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Infeccin de cultivos celulares por el virus de la hepatitis C Pablo Gastaminza, Madrid, 22-2-2013 Curso de Hepatologa Bsica-AEEH Identificacin de nuevas dianas y compuestos antivirales

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Introduccin: Virologa de VHC Estructura genmica Ciclo de replicacin Contenidos: Modelo de Infeccin Basado en JFH-1: Principios y componentes Rastreo de compuestos antivirales Aplicaciones Aspectos fundamentales Identificacin de nuevas dianas Conclusiones y Perspectivas

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Modelos Experimentales en Virologa Gentica reversa Factores celulares Antivirales Patognesis Immunologa Vacunas Antivirales (seguridad, eficacia) Hospedador Natural Cultivos Celulares Susceptibles Cultivo Celular Modelos animales pequeos Modelos en primates Hospedador Natural Modelos in vivo Epidemiologa Gentica viral Patognesis Immunologa

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Modelos Experimentales en VHC Gentica reversa Factores celulares Antivirales Patognesis Immunologa Vacunas Antivirales (seguridad, eficacia) Hospedador Natural Hepatocitos primarios (alta variabilidad y acceso limitado) Cultivo Celular Ratones inmunoKO quimricos Chimpancs Hospedador Natural Modelos in vivo Epidemiologa Gentica viral Patognesis Immunologa

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Ensamblaje Replicasa Virin Hepatitis C Virus (Flaviviridae)

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Replicasa Ensamblaje Virin Hepatitis C Virus (Flaviviridae)

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CLDN1 OCDN1 HCVpp Bartosch et al J Exp Med 2003 Hsu et al J Virol 2003 Ciclo de Infeccin de VHC

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CLDN1 OCDN1 REPLICONS Lohman et al. Science 1999 Blight et al. Science 2000 Ciclo de Infeccin de VHC

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2mAde Replicones para identificar inhibidores de VHC Hours post-transfection DMSO 0 0.5 1 1.5 2 2.5 5102448 Relative Luciferase Activity (LOG) Luciferase Activity Transfeccin de ARN subgenmico en clulas Huh-7 5UTR 3UTR NS3-NS5B IRES Luc Electroporation into Huh-7 cells Luciferase Activity

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CLDN1 OCDN1 HCV INFECTION CELL CULTURE MODEL (JFH-1) Wakita et al. Nature Med 2005 Lindenbach et al. Science 2005 Zhong et al. PNAS 2005 Ciclo de Infeccin de VHC

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Introduccin: Virologa de VHC Estructura genmica Ciclo de replicacin Contenidos: Modelo de Infeccin Basado en JFH-1: Principios y componentes Rastreo de compuestos antivirales Aplicaciones Aspectos fundamentales Identificacin de nuevas dianas Conclusiones y Perspectivas

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Clulas Susceptibles (Huh-7 y Derivados) Obtenidas por cultivo primario de un hepatocarcinoma bien diferenciado de un paciente japons de 57 aos (Nakabayashi et al. Cancer Research 1982) Lnea celular capaz de sostener la replicacin de replicones de VHC (Lohmann et al 1999; Blight et al. 2000) Subclones de la lnea Huh-7 (Huh-7.5) obtenidos por seleccin de clulas con mayor capacidad de replicacin de replicones de VHC. (Blight et al.2002)

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Japonese patient with Fulminant Hepatitis Construction of a consensus molecular clone (JFH-1) Sequencing of different quasispecies Clon molecular infeccioso JFH-1 (2a) Dr. Takaji Wakita

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Clon Molecular (cDNA) Transcripcin In vitro Rescate de virus infeccioso a partir de cDNA de JFH-1 ARN Genmico (desnudo) Transfeccin Virus infeccioso en cultivo y en modelos animales VIRUS RECOMBINANTE=OMG: LABORATORIO P3 !!!

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Produccin de Virus Infeccioso en Cultivo 1:10 1:100 cDNA (plsmido bacteriano) vRNA JFH-1 Transfeccin Huh-7 Huh-7.5.1 Lneas de hepatoma humano Undiluted Sobrenadante Sin diluir NS5A nucleo La infectividad se expresa como unidades formadoras de foco por mililitro (ffu/ml)

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JFH-1 RNA Transfection Huh-7 Huh-7.5.1 Infection Diluted supernatant day 3 day 8 Days post-infection Infectivity ( log ffu/ml) 1 2 3 4 5 051015 Supernatant Infectivity Propagacin de Virus Infeccioso en Cultivo

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Caractersticas Bsicas de Viriones de VHC Gastaminza et al. J Virol 2010

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Estructura 3D de Complejos de Replicacin Romero-Brey I. Plos Pathogens 2012

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Clon Molecular (cDNA) Transcripcin In vitro ARN Genmico (desnudo) Transfeccin Mutaciones en regiones del genoma viral de funcin desconocida Mutaciones que aparecen como consecuencia de tratamientos farmacolgicos. Estudios de Gentica Inversa MUTACIN FENOTIPO Crecimiento del virus Resistencia a frmacos

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Steinmann et al Plos Pathogens 2007 Gentica Inversa De La Viroporina P7

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Factores Celulares Implicados en la Infeccin por VHC Silenciamiento (RNAi) y sobreexpresin de genes celulares Inhibidores de procesos celulares conocidos Clon Molecular (cDNA) MUTACINFENOTIPO ARN Genmico (desnudo) Transfeccin Transcripcin In vitro

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Dreux M et al. PNAS 2009;106:14046-14051 AUTOFAGIA Gastaminza P. et al.J Virol. 2008 March; 82(5): 21202129. BIOGNESIS DE VLDL Factores Celulares Implicados en la Infeccin por VHC

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Visualizacin de la Infeccin en Tiempo Real Metodologa en Jones et al. Nat Prot 2010 Marcador de Infeccin Marcador Celular de Inters Realizado en la Unidad de Microscopa Confocal CNB-CSIC

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Identificacin De Nuevos Compuestos Antivirales Rastreo de colecciones de compuestos Identificar compuestos qumicos no txicos con actividad frente a VHC: Para utilizarlos como herramientas para estudios bsicos. Para identicar molculas con potencial teraputico. Gastaminza et al. PNAS 2010

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Rastreo De Colecciones De Compuestos Con Potencial Antiviral

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Gastaminza et al. PNAS 2010 Frmacos de uso clnico con actividad Antiviral

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Descubrimiento De Nuevos Compuestos Antivirales Screening de compuestos de actividad desconocida PNAS Dic 2007 CompuestoModo de accin Pptido lineal Viricida (no especfico) Chemistry and Biology 2011 Pptido cclico Entrada viral (especfico) J Virol Jun 2011 Molculas bajo Pm Iniciacin de la replicacin (especfico)

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Sistema JFH-1 de Infeccin en Cultivo Permite medir infectividad de muestras generadas en diferentes condiciones experimentales (antes solo posible en chimpancs) Permite manipular la informacin gentica del virus y analizar las consecuencias de dichos cambios en cualquier aspecto de la infeccin (gentica inversa) Permite el estudio fenotpico de un virus en cultivos celulares sometidos a variaciones experimentales controladas: silenciamiento gnico, tratamientos farmacolgicos, etc No permite el estudio sistemtico de cualquier aislado clnico de VHC, aunque se han generado virus quimricos que producen viriones de diversos genotipos. Depende de lneas celulares transformadas con escasa diferenciacin heptica. RELEVANCIA???

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Futuros Desafos Desarrollo de un sistema de infeccin con aislados primarios de pacientes: lnea(s) celular(es) susceptibles. Desarrollo de un sistema de infeccin para otros genotipos: clones infecciosos en cultivo celular.

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Agradecimientos Gema CalvoChiara Sorbo Lidia Mingorance Claudia Vasallo Martina Friesland http://www.cnb.csic.es/index.php/es/home/bio1/infeccion-por-el-virus-de-la-hepatitis-c.html

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