádicos y
epidémicos de listeriosis en humanos son principalmente de origen alimentario.
2.3. LISTERIA SPP
El género Listeria consiste en un grupo de bacterias Gram.-positivas de bajo G+C
estando estrechamente relacionado a Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus, y
Staphylococcus. Listeria spp. es un bacilo anaerobio facultativo de 0.4 por 1 a 1.5 μm no
formador de esporas, no tienen cápsula, y es móvil en 10 a 25º C. Es aislada desde una
diversidad de fuentes medio ambientales, incluyendo suelo, agua, efluentes, una gran variedad
de alimentos, y las heces de humanos y animales.
A fines de los años setenta y a comienzo de los años ochenta, el número de reportes de
aislamientos en Listeria spp. en el mundo comenzó a incrementarse, y desde 1983 en adelante,
una serie de brotes epidémicos en humanos en Norte América y Europa claramente estableció
a la listeriosis como una importante enfermedad de transmisión alimentaría.
Los alimentos más frecuentemente implicados son quesos suaves y productos lácteos,
patés y embutidos, pescado ahumado, ensaladas, y en general alimentos producidos
industrialmente, productos refrigerados listos para servir que se comen sin cocinar o
recalentar. Esto indica que Listeria spp. es una seria amenaza a la seguridad de los alimentos y
la sitúa entre las categorías de microorganismos de mayor preocupación de la industria de los
alimentos.
2.4 ESPECIES DEL GÉNERO LISTERIA.
El género Listeria contiene 6 especies: L. monocytogenes, L.innocua, L. seeligeri,
L.welshimeri, L. ivanovii, y L. grayi. Cada una de estas dos últimas, contiene dos subespecies.
L. ivanovii y L. monocytogenes son patogénicas para ratones y otros animales. Sólo L.
monocytogenes es comúnmente asociada con listeriosis humana. Listeriosis asociada a
infección por L. ivanovii, y lo mismo para L. seeligeri, es extremadamente rara en humanos.
2.5 LISTERIA MONOCYTOGENES.
El hombre y los animales se infectan con Listeria monocytogenes por diferentes vías
que van desde la transplacentaria hasta la cutánea. En las últimas décadas ha llamado la
atención la presentación de casos que adquirieron el agente patógeno a través de la ingesta de
alimentos, atribuyéndose primordial importancia a L. monocytogenes como agente de
enfermedad transmitida por alimentos.
Este patógeno fue asociado por años a la mujer embarazada y al recién nacido, sin
embargo en 1981 se confirmó como patógeno alimentario. Hoy en día se sabe que se trata de
una zoonosis a la cual se le han asignado nombres tales como listeriosis, leucocitosis,
mononucleosis, infección listérica o listeriasis.
2.5.1 Características Microbiológicas.
Listeria monocytogenes es una bacteria bacilar Gram. positiva, anaerobia facultativa
que crece entre - 0.4 y 50º C (Figura 1). Es catalasa positiva y oxidasa negativa y expresa una
ß- hemolisina que produce zonas de hemólisis alrededor de las colonias en agar sangre.
En las tinciones de Gram puede adoptar un aspecto cocoide o diplococoide y
confundirse con neumococos, corynebacterias, estreptococos beta-hemolíticos y Erysipelothrix
rhusiopathiae y más excepcionalmente con Haemophilus spp.
El organismo posee flagelos perítricos que otorgan motilidad, ocurriendo ésta sólo en
un rango de temperatura estrecho. Cuando el organismo crece entre 20-25º C, la flagelina que
compone a los flagelos, se ensambla a la superficie celular, pero a 37 ºC la producción de esta
proteína se ve reducida notoriamente. Las colonias demuestran una característica azul- verde
brillante en agar de crecimiento debido a la oblicuidad transmitida por luz.
El pH mínimo requerido para iniciación de crecimiento es de 5.0 a 5.7 a 4º C y desde
4.3 a 5.2 a 30ºC. La reacción de CAMP en sangre ovina y todas las cepas examinadas
producen ácido desde Lramnosa y a- metil-D- manosida. No produce ácido desde D- xilosa ni
desde D-manitol.
El medio de aislamiento selectivo diferencial para Listeria monocytogenes es el agar
PALCAM que ha sido introducido como agar selectivo compañero para agar Oxford .Si bien
los métodos difieren en los caldos de cultivo de pre-enriquecimiento y el agar selectivo
empleados, los inhibidores de flora acompañante que utiliza, coinciden en gran medida.
. Fig. 1. Fotografía de microscópica electrónica de L monocytogenes
2.5.2 Epidemiología
L. monocytogenes es capaz de crecer sobre amplios rangos de temperatura (1 a 45º C),
pH (pH 5 a 9), y os molaridad (1 a 10% NaCl), que hacen a esta bacteria un agente
contaminante ideal de los alimentos después de su procesamiento. L. monocytogenes ha
demostrado sobrevivir bajo condiciones ácidas de pH (4.4), y resistir a altas concentraciones
de NaCl (sobre 14%) y finalmente, aunque mesofílica, muchas cepas han demostrado
permanecer 20 metabólicamente activas a temperaturas bajas como a 5º C, una temperatura a
menudo usada durante el almacenamiento de alimentos.
Por lo anterior, L. monocytogenes puede sobrevivir en alimentos por largos períodos
de tiempo y constituyen reservorios de L. monocytogenes alimentos como la leche que se
considera particularmente susceptible dado que las vacas en producción pueden eliminar
listerias en concentraciones de 10 unidades por mL de leche o más. También otros alimentos
la portan y es así como en USA, un estudio preliminar indica una contaminación con L.
monocytogenes del 70% de la carne molida, 43% de cecinas de cerdo y 48% de pollos. Frutas
y vegetales también se contaminan a través de la fertilización con guano de corral.
No quedan ajenos a la contaminación los productos del mar, especialmente los
moluscos filtradores que captan la listeria en las aguas contaminadas. Dada la amplia
distribución de L. monocytogenes en el medio ambiente, son múltiples las posibilidades de
infección a través del suelo, agua, plantas, animales, insectos, aire y alimentos, sobre todo
porque las personas que desarrollan la enfermedad continúan como portadores sanos
eliminando el agente por las heces, por tiempo indefinido, existiendo así también la
transmisión de hombre a hombre por la vía fecal-oral. Casos descritos de brotes originados por
la leche o por verdura contaminada con heces de animales listéricos demuestran que los
animales pueden ser una importante fuente de infección.
Se describe también transmisión nocosomial de L. monocytogenes a través de
materiales, inoculación directa en caso de veterinarios, cuidadores de animales y agricultores.
Aunque L. monocytogenes puede infectar a gente sana, las personas que presentan mayor
riesgo son cualquiera de los extremos de vida (< 1mes o > de 60 años de edad), embarazadas,
o inmunocomprometidos en alguna forma.
En mujeres embarazadas se informa más del 25% de los casos, más comúnmente en el
tercer trimestre de gestación, aunque la enfermedad ha sido informada en todos los trimestres.
En los pacientes con alguna alteración maligna de inmunidad mediada celular se informa
aproximadamente un 70% como infecciones no peri natales. La quimioterapia, receptores de
trasplante de órganos, particularmente pacientes transplantados renales, tienen más riesgo por
su estatus inmunodeprimido. Pacientes VIH positivos posiblemente tienen 150 veces más
riesgo de listeriosis que otras personas. Otros grupos en riesgo son personas con diabetes, falla
renal, abuso de alcohol, abuso de drogas endovenosas, hipoclorhidria y estados de sobrecarga
de fierro. En el caso del recién nacido, éste se contagia a partir de la madre por vía
transplacentaria o durante el parto. Sin embargo el origen alimentario es sin duda el
mecanismo de transmisión más frecuente, tanto en los casos esporádicos como epidémicos.
CAPITULO III
“IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS
MICROBIOLÓGICAS EN PRODUCTOS
DESTINADOS AL CONSUMO HUMANO
Y ANIMAL.”
3.1 OBJETIVO
3.1.2 Objetivo general
Implementar técnicas microbiológicas, para establecer el método de detección y
enumeración de listeria monocytogenes, en los productos hidrobiologicos, de origen nacional
o importado que se comercialicen en el país o sean exportados
3.1.3 Objetivos específicos
• Realización de unas nuevas técnicas para la detección de Listeria Monocytogenes. • Implementar Técnica de Detección de Listeria Monocytogenes por NCh
2657Of2001. • Implementar Técnica de Detección y Enumeración de Listeria monocytogenes por
NCh 2657/2-2007 ISO 11290-2:1998
3.2 METODOLOGÍA
Revisión bibliografica: Antes de comenzar la implementación de cada método, se
reviso la bibliografía a utilizar, principalmente las normas: NCh 2657/2-2007 ISO 11290-
2:1998 y NCh 2657. Of. 2001, además de libros, tesis, páginas en Internet, entre otros.
Revisión de equipos, insumos y materiales: Corresponde a la revisión detalladamente
de los equipos e insumos y materiales para desarrollar las técnicas, si corresponden a los
exigidos en las normas.
Cotizaciones de insumos: Se realizaron distintas cotizaciones a los proveedores de la
empresa, donde fueron revisadas y comparadas para confirmar que los productos ofrecidos son
los requeridos por las normas.
Preparación de equipos, insumos y materiales: Los equipos, en el caso de las estufas
y refrigeradores, se revisaron que la temperatura fuera la requerida.
El material de vidrio donde se preparo los medios se esterilizó con calor húmedo (autoclave) a
121º C durante 15 minutos.
Los medios de Cultivos y reactivos se prepararon según lo especificado por la norma. Se
esterilizo según sus especificaciones, ya sea por calor húmedo a una temperatura y tiempo
determinado o mediante filtración por membrana.
Elaboración de los procedimientos técnicos microbiológicos: Cada procedimiento se
elaboro de acuerdo a los estándares de la empresa para así permitir una correcta realización de
la técnica.
El procedimiento consta de:
• Objetivo
• Alcance y Campo de aplicación
• Responsabilidades
• Referencias
• Principio o fundamento
• Definiciones
• Aparato y Equipo
• Reactivos
• Procedimiento o descripción de la actividad
• Expresión de resultado s
• Interferencias
• Informe
• Bibliografía
• Diagrama de flujo
• Anexos.
•
Además del nombre de la empresa, nombre del procedimiento, la abreviatura, numero de
procedimiento, control y el número de páginas.
Un vez terminado el procedimiento debe ser revisado por el jefe de laboratorio y
autorizado por el jefe de servicios de laboratorio.
3.3 DESARROLLO DE LAS TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS
3.3.1 Muestras analizadas
Para los análisis realizados se considero un total de 15 muestras al azar, de distintos
alimentos, en cual se trabajo en paralelo con ambas técnicas, Además 5 muestras fueron
inoculadas con cepa de Listeria Monocytogenes.
Se analizaron 15 muestras:
Numero Muestra
256.117 Chorito Cocido Congelado
257.484 Queso Fresco
258.268 Espinaca Cruda
258.269 Espinaca Cruda
258.609 Reineta
258.611 Reineta
258.612 Reineta
258.613 Reineta
258.615 Reineta
258.618 Reineta
259.396 Pollo
259.397 Pollo
259.400 Pollo
260.216 Pate de queso
260.217 Pate de queso
CAPITULO IV “DETECCIÓN DE LISTERIA
MONOCYTOGENES
NCh 2657 Of. 2001”
4.1 MATERIALES
4.1.1 Aparatos y equipos
• Autoclave • Horno de esterilización
• Balanza, de 0,1 g de resolución
• Estufa incubación 20 + 1º C (opcional)
• Estufa incubación 25 + 1º C (opcional)
• Estufa incubación 37 + 1º C
• Baño termorregulador 44° C Y 47° C
• Asas de inoculación
• Diseminadores (rastrillos) plásticos o vidrio, estériles
• Peachímetro de + 0,1 unidad pH a 25 º C
• Tubos de ensayo o frascos
• Pipetas graduadas de vaciado total, 0,1ml, 1ml, 5ml y 10 ml
• Placas Petri
• Frascos Schott, 500 ml, tapa rosca, estériles
• Tubos de ensayo 16 mm x 160 mm
• Propipetas
• Portaobjetos y cubreobjetos de vidrio
• Microscopio
• Gabinete Microbiológico
• Sistema de anaerobiosis
4.2 REACTIVOS
• Caldo de Enriquecimiento (EB) • Agar Oxford
• Agar PALCAM
• Agar TSAYE
• Caldo TSBYE
• Agar Motilidad
• Caldo Ramnosa
• Caldo Xilosa
• Tinción Gram.
• Peróxido de hidrógeno
• Agar Sangre de Cordero • Medio CAMP y cepas de prueba
4.3 DESARROLLO DEL ANÁLISIS
4.3.1 Requisitos generales Debe cumplir con las condiciones y precauciones establecidas en NCh 2047.
4.3.2 Homogeneización de la muestra El método para la detección de Listeria monocytogenes requiere del tratamiento previo
de la muestra, para liberar en el medio fluido los microorganismo que pueden estar
aprisionados en el interior o adheridos en las superficies secas o gelatinosas del alimento.
El proceso a utilizar es la homogenización de la muestra.
• Se tomaron asépticamente 25g de cada muestra en una bolsa de stomacher estéril.
• Posteriormente se añaden 225 ml de caldo de enriquecimiento (EB) sin agentes
selectivos a la bolsa.
• Se contaminaron algunas muestras al azar con inoculo de cepa de Listeria
monocytogenes.
• Homogenizar.
4.3.3 Incubación y aislamiento
• Incubar los frascos por 4 h a 30 º C + 1 º C
• Se le añaden los agentes selectivos y continuar la incubación otras 44 h, hasta un total
de dos días a 30 º C + 1 º C.
• A continuación se inocularon, por siembra en superficie, dos placas con Agar Oxford y
Agar PALCAM, medios selectivo.
• Examinar las placas después de incubar 24 h y por un tiempo adicional de 18 h a 24 h mas
(si el crecimiento es escaso y no se observan colonias después de 24 h de incubación),
para la presencia de colonias presuntamente de Listeria ssp.
• Agar Oxford: las colonias típicas de Listeria spp. Después de incubar 24 h son
pequeñas (1 mm), grisáceas y rodeadas de halos negros (ver foto 1). Después de 48 h de
incubación, estás se tornan más oscuras, con un posible brillo verdoso, de un diámetro de
2 mm aproximadamente, con halos negros y centros hundidos.
FOTO 1 Agar Oxford, colonias de Listeria spp.
• Agar PALCAM: las placas que han sido incubadas microaróbicamente se deben exponer
al aire durante 1 h, para permitir que el medio recobre su color rosado a púrpura. Después
de incubar por 24 h, Listeria spp. crece formando colonias muy pequeñas o pequeñas (1,5
mm a 2 mm de diámetro) de color verde grisáceo o verde oliva, a veces con centros
negros, pero siempre con halos negros.(ver foto 2)
Después de 48 h de incubación, Listeria spp. forma colonias de 1.5 mm a 2 mm de
diámetro, con una descripción central y rodeadas de halos negros.
FOTO 2 Agar PALCAM, colonias de Listeria spp.
4.3.4 Confirmación de Listeria spp • Al dar positiva cada placa se saca de cada medio selectivo, cinco colonias que sean
sospechosas de ser Listeria spp.Si en una de las placas hay menos de cinco colonias
sospechosas, se deben confirmar todas
• Sembrar las colonias seleccionadas, sobre la superficie de placas de TSAYE, de tal forma
de permitir el desarrollo de colonias separadas unas de otras. Incubar las placas a 35° C +
1°C o 37° C + 1° C por 18 h a 24 h o hasta que el crecimiento sea satisfactorio
• Observar su crecimiento después de las 24 h se confirma , en el CAPITULO VII en el
que se lleva a cabo su confirmación en paralelo
CAPITULO V “DETECCIÓN Y ENUMERACICÓN DE
LISTERIA MONOCYTOGENES
NCh 2657/2-2007
ISO 11290-2:1998”
5.1 MATERIALES
5.1.1 Aparatos y equipos
• Autoclave • Horno de esterilización
• Balanza, de 0,1 g de resolución
• Estufa incubación 20 + 1º C (opcional)
• Estufa incubación 25 + 1º C (opcional)
• Estufa incubación 37 + 1º C
• Baño termorregulador 44° C Y 47° C
• Asas de inoculación
• Diseminadores (rastrillos) plásticos o vidrio, estériles
• Peachímetro de + 0,1 unidad pH a 25 º C • Tubos de ensayo o frascos
• Pipetas graduadas de vaciado total, 0,1ml, 1ml, 5ml y 10 ml
• Placas Petri
• Frascos Schott, 500 ml, tapa rosca, estériles
• Tubos de ensayo 16 mm x 160 mm
• Propipetas
• Portaobjetos y cubreobjetos de vidrio
• Microscopio
• Gabinete Microbiológico
• Sistema de anaerobiosis
5.2 REACTIVOS
• Caldo medio base Half -Fraser • Agar Aloa
• Agar TSAYE
• Caldo TSBYE
• Agar Motilidad
• Caldo Ramnosa
• Caldo Xilosa
• Tinción Gram.
• Peróxido de hidrógeno
• Agar Sangre de Cordero
• Medio CAMP y cepas de prueba
5.3 DESARROLLO DEL ANÁLISIS
5.3.1 Procedimiento
• Pesado los 25g de muestra se añaden los 225ml de caldo medio Half-Fraser.
• Se deja en suspensión inicial por 1 h + 5 minutos a 20 º C + 2 º C. para permitir la
resucitación de los microorganismos estresado.
5.3.2 Inoculación e incubación
• Una vez transcurrido la 1h, se transfiere en duplicado por medio de una pipeta estéril,
0,1 ml de la suspensión inicial, a placas de agar Aloa
• Invertir la s placas preparadas e incubarlas a 37° C + 1 ° C.
5.3.3 Enumeración de colonias características.
• Examinar las placas después de haberlas incubados por 24 h y por un tiempo adicional de
de 18 h a 24 h mas consideramos como listeria monocytogenes las colonias verde – azul
rodeadas por un halo opaco (colonia típica).
FOTO 3 Agar Aloa , con colonias positivas .
• Contar todas las colonias presuntivas características y no características de Listeria ssp.
en todas las placas que contengas no mas de 150 colonias.
• Las colonias presuntivas se transfiere a agar TSAYE, se incuba las placas a 37° C + 1 °
C por 18 h a 24 h hasta que el crecimiento sea satisfactorio.
• Las colonias típicas desarrolladas son de 1 mm a 2 mm de diámetro, convexas, incoloras
y opacas con un borde liso.
• Su confirmación se describe en el CAPITULO VI
CAPITULO VI
“CONFIRMACIÓN EN PARALELO DE
DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE
LISTERIA MONOCYTOGENES”
6.1 CONFIRMACION DE LISTERIA SPP
En la etapa de confirmación se llevo en paralelo con ambas normas debido a que sus
análisis requeridos son los mismos.
6.1.1. Confirmación de Listeria ssp
• Una vez las colonias desarrolladas , en el agar TSAYE se realizan pruebas
confirmativas de colonias presuntivas de Listeria spp :
6.1.2. Reacción de Catalasa
• Se toma una colonia típica aislada de agar TSAYE, con un asa y se suspende en un porta
objeto de vidrio limpio, se le agrega una gota de peróxido de hidrógeno AL 3%, en cual
en ambas pruebas tuvo presencia de burbujas, entonces la prueba son positivas.(ver foto
6-1)
FOTO 6-1 Reacción de Catalasa Positiva.
6.1.3 Tinción Gram.
• La tinción se hace con cultivos de 18 a 24 h
• Hacer un frotis de la muestra y fijar en un portaobjetos de una colonia típica de agar
TSAYE.
• Agregar una gota de cristal violeta durante un minuto. Lavar con agua.
• Agregar una gota de solución de yodo (lugol) por un minuto. Lavar con agua
• Aplicar un agente decolorante (alcohol-acetona o alcohol) durante 30 segundos y se
vuelve a lavar con agua.
• Agregar una gota de safranina por 30 segundos y lavar con agua.
• Seca al aire, después y examinar al microscopio con objeto de inmersión. Las colonias
Gram (+) conservan el colorante cristal violeta, por lo tanto aparecen de color violeta
oscuro. El genero Listeria es Gram (+)(ver foto 6-2)
FOTO 6-2 Tinción Gram. , puede adoptar un aspecto cocoide o diplococoide.
6.1.4. Prueba de Movilidad
• Se inocular una colonia aislada y suspender en un tubo que contenga TSBYE.
• Incubar a 25° C + 1° C por 8 h a 24 h hasta que se observe turbidez en el medio.
• Depositar en un portaobjeto de vidrio limpio, una gota del cultivo obtenida con un asa.
• Poner un cubre objeto sobre la gota y examinar al microscopio. La bacteria Listeria spp.
se observa como bastones delgados y cortos que se desplazan dando tumbos. Los cultivos
que son crecidos a temperaturas mayores a 25° C pueden no presentar este tipo de
motilidad. Siempre es recomendable comparar con un cultivo de una cepa conocida. Los
cocos, bastones largos y bastones que presentan movimientos natatorios rápidos, no son
Listeria ssp.
FOTO 6-3 Movilidad en TSBYE.
• También se puede usar un test alternativo para observar la motilidad, mediante la
inoculación con una aguja en profundidad de un Agar Motilidad a partir de una colonia
típica tomada de TSAYE. Incubar a 25° C + 1° C por 48 h.
• Examinar el crecimiento alrededor de la picadura. Listeria ssp. es móvil, y da un patrón
de desarrollo típico en forma de paraguas (ver foto 6-4). Si el crecimiento no es suficiente,
incubar por un tiempo adicional de cinco días y observar la picadura nuevamente.
FOTO 6-4 Prueba Motilidad, en forma de paraguas.
6.2 CONFIRMACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES
6.2.1 Prueba de hemólisis
• Tomar una colonia aislada con una aguja de inoculación y hacer una punción en el agar,
usando un espacio diferente para cada cultivo sembrado. Simultáneamente se sembró un
control positivo y negativo.
Control (+): Listeria monocytogenes.
Control (- ): Listeria innocua.
• Después de incubar a 35° C a 35° C + 1° C por 24 h +
2 h, se examinaron los cultivos en
estudio y los controles.
• La listeria monocytogenes se desarrolla con zonas delgadas y claras, Listeria innocua no
presenta una zona clara alrededor de la picadura. Listeria seeligeri desarrolla una zona
débil de hemólisis. Listeria ivanovii generalmente presenta zonas de β – hemólisis
anchas y claramente delineadas.
• Examinar las placas a luz brillante para comparar las reacciones con la de los controles.
FOTO 6-5 Prueba de hemólisis, se divide en 6 espacios, en el centro se siembra un control
positivo de Listeria monocytogenes.
6.2.2 Utilización de Carbohidratos
• Inocular usando un asa, cada uno de los cuales de carbohidratos (ramnosa y xilosa) con
un cultivo proveniente de TSBYE.
• Inocular a 35° C + 1 ° C por cinco días.
• Las reacciones positivas (formación de acido) se evidencian por un color amarillo que
generalmente se desarrolla dentro de 24 h a 48 h.
FOTO 6-6 Prueba Carbohidratos.
6.2.3 Prueba CAMP
• Se siembra con una línea las cepas de Staphylococcus aureus y Rhodococcus equi
sobre Agar sangre de cordero o medio CAMP, de tal forma que los cultivos sean
paralelos y diametralmente opuesto. Se requiere para esto una cantidad mínima de
inóculo, el cual se puede obtener usando un asa de inoculación o aguja mantenida en
ángulo recto respecto al agar.
• Sembrar las cepas en estudio de igual forma que lo citado anteriormente, pero en
ángulo recto respecto a las líneas sembradas con Staphylococcus aureus y
Rhodococcus equi. Las líneas sembradas con la cepa en estudio no deben tocar los
cultivos de los microorganismos de referencia, debiendo quedar a una distancia de 1
mm a 2 mm de ellos. Se pueden sembrar varias cepas en la misma placa.
• Simultáneamente sembrar cultivos control de Listeria monocytogenes, Listeria innocua
y Listeria ivanovii. Si se usa Agar sangre de cordero, incubar las placas a 35° C + 1° C
por 18 h a 24 h. Si se usa Medio CAMP en doble capa, incubar las placas a 35° C + 1°
C por 12 h a 18 h.
• Se considera como prueba positiva el desarrollo de una zona amplia de β – hemólisis en
la intersección de las cepas en estudio con cada cultivo de Staphylococcus aureus y
Rhodococcus equi.
FOTO 6-7 Prueba CAMP (opcional)
R. equi S. aureus L. monocytogenes
L. ivanovii
L. innocua
6.3 Expresión de resultados
6.3.1 Resultados obtenidos por el método Nch2657.Of2001.
Numero Muestra Resultado
256.117 Chorito Cocido Congelado Ausencia
257.484 Queso Fresco Presencia
258.268 Espinaca Cruda Presencia
258.269 Espinaca Cruda Ausencia
258.609 Reineta Ausencia
258.611 Reineta Ausencia
258.612 Reineta Ausencia
258.613 Reineta Ausencia
258.615 Reineta Ausencia
258.618 Reineta Presencia
259.396 Pollo Ausencia
259.397 Pollo Presencia
259.400 Pollo Ausencia
260.216 Pate de queso Ausencia
260.217 Pate de queso Presencia
Nota: Cada dato obtenido del análisis se registra en su planilla (PTMA – 22)
Anexo - 1
6.3.2 Resultados obtenidos por el método NCh 2657/2-2007
ISO 11290-2:1998.
Numero Muestra Nº Colonias Resultado
256.117 Chorito Cocido Congelado 0 <1
257.484 Queso Fresco Incontable MNC
258.268 Espinaca Cruda 92 92
258.269 Espinaca Cruda 0 <1
258.609 Reineta 0 <1
258.611 Reineta 0 <1
258.612 Reineta 0 <1
258.613 Reineta 0 <1
258.615 Reineta 0 <1
258.618 Reineta 77 77
259.396 Pollo 0 <1
259.397 Pollo 25 25
259.400 Pollo 0 <1
260.216 Pate de queso 0 <1
260.217 Pate de queso Incontable MNC
MNC= Muy numeroso para contar
Nota: Cada dato obtenido del análisis se registra en su planilla (PTMA – 23)
Anexo - 1
6.3.3 Cálculos para recuento en 0,1 ml de muestra:
a = b
A b = numero de colonias típicas que cumple con los criterios de identificación
x C En que:
A = numero de colonias típicas seleccionadas para confirmación
C = numero total de colonias típicas presentes en la placa
Si las placas, no presentan desarrollo de colonias, expresar los resultados como sigue
Menor que 1
d x V
Listeria monocytognes por ml o gramo
En que: d = factor de dilución de la suspensión inicial
V= volumen de inoculo en cada placa
256.117: < = 1 10 x 0,1
=1ufc/ml 257.484: Incontable
258.268: a= 5 x 92 = 92 ufc/0,1 ml 258.269: < = 1
5 10 x 0,1
=1 ufc/ml
258.609: < = 1 =1ufc/ml 258.611: < = 1
10 x 0,1 10 x 0,1
=1 ufc/ml
258.612: < = 1 =1 ufc/ml 258.613: < = 1
10 x 0,1 10 x 0,1
=1 ufc/ml
258.615: < = 1 =1 ufc/ml 258.618: a= 5
10 x 0,1 5
x 77 = 77 ufc/0,1 ml
259.396: < = 1
10 x 0,1 5
=1 ufc/ml 259.397: a=5 x 25 = 25ufc/0,1ml
259.400: < = 1 =1 ufc/ml 260.216: < = 1
10 x 0,1 10 x 0,1
=1 ufc/ml
260.217: Incontable
CONCLUSIÓN
El en presente estudio, el género Listeria fue detectado mediante la implementación de
los siguientes métodos tradicionales, NCh 2657.Of2001 y NCh 2657/2-2007 ISO 11290-2:1998.
Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-
enriquecimientos no-selectivos, enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y
la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología
propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio.
Los resultados obtenidos en la aplicación de la detección y enumeración de Listeria
monocytognes demostraron que es posible usar cualquiera de estos dos métodos ya que poseen la
misma sensibilidad y especificidad.
La obtención de resultados son confiables, el proceso de los análisis de ambas técnicas es
largo dura aproximadamente 11 días pero te asegura su confirmación de L .monocytogenes en
alimentos, con exactitud, sensibilidad y precisión como se señalan.
Las posibles rutas de contaminación con L.monocytogenes estarían en la carencia de
higiene tanto en manufactura como procesos productivos en las fábricas y carencia de
procedimientos de higiene en alimentos, que llevarían a contaminación cruzada entre alimentos o
contaminación directa a través del hombre.
BIBLIOGRAFÍA • Datos obtenidos de la empresa GCL, Fundación Chile. como son documentos de
normas, fotos.
• Normas Chilenas:
Nch. 2657 Of. 2001 Producto hidrobiológicos – Detección de Listeria
Monocytogenes.
Nch. 2657/2-2007 ISO 11290-2:1998 Microbiología de los alimentos de consumo
humano y animal – Método horizontal para la detección y enumeración de Listeria
Monocytogenes.
Nch. 2047 .OF1999 microbiología de los alimentos de consumo humano y animal-
condiciones generales para los exámenes microbiológicos
• LISTERIA. Una aproximación práctica al microorganismo y su control en los
alimentos. Chris Bell, Alec Kyriakides. Editorial ACRIBIA S.A.- Royo,23 – 50006
Zaragoza (España).
• Microbiology manual Merck, 12th
• Microbiology manual Oxoid, 8
edición, 2006 th edición
• Memoria; Evaluación de técnicas para recuento de listeria monocytogenes. Autor:
, 1998.
Bustos Villegas , Katherine Elizabeth, Barría Espinoza, Gloria Lourdes , prof. guía,
UTFSM. Sede Talcahuano. Técnico Universitario en Control de Alimentos
• Memoria; Aplicación del método Food and Drug Administration (FDA) para
determinar Listeria monocytogenes en productos lácteos chilenos: leche y quesos.
Autor:
.
• Guía de Microbiología General,
Bannen Brüggemann, Cristel Viviana, Saavedra González, Manuel (Comisión
de tesis) prof. guía, Musalem Sabat, Cecilia corref., UTFSM. Sede Viña. Carrera de
Control de Alimentos
Paginas Web:
Adams, M. R., Moss, M. O. coaut.Frazier, W. C.,
Westhoff, D. C.
• http://www.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es/2.10.14_Listeria_monocytogenes.pdf
• http://www.seimc.org/control/revi_Bacte/listeria.htm
• http://www.fundacionchile.cl/portal/page?_pageid=233,1574272&_dad=portal&_sche
ma=PORTAL
GLOSARIO
• LISTERIA MONOCYTOGENES: Microorganismo que forman colonias típicas en
medios selectivos sólidos y que presentan las características morfológicas, fisiológicas y
bioquímicas descritas cuando las pruebas se desarrollan de acuerdo a la presente norma.
• DETECCIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES: Determinación de la presencia o
ausencia de este microorganismo, en una cantidad dada de masa o volumen de producto,
cuando las pruebas se desarrollan de acuerdo a la presente norma.
• BACTERIAS: Son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de algunos
micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 μm, por lo general) y diversas formas incluyendo
esferas, barras y hélices.
• GRAM-POSITIVAS: En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a
aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí
el nombre de "Gram-positivas" o también "grampositivas". Esta característica está
íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo
natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, las
otras son las bacterias Gram negativas.
• ENDOESPORA: Es una sustancia inactiva, resistente, no reproductiva producida por
una pequeña cantidad de bacterias de la familia de Firmicute. La función primaria de
las endosporas es sobrevivir en tiempos de tensión ambiental. Por lo tanto son
resistentes a la radiación ultravioleta y gamma, a la desecación, a lisozima, a la
temperatura, al hambre y a los desinfectantes químicos. Las endosporas se encuentran
comúnmente en el suelo y el agua donde sobreviven por periodos de tiempo largos.
• CONTENIDO G C: En genética, GC, Contenido GC o Porcentaje GC (contenido de
guanina y citosina) es una característica del genoma de un organismo o de cualquier
pedazo de ADN o ARN. G y C denotan guanina y citosina, respectivamente.
• HEMOLISIS: Es el fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o
hematíes). El eritrocito carece de núcleo y orgánulos, por lo que no puede repararse y
muere cuando se «desgasta».
• LOTE: Conjunto homogéneo de envases o unidades primarias, de peso, tipo y clase
similares, procesadas bajo condiciones semejantes, en una jornada de trabajo, las que se
identifican con una clave de producción
• MUESTRA: Unidades representativas de un lote obtenidas mediante la aplicación de un
plan de muestreo con el fin de realizar pruebas y análisis microbiológicos.
• PRODUCTOS HIDROBIOLOGICOS: Productos de las diversas especies marinas o de
aguas interiores, frescos o procesados.
• ENUMERACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES: Determinación del numero de
unidades formadoras de colonias (ufc) de Listeria monocytogenes, en una cantidad dada
de producto, cuando el ensayo se efectúa de acuerdo con esta norma.
• NOCOSOMIAL: Se refiere a una afección o enfermedad iatrogénica debida o
contraída durante la hospitalización del enfermo si esta aparece después de las 48 horas
de la admisión o durante los 30 días después de darle el alta.
ANEXOS
PLANILLA DE RESULTADO DE DETECCIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES MÉTODO NCH 2657 OF. 2001 (PTMA -22) Nº de Muestra: 256.117
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: - 48h: -
PALCAM 24h:- 48h:-
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia Nº de Muestra: 257.484
Caldo (EB) Caldo (EB)
Oxford 24h: Presencia leve
48h:+ PALCAM 24h: Presencia leve
48h: +
Catalasa + + + + + Morfología (+) (+) (+) (+) (+) Movilidad TSBYE Agar motilidad
(+) (+) (+) (+) + + + + + +
Hemolisis + + + + + Producción Xilosa De Acido Ramnosa
- - - - - + + + + +
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
+ + + + + - - - - -
RESULTADO Presencia Nº de Muestra: 258.268
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: - 48h: + PALCAM 24h:
Presencia leve 48h: +
Catalasa + + + + Morfología + + + + Movilidad TSBYE Agar motilidad
+ + + (+) + + + +
Hemolisis + + + + Producción Xilosa De Acido Ramnosa
- - - - + + + +
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
+ + + + - - - -
RESULTADO Presencia
Nº de Muestra: 258.269
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: - 48h: - PALCAM 24h: - 48h: -
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia Nº de Muestra: 258.609
Caldo (EB) Caldo (EB)
Oxford 24h: -
48h: - PALCAM 24h: - 48h: -
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia Nº de Muestra: 258.611
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: - 48h: - PALCAM 24h: - 48h: -
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia
Nº de Muestra: 258.612
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: - 48h: - PALCAM 24h: - 48h: -
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia Nº de Muestra: 258.613
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h:- 48h:- PALCAM 24h:- 48h:-
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia Nº de Muestra: 258.615
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h:- 48h:- PALCAM 24h:- 48h: -
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia
Nº de Muestra: 258.618
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: + 48h: PALCAM 24h: + 48h:
Catalasa + + + + + + + + Morfología + + + + + + + + Movilidad TSBYE Agar motilidad
(+) (+) (+) + + + + + + + + + + + + +
Hemolisis + + + + + + + + Producción Xilosa De Acido Ramnosa
- - - - - - - - + + + + + + + +
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
+ + + + + + + + - - - - - - - -
RESULTADO Presencia Nº de Muestra: 259.396
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: - 48h: - PALCAM 24h:- 48h: -
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia Nº de Muestra: 259.397
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: + 48h: PALCAM 24h:+ 48h:
Catalasa + + + + + + - + Morfología + + + + + + + + Movilidad TSBYE Agar motilidad
+ + + + + + + + + + + + + + + +
Hemolisis + + - - + + + + Producción Xilosa De Acido Ramnosa
- - - - - - - - + + + + + + + +
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
+ + + + + + + + - - - - - - - -
RESULTADO Presencia
Nº de Muestra: 259.400
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: - 48h: - PALCAM 24h: - 48h: -
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia
Nº de Muestra: 260.216
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: - 48h:- PALCAM 24h:- 48h: -
Catalasa Morfología Movilidad TSBYE Agar motilidad
Hemolisis Producción Xilosa De Acido Ramnosa
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
RESULTADO Ausencia Nº de Muestra: 260.217
Caldo (EB) Caldo (EB) Oxford 24h: Presencia leve
48h: + PALCAM 24h: Presencia leve
48h: +
Catalasa + + + + + + + + + + Morfología + + + + + + + + + + Movilidad TSBYE Agar motilidad
+ (+) (+) (+) (+) + + + + + + + + + + + + + + +
Hemolisis + + + + + + + + + + Producción Xilosa De Acido Ramnosa
- - - - - - - - - - + + + + + + + + + +
Prueba de S.aureus CAMP R.equi
+ + + + + + + + + +
- - - - - - - - - -
RESULTADO Presencia
- V : Reacción variable - (+) : Reacción débil - + : > 90% de reacciones positivas - - : Sin reacción - N/A : No Aplicable
PLANILLA DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGNES MÉTODO NCH 2657/2-2007 ISO 11290-2:1998 (PTMA -23)
- V : Reacción variable - (+) : Reacción débil - + : > 90% de reacciones positivas - - : Sin reacción - N/A : No Aplicable
Nª -1 Resultado Catalasa Tinción motilidad Hemólisis Carbohidrato Prueba CAMP Resultado Muestra 0.1 presuntivo TSBYE motilidad ramnosa xilosa S.aureus R.equi 256.117 0 0 - - - - - - - - - <1 257.484 Incontable MNC - - - - - - - - - MNC 258.268 92 92 + + + + + + - + - 92 258.269 0 0 - - - - - - - - - <1 258.609 0 0 - - - - - - - - - <1 258.611 0 0 - - - - - - - - - <1 258.612 0 0 - - - - - - - - - <1 258.613 0 0 - - - - - - - - - <1 258.615 0 0 - - - - - - - - - <1 258.618 77 77 + + + + + + - + - 77 259.396 0 0 - - - - - - - - - <1 259.397 25 25 + + + + + + - + - 25 259.400 0 0 - - - - - - - - - <1 260.216 0 0 - - - - - - - - - <1 260.217 Incontable MNC - - - - - - - - - MNC
ANEXO2
DETECCIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES
1.- Objetivo
Detección de Listeria Monocytogenes.
2.- Alcance y campo de aplicación
Esta metodología es aplicable a productos destinados a consumo humano y animal.
3.- Responsabilidades
3.1 Es responsabilidad del analista la correcta aplicación de este procedimiento.
3.2 Es responsabilidad del jefe del laboratorio supervisar la correcta aplicación de
este procedimiento.
3.3 Es responsabilidad del Jefe de los Servicios de Laboratorio verificar la correcta
aplicación de este Procedimiento.
4.- Referencias
NCh 2657.Of2001. Productos hidrobiológicos – Detección de Listeria monocytogenes.
5.- Principio o fundamento
El método se basa en la preparación de una suspensión inicial en la dilución descrita, se
incuba la muestra por 4 h a 30º C + 1º C, se le añaden los agentes selectivos y se continua
su incubación otras 44 h, hasta un total de dos días a 30º C + 1º C, a las 24 h y 48 h se
transfiere una porción de cultivo y sembrar por agotamiento en placas con agares
selectivos sólidos. Incubación de las placas a PALCAM 35º C + 1º C y Oxford 30ºC+ 1º
C y examinación después de 24 y 48 horas.
Confirmación de las colonias presuntivas de Listeria monocytogenes con el ensayo
descrito finalmente.
6.- Definiciones
6.1 Listeria Monocytogenes: microorganismo que forman colonias típicas en medios
selectivos sólidos y que presentan las características morfológicas, fisiológicas y
bioquímicas descritas cuando las pruebas se desarrollan de acuerdo a la presente
norma.
6.2 Detección de Listeria monocytogenes: determinación de la presencia o ausencia de
este microorganismo, en una cantidad dada de masa o volumen de producto, cuando
las pruebas se desarrollan de acuerdo a la presente norma.
6.3 Lote: conjunto homogéneo de envases o unidades primarias, de peso, tipo y clase
similares, procesadas bajo condiciones semejantes, en una jornada de trabajo, las que
se identifican con una clave de producción
6.4 Muestra: unidades representativas de un lote obtenidas mediante la aplicación de un
plan de muestreo con el fin de realizar pruebas y análisis microbiológicos.
6.5 Productos hidrobiologicos: productos de las diversas especies marinas o de aguas
interiores, frescos o procesados.
7.- Aparatos y equipos
7.1 Autoclave
7.2 Horno de esterilización
7.3 Balanza, de 0,1 g de resolución
7.4 Estufa incubación 20 + 1º C (opcional)
7.5 Estufa incubación 25 + 1º C (opcional)
7.6 Estufa incubación 37 + 1º C
7.7 Baño termorregulador 44° C Y 47° C
7.8 Asas de inoculación
7.9 Diseminadores (rastrillos) plásticos o vidrio, estériles
7.10 Peachímetro de + 0,1 unidad pH a 25 º C
7.11 Tubos de ensayo o frascos
7.12 Pipetas graduadas de vaciado total, 0,1ml, 1ml, 5ml y 10 ml
7.13 Placas Petri
7.14 Frascos Schott, 500 ml, tapa rosca, estériles
7.15 Tubos de ensayo 16 mm x 160 mm
7.16 Propipetas
7.17 Portaobjetos y cubreobjetos de vidrio
7.18 Microscopio
7.19 Gabinete Microbiológico
7.20 Sistema de anaerobiosis
8.- Medios de cultivo y reactivos
8.1 Caldo EB
Marca : Merck
Gramo/Litro : 48
Preparación : Suspender 48g en un litro de agua desionizada, distribuir en
recipientes mas pequeños si lo desea, autoclavar 15 min. 121 º C pH final 7,2 +
0,2.
Después de haber incubado por 4h a 30º C la muestra, agregar 0,5 ml de
suplemento en forma aséptica.
8.2 Caldo Agar Oxford
Marca : Merck
Gramos/Litro : 58,5
Preparación :
Disolver 29,25 de agar Oxford en 500 ml de agua desmineralizada,
calentar a baño maria por 20 min. Ajustar pH, si es necesario, de tal forma que
después de la esterilización sea 7,0 + 0,2 a 25º C.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
Enfriar a 46 º C y añadir asépticamente 5 ml de suplemento selectivo
Oxford (según instrucciones del fabricante). Dispensar el medio en placas de petri
estériles en cantidades de 15 ml aproximadamente y dejar solidificar, refrigerar a
4º C + 1 º C.
8.3 Agar PALCAM
Marca : Merck
Gramos/Litro : 71,8
Preparación :
Disolver 35,9 de agar Oxford en 500 ml de agua desmineralizada, calentar
a baño maria por 20 min. Ajustar pH, si es necesario, de tal forma que después de
la esterilización sea 7,0 + 0,2 a 25º C.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
Enfriar a 46 º C y añadir asépticamente 2 ml de suplemento selectivo
Oxford (según instrucciones del fabricante). Dispensar el medio en placas de petri
estériles en cantidades de 15 ml aproximadamente y dejar solidificar, refrigerar a
4º C + 1 º C.
8.4 Agar TSAYE
Componentes Cantidad
Agar soya 40g
Extracto de levadura 6g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver los componentes en agua mediante ebullición. Ajustar pH, si es
necesario de tal forma que después de esterilizar este sea 7.3 + 0,2 a 25 º C.
Dispensar en envases adecuados, las cantidades requeridas.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
Dispensar en cantidades de 15 ml en placas estériles y dejar solidificar. Al
utilizar tubos con 9 ml, dejar enfriar en plano inclinado.
8.5 Peroxido de Hidrogeno
Marca : Merck
Uso : Directo
8.6 Tinción Gram
Marca : Difco
Uso : Directo
8.7 Caldo TSBYE
Componentes Cantidad
Caldo soya triptona 30g
Extracto de levadura 6g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver los componentes en agua mediante ebullición. Ajustar pH, si es
necesario de tal forma que después de esterilizar este sea 7.3 + 0,2 a 25 º C.
Dispensar en envases adecuados, las cantidades requeridas.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
8.8 Agar Motilidad
Componentes Cantidad
Peptona de caseína 20g
Peptona de carne 6,1g
Agar 3,5g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver los componentes en el agua, con ayuda de ebullición.. Ajustar pH, si es
necesario de tal forma que después de esterilizar este sea 7.3 + 0,2 a 25 º C.
Dispensar en envases adecuados, las cantidades requeridas.
Dispensar el medio en tubos en cantidades cercanas a 5 ml.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
8.7 Agar Sangre de cordero
Marca : Merck
Uso : Directo
8.8 Solución Carbohidratos
Composición del medio basal
Componentes Cantidad
Proteasa peptona 10g
Extracto de carne 1g
NaCl, Cloruro de sodio 5g
Púrpura de bromocresol 0,02g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver los ingredientes, calentando si es necesario. Ajustar pH, si es necesario
de tal forma que después de esterilizar este sea 6.8 + 0,2 a 25 º C.
Dispensar en envases adecuados, las cantidades requeridas.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
Solución de carbohidratos
Componentes Cantidad
Carbohidrato 5g
(L-Ramnosa o D- Xilosa)
Agua destilada 100ml
Preparación:
Disolver separadamente cada carbohidrato en 100 ml de agua.
Esterilizar por filtración
Medio completo:
Para cada carbohidrato, añadir asépticamente 1 ml de solución de
carbohidrato a 9 ml de la base.
9.- Procedimiento para el análisis
9.1.1 El método requiere del tratamiento previo de la muestra, para liberar en el
medio fluido de los microorganismos que pueden estar aprisionados en el
interior o adherido en las superficies secas o gelatinosas del alimento.
9.1.2 Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso de licuadora o bolsa de
Stomacher estéril. Las muestras grandes se deben cortar en pequeños trozos
antes de homogeneizar.
9.1.3 Añadir 225 ml de caldo de enriquecimiento (EB) sin agentes selectivos al vaso
o bolsa.
9.1.4 Al utilizar licuadora, homogeneizar a una velocidad entre 15000 rpm y 20000
rpm por 2 min. Si se utiliza Stomacher el proceso no debe superar 1 min.
9.2 Inoculación y aislamiento
9.2.1 Traspasar las muestras homogenizadas a frascos con tapas rosca de 500 ml
dejando la tapa suelta.
9.2.2 Incubar los frascos por 4 h a 30° C + 1° C.
9.2.3 Añadir los agentes selectivos (acriflavina. acido nalidixico y cicloheximida) y
continuar
la incubación otras 44 h, hasta un total de dos días a 30 ° C +1° C.
9.2.4 A las 24 h y 48 h, transferir con un asa una porción de cultivo y sembrar por
agotamiento sobre la superficie del primer medio de cultivo selectivo (Agar
Oxford), de modo de obtener colonias separadas. Proceder del mismo modo con el
segundo medio de cultivo selectivo (Agar PALCAM).
9.2.5 Invertir las placas e incubarlas a las 35 ° C. Las placas de Agar PALCAM se
pueden incubar ya sea aeróbica o microaeróbicamente (5% a 12% CO2 , 5% a
15% O2 Y 75% N2 ) en un sistema para anaerobiosis. (Nota – Es recomendable
incubar las placas de Agar Oxford a 30° C + 1° C en el caso de alimentos que
presentan bajos niveles de contaminación de flora acompañante. Para productos
altamente contaminados con flora acompañante, es preferible incubar el Agar
Oxford a 35 ° C + 1° C o 37 ° C + 1° C, debido a que Listeria spp. tiende a
desarrollarse en forma paralela con la flora acompañante.)
9.2.6 Examinar las placas después de incubar 24 h y por un tiempo adicional de 18 h a
24 h mas (si el crecimiento es escaso y no se observan colonias después de 24 h de
incubación), para la presencia de colonias presuntamente de Listeria ssp.
9.2.6.1 Agar Oxford: las colonias típicas de Listeria spp. Después de incubar 24 h son
pequeñas (1 mm), grisáceas y rodeadas de halos negros. Después de 48 h de
incubación, estás se tornan más oscuras, con un posible brillo verdoso, de un
diámetro de 2 mm aproximadamente, con halos negros y centros hundidos.
9.2.6.2 Agar PALCAM: las placas que han sido incubadas microaróbicamente se
deben exponer al aire durante 1 h, para permitir que el medio recobre su color
rosado a púrpura. Después de incubar por 24 h, Listeria spp. crece formando
colonias muy pequeñas o pequeñas (1,5 mm a 2 mm de diámetro) de color
verde grisáceo o verde oliva, a veces con centros negros, pero siempre con
halos negros.
Después de 48 h de incubación, Listeria spp. forma colonias de 1.5 mm a 2
mm de diámetro, con una descripción central y rodeadas de halos negros.
9.3 Confirmación de Listeria spp.
9.3.1 Selección de las colonias a confirmar:
9.3.1.1 Para confirmar, sacar de cada placa de cada medio selectivo, cinco colonias
que sean sospechosas de ser Listeria spp.Si en una de las placas hay menos de
cinco colonias sospechosas, se deben confirmar todas.
9.3.1.2 Sembrar por aislamiento las colonias seleccionadas, sobre la superficie de
placas secadas con anterioridad y que contienen TSAYE, de tal forma de
permitir el desarrollo de colonias separadas unas de otras. Incubar las placas a
35° C + 1°C o 37° C + 1° C por 18 h a 24 h o hasta que el crecimiento sea
satisfactorio. Las colonias típicas desarrolladas son de 1 mm a 2 mm de
diámetro, convexas, incoloras y opacas con un borde liso. Si las colonias no
están bien separadas, traspasar una colonia típica para Listeria spp. y
sembrarla en otra placa de TSAYE. A partir de las colonias aisladas, repicar
en tubos de agar TSAYE para la mantención del cultivo.
9.3.2 Reacción de catalasa.
9.3.2.1 Tomar una colonia típica aislada de agar TSAYE, con asa y suspenderla sobre
un portaobjeto de vidrio limpio, agregar una gota de peróxido de hidrogeno
(H2 O2) AL 3%. Si existe presencia de burbujas por degradación de H2O2 en
H2 + 02, entonces la prueba es catalasa positiva. Todas las especies de Listeria
son catalasa positiva.
9.3.3 Tinción Gram: la tinción se hace con cultivos de 18 a 24 h
9.3.3.1 Hacer un frotis de la muestra y fijar en un portaobjetos de una colonia típica
de agar TSAYE.
9.3.3.2 Agregar una gota de cristal violeta durante un minuto. Lavar con agua.
9.3.3.3 Agregar una gota de solución de yodo (lugol) por un minuto. Lavar con agua
9.3.3.4 Aplicar un agente decolorante (alcohol-acetona o alcohol) durante 30
segundos y se vuelve a lavar con agua.
9.3.3.5 Agregar una gota de safranina por 30 segundos y lavar con agua.
9.3.3.6 Seca al aire, después y examinar al microscopio con objeto de inmersión. Las
colonias Gram (+) conservan el colorante cristal violeta, por lo tanto aparecen
de color violeta oscuro. El genero Listeria es Gram (+)
9.3.4 Prueba de Movilidad
9.3.4.1 Inocular una colonia aislada y suspenderla en un tubo que contenga TSBYE.
Incubar a 25° C + 1° C por 8 h a 24 h hasta que se observe turbidez en el
medio. Depositar en un portaobjeto de vidrio limpio, una gota del cultivo
obtenida con un asa. Poner un cubreobjeto sobre la gota y examinar al
microscopio. La bacteria Listeria spp. se observa como bastones delgados y
cortos que se desplazan dando tumbos. Los cultivos que son crecidos a
temperaturas mayores a 25° C pueden no presentar este tipo de motilidad.
Siempre es recomendable comparar con un cultivo de una cepa conocida. Los
cocos, bastones largos y bastones que presentan movimientos natatorios
rápidos, no son Listeria ssp.
9.3.4.2 Se puede usar un test alternativo para observar la motilidad, mediante la
inoculación con una aguja en profundidad de un Agar Motilidad a partir de
una colonia típica tomada de TSAYE. Incubar a 25° C + 1° C por 48 h.
Examinar el crecimiento alrededor de la picadura. Listeria ssp. es móvil, y da
un patrón de desarrollo típico en forma de paraguas. Si el crecimiento no es
suficiente, incubar por un tiempo adicional de cinco días y observar la
picadura nuevamente.
9.4 Confirmación de Listeria monocytogenes
9.4.1Prueba de hemólisis.
9.4.1.1 Secar bien la superficie del agar antes de usar. Tomar una colonia aislada con
una aguja de inoculación y hacer una punción en el agar, usando un espacio
diferente para cada cultivo sembrado. Simultáneamente sembrar un control
positivo y negativo.
Control (+): Listeria monocytogenes.
Control (- ): Listeria innocua.
9.4.1.2 Después de incubar a 35° C a 35° C + 1° C por 24 h +
2 h, examinar los
cultivos en estudio y los controles.
Listeria monocytogenes desarrolla zonas delgadas y claras, Listeria innocua no
presenta una zona clara alrededor de la picadura. Listeria seeligeri desarrolla una
zona débil de hemólisis. Listeria ivanovii generalmente presenta zonas de β –
hemólisis anchas y claramente delineadas.
9.4.1.3 Examinar las placas a luz brillante para comparar las reacciones con la de
los controles.
9.4.2Utilizacion de carbohidratos.
9.4.2.1 Inocular usando un asa, cada uno de los cuales de carbohidratos (ramnosa y
xilosa) con un cultivo proveniente de TSBYE. Inocular a 35° C + 1 ° C por
cinco días. Las reacciones positivas (formación de acido) se evidencian por
un color amarillo que generalmente se desarrolla dentro de 24 h a 48 h.
9.4.3Prueba de CAMP.
9.4.3.1 Sembrar con una línea las cepas de Staphylococcus aureus y Rhodococcus
equi sobre Agar sangre de cordero o medio CAMP, de tal forma que los
cultivos sean paralelos y diametralmente opuesto. Se requiere para esto una
cantidad mínima de inóculo, el cual se puede obtener usando un asa de
inoculación o aguja mantenida en ángulo recto respecto al agar.
9.4.3.2 Sembrar las cepas en estudio de igual forma que lo citado anteriormente,
pero en ángulo recto respecto a las líneas sembradas con Staphylococcus
aureus y Rhodococcus equi. Las líneas sembradas con la cepa en estudio
no deben tocar los cultivos de los microorganismos de referencia, debiendo
quedar a una distancia de 1 mm a 2 mm de ellos. Se pueden sembrar varias
cepas en la misma placa.
9.4.3.3 Simultáneamente sembrar cultivos control de Listeria monocytogenes,
Listeria innocua y Listeria ivanovii. Si se usa Agar sangre de cordero,
incubar las placas a 35° C + 1° C por 18 h a 24 h. Si se usa Medio CAMP
en doble capa, incubar las placas a 35° C + 1° C por 12 h a 18 h.
9.4.3.4 Se considera como prueba positiva el desarrollo de una zona amplia de β –
hemólisis en la intersección de las cepas en estudio con cada cultivo de
Staphylococcus aureus y Rhodococcus equi.
La reacción positiva con Rhodococcus equi se observa como una hemólisis en
forma de punta de flecha de 5 mm a 10 mm. La reacción es considerada como
negativa cuando se observa una pequeña zona de hemólisis débil que se extiende
solamente por 1 mm en la intersección de la cepa en estudio con la zona de difusión
del cultivo de Rhodococcus equi
Una reacción positiva con Staphylococcus aureus aparece como una pequeña zona
de hemólisis marcada, que se extiende por 2 mm en el área en que fue sembrada la
cepa en estudio y dentro de la zona de hemólisis débil debida al crecimiento del
cultivo de Staphylococcus aureus. Zonas de hemólisis de gran tamaño no se
presentan en el área de Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes.
Porción de muestra (x g)
Caldo del enriquecimiento (EB) sin suplemento
Incubar a 30 º C por 4 h
A las 24 h y 48 h aislar en placas
Agar Oxford
Agar PALCAM
Confirmación
10.- Diagrama de flujo
Diagrama del procedimiento
DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES POR
MÉTODO HORIZONTAL
1.- Objetivo
Detección y enumeración de Listeria Monocytogenes por método horizontal.
2.- Alcance y campo de aplicación
Esta metodología es aplicable a productos destinados a consumo humano y animal.
3.- Responsabilidades
3.1 Es responsabilidad del analista la correcta aplicación de este procedimiento.
3.2 Es responsabilidad del jefe del laboratorio supervisar la correcta aplicación de
este procedimiento.
3.3 Es responsabilidad del Jefe de los Servicios de Laboratorio verificar la correcta
aplicación de este Procedimiento.
4.- Referencias
Norma ISO 11290-2:1998. Microbiología de los alimentos. de consume humano y
animal - Método horizontal para la detección y enumeración de Listeria
Monocytogenes - Parte 2: Método enumeración.
5.- Principio o fundamento
El método se basa en la preparación de una suspensión inicial en una de las dos
diluciones descritas o en el caso de muestras liquidas con sospechas de estresados
microorganismos, si es necesario. Resucitar por 1 h + 5 min. a 20° C, inoculación en la
superficie de una placa con agares selectivos sólidos. Incubación de las placas a 35° C ó
37 ° C y examinación después de 24 y 48 horas.
Confirmación de las colonias presuntivas de Listeria monocytogenes con el ensayo
descrito finalmente el calculo del numero de Listeria monocytogenes confirmado por
gramo o ml de la muestra ensayada
6.- Definiciones
6.1 Listeria Monocytogenes: microorganismo que forman colonias típicas en medios
selectivos sólidos y que presentan las características morfológicas, fisiológicas y
bioquímicas descritas cuando las pruebas se desarrollan de acuerdo a la presente norma.
6.2 Enumeración de Listeria monocytogenes: determinación del numero de unidades
formadoras de colonias (ufc) de Listeria monocytogenes, en una cantidad dada de
producto, cuando el ensayo se efectúa de acuerdo con esta norma.
7.- Aparatos y equipos
7.1 Autoclave
7.2 Horno de esterilización
7.3 Balanza, de 0,1 g de resolución
7.4 Estufa incubación 20 + 1º C (opcional)
7.5 Estufa incubación 25 + 1º C (opcional)
7.6 Estufa incubación 37 + 1º C
7.7 Baño termorregulador 44° C Y 47° C
7.8 Asas de inoculación
7.9 Diseminadores (rastrillos) plásticos o vidrio, estériles
7.10 Peachímetro de + 0,1 unidad pH a 25 º C
7.11 Tubos de ensayo o frascos
7.12 Pipetas graduadas de vaciado total, 0,1ml, 1ml, 5ml y 10 ml
7.13 Placas Petri
7.14 Frascos Schott, 500 ml, tapa rosca, estériles
7.15 Tubos de ensayo 16 mm x 160 mm
7.16 Propipetas
7.17 Portaobjetos y cubreobjetos de vidrio
7.18 Microscopio
7.19 Gabinete Microbiológico
7.20 Sistema de anaerobiosis
8.- Medios de cultivo y reactivos
8.1 Caldo Half - Fraser
Marca : Biomerieux
Uso : Directo
8.2 Agar Aloa
Marca : Pvequip (AES)
Uso : Directo
8.3 Agar TSAYE
Componentes Cantidad
Agar soya 40g
Extracto de levadura 6g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver los componentes en agua mediante ebullición. Ajustar pH, si es
necesario de tal forma que después de esterilizar este sea 7.3 + 0,2 a 25 º C.
Dispensar en envases adecuados, las cantidades requeridas.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
Dispensar en cantidades de 15 ml en placas estériles y dejar solidificar.
Al utilizar tubos con 9 ml, dejar enfriar en plano inclinado
8.4 Peroxido de Hidrogeno
Marca : Merck
Uso : Directo
8.5 Tinción Gram
Marca : Difco
Uso : Directo
8.6 Caldo TSBYE
Componentes Cantidad
Caldo soya triptona 30g
Extracto de levadura 6g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver los componentes en agua mediante ebullición. Ajustar pH, si es
necesario de tal forma que después de esterilizar este sea 7.3 + 0,2 a 25 º C.
Dispensar en envases adecuados, las cantidades requeridas.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
8.7 Agar Motilidad
Componentes Cantidad
Peptona de caseína 20g
Peptona de carne 6,1g
Agar 3,5g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver los componentes en el agua, con ayuda de ebullición.. Ajustar pH, si es
necesario de tal forma que después de esterilizar este sea 7.3 + 0,2 a 25 º C.
Dispensar en envases adecuados, las cantidades requeridas.
Dispensar el medio en tubos en cantidades cercanas a 5 ml.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
8.8 Agar Sangre de cordero
Marca : Merck
Uso : Directo
8.9 Solución Carbohidratos
Composición del medio basal
Componentes Cantidad
Proteasa peptona 10g
Extracto de carne 1g
NaCl, Cloruro de sodio 5g
Púrpura de bromocresol 0,02g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver los ingredientes, calentando si es necesario. Ajustar pH, si es
necesario de tal forma que después de esterilizar este sea 6.8 + 0,2 a 25 º C.
Dispensar en envases adecuados, las cantidades requeridas.
Esterilizar en autoclave a 121 º C por 15 min.
Solución de carbohidratos
Componentes Cantidad
Carbohidrato 5g
(L-Ramnosa o D- Xilosa)
Agua destilada 100ml
Preparación:
Disolver separadamente cada carbohidrato en 100 ml de agua.
Esterilizar por filtración.
Medio completo:
Para cada carbohidrato, añadir asépticamente 1 ml de solución de
carbohidrato a 9 ml de la base
9.- Procedimiento para el análisis
9.1 Porción de ensayo, suspensión inicial y diluciones
9.1.1 Para preparar la suspensión inicial, usar uno de los dos diluyentes; agua
peptonada tamponada, o caldo base half-Fraser. Caldo Half –Fraser base sin
adición de agentes selectivos se puede usar como diluyente para muestras de
alimentos de consumo humano y animal cuando se aplica sobre la misma muestra
el método de detección y el método de enumeración. Este procedimiento evita la
necesidad de preparar dos suspensiones iniciales; agentes selectivos son
adicionados a la suspensión remanente después de extraer la porción de ensayo
para enumeración. El uso de este procedimiento debe ser destacado en el informe.
9.1.2 Pesar 25 g o ml de muestra en la bolsa estéril, incorporarle 225ml de caldo Half
Fraser sin suplementos selectivos. Homogenizar la muestra para obtener una
suspensión inicial. Incubar la suspensión inicial 1 + 5 min. a 20° C + 2° C
(usar una estufa de incubación, si es necesario). Si se realizan diluciones
decimales sucesivas, prepararlas después de la resucitación
9.2 Inoculación e incubación
9.2.1 Transferir en duplicado por medio de una pipeta estéril, 0,1 ml de la suspensión
Inicial, a placas con agar ALOA (ottaviani y Agosti) es necesario secar
previamente en la estufa de incubación.
Nota - Cuando para ciertos productos, si es necesario estimar un menor numero de
Listeria monocytogenes, el limite de enumeración puede ser disminuido en un
factor de 10, si se siembra 1,0 ml de la suspensión inicial. Distribuir el inoculo de
1 ml, ya sea sobre la superficie del agar en placas petri (140 mm) o sobre la
superficie del agar en tres placas pequeñas (90 mm) usando un diseminador
estéril. En ambos casos, preparar duplicado usando dos placas grandes o seis
placas pequeñas.
9.2.2 Distribuir cuidadosamente el inoculo, lo mas rápido posible sobre la superficie del
agar sin tocar los bordes de la placa con el diseminador (rastrillo). Usar un
diseminador estéril para cada placa. Dejar las placas cerradas alrededor de 15 min.
a temperatura ambiente para que el inoculo sea absorbido dentro del agar.
9.2.3 Invertir la s placas preparadas e incubarlas a 37° C + 1 ° C.
9.3 Enumeración de colonias características.
9.3.1. Examinar las placas después de incubar por 24 h y por un tiempo adicional de 18
h a 24 h mas (si el crecimiento es escaso o si no se observan colonias después de
24 h de incubación) y observar la presencia de colonias presuntamente de Listeria
spp.
9.3.2. Considerar como Listeria monocytogenes las colonias verde-azul rodeadas por un
halo opaco (colonia típica). Si después de 24 h + 3 h de incubación, el
crecimiento es leve o si no se observan colonias o si no se presentan colonias
típicas, reincubar las placas por 24 h + 3 h más.
Nota
1) Algunas cepas de Listeria monocytogenes muestran un halo muy débil (o sin halo) en
caso de estrés, en particular es producido por la alta acidez.
2) Algunas Listeria monocytogenes se caracterizan por una suave actividad PIPLC
(fosfatidil inositol fosfolipasa) Tales bacterias se detectan cuando la duración total de la
incubación es mas que cuatro días. Algunas de estas cepas pueden ser patógenas.
9.3.3. Contar todas las colonias presuntivas características y no características de
Listeria spp. en todas las placas que contengan no mas de 150 colonias.
9.4. Confirmación de Listeria spp
9.4.1. Selección de las colonias a confirmar
9.4.1.1. Después del periodo de incubación, seleccionar las placas que
contengan menos de 150 colonias presuntivas de Listeria spp. de todas las
diluciones y si es posible, de dos diluciones sucesivas. Seleccionar cinco
colonias presuntivas de cada.
Si son menos que cinco las colonias presuntivas en las placas, seleccionar
para confirmar todas las colonias presuntivas.
.
9.4.1.2 Sembrar por aislamiento las colonias seleccionadas, sobre la
superficie de placas que contienen agar soya tristona extracto de levadura
(TSAYE) secadas con anterioridad, de tal forma de permitir el desarrollo de
colonias aisladas unas de otras.
Incubar las placas a 37° C + 1 ° C por 18 h a 24 h hasta que el crecimiento
sea satisfactorio.
Las colonias típicas desarrolladas son de 1 mm a 2 mm de diámetro,
convexas, incoloras y opacas con un borde liso. Si las colonias no están bien
separadas, traspasar una colonia típica para Listeria spp. y sembrarla en otra
placa de TSAYE. A partir de las colonias aisladas, repicar en tubos de agar
TSAYE para la mantención del cultivo. Realizar las pruebas siguientes a
partir de colonias de cultivos puros de TSAYE.
9.5 Reacción de la catalasa
9.5.1 Tomar una colonia aislada de agar TSAYE y suspenderla en una gota de
solución de peroxido de hidrogeno sobre un portaobjeto de vidrio. La
formación inmediata de burbujas de gas indica una reacción positiva.
9.6 Tinción Gram: la tinción se hace con cultivos de 18 a 24 h
9.6.1 Hacer un frotis de la muestra y fijar en un portaobjetos de una colonia típica de
agar TSAYE.
9.6.2 Agregar una gota de cristal violeta durante un minuto. Lavar con agua.
9.6.3 Agregar una gota de de solución de yodo (lugol) por un minuto. Lavar con
agua
9.6.4 Aplicar un agente decolorante (alcohol-acetona o alcohol) durante 30 segundos
y se vuelve a lavar con agua.
9.6.5 Agregar una gota de safranina por 30 segundos y lavar con agua.
9.6.6 Seca al aire, después y examinar al microscopio con objeto de inmersión. La
Listeria spp. se presenta como un bastón Gram. (+) corto y delgado
(aproximadamente 0,4 um a 0,5 um de diámetro, y 1 um a 2 um de largo)
9.7 Prueba de Movilidad
9.7.1 Tomar una colonia aislada en agar TSAYE y suspenderla en un tubo que
contenga TSBYE. Incubar a 25° C + 1° C por 8 h a 24 h hasta que se observe
turbidez en el medio. Depositar en un portaobjeto de vidrio limpio, una gota
del cultivo obtenida con un asa. Poner un cubreobjeto sobre la gota y examinar
al microscopio. La bacteria Listeria spp. se observa como bastones delgados y
cortos que se desplazan dando tumbos. Los cultivos que son crecidos a
temperaturas mayores a 25° C pueden no presentar este tipo de motilidad.
Siempre es recomendable comparar con un cultivo de una cepa conocida. Los
cocos, bastones largos y bastones que presentan movimientos natatorios
rápidos, no son Listeria ssp.
9.7.2 Se puede usar un test alternativo para observar la motilidad, mediante la
inoculación con una aguja en profundidad de un Agar Motilidad a partir de una
colonia típica tomada de TSAYE. Incubar a 25° C + 1° C por 48 h. Examinar
el crecimiento alrededor de la picadura. Listeria ssp. es móvil, y da un patrón
de desarrollo típico en forma de paraguas. Si el crecimiento no es suficiente,
incubar por un tiempo adicional de cinco días y observar la picadura
nuevamente.
9.8 Confirmación de Listeria monocytogenes
9.8.1 Prueba de hemólisis
9.8.1.1. Secar bien la superficie del agar antes de usar. Tomar una colonia aislada del
agar TSAYE con una aguja de inoculación y hacer una punción en el agar,
usando un espacio diferente para cada cultivo sembrado. Simultáneamente
sembrar un control positivo y negativo.
Control (+): Listeria monocytogenes.
Control (-): Listeria innocua
9.8.1.2. Después de incubar a 37° C + 1° C por 24 h + 2 h, examinar los cultivos en
estudio y los controles. Listeria monocytogenes desarrolla zonas delgadas y
claras, Listeria innocua no presenta una zona clara alrededor de la picadura.
Listeria seeligeri desarrolla una zona débil de hemólisis. Listeria ivanovii
generalmente presenta zonas de β – hemólisis anchas y claramente
delineadas.
9.8.1.3. Examinar las placas a luz brillante para comparar las reacciones con la de los
controles.
9.8.2 Utilización de carbohidratos
9.8.2.1. Inocular usando un asa, cada uno de los cuales de carbohidratos (ramnosa y
xilosa) con un cultivo proveniente de TSBYE. Inocular a 37° C + 1 ° C por
cinco días. Las reacciones positivas (formación de acido) se evidencian por un
color amarillo que generalmente se desarrolla dentro de 24 h a 48 h.
9.8.3 Prueba de CAMP
9.8.3.1 Sembrar con una línea las cepas de Staphylococcus aureus y
Rhodococcus equi sobre Agar sangre de cordero o medio CAMP, de tal
forma que los cultivos sean paralelos y diametralmente opuesto. Se
requiere para esto una cantidad minima de inóculo, el cual se puede
obtener usando un asa de inoculación o aguja mantenida en ángulo
recto respecto al agar.
9.8.3.2 Sembrar las cepas en estudio de igual forma que lo citado
anteriormente, pero en ángulo recto respecto a las líneas sembradas con
Staphylococcus aureus y Rhodococcus equi. Las líneas sembradas con
la cepa en estudio no deben tocar los cultivos de los microorganismos
de referencia, debiendo quedar a una distancia de 1 mm a 2 mm de
ellos. Se pueden sembrar varias cepas en la misma placa.
9.8.3.3 Simultáneamente sembrar cultivos control de Listeria monocytogenes,
Listeria innocua y Listeria ivanovii. Si se usa Agar sangre de cordero,
incubar las placas a 35° C + 1° C por 18 h a 24 h. Si se usa Medio
CAMP en doble capa, incubar las placas a 35° C + 1° C por 12 h a 18h.
9.8.3.4 Se considera como prueba positiva el desarrollo de una zona amplia de β
– hemólisis en la intersección de las cepas en estudio con cada cultivo
de Staphylococcus aureus y Rhodococcus equi.
La reacción positiva con Rhodococcus equi se observa como una hemólisis en
forma de punta de flecha de 5 mm a 10 mm. La reacción es considerada como
negativa cuando se observa una pequeña zona de hemólisis débil que se extiende
solamente por 1 mm en la intersección de la cepa en estudio con la zona de difusión
del cultivo de Rhodococcus equi
Una reacción positiva con Staphylococcus aureus aparece como una pequeña zona
de hemólisis marcada, que se extiende por 2 mm en el área en que fue sembrada la
cepa en estudio y dentro de la zona de hemólisis débil debida al crecimiento del
cultivo de Staphylococcus aureus. Zonas de hemólisis de gran tamaño no se
presentan en el área de Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes.
10.- Expresión de resultados
10.1 Calculo para colonias de Listeria Monocytogenes
Calcular para cada una de las placas el numero a de colonias de Listeria Monocytogenes
presentes en 0,1 ml de muestra, usando la formula siguiente
a = b
A
x C
En que:
b = numero de colonias típicas que cumple con los criterios de identificación
A = numero de colonias típicas seleccionadas para confirmación
C = nuecero total de colonias típicas presentes en la placa
Redondear el número de colonias hasta el número entero más próximo
10.2 Las placas con más de 150 colonias se expresan MNC (muy numerosas para contar)
10.3 Las placas, no presentan desarrollo de colonias, expresar los resultados como sigue
Menor que 1
d x V
Listeria monocytognes por ml o gramo.
En que: d = factor de dilución de la suspensión inicial
V= volumen de inoculo en cada placa
Porción de muestra (x g o x ml) + Suspensión inicial (medio base half- fraser)
Resucitar por 1 h a 20 ºC
Sembrar en superficie sobre agar Listeria de acuerdo a Ottaviani y Agosti
Incubar a 37º C por 24 h a 48 h
Indentificacion y enumerar Listeria spp
Confirmación de Listeria spp. - inocular sobre agar TSYEA e incubar 37ºC - reacción de la catalasa - tinción de Gram. - prueba de movilidad (si es necesario)
11.- Diagrama de flujo
Diagrama del procedimiento
Confirmación de Listeria Monocytogenes - prueba de hemólisis - utilización de carbohidratos - prueba de CAMP
