Influencia de diversas variantes genéticas y el estilo de ...dadun.unav.edu/bitstream/10171/36780/1/TesisDoctoralCeciliaGalbete.pdf · Agradecimientos Y las últimas palabas, las

Facultad de Farmacia

“Influencia de diversas variantes genéticas y el estilo de vida

sobre el riesgo de obesidad en población mayor de 55 años de

la cohorte SUN”

CECILIA GALBETE CIÁURRIZ

Pamplona, 2012

Facultad de Farmacia

“Influencia de diversas variantes genéticas y el estilo de

vida sobre el riesgo de obesidad en población mayor de 55

años de la cohorte SUN”

Memoria presentada por Dª Cecilia Galbete Ciáurriz para aspirar al grado de Doctor

por la Universidad de Navarra

Cecilia Galbete Ciáurriz

El presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de

Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología, autorizamos su presentación

ante el Tribunal que lo ha de juzgar.

Pamplona, ....... de ............................. de 2012.

Dra. Amelia Marti del Moral Dr. Francisco Guillén-Grima

Cuando emprendas tu viaje hacia Ítaca debes rogar que el viaje sea largo,

lleno de peripecias, lleno de experiencias. No has de temer ni a los lestrigones ni a los cíclopes,

ni la cólera del airado Poseidón. [...] Mas no hagas con prisas tu camino;

mejor será que dure muchos años, y que llegues, ya viejo, a la pequeña isla,

rico de cuanto habrás ganado en el camino. No has de esperar que Ítaca te enriquezca: Ítaca te ha concedido ya un hermoso viaje.

Sin ella, jamás habrías partido.

AGRADECIMIENTOS

Ítaca (C.P. Cavafis)

A g r a d e c i m i en t o s

Y desde aquí ya puedo avistar Ítaca, casi no queda nada para llegar. Lo cierto es que

no considero que haya sido un viaje largo, creo que ha durado lo que tenía que durar, lo

que también es de agradecer. Y es que ha llegado el momento de los agradecimientos, de

acordarse de todos los que han estado conmigo en este hermoso viaje lleno de peripecias

y experiencias y que creo tanto me ha hecho crecer.

Y en primer lugar debo agradecer tanto al Gobierno de Navarra como a la

Universidad de Navarra la oportunidad que me han dado con su financiación a través de

la beca de Formación de Tecnólogos y la beca de la Asociación de Amigos de la

Universidad respectivamente. Gracias a ellas he podido conocer muy de cerca el mundo

de la investigación y saber que esto me gusta, que me quiero dedicar a ello.

Por supuesto agradecer al departamento de Ciencias de la Alimentación, Fisiología y

Toxicología la oportunidad de hacer este trabajo de tesis con ellos, ha sido un verdadero

placer. Y no me olvido de mi segundo departamento, Medicina Preventiva y Salud

Pública, de quienes he recibido siempre tanta ayuda y de manera tan gustosa. En este

apartado una mención especial para quienes me han guiado de la mano en este camino.

En primer lugar, por supuesto, la Dra. Amelia Marti, quien me ha visto nacer en el

mundo de la ciencia y siempre ha estado conmigo de manera cercana y constante, en lo

mejor y en lo peor. En segundo lugar el Dr. Francisco Guillén porque siempre que le he

necesitado me ha prestado su ayuda y tanto me ha enseñado en esto de la bioestadística.

Y no me olvido del Dr. Miguel Ángel Martínez por brindarme esta oportunidad, por toda

su paciencia y su disposición y sobre todo por confiar en mí. Ni del Dr. Alfredo Martínez

que siempre me ha mostrado todo su interés y apoyo en esta andadura.

Siguiendo con los agradecimientos no me puedo olvidar de Bea y Paula que siempre

me han ayudado con una sonrisa, todo un placer haber coincidido con vosotras. Y las

mismas palabras y agradecimientos para Vero y Ana por todas las manos que me han

echado y por todo lo que me han enseñado en el laboratorio. Y por supuesto también a

Asun que tan buenos momentos me ha hecho pasar.

Y agradecer también su ayuda a los jefes más cercanos, a Javier por ayudarme

tantísimo con esto de la genética y por contagiarme su entusiasmo. Y también a Fermín

que siempre ha estado tan dispuesto a resolver mis dudas. Agradecer a Santi su compañía

y su infinita ayuda y a Pedro toda su comprensión y apoyo. Y no me olvido de Jaione,

gracias por sacarme siempre una sonrisa. Y aquí quiero incluir también a Mª Luisa, todo

un placer haber coincidido contigo.

Por supuesto no me puedo dejar a mis amigos y a mis compañeros de ordenadores,

a los que estuvieron, a los que siguen estando y a los que acaban de llegar. Hemos

compartido tantísimos momentos que no se me ocurre nada mejor que deciros que

GRACIAS.

El primer lugar se lo cedo a Adri, Tara y Laura, ¿a quién sino? Cualquier palabra se

me queda corta. Adri, puedo decir que tú me lo has enseñado casi todo (el casi es porque


ya sabes que no me gusta exagerar…), gracias por tener tanta paciencia. Tara, muchas

gracias por tantos buenos momentos, estoy segura que vamos a tener muchos más y no

dejes nunca que nadie te quite esa fuerza que tienes. Laura, gracias por todo el apoyo que

siempre me has dado y por tener siempre unas palabras de ánimo en los malos

momentos. Chicas, habéis hecho que este viaje sea mejor incluso de cuanto prometía el

poema. Ahora este viaje termina pero os digo con total seguridad ¡que en el siguiente os

llevo conmigo!

Y siguiendo con mis compañeros de tesis por supuesto no me puedo olvidar de

Mentx y de cuánto nos hemos divertido, ni de Noe, mi compañera de despistes.

También me acuerdo de los chicos. Por supuesto de Pablo y de los buenísimo

momentos que hemos pasado, me llevo de ti toda la música que hemos compartido. De

Carlos, quién me iba a decir a mí que te iba a coger tanto cariño… y de Paúl, ¡mucho

ánimo en tu recta final! Y también de Jonai, no pierdas esa tranquilidad, creo que la vas a

necesitar... Y a Gorka, ¡muchas gracias por introducirme en el mundo del squash!

Siguiendo con ordenadores no me puedo olvidar a mis flancos derecho e izquierdo,

Ana Laura y Rocío, ha sido un placer teneros tan cerca. Ni por supuesto de la sonrisa de

Aurora. Tampoco me olvido de las chicas del otro lado de ordenadores. De Ana G. y sus

infinitas anécdotas, y de Pilar por ayudarme en esta recta final, ¡ya verás como

encontraremos una beca! Ni de las más rojillas del otro lado de ordenadores Mary y

Patri. Y tampoco me olvido de Pedro y Marta.

A los nuevos, Miguel, Usune e Idoia, decirles que disfruten el camino, que eso es lo

verdaderamente importante. Y a Sonia, allí donde vaya te conseguiré una estancia, qué

bien lo íbamos a pasar tu y yo, muchas gracias por tener siempre una sonrisa.

Unas palabras de agradecimiento también a quienes ya no están en el departamento

pero de quienes puedo decir que he aprendido muchísimo y de quienes estoy segura que

seguiré aprendiendo. A Itzi, a Blanca, a Esti, a Cris, a Idoia, a Almu y a Bea.

Y no podría olvidarme de Silvia, Zenaida, David y Carmen ni de todo el equipo

SUN, ni de los voluntarios, está claro que esta tesis no hubiera sido posible sin vosotros.

Ni de Rafa, este trabajo también es en parte tuyo.

No me puedo dejar a mis amigas, a mi cuadrilla. Ángela, Carmen, Cris, Ley, Lu,

Ruth y Claudia. Vosotras sí que me habéis acompañado, incluso sin entender nada de lo

que estaba haciendo. A Carmen doble mención, porque ha sido de gran ayuda compartir

etapa contigo.

Por supuesto no me olvido de Karmele y Álvaro, muchísimas gracias por todo, os

habéis hecho unos imprescindibles para mí. Ni de Pedro ni de Marina ni del resto de la

cuadrilla de la Universidad. Y acordarme también de Ester, de Esti, de Troy, de Irene y

de todos los demás.


Y las últimas palabas, las más importantes, se las dedico a mi gran familia. Sobre

todo A MIS PADRES, por su infinita paciencia. Por intentar entenderme, y por dármelo

todo. Y A MIS HERMANOS por ser como son, ¡que no me los cambien nunca! Y por

supuesto a mi abuela, eres la mejor.

A todos vosotros GRACIAS por haberme hecho desear que el viaje fuese largo y por

haber hecho de él un camino lleno de experiencias. Sin vosotros nada de esto hubiese

tenido sentido.

ABREVIATURAS

A b r e v i a t u r a s

A: Adenina

ADIPOQ: Adiponectina

ADN: Ácido desoxirribonucleico

ADRB: Receptor beta adrenérgico

AGM: Ácidos grasos monoinsaturados

AGP: Ácidos grasos poliinsaturados

AGS: Ácidos grasos saturados

Ala: Alanina

ARNm: Ácido ribonucleico mensajero

BMAL1: Brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator

(ARNT)-like 1

C: Citosina

CLOCK: Circadian Locomotor Output Cycles Kaput

CRY: Criptocromo 1

CSFC: Cuestionario semi-cuantitativo de frecuencia de consumo de alimentos

DM2: Diabetes Mellitus tipo 2

ENPP1/PC-1: ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1/ plasma cell

membrane glycoprotein 1

FTO: Fat Mass and Obesity associated gene

GRL: Receptor de glucocorticoides

GWAS: Genome wide association study/ Estudio de asociación del genoma completo

HC: Hidratos de carbono

HDL: High Density Lipoproteins/Lipoproteínas de alta densidad

HTA: Hipertensión arterial


IL6: Interleuquina 6

IMC: Índice de masa corporal

INSIG2: Insuline induced gene 2/ Gen inducido por la insulina 2

LEP: Leptina

LEPR: Receptor de la leptina

MC4R: Receptor 4 de melanocortina

MET: Equivalente metabólico

NF-B: Factor de transcripción potenciador de las cadenas ligeras kappa de las

células B activadas

NHANES: National Health and Nutrition Examination Survey

NHS: Nurses’ Health Study

OMS: Organización Mundial de la Salud

PCSK1: Proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 1

PER: Period

POMC: Proopiomelanocortina

PPARG2: Receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma 2

Pro: Prolina

REVERB: Reverse erythroblastosis virus alfa

ROR: Retinoid-related orphan receptor-alfa

RT-PCR: Real Time- Reverse transcription polymerase chain reaction/ Reacción

en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa a tiempo real

rs: reference SNP cluster

SEEDO: Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad

SNP: Single Nucleotide Polymorphism/ Polimorfismo de nucleótido simple


SQN: Núcleo supraquisamático

SUN: Seguimiento Universidad de Navarra

T: Timina

UCP: Proteína desacoplante

ÍNDICE

Ín d i c e

INTRODUCCIÓN ........................................................................ 1

1. OBESIDAD ................................................................................................ 3

1.1 Definición de obesidad ......................................................................... 3

1.2 Epidemiología de la obesidad ............................................................... 6

1.3 Etiología de la obesidad ....................................................................... 9

1.4 Complicaciones de la obesidad .......................................................... 10

2. GENÉTICA DE LA OBESIDAD ............................................................. 12

2.1 Variantes genéticas implicadas en el desarrollo de la obesidad ......... 12

2.1.1. Estudios de genes candidatos .................................................... 14

2.1.1.1. Receptor activado por el proliferador de peroxisomas

gamma 2 (PPARG2) ....................................................... 16

2.1.1.2. Circadian Locomotor Output Cycles Kaput gene

(CLOCK) ........................................................................ 17

2.1.2. Estudios de asociación del genoma completo ........................... 20

2.1.2.1. Fat Mass and Obesity Associated gene (FTO) .............. 22

2.2 Interacción gen-estilo de vida ............................................................. 23

2.1.3. Nutrigenética ............................................................................. 24

2.1.4. Interacciones gen-actividad física ............................................. 27

3. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 29

OBJETIVOS ................................................................................. 45

SUJETOS Y MÉTODOS ............................................................ 49

1. EL ESTUDIO SUN ................................................................................... 51

1.1 Características generales ..................................................................... 51

1.2 Cuestionario basal ............................................................................... 52

1.2.1. Variables socio-demográficas ................................................... 53

1.2.2. Actividad física y otras variables del estilo de vida ................. 53

1.2.3. Variables clínicas y antropométricas ........................................ 54

1.2.4. Evaluación dietética .................................................................. 54

2. ANÁLISIS DE VARIANTES GENÉTICAS ............................................ 55

2.1 Extracción de ADN .............................................................................. 55

2.2 Protocolo para la detección de variantes genéticas .............................. 56

3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...................................................................... 59

4. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 61

Ín d i c e

RESULTADOS ............................................................................. 65

1. CAPÍTULO 1: Pro12Ala variant of PPARG2 increases body mass

index: an updated meta-analysis encompassing 49,092 subjects ............. 67

2. CAPÍTULO 2: Lifestyle factors modify obesity risk linked to PPARG2

and FTO variants in an elderly population: a cross-sectional analysis

in the SUN Project ..................................................................................... 91

3. CAPÍTULO 3: Physical activity and gender modulate obesity risk

linked to 3111T/C gene variant of the CLOCK gene in an elderly

population: The SUN Project ................................................................. 113

DISCUSIÓN GENERAL ........................................................... 141

1. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO ........................................................ 143

2. LA COHORTE SUN: FORTALEZAS Y DEBILIDADES .................... 144

3. ESTUDIO DE VARIANTES GENÉTICAS ASOCIADAS CON

OBESIDAD ............................................................................................. 147

3.1 Efecto del polimorfismo Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 .. 147

3.2 Efecto combinado de las variantes genéticas Pro12Ala del gen

PPARG2 y rs9939609 del gen FTO ................................................. 149

3.3 Efecto del SNP 3111T/C (rs1801260) del gen CLOCK ................... 151

4. COROLARIO .......................................................................................... 153

5. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 154

CONCLUSIONES ........................................................................ 163

ANEXOS/OTRAS PUBLICACIONES ...................................... 167

1. ANEXO 1: Consentimiento informado ................................................... 169

2. ANEXO 2: Cuestionario basal C_0 ......................................................... 173

3. ANEXO 3: The effect of the Mediterranean diet on plasma brain-

derived neurotrophic factor (BDNF) levels: the PREDIMED-

NAVARRA randomized trial .................................................................... 183

INTRODUCCIÓN

In t r o d u c c i ó n

3 | P á g i n a

1. OBESIDAD

Hoy en día la prevención de la obesidad es un aspecto prioritario para la salud

pública. La obesidad supone el problema nutricional más frecuente en la sociedad

occidental (OMS, 2000) y ha sido incluso catalogada como la epidemia del siglo XXI.

Conlleva no sólo complicaciones desde el punto de vista estético y psicológico, sino

también y principalmente, enfermedades a las que este trastorno puede derivar o

acompañar como la diabetes, la hipertensión, alteraciones inflamatorias, aumento de

riesgo de padecer cáncer, insuficiencia respiratoria u osteoartritis entre otras (Martinez,

2000; Bray, 2004; Sorensen et al., 2010).

Ya Hipócrates en el siglo V a.C. asoció la obesidad con la muerte súbita (Salas-

Salvadó et al., 2005) pero no fue hasta finales del siglo XVI cuando se desarrollaron las

primeras tesis doctorales con la obesidad como tema principal. A mitad del siglo XX,

después de la II Guerra Mundial, las compañías de seguros descubrieron que las

personas con mayor peso tenían una mayor mortalidad y elaboraron unas tablas usadas

para el cálculo de las primas de seguros (MLIC, 1942;1943). En estas investigaciones

resulta interesante destacar que no estaban implicados investigadores de ciencias de la

salud sino agentes de seguros.

1.1. Definición de obesidad

El sobrepeso y la obesidad han sido definidos por la OMS como una acumulación

excesiva de grasa que puede ser perjudicial para la salud (OMS, 2011). Esto se debe al

desequilibrio en el balance energético entre la ingesta y el gasto energético (Martinez,

2000). Se trata de una enfermedad con una etiología compleja pues factores genéticos y

ambientales interaccionan entre sí haciendo que se incrementen en el organismo las

reservas energéticas en forma de grasa (Marti et al., 2004).

La obesidad se asocia con un exceso en el número de adipocitos (hiperplasia), en el

tamaño de éstos (hipertrofia) o a ambos (Wang & Beydoun, 2007). Se ha comprobado

que la hipertrofia del tejido adiposo ocurre antes que la hiperplasia del mismo, y se ha

observado también que el número de adipocitos se mantiene constante en los adultos


4 | P á g i n a

incluso después de una importante pérdida de peso. Este hecho sugiere que el número

de adipocitos se establece durante la infancia y la adolescencia y se mantiene en la vida

adulta (Spalding et al., 2008).

Los criterios para la clasificación del sobrepeso y la obesidad han ido

evolucionando con el tiempo. En el año 1832 el estadístico belga Lambert Adolphe

Jacques Quetelet (1796-1874) demostró que desde el nacimiento hasta la pubertad el

peso aumentaba de forma proporcional con el cuadrado de la estatura y formuló un

índice que sería conocido como el índice Quetelet.

Otro de los índices para la medición del peso fue el índice de peso ideal o índice de

Broca, desarrollado por el neurólogo y antropólogo francés Paul Pierre Broca (1824-

1880) que calculaba el peso ideal mediante la siguiente fórmula (Rossner, 2007):

Peso ideal (kg) = Estatura (cm) – 100 (± 15% en mujeres y ± 10% en varones)

Este índice estaría en vigor hasta el año 1983, utilizándose en una versión

modificada, conocida como fórmula de Devine, para el cálculo de dosis de

medicamentos ajustado por peso corporal (Pai & Paloucek, 2000).

En la actualidad el parámetro más utilizado es el Índice de Masa Corporal

(IMC=kg/m2) que se trata de una versión modificada por el fisiólogo americano Ancel

Keys (1904-2004) del anteriormente mencionado índice de Quetelet. Es el índice

utilizado por la mayoría de los estudios epidemiológicos y el recomendado por

diferentes sociedades médicas y organizaciones de salud internacionales para el uso

clínico dada su reproducibilidad, facilidad de utilización y capacidad de reflejar la

adiposidad en la mayoría de la población (McCrory et al., 2000). Así, con la ayuda de

este índice se puede definir a los pacientes que presentan sobrepeso y obesidad según

ciertos límites que han sido previamente establecidos. La OMS considera que los puntos

de corte del IMC para clasificar a la población adulta son 25, 30, 35 y 40 kg/m2,

correspondientes con los grados de sobrepeso, obesidad grado I, II y III (Tabla 1).


5 | P á g i n a

Tabla 1. Clasificación del estado nutricional en función del IMC según la

OMS. Fuente: OMS (2011)

Categoría IMC (kg/m2)

Bajo peso < 18,5

Peso ideal 18,5-24,9

Sobrepeso 25,0-29,9

Obesidad grado I 30,0-34,9

Obesidad grado II 35,0-39,9

Obesidad mórbida o grado III ≥ 40,0

De la misma manera, la Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad

(SEEDO) considera valores normales de IMC los comprendidos entre 18,5 kg/m2 y 24,9

kg/m2. También propone valores de IMC por encima de los 25,0 kg/m

2 como sobrepeso

y prevé un intervalo de riesgo para los valores comprendidos entre 27,0 kg/m2

y 29,9

kg/m2 cuando se acompañan de otros factores de riesgo (consumo de tabaco,

hipertensión y diabetes) (Tabla 2).

Tabla 2. Clasificación del estado nutricional en función del IMC según la

SEEDO. Fuente: Salas-Salvado et al. (2007)

Categoría IMC (kg/m2)

Normopeso 18,5-24.9

Sobrepeso I 25,0-26,9

Sobrepeso II (preobesidad) 27,0-29,9

Obesidad I 30,0-34,9

Obesidad II 35,0-39,9

Obesidad III (mórbida) 40,0-49,9

Obesidad IV (extrema) ≥50,0


6 | P á g i n a

kg/m2

kg/m2

kg/m2

kg/m2

IMC medio (varones)

1.2. Epidemiología de la obesidad

En 2008 la Organización Mundial de la Salud estimó que aproximadamente 1.500

millones de adultos mayores de 20 años tenían sobrepeso, de los cuales más de 300

millones de mujeres y 200 millones de varones eran obesos. Se estimó que para el año

2015 aproximadamente 2.300 millones de adultos sufrirán sobrepeso y más de 700

millones obesidad (OMS, 2007).

Inicialmente se ha considerado la obesidad como un importante problema de salud

en los países industrializados (Gesta et al., 2006), sin embargo, hoy en día, la obesidad

ha alcanzado proporciones epidémicas en todo el mundo. Muchos estudios

epidemiológicos han demostrado un importante aumento en la frecuencia del sobrepeso

y la obesidad en la población de la mayoría de los países desarrollados y en desarrollo.

Las Figuras 1 y 2 muestran como se ha visto incrementado significativamente el IMC

medio entre los años 1980 y 2008 (Finucane et al., 2011)

Figura 1: IMC medio en varones a escala mundial en 1980 y 2008. Fuente:

Finucane et al. (2011)


7 | P á g i n a

kg/m2

kg/m2

kg/m2

kg/m2

IMC medio (mujeres)

Figura 2: IMC medio en mujeres a escala mundial en 1980 y 2008. Fuente:

Finucane et al. (2011)

La obesidad está presente en aproximadamente el 20%-30% de la población adulta

de los países occidentales (Flegal et al., 2002). En 2008, Estados Unidos era el país con

la media de IMC en varones más alta del mundo [28,4 kg/m2 (IC95% = 27,9-28,7)].

Además, más de las dos terceras partes de los adultos presentaban sobrepeso u obesidad.

De continuar esta tendencia se estima que para el año 2015 tres cuartas partes de la

población de este país presentarán sobrepeso u obesidad (Wang et al., 2007). Un factor

que probablemente esté relacionado con esta patología pudiera ser el aumento del

consumo de alimentos con alto contenido calórico así como también los estilos de vida

más sedentarios.

A nivel mundial, la prevalencia de obesidad en 2008 se estimó en 9,8% en los

varones y 13.8% en las mujeres, lo que significa que desde 1980 a 2008 esta prevalencia

casi se duplicó, pues en 1980 dicha prevalencia era de 4,8% en los varones y 7,9% en

las mujeres (Finucane et al., 2011). En concreto, en las mujeres, este mismo año las

medias de IMC más altas se observaron en Norte América, Norte de África, y Medio

Oriente, todos ellos con una media de IMC ≥ 28 kg/m2.


8 | P á g i n a

En Europa la prevalencia de sobrepeso y obesidad es bastante variable, siendo

España uno de los países con las tasas más elevadas, más del 25% de la población

adulta padece sobrepeso (Berghofer et al., 2008). En este sentido, el estudio ENRICA,

llevado a cabo entre los años 2008 y 2010 ha puesto de manifiesto que más de un 36%

de adultos españoles presentan obesidad abdominal (Gutierrez-Fisac et al., 2012), lo

que resulta especialmente alarmante por las comorbilidades asociadas a este tipo de

obesidad (Hermsdorff et al., 2011; Phillips et al., 2012). La Figura 3 muestra la

prevalencia de obesidad general en España descrita por el estudio ENRICA.

Figura 3: Prevalencia de la obesidad general en varones y mujeres españoles entre

los años 2008 y 2010. Fuente: Gutierrez-Fisac et al. (2012)

Por otro lado, la última Encuesta Nacional de Salud (2006) muestra que en el año

1987 el porcentaje de obesidad en la población adulta en España era de 6,9% en los

varones y del 7,9% en las mujeres. Mientras que en el año 2006 estos valores subieron

hasta el 15,6% en el caso de los varones y el 15,2% en el de las mujeres (Encuesta

Nacional de Salud, 2006). El rango de población adulta de entre 65 y 74 años es el

grupo para el que se encuentran los mayores índices de de obesidad, el 25,5% de los

varones y el 28,3% de las mujeres declaran tener un IMC por encima de 30,0 kg/m2.

En este sentido aún más alarmantes son los datos recogidos por Basterra-Gortari et

al. (2011) donde se muestra que la prevalencia autodeclarada de obesidad mórbida en

España aumentó de un 1,8% en 1993, a un 6,1% en 2006 según datos de la Encuesta

Nacional de Salud (2006).

VARONES MUJERES


9 | P á g i n a

Predisposición genética

Ingesta

energética

Gasto

energético

Composición

de la DIETA

Adipogénesis

SOBREPESO OBESIDAD

1.3. Etiología de la obesidad

La obesidad es una condición heterogénea y multifactorial en cuya aparición están

implicados numerosos elementos causales entre los que se encuentran factores

genéticos, metabólicos, endocrinológicos, ambientales (hábitos dietéticos y actividad

física) y psicosociales. De hecho, en la mayor parte de los sujetos que desarrollan

obesidad es difícil establecer una única causa, atribuyéndose en gran medida a la

interacción entre la carga genética y los factores ambientales relacionados con el estilo

de vida (Weinsier et al., 1998; Marti et al., 2008; Moleres et al., 2012a). Algunos

desequilibrios nutricionales pueden provocar alteraciones en el organismo que resulten

en un fenotipo de tipo ahorrador y que a medio o largo plazo sea responsable de

trastornos metabólicos como la obesidad y el síndrome metabólico.

Las relaciones entre la ingesta energética, el gasto energético, el reparto de

macronutrientes de la dieta y la adipogénesis determinan el crecimiento de la reserva

energética corporal (Martinez et al., 2002). Como se muestra en la Figura 4, cuando la

ingesta energética excede crónicamente al gasto energético o el reparto de

macronutrientes de la dieta favorece la reserva de lípidos, se produce un desequilibrio

que conlleva al desarrollo de sobrepeso y, a largo plazo, de obesidad (Loos & Bouchard,

2003).

Figura 4: Diagrama que relaciona el balance energético positivo con la

acumulación de grasa, indicando los puntos de actuación de la predisposición

genética. Fuente: Loos & Bouchard (2003)


10 | P á g i n a

1.4. Complicaciones de la obesidad

Son diversos los estudios epidemiológicos realizados en grandes poblaciones que

confirman el dato de que muchas muertes pueden ser atribuidas al exceso de peso y de

hecho, en personas con IMC superior a 30,0 kg/m2, la mitad de las muertes pueden ser

atribuibles a esta patología (Bray, 1996). En Europa una de cada trece muertes se

atribuye a la obesidad (Banegas et al., 2003). Se estimó que la obesidad es el séptimo

factor de riesgo que más mortalidad causa a nivel mundial (Lopez et al., 2006). En

Estado Unidos la obesidad es la segunda causa de muerte prevenible, sólo por detrás del

tabaco (Stewart et al., 2009).

A pesar de todos estos datos, en el rango de población más adulta, el riesgo de

mortalidad y morbilidad asociado a la obesidad es menor que en el rango de población

de adultos de mediana edad. Sin embargo, los gastos en sanidad asociados al sobrepeso

y la obesidad son mayores en este rango de población (Wee et al., 2005)

Estas son algunas de las complicaciones atribuidas a la obesidad:

- Alteraciones cardiovasculares: La obesidad es responsable de que se produzca

una mayor incidencia de cardiopatía isquémica (Alexander, 2001), así como de un

aumento en la incidencia de la hipertensión arterial (HTA) (Thakur et al., 2001).

Además, en este caso, resulta relevante la distribución de la grasa corporal pues es la

adiposidad abdominal la que se asocia con un mayor riesgo de padecer enfermedades

cardiovasculares y con un perfil lipídico desfavorable (Canoy et al., 2007) y de esta

manera, el índice cintura-cadera se utiliza para valorar la adiposidad central (visceral)

frente a la periférica.

- Diabetes: El sobrepeso es uno de los principales factores de riesgo para el

desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (Wild & Byrne, 2006; Sanada et al., 2012).

También en este caso son la circunferencia de cintura y el IMC elevados los que se

asocian con el riesgo de desarrollar DM2 (Guh et al., 2009), considerándose el primer

factor causal.


11 | P á g i n a

- Cáncer de colon: Un reciente meta-análisis ha demostrado una mayor

prevalencia de este tipo de cáncer entre sujetos con sobrepeso (Okabayashi et al., 2012).

Además, los resultados de diversos estudios sugieren que la mejor protección frente a

este tipo de cáncer parece ser un peso corporal estable y la actividad física regular

(Giovannucci et al., 1996) y sobre todo que no haya aumento del perímetro de cintura

(Pischon et al., 2006).

- Cáncer de mama: Estudios epidemiológicos han demostrado una fuerte

asociación entre el IMC y el cáncer de mama después de la menopausia (Renehan et al.,

2008). Aproximadamente el 50% de casos en este tipo de cáncer ocurren en aquellas

mujeres con IMC superior a 29,0 kg/m2

(Ballard-Barbash & Swanson, 1996).

- Otros tipos de cáncer: el adenocarcinoma de esófago, el cáncer de páncreas,

hígado y vesícula biliar son otros cánceres que presentan la obesidad como un factor de

riesgo para su desarrollo (Danaei et al., 2005).

- Hipertensión: El sobrepeso es un determinante de la hipertensión arterial

(HTA) (Nguyen & Lau, 2012). Según la National Health and Nutrition Examination

Survey (NHANES), la prevalencia de HTA aumenta conforme aumenta el IMC, de un

24% en aquellos con IMC <25,0 kg/m2 a 54% para los que tienen IMC ≥35,0 kg/m

2

(Nguyen et al., 2010).

- Aparato respiratorio: En los obesos se encuentran disminuidas tanto la

capacidad residual funcional como el volumen de reserva respiratoria. También los

obesos tienden a ventilar exclusivamente los campos aéreos pulmonares superiores, lo

que da lugar a una disminución en la concentración de oxígeno en la sangre. Otro

problema que puede presentarse es la apnea del sueño (Vgontzas et al., 1994; Ong et al.,

2012).

- Aparato locomotor: La obesidad se ha asociado con la osteoartritis y la artrosis

preferentemente de rodilla, cadera y tobillos (Gelber et al., 1999; Coggon et al., 2001,

Issa & Griffin, 2012). Estas patologías se producen con mayor frecuencia en los obesos,

principalmente por la sobrecarga que supone.


12 | P á g i n a

- Aparato digestivo: Existe una relación evidente entre la obesidad y el reflujo

gástroesofágico (Festi et al., 2009). Un meta-análisis encontró que el sobrepeso y la

obesidad estaban asociados con los síntomas de reflujo gastroesofágico, esofagitis

erosiva, y adenocarcinoma de esófago (Hampel et al., 2005) así como también con

litiasis biliar (Petroni, 2000).

El sobrepeso y la obesidad también deterioran la calidad de vida de quienes las

padecen no solo por todas estas enfermedades específicas derivadas de ellas sino

también por las limitaciones en las actividades cotidianas que pueden conllevar.

También acontece en este sentido el estigma social de la persona obesa, que puede

comprometer al individuo en sus relaciones sociales (Kim et al., 2008)

Además de todo lo mencionado anteriormente, en las personas de mayor edad la

obesidad puede acentuar el deterioro. Sin embargo, encontrar el tratamiento más

adecuado contra la obesidad en este rango de población resulta complicado por los

problemas que puede conllevar la pérdida de peso, como son la pérdida de masa

muscular y de masa ósea.

2. GENÉTICA DE LA OBESIDAD

2.1. Variantes genéticas implicadas en el desarrollo de la obesidad

En las primeras décadas del siglo XX se comenzó a valorar el componente

hereditario de la obesidad, pero sólo recientemente se han obtenido datos objetivos

sobre los genes involucrados en su desarrollo. En el año 1994 Friedman y col.

describieron por primera vez el gen que codifica para la leptina (ob) (Halaas et al.,

1995). A partir de entonces se han producido enormes avances en nuestro conocimiento

sobre la implicación de la genética en el desarrollo de la obesidad. Estudios en familias

y en gemelos han ayudado en gran medida en estos descubrimientos pues han revelado

que entre un 50% y un 80% de la variación en el IMC puede deberse a factores

genéticos (Bell et al., 2005; Hinney et al., 2010).

En las últimas dos décadas hemos pasado de conocer unos pocos genes vinculados

con la acumulación de grasa a conocer más de cincuenta loci que pueden estar


13 | P á g i n a

implicados en la predisposición a desarrollar obesidad (Speliotes et al., 2010). Hasta el

momento se considera que la obesidad debida a causas monogénicas no supera el 5%

del total de casos. En éstos está bien establecido que diversas mutaciones en genes que

codifican proteínas implicadas en la regulación del apetito son responsables de

alteraciones patológicas cuyo fenotipo más evidente es la obesidad (Bell et al., 2005;

Farooqi & O'Rahilly, 2005). A día de hoy, como se muestra en la Tabla 3, se han

asociado 11 genes con la obesidad monogénica.

Tabla 3: Genes causantes de obesidad de origen monogénico. Fuente: Ochoa (2007)

Gen Nombre del gen Región

cromosómica

CRHR1 Receptor 1 de la hormona liberadora de corticotropina 17q12-q22

CRHR2 Receptor 2 de la hormona liberadora de corticotropina 7p14.3

GPR24 Receptor 24 acoplado a proteína C4 22q13.2

LEP Leptina 7q31.3

LEPR Receptor de leptina 11p31

MC3R Receptor 3 de melanocortina 20q13.2-q13.3

MC4R Receptor 4 de melanocortina 18q22

NTRK2 Receptor neurotrófico de tirosinquinasa tipo 2 19q22.1

PCSK1 Proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 1 5q15-q21

POMC Proopiomelanocortina 2p23.3

SIM1 Homólogo 1 de la mente simple de Drosophila 6q16.3-q21

De todas ellas las mutaciones en los genes LEP, LEPR, POMC, MC4R y PCSK1

son particularmente importantes. Se estima que entre las cinco se puede explicar el 5%

de los casos de obesidad severa de desarrollo temprano en niños (Farooqi et al., 2005).

Sin embargo, la mayor parte de los casos de obesidad son de origen poligénico, es

decir, deben su fenotipo a la presencia de diversas variantes genéticas de alta

prevalencia pero con un efecto poco relevante. Cada una de estas variantes genéticas

contribuye de manera sutil al desarrollo de la obesidad, y solo la combinación de varias

hace que el efecto sea más relevante (Hinney & Hebebrand, 2008). Para el estudio de la

obesidad poligénica se han utilizado dos tipos de aproximaciones; estudios de genes

candidatos y estudios de barrido del genoma completo (GWAS).


14 | P á g i n a

2.1.1. Estudios de genes candidatos

Estos estudios analizan genes involucrados en vías metabólicas importantes o que

han resultado de interés en estudios realizados en animales (Hinney et al., 2010).

Una limitación importante de estos estudios es que normalmente tienen un reducido

tamaño muestral que no les otorga la potencia necesaria para identificar los efectos

modestos provocados por la obesidad (Vimaleswaran & Loos, 2010). Para corregir esta

limitación en los últimos años se han llevado a cabo estudios con un gran número de

participantes o meta-análisis y a partir de ellos se han encontrado asociaciones sólidas

entre obesidad y diversas variantes genéticas.

El meta-análisis es una herramienta que nos permite reunir toda la información

publicada de manera objetiva y así dar una estimación cuantitativa sintética de todos los

estudios encontrados. El término meta-análisis fue acuñado por Glass en el año 1976

(Glass, 1976) que lo definió como “un análisis estadístico de una amplia serie de

análisis de resultados de estudios individuales con el objetivo de integrar sus hallazgos”.

Se trata de una herramienta estadística que aporta un poder estadístico mayor al de los

trabajos que se incluyen en él y entre sus objetivos están el de resolver incertidumbres

cuando hay estudios contradictorios, mejorar la estimación del tamaño del efecto,

aumentar la potencia estadística y aportar mejoras a la calidad de la investigación

primaria.

Existen dos principales problemas metodológicos a la hora de realizar un meta-

análisis:

- La heterogeneidad entre los estudios incluidos (Higgins & Thompson, 2002).

- El sesgo de publicación debido a que no todos los estudios realmente

relacionados hayan sido publicados, ya sea por resultados negativos o por no esperados

(Golder et al., 2011).

En los últimos años numerosos estudios han analizado la asociación de diferentes

variantes genéticas y distintos fenotipos asociados con obesidad mediante meta-análisis

(Marti et al., 2006; Jalba et al., 2008; Wang et al., 2010; Yu et al., 2012) y éstos han

permitido confirmar o rechazar dicha asociación (Tabla 4).

Tabla 4: Resumen de estudios de meta-análisis sobre variantes genéticas asociadas con adiposidad

Gen Variante Tamaño muestral Fenotipos asociado con obesidad Referencia

ADIPOQ G276T - Asociación con susceptibilidad a la obesidad Yu et al. (2012)

ADRB2 Arg16Gly 4.328 No hay asociación con obesidad Jalba et al. (2008)

Glu27Gln 10.404 Glu27 > riesgo de obesidad en Asia, islas del Pacífico, o

indios americanos Jalba et al. (2008)

ADBR3 Trp64Arg 7.399 No asociación con IMC Allison et al. (1998)

9.236 Arg64 >IMC Fujisawa et al. (1998)

6.528 Arg64 >IMC Japoneses Kurokawa et al. (2001)

44.833 Arg64 >IMC Asia del este, no asociación en caucásicos Kurokawa et al. (2008)

ENPP1/PC-1 K121Q 24.324 Q > Riesgo obesidad Wang et al. (2011)

GRL Asn363Ser 4.792 No asociación con obesidad o IMC Marti et al. (2006)

IL6 -174G/C 26.944 No asociación con IMC Qi et al. (2006)

LEPR K109R 3.012 No asociación con IMC Heo et al. (2002)

- Asociado con sobrepeso en estudios de IMC>25 kg/m2

Bender et al. (2011)

Q223R 3.263 No asociación con IMC Heo et al. (2002)

- No asociación con riesgo de sobrepeso/obesidad Bender et al. (2011)

2.045 < Riesgo de obesidad en población china Yang et al. (2011)

K656N 3.263 No asociación con IMC Heo et al. (2002)

- No asociación con riesgo de sobrepeso/obesidad Bender et al. (2011)

P1019P 1.779 > Riesgo de obesidad en población china Yang et al. (2011)

MC4R Val103Ile 7.713 Ile < Riesgo obesidad Geller et al. (2004)

29.563 Ile < Riesgo obesidad Young et al. (2007)

39.879 Ile < Riesgo obesidad Stutzmann et al. (2007)

55.195 Ile < Riesgo obesidad Wang et al. (2010)

Ile251Leu 11.435 Ile < Riesgo obesidad Stutzmann et al. (2007)

PPAR2 Pro12Ala 29.914 Ala > IMC Tonjes et al. (2006)

19.136 Ala > IMC en sujetos con IMC≥27 kg/m2 Masud & Ye (2003)

TNFalfa G308A - Asociación con susceptibilidad a la obesidad Yu et al. (2012)

UCP2 -866G>A 12.984 G > Riesgo obesidad Andersen et al. (2012)


16 | P á g i n a

A1 A2 B 1 2 3 4 5 6

PPAR2

PPAR1

2.1.1.1. Receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma 2

(PPARG2)

El receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR) es un factor de

transcripción dependiente de ligando que forma parte de de la súper-familia de receptores

hormonales nucleares (Spiegelman, 1998). Su principal función es la de regular la

transcripción de genes implicados en el metabolismo glucídico y lipídico en el adipocito

(Uauy et al., 2000; Tyagi et al., 2011).

Se conocen tres subtipos de PPAR: PPAR, PPAR y PPAR. Éste último se expresa

en tejido adiposo donde activa la diferenciación de adipocitos por medio de la regulación

de la expresión de genes implicados en dicho proceso (Pirat et al., 2012). Además, PPAR

se ha asociado a procesos antiinflamatorios ya que puede inhibir la actividad de factores de

transcripción pro-inflamatorios como AP-1 (proteína activadora 1), STAR (transductores

de señales y activadores de la transcripción) y NF-B (factor nuclear B) (Pascual et al.,

2007).

El gen PPAR se localiza en el cromosoma 3p25 y contiene nueve exones. Se expresa

sobre todo en tejido adiposo donde tiene un papel clave en la adipogénesis y la sensibilidad

a insulina (Pirat et al., 2012). A partir de este gen y por medio de diferentes promotores y

de procesamiento alternativo se forman tres ARNm (1,2 y 3) diferentes que dan lugar a

dos isoformas de la proteína: PPAR1 (generada por ARNm 1 y 3) y PPAR2 (Elbrecht et

al., 1996), como se puede observar en la Figura 6.

Figura 6: Esquema de los exones que codifican para las isoformas 1 y 2 de PPAR


17 | P á g i n a

El polimorfismo más frecuente de los estudiados en el gen PPAR es el que afecta al

exón B, y por tanto a la proteína PPAR2, y que se debe al cambio de una citosina por una

guanina (C/G) que conlleva la sustitución en el codón 12 de una prolina por una alanina

(Pro12Ala; rs1801282). Los análisis han revelado los efectos del alelo 12Ala in vitro:

cuando el receptor porta este alelo presenta una menor afinidad de unión al ADN y menor

capacidad para inducir la transcripción de los genes diana del PPAR (Deeb et al., 1998).

Esto haría pensar que el alelo 12Ala in vivo debería proteger frente a altos índices de

adiposidad debida la menor actividad del receptor. Sin embargo, diversos estudios

poblacionales apuntan que este alelo se asocia con un aumento en la adiposidad corporal

(Franks et al., 2007; Passaro et al., 2011). La disparidad de los resultados in vitro e in vivo

podrían explicarse, en parte, porque parece ser que en humanos el efecto del polimorfismo

sobre la adiposidad se ve modulado por el grado de IMC y por los niveles de insulina

(Deeb et al., 1998).

2.1.1.2. Circadian Locomotor Output Cycles Kaput gene (CLOCK)

Los ritmos circadianos o ritmos biológicos son oscilaciones de las variables biológicas

en intervalos regulares de tiempo que condicionan los procesos fisiológicos del cuerpo

humano para llevarse a cabo en el momento óptimo del día. Esto es gracias al desarrollo de

un ciclo circadiano endógeno que se adapta a los estímulos externos de manera que el

cuerpo se anticipa al sueño y a periodos de actividad (Panda et al., 2002).

Muchos aspectos de la fisiología y del comportamiento se ven influenciados por los

ritmos circadianos, incluidos los ciclos sueño-vigilia, actividad cardiovascular, sistema

endocrino, la temperatura corporal, la actividad renal, la fisiología del tracto

gastrointestinal y el metabolismo hepático (Panda et al., 2002; Reppert & Weaver, 2002).

El organismo se rige por un reloj circadiano endógeno que está ubicado en el núcleo

supraquiasmático (SQN) del hipotálamo anterior y que responde al ciclo luz-oscuridad

natural. También se han encontrado reguladores circadianos similares en tejidos periféricos

como el hígado, el intestino y el tejido adiposo, que regulan funciones celulares.

En lo que a adiposidad se refiere, se ha visto que muchas hormonas implicadas en el

metabolismo como la insulina (La Fleur et al., 1999), el glucagón (Ruiter et al., 2003), la


18 | P á g i n a

adiponectina (Ando et al., 2005), la corticosterona (De Boer & Van der Gugten, 1987), la

leptina y la grelina (Ahima et al., 1998; Bodosi et al., 2004) se modifican de acuerdo con

la oscilación circadiana. Además, los centros hipotalámicos que controlan las sensaciones

de hambre y saciedad dependen del sistema circadiano y reciben señales del estado

nutricional del organismo por la leptina y otros indicadores humorales que son producidos

por los tejidos periféricos (Welsh et al., 1995). Además, en el adipocito también existen

genes regulados por los ritmos circadianos, y su expresión en el tejido adiposo puede verse

alterada por situaciones patológicas como ocurre en ratones obesos o diabéticos

(Kondratov et al., 2006)

El gen CLOCK se localiza en el cromosoma 4q12 y codifica para un factor de

transcripción implicado en la regulación de los ritmos circadianos. Fue identificado en el

año 1997 por King et al. (1997) mediante la utilización de ratones creados y tratados para

la identificación de genes clave en la actividad circadiana. Se trata de un elemento positivo

imprescindible para el correcto funcionamiento del sistema circadiano central y periférico.

Entre sus funciones está la de heterodimerizar en el citoplasma con la proteína BMAL1

formando un complejo que se desplaza al interior del núcleo. Una vez aquí se une a los

promotores de sus genes diana entre los que se encuentran Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2,

Reverb, Ror, controlando su expresión. Además, el heterodímero formado por CLOCK

y BMAL1 también estimula la trascripción de Bmal1 en sí misma, dando lugar a un lazo de

retroalimentación positiva. CRY y PER son quienes regulan este lazo de retroalimentación

de manera negativa. Heterodimerizan en el citoplasma, se desplazan al núcleo, y desde

aquí inhiben la función del heterodímero CLOCK/BMAL1 (Zanquetta et al., 2010)

(Figura 7).

El heterodímero CLOCK/BALM1 activa la transcripción de genes directamente

implicados en el metabolismo como Ror y Reverb y la familia de factores de

transcripción Ppar. La familia PPAR está involucrada en el metabolismo de la glucosa y

los lípidos así como en la adipogénesis. REVERB y ROR lo están en el metabolismo de

la glucosa, lípidos, lipoproteínas así como en la adipogénesis y la lipogénesis (Zanquetta et

al., 2010) (Figura 8).


19 | P á g i n a

Metabolismo lipídico

Metabolismo de lipoproteínas

Metabolismo glucídico

Adipogénesis

Lipogénesis


Metabolismo de lipoproteínas

Lipogénesis


Metabolismo glucídico

Adipogénesis

Diferenciación de adipocitos


Metabolísmo glucídico

Figura 7: Mecanismo molecular del reloj circadiano. Fuente: Zanquetta et al. (2010)

Figura 8: Mecanismo molecular subyacente a la asociación entre los ritmos

circadianos y las vías metabólicas. Fuente: Zanquetta et al. (2010)


20 | P á g i n a

Estudios previos han demostrado asociación entre diferentes polimorfismos del gen

CLOCK y el desarrollo de obesidad en distintas poblaciones (Sookoian et al., 2008) pero

probablemente la variante genética más estudiada en este contexto sea el SNP 3111T/C

(rs1801260). Este polimorfismo se localiza en la posición 56301369 del cromosoma 4 y

consiste en el cambio de una timina por una citosina.

Garaulet et al. (2011) describieron diferencias en las horas de sueño, cambios en los

niveles de grelina, alteraciones en el comportamiento alimentario y preferencias nocturnas

en aquellos sujetos que portaban el alelo minoritario C de este polimorfismo y sugirieron

que todas estas diferencias hacían a éstos más resistentes a la pérdida de peso tras una

intervención. En este estudio se propone que la resistencia a la pérdida de peso podría

deberse a problemas de sueño, lo que conlleva cansancio y fatiga que hacen que el sujeto

disminuya su actividad física. De esta manera, el gen CLOCK no estaría directamente

ligado al desarrollo de obesidad sino a cambios en el comportamiento.

Por otro lado, Tortorella et al. (2007) observaron asociación entre el alelo C del

polimorfismo 3111T/C del gen CLOCK y un menor peso corporal en un grupo de mujeres

con trastornos de la conducta alimentaria. Este grupo sugiere que este SNP no predispone a

sufrir anorexia nerviosa o bulimia nerviosa, pero conlleva una mayor pérdida de peso

durante el transcurso de la enfermedad. Además, Scott et al. (2008) propusieron que un

haplotipo que incluía el alelo C de esta variante genética podría proteger frente al

desarrollo de obesidad en un grupo de varones caucásicos. Monteleone et al. (2008) no

encontraron ninguna asociación de este locus con el desarrollo de la obesidad. Por todo lo

anterior parece que no existen resultados concluyentes acerca de la asociación entre la

variante 3111T/C del gen CLOCK y la obesidad.

2.1.2. Estudios asociados del genoma completo (GWAS)

En la actualidad es la herramienta más utilizada para detectar nuevas variantes

genéticas relacionadas con la obesidad y con sus comorbilidades asociadas. El diseño más

común de este tipo de estudios consiste en comparar los genomas de un grupo de personas

con la enfermedad a estudiar (casos) frente a otro grupo de personas sanas (controles) para

detectar variaciones genéticas asociadas a dicha enfermedad. Este método tiene tres

ventajas importantes en comparación con los estudios de genes candidatos (Frayling, 2007)


21 | P á g i n a

- Resulta más rentable

- Tiene una resolución mucho mayor

- No requiere individuos relacionados (cuyo reclutamiento es normalmente mucho

más laborioso) y por tanto facilita el obtener mayores tamaños muestrales.

El primer gen que se relacionó incuestionablemente con la obesidad a partir de estos

análisis, tras replicarse su asociación en varias poblaciones diferentes, fue el gen FTO (Fat

Mass and Obesity associated gene) (Dina et al., 2007; Frayling, 2007; Scuteri et al., 2007).

A partir de entonces se han realizado nuevos GWAS en los que se han identificado nuevas

variantes genéticas asociadas a obesidad, hasta más de cincuenta (Chambers et al., 2008;

Loos et al., 2008; Thorleifsson et al., 2009; Willer et al., 2009; Speliotes et al., 2010)

(Figura 5).

Figura 5: Representación del efecto en el incremento del peso corporal por alelo de

riesgo en un individuo de 170 cm de alto. Los loci están ordenados por fecha de

descubrimiento y magnitud de su efecto sobre el IMC. Fuente: Day & Loos (2011)


22 | P á g i n a

Recientemente se creó la plataforma GIANT (Genetic Investigation of Anthropometric

Traits) para combinar la información de los GWAS sobre algunos parámetros

antropométricos. Es un consorcio internacional en el que colaboran más de 400 científicos

de distintas instituciones. En relación con los niveles de IMC el trabajo de Speliotes et al.

(2010) reúne información genética de 249.796 sujetos y confirma la asociación de 32

variantes genéticas con el IMC.

A partir de estos resultados, durante los últimos años se han desarrollado diferentes

“scores” de susceptibilidad genética basados en la puntuación obtenida como resultado de

la suma de los alelos de riesgo presentes en cada individuo. Se han desarrollado “scores”

de susceptibilidad genética con 8 (Willer et al., 2009), 9 (Moleres et al., 2012b), 12 (Li et

al., 2010) e incluso 32 de estas variantes genéticas (Speliotes et al., 2010), confirmándose

en todos ellos un efecto aditivo sobre la obesidad (incremento de IMC)

2.1.2.1. Fat Mass and Obesity Associated gene (FTO)

El gen FTO se descubrió en el año 2002 en un modelo de animal murino (Ft) que tenía

una deleción en la región en la que se localiza este gen (Peters et al., 2002). Codifica para

una demetilasa de ácidos nucleicos dependientes de 2-oxoglutarato que se localiza en el

núcleo celular (Gerken et al., 2007). Se trata de un gen de gran tamaño, ocupa sus 9

exones, más de 400 kb, del cromosoma 16 y se encuentra altamente conservado en

vertebrados (Razquin et al., 2011). Se expresa principalmente en el cerebro, en concreto en

una región del hipotálamo, además de en músculo, tejido adiposo, páncreas y corazón entre

otros (Dina et al., 2007).

Cinco años más tarde de ser identificado el gen FTO dos estudios independientes

descubrieron la relevancia biológica de este gen en el ser humano. Frayling y col. (2007)

identificaron el gen FTO a través de un estudio de asociación a escala genómica (GWAS)

llevado a cabo en 1.924 sujetos con diabetes tipo 2 y 2.938 sujetos sanos. Se asociaron

varios polimorfismos de este gen con la presencia de la diabetes pero también se vio que

esta asociación estaba mediada por el IMC. Otro estudio de este tipo en relación con el

IMC llevado a cabo en 6.148 sujetos de una población aislada de Cerdeña, encontró una

importante asociación entre varios polimorfismos de este gen y el IMC (Scuteri et al.,

2007). En los años siguientes estos resultados se han replicado en diversas poblaciones


23 | P á g i n a

caucásicas, especialmente en niños (Rendo et al., 2009). Otros rasgos asociados con la

obesidad como el peso corporal, los niveles de leptina, la masa grasa o la circunferencia de

la cintura han sido asociados con los polimorfismos del gen FTO (Andreasen et al., 2008a;

Zimmermann et al., 2011; Moleres et al., 2012a).

El polimorfismo rs9939609 es la variante genética más estudiada del gen FTO a día de

hoy. Se trata del cambio de una adenina por una timina (A/T) y es el alelo A el que se

asocia con un mayor peso corporal y riesgo de obesidad (Frayling et al., 2007; Lappalainen

et al., 2009; Rendo et al., 2009; Razquin et al., 2011; Moleres et al., 2012a). Varios

estudios han relacionado este polimorfismo con una mayor ingesta así como con la pérdida

del control sobre la alimentación (Cecil et al., 2008; Tanofsky-Kraff et al., 2009).

Los estudios mencionados anteriormente asocian el alelo A del SNP rs9939609 del

gen FTO con mayores índices de adiposidad, sin embargo, no todos los estudios confirman

estos resultados. Hardy et al. (2010) proponen que el efecto de esta variante genética en la

adiposidad varía con la edad. Este grupo observó en un estudio longitudinal con un

seguimiento de 53 años que el efecto de este polimorfismo era fuerte en la niñez y la

adolescencia, alcanzando su mayor efecto en adultos jóvenes, alrededor de los 20 años. Sin

embargo, ese efecto parecía atenuarse con la edad. Por otro lado Jacobsson et al. (2011)

obtuvieron resultados similares en una población de 70 años de edad, observaron que

ninguno de los SNPs o haplotipos estudiados en el gen FTO estaba relacionado con el

consumo total de energía o con la adiposidad.

2.2. Interacción gen-estilo de vida

Como se muestre en la Figura 9 el peso corporal está determinado por una

combinación de factores genéticos y ambientales relacionados con el estilo de vida, así

como por las interacciones entre ellos (Marti et al., 2008; Ordovas et al., 2011; Moleres et

al., 2012a). De esta manera, mientras que algunos individuos parecen ser susceptibles a

cambios en su estilo de vida, otros parecen ser resistentes a éstos.


24 | P á g i n a

Figura 9: Factores influyentes en el desarrollo de la obesidad. Fuente: Ochoa (2007)

Actualmente se sabe que diversos factores ambientales pueden modular el efecto de

estas variantes genéticas implicadas en el desarrollo de la obesidad.

2.2.1. Nutrigenética

En los últimos años la ciencia de la nutrición ha acuñado el término “genética

nutricional” todavía en desarrollo. Esta ciencia trata de aplicar la biología de sistemas a la

investigación nutricional (van Ommen & Stierum, 2002; van Ommen, 2004) con el fin de

comprender cómo la nutrición influye en las vías metabólicas y en el control homeostático

y entender también cómo esta regulación se ve alterada en el inicio de la aparición de una

enfermedad relacionada con la dieta. Además, también trata de determinar hasta qué punto

la carga genética del individuo contribuye a la aparición de la enfermedad (Ross, 2007).

Dentro de este concepto se engloban los términos “nutrigenómica” y “nutrigenética”.

La nutrigenómica hace referencia al análisis de las diferencias entre los nutrientes con

respecto a la regulación de la expresión de genes (Mutch et al., 2005) y la nutrigenética

estudia el impacto o la influencia de las variantes genéticas de los individuos en la

respuesta metabólica a los nutrientes (Gillies, 2003) (Figura 10). Así, el progreso de ambas

disciplinas viene ligado a la futura utilización de dietas personalizadas para retrasar el

inicio de la enfermedad y optimizar el mantenimiento de la salud humana (Marti et al.,

2005; de Luis et al., 2008).

OBESIDAD

ESTILOS DE VIDA

Composición de

la dieta

Actividad física

GENÉTICA

SNPs

Haplotipos

“Scores” genéticos

Copy number variation

INTERACCIONES

INTERACCIONES


25 | P á g i n a

NUTRIGENÓMICA

NUTRIGENÉTICA

Figura 10: Nutrigenómica y nutrigenética, dos caras de la misma moneda. Fuente:

Mutch et al. (2005)

Un objetivo importante de la nutrigenética es formular recomendaciones nutricionales

en relación a los riesgos y a los beneficios de ciertos componentes dietéticos o incluso de

dietas concretas. Es por esto que también se le ha llamado “nutrición individualizada” o

“nutrición personalizada” (Ordovás et al., 2005). Este trabajo se centra en la obesidad

como desenlace pero el estudio de las interacciones gen-dieta resulta muy interesante en el

ámbito de la investigación de muchos desórdenes metabólicos (Ordovas et al., 2011),

como por ejemplo el estudio del metabolismo lipídico (Garcia-Rios et al., 2012).

En el caso de la obesidad es evidente su relación con un exceso en la ingesta calórica

pero no todos los sujetos responden de igual forma. Estudios en familias de adopción

(Stunkard et al., 1986) y en gemelos (Price & Gottesman, 1991) han demostrado que el

peso corporal viene determinado por la influencia de factores genéticos y ambientales.

De entre las variantes genéticas más estudiadas en el campo de la nutrigenética en

relación con la obesidad se encuentran el polimorfismo Pro12Ala del gen PPARG2 y el

rs9939609 del gen FTO. En las Tablas 5 y 6 se muestra un resumen de aquellos estudios

que han encontrado interacción entre distintos componentes de la dieta y estas variantes

genéticas sobre el peso corporal en poblaciones adultas.


26 | P á g i n a

Tabla 5: Resumen de los estudios que analizan interacciones entre el polimorfismo

Pro12Ala del gen PPARG2 y distintos componentes de la dieta en relación a la

obesidad. Fuente: Razquin et al. (2011)

Población adulta Interacción con el SNP

Pro12Ala Efecto en el fenotipo Referencia

Sujetos españoles con un

elevado riesgo cardiovascular

(n=774)

Dieta Mediterránea con

un alto consumo de

aceite de oliva virgen y

nueces en sujetos 12Ala

Menor

crecimiento del

perímetro de la

cintura

Razquin et al.

(2009)

Mujeres del NHS de EEUU

(n=2141)

Bajo consumo de AGM

en sujetos 12Ala

Mayor IMC Memisoglu et al.

(2003)

Sujetos canadienses del

“Quebec Family Study”

(n=720)

Alto consumo de grasas

en los sujetos Pro12Pro

Mayor IMC y

perímetro de

cintura

Robitaille et al.

(2003)

Sujetos obesos y controles del

estudio WPIC-Heidelberg

(n=308)

Alto consumo de ácido

araquidónico en sujetos

12Ala

Mayor riesgo

de obesidad

Nieters et al. (2002)

Sujetos españoles obesos y

controles (n=313)

Alto consumo de HC en

los sujetos 12Ala

Mayor riesgo

de obesidad

Marti et al. (2002a)

Sujetos caucásicos no

diabéticos (n=592)

Alto ratio AGP:AGS en

sujetos 12Ala

Mayor IMC Luan et al. (2001)

Alelo de riesgo: 12Ala

Tabla 6: Resumen de los estudios que analizan interacciones entre el SNP rs9939609

del gen FTO y distintos componentes de la dieta en relación a la obesidad

Población adulta Interacción con el SNP

Pro12Ala

Efecto en el

fenotipo Referencia

Sujetos del estudio GOLDN

(n=1069)

Alto consumo de AGS en

sujetos AA

Mayor IMC Corella et al. (2011)

Sujetos suecos (n=4839) del

“Malmö Diet and Cancer Study “

Alto consumo de grasas

en los sujetos AA

Mayor IMC Sonestedt et al.

(2009)

Sujetos suecos (n=4839) del

“Malmö Diet and Cancer Study “

Bajo consumo de HC en

los sujetos AA

Mayor IMC Sonestedt et al.

(2009)

Alelo de riesgo: A


27 | P á g i n a

En el caso del gen FTO son más numerosos los estudios que han encontrado

interacciones en poblaciones de niños y adolescentes pues parece ser que su efecto

“obesogénico” tiene una mayor relevancia en esta etapa de la vida y desaparece en etapas

más avanzadas (Hardy et al., 2010; Jacobsson et al., 2011).

2.2.2. Interacción gen-actividad física

En el mantenimiento del balance energético la actividad física juega un papel

importante. Es evidente que en los últimos años el estilo de vida sedentario ha favorecido

un balance energético positivo, desencadenante de la obesidad (Chakravarthy & Booth,

2004).

Son numerosos los estudios que describen interacciones entre variantes genéticas y la

actividad física sobre el IMC y el riesgo de obesidad. Por ejemplo, Corbalan et al. (2002)

observaron que en mujeres obesas la presencia del alelo 27Glu del polimorfismo Gln27Glu

del gen ADRB2 parecía impedir el beneficio asociado a altos niveles de actividad física

sobre el IMC en comparación con aquellas mujeres que no portaban este alelo. Por otro

lado, el trabajo de Marti et al. (2002b) sugería que el efecto del loci Trp64Arg en el gen

ADRB3 sobre el riesgo de obesidad podía ser modificado por los niveles de actividad

física. Así, el alelo de riesgo 64Arg se asociada con obesidad en las mujeres con hábitos de

vida sedentarios pero no en aquellas físicamente activas. En el caso de la variante genética

rs7566605 (G/C) del gen INSIG2 un estudio observó interacción con la actividad física y

determinó un mayor IMC en los sujetos físicamente inactivos con el genotipo CC frente a

los sujetos físicamente inactivos portadores del alelo G (Andreasen et al., 2008b). También

se ha observado interacción sobre la adiposidad con la actividad física en variantes de los

genes LIPE (Garenc et al., 2009), PPARGC1A (Ridderstrale et al., 2006) y UCP3 (Otabe

et al., 2000), entre otros.

En los últimos años el SNP para el que más se ha estudiado su interacción con la

actividad física sobre la adiposidad es el rs9939609 del gen FTO. Muchos estudios

observan que el efecto de esta variante genética sobre la obesidad podría quedar atenuado

por altos niveles de actividad física (Andreasen et al., 2008a; Rampersaud et al., 2008;

Cauchi et al., 2009; Jacobsson et al., 2009; Sonestedt et al., 2009; Vimaleswaran et al.,

2009; Lee et al., 2010; Ruiz et al., 2010; Scott et al., 2010; Xi et al., 2010; Ahmad et al.,


28 | P á g i n a

2011; Sonestedt et al., 2011). Sin embargo, algunos estudios no consiguieron replicar esta

asociación (Tan et al., 2008; Jonsson et al., 2009; Lappalainen et al., 2009; Kaakinen et

al., 2010; Liem et al., 2010; Liu et al., 2010). Para conocer el alcance de la interacción

entre esta variante genética y la actividad física sobre la adiposidad Kilpelainen et al.

(2011) recogieron la información disponible, 45 estudios con un total de 218,166 adultos, y

realizaron un meta-análisis. Concluyen que el riesgo de obesidad asociado a este

polimorfismo descendía en un 27% en aquellos sujetos físicamente más activos.


29 | P á g i n a

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OBJETIVOS

O b j e t i v o s

47 | P á g i n a

El objetivo principal del presente trabajo es determinar el posible efecto que ejercen

diversas variantes genéticas en el desarrollo de sobrepeso y obesidad, así como su

interacción con el estilo de vida (dieta y actividad física) en una población mayor de 55

años de la cohorte SUN.

Los objetivos específicos son los siguientes:

1. Conocer el efecto del polimorfismo Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 sobre el

IMC en la población del estudio SUN y mediante meta-análisis en una población

ampliada de 49.092 sujetos.

2. Estudiar el efecto conjunto de los polimorfismos rs9939609 del gen FTO y Pro12Ala

(rs1801282) del gen PPARG2 y del estilo de vida (dieta y actividad física) sobre el

riesgo de obesidad en población mayor de 55 años de la cohorte SUN.

3. Analizar el efecto del polimorfismo 3111T/C (rs1801260) del gen CLOCK, implicado

en la regulación de los ciclos circadianos, y su interacción con la actividad física sobre

el riesgo de sobrepeso y obesidad en población mayor de 55 años de la cohorte SUN.

SUJETOS Y MÉTODOS

S u j e t o s y M é t o d o s

51 | P á g i n a

1. EL ESTUDIO SUN

1.1. Características generales

Este estudio forma parte del Proyecto SUN. El Proyecto SUN es una cohorte de

graduados universitarios que fue diseñada para establecer la asociación entre la dieta y

la ocurrencia de enfermedades y patologías crónicas. Entre los efectos a valorar están

incluidos el sobrepeso, la obesidad y el cambio de peso a lo largo del tiempo (Martinez-

Gonzalez et al., 2002b). Se trata de un estudio de cohortes prospectivo y dinámico, es

decir, con reclutamiento permanentemente abierto. La cohorte fue diseñada en

colaboración con la Escuela de Salud Pública de Harvard usando una metodología

similar a la de las grandes cohortes Americanas como la Nurses’ Health Study (NHS) o

la Health Professionals Follow-up Study (HPFS) (Martinez-Gonzalez et al., 2002b).

Antes de comenzar el reclutamiento de los participantes, se realizó un estudio piloto

para valorar la viabilidad de la cohorte. En este estudio piloto se comprobó que existía

suficiente variabilidad en el consumo de los alimentos más representativos de la Dieta

Mediterránea, confirmando que esta población ofrecería un rango de exposiciones

suficiente como para detectar posibles asociaciones dieta-enfermedad (Sanchez-Villegas

et al., 2002).

El reclutamiento de los participantes se inició en diciembre de 1999 y se ha

realizado en diversos colectivos:

Agrupación de graduados de la Universidad de Navarra (Alumni

Navarrensis).

Colegio de Enfermería de Navarra.

Miembros con título universitario de la aseguradora sanitaria de la Clínica

Universitaria [Asistencia Clínica Universitaria de Navarra (ACUNSA)].

Alumnos recién graduados de la Universidad de Navarra.


52 | P á g i n a

Padres (con título universitario) de alumnos actuales de la Universidad de

Navarra.

Miembros de otros colegios profesionales de diversas provincias españolas.

A los miembros de estos colectivos se les envió una carta de invitación,

exponiéndoles brevemente los objetivos del estudio, explicándoles lo que supondría su

participación y la colaboración que se les exigiría a lo largo del tiempo. Junto con la

carta de invitación, se proporcionaba el cuestionario basal de la cohorte y un sobre de

respuesta a franquear en destino.

El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Clínica de la

Universidad de Navarra. Se consideró que la respuesta al cuestionario equivalía al

consentimiento informado de los individuos a participar en el estudio (Martinez-

Gonzalez et al., 2002b).

Para este subestudio se seleccionó a todos aquellos participantes del Proyecto SUN

que en el momento en el que fueron reclutados eran mayores de 55 años. Todos los

voluntarios que participaron en el estudio firmaron un consentimiento informado

(Anexo 1). En mayo de 2008 se comenzaron a enviar las cartas de participación así

como los kits para la recogida de saliva de los cuales se extraería el ADN. Se enviaron

1.619 propuestas de participación de las que se obtuvieron 1.247 respuestas. 108

personas decidieron no participar y 1.085 contestaron afirmativamente. Finalmente se

recibieron de vuelta 986 kits de saliva.

1.2. Cuestionario basal

Una vez que el participante contesta el cuestionario basal y lo envía al

departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública de la Universidad de Navarra,

éste se procesa de manera estandarizada. En primer lugar, los datos ‘administrativos’

(nombre, direcciones) del participante se introducen en una base de datos (base de datos

administrativa) cuyo acceso es restringido y no tiene conexión a la red. A continuación,

se lleva a cabo la supervisión manual para verificar si se contestó correctamente y la

codificación del cuestionario para algunas variables. Posteriormente, se realiza la lectura


53 | P á g i n a

óptica del mismo, pasando esa información a una base de datos en formato SPSS donde

a cada participante sólo se le identifica con un código numérico. Así se mantiene en

todo momento la confidencialidad respecto a la identidad de los participantes.

En el cuestionario basal se pueden distinguir diversos apartados. Un ejemplar del

mismo se puede consultar en el Anexo 2.

1.2.1. Variables socio-demográficas

El cuestionario recoge información sobre fecha de nacimiento, sexo, nivel máximo

de estudios alcanzado, carrera universitaria cursada, estado civil, situación laboral,

número de hijos y número de personas con las que vive el participante.

1.2.2. Actividad física y otras variables de estilo de vida

Para la valoración de la actividad física se utiliza un cuestionario de frecuencia de

práctica de actividades basado en el empleado en el NHS y el HPFS (Tanasescu et al.,

2003; Hu et al., 2004). El cuestionario utilizado en el estudio SUN indaga sobre la

participación en 17 actividades deportivas diferentes y el tiempo semanal dedicado a

cada una de ellas (10 categorías: “desde nunca” a “más de 11 horas a la semana”).

También se pregunta sobre los meses al año que se practica cada actividad para tener en

cuenta la variabilidad estacional. Se añade otra pregunta para cada actividad sobre el

número de meses al año en que se practica. Para cuantificar el volumen de actividad

física durante el tiempo libre se asignan equivalentes metabólicos (METs) a cada

actividad. Los METs representan la cantidad de energía empleada por el organismo

durante la realización de una actividad física respecto a la empleada estando sentado y

en reposo (Ainsworth et al., 2000). Para estimar la cantidad total de actividad física en

una semana (METs-horas) se multiplicó el número de horas semanales dedicadas a una

determinada actividad por la asignación de equivalentes metabólicos específica de esa

actividad. Por último, sumando los METs-horas correspondientes a todas las actividades

durante una semana se obtuvo la cantidad total de METs-horas/semana de cada

participante en el estudio, que comprobamos que estaba adecuadamente correlacionada

(Rho de Spearman=+0,51; p=0,002) con el gasto energético medido de forma objetiva


54 | P á g i n a

con un acelerómetro triaxial en un estudio de validación realizado en una submuestra de

la cohorte (Martinez-Gonzalez et al., 2005).

Otras variables de estilo de vida que se recogían en el cuestionario eran: hábito

tabáquico, exposición pasiva al tabaco, consumo de alcohol y hábito de picotear entre

comidas. Se recogieron otras variables no relacionadas con los objetivos de este estudio

como son las referentes a conducción bajo los efectos del alcohol, uso de cinturón de

seguridad y/o casco, número de kilómetros conducidos anualmente en moto y/o coche,

y uso de cremas fotoprotectoras.

1.2.3. Variables clínicas y antropométricas

El cuestionario incluía preguntas sobre la presencia de un diagnóstico médico de

diversas manifestaciones de enfermedad cardiovascular, cáncer, diabetes,

hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, entre otras patologías. Asimismo, se recogía

información sobre los antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular,

hipertensión arterial (HTA), cáncer, diabetes y obesidad.

La información sobre el peso y la talla era auto-declarada. En un estudio realizado

en todos los participantes del estudio SUN que habían sido pesados y tallados en la

Clínica Universidad de Navarra en un plazo no superior a 3 meses tras responder al

cuestionario, se observo un error relativo medio para el peso de –1,45% (IC 95%: –

2,03% a –0,86%) y de –2,64% (IC 95%:–3,70% a –1,60%) para el IMC (Bes-Rastrollo

et al., 2005).

1.2.4. Evaluación dietética

La dieta se valoró utilizando un cuestionario semi-cuantitativo de frecuencia de

consumo de alimentos (CSFC) previamente validado en España por (Martin-Moreno et

al., 1993) y recientemente vuelto a validar

(de la Fuente et al., 2010; Fernandez-Ballart

et al., 2010). En el estudio de validación de este cuestionario, comparando la ingesta de

nutrientes según el cuestionario y según tres registros de 4 días cada uno, separados 3

meses entre sí, se observaron unos coeficientes de correlación atenuados entre un

mínimo de 0,45 para la vitamina A y un máximo de 0,90 para el consumo de alcohol.

En relación con el grado más grosero de mala clasificación, únicamente el 3% de los


55 | P á g i n a

individuos clasificados en el quintil más alto o más bajo según el registro de alimentos

tenían asignado el quintil más bajo o más alto según el CSFC. Este CSFC ya fue

utilizado previamente por el departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública de la

Universidad de Navarra en un estudio de casos y controles para evaluar factores

dietéticos asociados con la incidencia de un primer infarto de miocardio (Fernandez-

Jarne et al., 2002; Hernandez-Diaz et al., 2002; Martinez-Gonzalez et al., 2002c;

Martinez-Gonzalez et al., 2002a; Fernandez-Jarne et al., 2003).

Al cuestionario original de Martín-Moreno se le han añadido algunas pequeñas

modificaciones para mejorar su adaptación a los objetivos específicos del proyecto

SUN. La versión empleada en el proyecto SUN cubre 136 ítems e incluye una sección

de preguntas abiertas para suplementos de vitaminas y/o minerales y otros alimentos no

especificados en el cuestionario junto con otra nueva sección más específica sobre los

patrones de consumo que son típicos de la Dieta Mediterránea (por ejemplo: vino y

grasas) y algunas cuestiones sobre actitudes y prácticas frente a los alimentos y la salud.

Además, se incluye una pregunta específica indagando sobre el seguimiento de dietas

especiales.

Para cada uno de los alimentos incluidos en el cuestionario se especifica un tamaño

de la ración y se ofrece la posibilidad de elegir entre 9 posibles frecuencias de consumo

de ese alimento (desde ‘nunca o casi nunca’ hasta ‘más de seis veces al día’). Este tipo

de cuestionarios ofrecen una buena aproximación a la dieta habitual del individuo.

2. ANÁLISIS DE VARIANTES GENÉTICAS

2.1. Extracción de ADN

La extracción de ADN se realizó a partir de una muestra de saliva, recibida por

correo postal, de los participantes. Con este fin se envió a cada uno de los voluntarios

un kit diseñado para la recogida de saliva (Oragene®ADN Self-Collector kit- OG250).

Cada voluntario recibió un sobre franqueado con el kit, debía rellenarlo según las

instrucciones y volver a enviarlo. El kit está diseñado para ser almacenado a

temperatura ambiente durante años o de forma indefinida si se almacena entre 15ºC y


56 | P á g i n a

20ºC, gracias a la solución Oragene•ADN. Esta solución es un estabilizador de ADN

que es liberada al girar la tapa para cerrar el kit. La capacidad del kit es de unos 4 ml de

saliva y el promedio del volumen de muestra recibido es de 5,1 ml. Existen estudios que

certifican la buena calidad del ADN genómico obtenido a partir de saliva humana

(Hansen et al., 2007).

En total se recibieron 986 kits y se extrajo el ADN según el protocolo facilitado por

el laboratorio. Primero se trata de lisar las células con un reactivo que facilita el

laboratorio Oragene al realizar el pedido de los kits. Una vez lisadas se llega a precipitar

el ADN gracias a una serie de centrifugaciones. Cuando el ADN ha precipitado se

diluye en un buffer en el que se encuentra totalmente estable. Cada muestra fue

cuantificada con el espectrofotómetro NanoDrop para determinar la concentración de la

solución madre de ADN, a partir de la cual se realizaron diluciones con las

concentraciones adecuadas de ADN para las diferentes técnicas de detección de

polimorfismos.

2.2. Protocolo para la detección de variantes genéticas

El análisis de las muestras de ADN genómico obtenido de la saliva se realizó

mediante el procedimiento de PCR a tiempo real multicolor o PCR fluorigénica a punto

final. Este procedimiento consiste en la detección de polimorfismos mediante el Sistema

de Detección de Secuencias Perkin Elmer (SDS PE) ABI PRISM 7900. Este proceso se

da en dos etapas diferentes:

1. PCR cuantitativa

2. Discriminación alélica a punto final.

La técnica de PCR tiene el mismo fundamento que la PCR tradicional en cuanto a

que utiliza unos cebadores específicos para amplificar la región del gen que interesa

para su estudio. La ventaja que incorpora es que incluye unas sondas específicas de

dicha región, marcadas con fluorescencia que permiten detectar el número de copias

generadas en cada ciclo de PCR.


57 | P á g i n a

En el caso de la detección de polimorfismos, las sondas son específicas de alelo, es

decir, que en cada reacción de PCR se introducen dos tipos de sondas que son idénticas

entre sí, excepto en una base que es el polimorfismo puntual que queremos detectar y

que además están marcadas con diferentes fluorocromos. Las sondas únicamente emiten

fluorescencia cuando se han unido a su región complementaria. De esta forma se pueden

diferenciar los homocigotos de cada alelo y el heterocigoto según se detecte un tipo de

fluorescencia u otro o ambos (Figura 13).

La emisión de fluorescencia en cada muestra es recogida por un programa asociado

al soporte de PCR a tiempo real ABI PRISM 7900HT, que indica los valores de emisión

de los dos fluorocromos para cada muestra.

Figura 12. Fundamento de la discriminación alélica

La PCR se realizó en placas de 384 pocillos (PCR microplate, Axygen scientific)

conteniendo cada uno de ellos un volumen final de 10 µL. De este volumen 5 µL son de

ADN a una concentración de 10 ng/µL y 5 µL de una mezcla que contiene 4.750 µL de

Master mix (Taqman Universal Master Mix, Applied biosystems) y 0.250 µL de de la

mezcla de los dos cebadores y las dos sondas específicas de la región que comprende el

polimorfismo.


58 | P á g i n a

Una vez añadidos todos los reactivos a la placa, ésta es sellada con una lámina

transparente para evitar la evaporación y la contaminación de las muestras, y es

introducida en el detector de secuencias (PCR a tiempo real). En este soporte la mezcla

es incubada en las siguientes condiciones: a 95ºC durante 10 minutos y posteriormente

se repite durante cuarenta ciclos el proceso a 92ºC durante 15 segundos y 60ºC durante

1 minuto.

Figura 13. Amplificación del gen por RT-PCR

Tras este proceso en el que obtenemos las curvas de amplificación de cada muestra

que representan la sonda que se ha unido específicamente, se realiza la discriminación

alélica a punto final propiamente dicha. En este punto la misma placa es incubada

durante 1 minuto a 60ºC y el programa procesa los datos de emisión de fluoresecencia

mostrando los valores para ambos fluorocromos (FAM y VIC) que son interpretados

según los valores de los controles:

Dos pocillos contienen agua ultrapura milli-Q más la mezcla de Master

mix y sondas/cebadores.

Se han hecho duplicados de un 25% de las muestras para comprobar los

resultados obtenidos.


59 | P á g i n a

Figura 14. Análisis de la discriminación alélica

3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis descriptivo de la población según los diferentes grupos (Ej.

Polimorfismo) se realizó mediante pruebas paramétricas como los test de t-student para

muestras independientes y el del análisis de la varianza (ANOVA) (Martinez-Gonzalez

et al., 2006).

El test de chi-cuadrado (χ2) se aplicó para evaluar el equilibrio de Hardy-Weinberg,

así como para estudiar la distribución de las frecuencias de los genotipos y las variables

cualitativas de interés, en este caso la presencia de sobrepeso u obesidad (Martinez-

Gonzalez et al., 2006).

Con el fin de analizar la fuerza de asociación entre los posibles genotipos y el IMC

se realizaron modelos de regresión lineal, incluyendo como covariables aquellas

estimadas necesarias para ajustar el modelo (sexo, edad, energía total y actividad física)


60 | P á g i n a

(Martinez-Gonzalez et al., 2006). También se estudió esta asociación mediante el

análisis de covarianza (ANCOVA) ajustando por las mismas variables de confusión.

El riesgo o la protección que ejercían los posibles genotipos sobre el riesgo de

padecer sobrepeso u obesidad se analizó mediante un modelo de regresión logística, a

través de la estimación de la odds ratio (OR). Este modelo fue ajustado por los mismos

factores de confusión que los modelos de regresión lineal y ANCOVA (Martinez-

Gonzalez et al., 2006).

Las pruebas de razón de verosimilitud se realizaron para estudiar la posible

interacción entre los genotipos y los distintos factores de estilo de vida sobre el riesgo

de desarrollar sobrepeso u obesidad. También se estudió esta misma interacción sobre

los niveles de IMC.

Con el fin de controlar la aparición de falsos positivos debido al análisis múltiple se

realizó el test de Benjami-Hochberg para comparaciones múltiples (Benjamini &

Hochberg, 1995).

El valor del punto medio de algunas de las variables estudiadas (consumo de

carbohidratos o niveles de actividad física) se presentó como mediana. El nivel de

significación estadística se fijó en p<0,05 y el de tendencia o significación estadística

marginal en p<0,10. Los datos fueron analizados con el programa estadístico SPSS

versión 15.0 para Windows XP (SPSS, Inc., Chicago, EE.UU).


61 | P á g i n a

4. BIBLIOGRAFÍA

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RESULTADOS

Pro12Ala variant of the PPARG2 gene increases body mass index: an updated meta-analysis encompassing 49,092 subjects

CAPÍTULO 1

R e s u l t a d o s : C a p í t u l o 1

69 | P á g i n a


Cecilia Galbete, Estefanía Toledo, Miguel Ángel Martínez-González, J. Alfredo Martínez, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti

Enviado a Obesity 15-Sept.-2011, Primera revisión 21-Dic.-2012, Segunda revisión 6-Feb.-2012

Resumen

El gen del receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma 2 (PPARG2) ha

sido ampliamente estudiado en su relación con la obesidad y los desordenes

metabólicos. En este sentido, se han publicado un gran número de trabajos sobre la

asociación entre el polimorfismo Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 con el índice

de masa corporal (IMC=kg/m2), sin embargo, los resultados son controvertidos. El

objetivo de este meta-análisis fue estudiar el efecto del polimorfismo Pro12Ala del gen

PPARG2 sobre el IMC.

Con este propósito se recogieron todos aquellos datos publicados sobre este tema antes

de enero del 2011 así como nuestros propios datos. Éstos últimos se referían a una sub-

población adulta mayor de 55 años de la cohorte SUN (Seguimiento Universidad de

Navarra). En total se reunieron 75 estudios independientes con los que se que se llegó a

agrupar 49.092 sujetos (39.806 portadores del genotipo Pro12Pro y 9.286 portadores del

alelo Ala).

El análisis de los datos reveló un mayor IMC en los sujetos portadores del alelo Ala. Se

estimó un incremento global de +0,065 kg/m2 (IC95%=0,026-0,103, p=0,001) en los

sujetos portadores de este alelo frente a los no portadores. El análisis de los datos

recogidos también mostró que existía heterogeneidad entre los estudios (p de

heterogeneidad < 0,001) aunque parece que no existía sesgo de publicación entre los

trabajos reunidos. Además, también se observó que la asociación entre el alelo Ala y el

IMC era más fuerte en la subpoblación de varones caucásicos (estimación global =

+0,090, IC95%=0,023-0,148, p=0,002, p de heterogeneidad = 0,121).


71 | P á g i n a


Cecilia Galbete, Estefanía Toledo, Miguel Ángel Martínez-González, J. Alfredo Martínez, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti

1 Department of Nutrition, Food Science, Physiology and Toxicology, University of Navarra, Pamplona, Spain

2 Department of Preventive Medicine and Public Health, University of Navarra, Pamplona, Spain

3 Division of Preventive Medicine, University of Navarra Clinic, Pamplona, Spain

CORRESPONDING AUTHOR

Dr. Amelia Marti. Department of Nutrition, Food Science, Physiology and Toxicology

University of Navarra C/Irunlarrea s/n

31008, Pamplona, Navarra, SPAIN Phone: +34 948425600 Fax: +34 948425740

E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]


72 | P á g i n a

ABSTRACT

The peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARG2) gene has been

intensively studied with relation to obesity and metabolic-disorders. Indeed, a large

number of studies assessing the association between the PPARG2 polymorphism

Pro12Ala (rs1801282) and body mass index (BMI) have been published with some

controversial results. In this meta-analysis we investigated the effects of Pro12Ala

polymorphism of PPARG2 gene on BMI.

We collected externally published data and included our own novel data from a study in

the elderly participants (>55 years) of a Mediterranean cohort, the SUN (“Seguimiento

Universidad de Navarra”) Project (n=972). A total of 75 independent studies with

49,092 subjects (39,806 with the genotype Pro12Pro and 9,286 carrier subjects of the

Ala allele) were included.

The meta-analysis revealed a higher BMI with an overall estimation of +0.065 kg/m2

(95%CI=0.026-0.103, p=0.001) for homo-/heterozygous carriers of the Ala allele of the

PPARG2 gene in comparison to non-carriers. The analysis also showed that there was

heterogeneity (p for heterogeneity <0.001), but funnel plots did not suggest apparent

publication bias. Furthermore, the association between the Pro12Ala polymorphism of

PPARG2 gene and increased BMI was stronger in Caucasian. Thus, carriers of the Ala

allele had significantly higher BMI than non carriers in a subsample of 6,528 Caucasian

men subjects (standardized mean difference =0.090, 95%CI=0.032-0.148, p=0.002, p

for heterogeneity =0.121).

This updated meta-analysis showed that carriers of the Ala12 allele of PPARG2 gene

had a higher average BMI.

Running head: Pro12Ala SNP of PPARG2 gene increases BMI


73 | P á g i n a

INTRODUCTION

The peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARG2) is a nuclear

receptor expressed mainly in adipose tissue that exerts an essential role in the regulation

of adipocyte differentiation, lipid storage and insulin sensitization (1). PPARG2 also

plays a key role in the entraining of adipose tissue lipid metabolism to nutritional state.

The PPARG2 gene activation leads to upregulation of genes that mediate fatty acid

uptake and trapping (2).

The PPARG2 gene is located in the chromosome 3p25; the Pro12Ala gene variant

(rs1801282) of this gene, a missense mutation on exon B highly prevalent in the

Caucasian population, has been controversially associated with obesity risk (3). This

mutation is a C→G substitution that results in the conversion of proline to alanine at

residue 12 of the PPARG2 protein (3). Functional analysis revealed that the receptor

expressing this allele displays reduced deoxyribonucleic acid (DNA)-binding affinity

and impaired transcriptional activity in target genes (4).

Two previous meta-analyses assessing the role of Pro12Ala of the PPARG2 gene on

BMI and diabetes-related traits have been published (5-6). In 2003 Masud et al. (5)

conducted a meta-analysis to explore the effect of this Pro12Ala gene variant

(rs1801282) on BMI in 19,136 subjects from 30 studies. They found a stronger

association between the Ala12 allele and BMI in subjects with BMI≥27 kg/m2, whereas

this association was not detected in individuals with BMI<27 kg/m2. In 2006, Tönjes et

al. (6) performed another meta-analysis on the effect of the same SNP (rs1801282) of

PPARG2 on diabetes-related traits in pre-diabetic subjects. They showed a direct

association between carrying the Ala allele and greater BMI in 28,734 subjects from 45

studies.

A number of studies evaluating the association between the Pro12Ala polymorphism of

the PPARG2 gene and BMI have been reported since 1998. In the present study we

pooled data obtained after a comprehensive and systematic literature review to

overcome the limitations of single study research work. Meta-analysis provides more

reliable results by reducing the probability that random errors will produce false-

positive or false-negative associations (7). In our meta-analysis we included novel data


74 | P á g i n a

(n=972) from a Mediterranean study (older participants of the SUN “Seguimiento

Universidad de Navarra” cohort).

SUBJECTS AND METHODS

Subjects

This study was conducted within the framework of the SUN Project (8). This is a

dynamic cohort study including only university graduates initiated in December 1999 in

Spain. The survey and procedures have been previously described elsewhere (8-9). For

this study, elderly participants of the SUN project, those aged more than 55 years old

when the basal questionnaire was completed, were invited to participate. Each volunteer

received a kit designed to collect saliva (Oragene®ADN Self-Collector kit-OG250).

Anthropometric data were collected from the baseline questionnaire. Self-reported

information on BMI had been previously validated in a subsample of the SUN Project

(10).

Voluntary completion of the first questionnaire was considered to imply informed

consent to participate in the SUN Project and written informed consent was requested to

collaborate in this study. The study protocol was performed in accordance with the

ethical standards of the Declaration of Helsinki (as revised in Hong Kong in 1989, in

Edinburgh in 2000 and in South Korea in 2008), and was approved by the Institutional

Ethical Review Board of the University of Navarra.

Genotyping

DNA was extracted from saliva samples according to the instructions of the kits

manufacture (Oragene®ADN Self-Collector kit-OG250). The genotyping for the

Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene (rs1801282) was performed using a

TaqMan assay with allele-specific probes on the ABI Prism 7900HT Sequence

Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to the

standardized laboratory protocols. Replicate quality control samples were included in

each genotyping plate with more than 99% of concordance.


75 | P á g i n a

Statistical analysis

A Chi-square test was use to evaluate the Hardy-Weinberg equilibrium. The association

of Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene on BMI was analysed with Student’s t

test. The threshold for statistical significance was set a priori at p<0.05.

Logistic regression model was performed to calculate Odds Ratio for obesity risk in the

SUN cohort after adjustment for confounding factors such as sex, age (years), physical

activity practice (METs/h-week) and total energy intake (kcal/day).

Raw and adjusted geometric means for BMI have also been calculated to take into

account skewed data. Linear general model was used to estimate adjusted BMI

differences after controlling for the indicated confounding variables.

Meta-analysis

In our meta-analysis, the presence/absence of the Ala allele (dominant effect) was

considered as the exposure, whereas differences in BMI between carriers and non-

carriers of the Ala allele were considered as the outcome (7). To systematically review

differences in BMI across the presence/absence of the Pro12Ala polymorphism of the

PPARG2 gene we used a formal meta-analysis and updated the existing literature

review (5). A Pubmed search was done to find articles concerning the influence of

Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene on BMI using different combinations of

the following search criteria: “BMI”, ”obesity”, “Pro12Ala” and “rs1801282”. A total of

75 studies comprising 109 samples and published before January 2011were identified.

Thirty of them were previously included in Masud’s meta-analysis, with a total sample

of 19,136 subjects. Tönjes’ meta-analysis provided 19,041 new subjects from 27 new

studies and finally our work contribute with 11,243 novel individuals from 19 studies

(Table 4). They are mainly Caucasian, but also some Asian, Mexican Hispanic and

African-American subjects. Studies conducted in children or adolescents were not

included as well as populations in which the allele prevalence of the Pro12Ala

polymorphism of PPARG2 was not similar to those described in the HapMap database

(11-14).


76 | P á g i n a

Our meta-analysis was carried out using the STATA 10.0 software (Stata-Corp, College

Station TX). We estimated a standardized mean difference (SMD) as the weighted

effect size. This variable is the pooled estimate across studies for the BMI difference

(kg/m2) in homo-/heterozygous carriers vs. non-carriers of the Ala allele (dominant

effect). We also calculated a 95% confidence interval (CI) for the pooled difference in

BMI. A test of heterogeneity was also calculated, estimating the Cochran’s Q statistic

(Cochran 1954). A p value <0.05 for this parameter indicates the presence of

heterogeneity. A random-effect model was used when heterogeneity among studies was

observed and a fixed-effect model when studies were homogenous. The I2 test was also

used to evaluate heterogeneity among studies (15). I2 describes the percentage of total

variation across all the studies due to heterogeneity rather than chance and does not rely

on the number of studies. Thus, it can be used for comparisons across meta-analyses

with different number of studies. Percentages around 25% (I2=25), 50% (I2=50) and

75% (I2=75) would indicate low, medium, and high heterogeneity, respectively (15).

The meta-analysis was carried out firstly in the total sample, 9,286 carrier subjects of

the Ala allele compared with 39,806 non-carrier subjects (dominant model) and because

significant heterogeneity was evident the DerSimonian and Laird’s random effect model

was used. In order to evaluate potential sources of heterogeneity we separated samples

into sub-groups using the following criteria: sex, ethnic group (Asian or Caucasian) and

presence or absence of type 2 diabetes. Within the Caucasian samples, we studied

separately men and women, lean and obese and diabetic and non diabetic subjects.

When homogeneity between samples was observed the DerSimonian and Laird’s fixed

effect model was used. The false discovery rate method from Benjamini and Hochberg

was used to control for multiple testing in the sub-groups analyses (16-17).

The visual Funnel plots and the Egger’s test were used to detect evidence of possible

bias resulting from selective publication of positive studies (18).


77 | P á g i n a

RESULTS

Effect of the Pro12Ala polymorphism on body mass index in an elderly SUN

population

The frequency of the Ala allele of the PPARG2 gene was 0.19 in our elderly SUN

population. Specifically, 83% of the subjects carried the Pro12Pro genotype (wildtype),

16% of the subjects were heterozygous for the mutation (Pro12Ala) and only 1% was

homozygous (Table 1). The allele distribution fulfilled the Hardy-Weinberg

equilibrium. The presence of the Ala allele of PPARG2 gene significantly increased

obesity risk (OR=1.664, 95%CI=1.011-2.738, p=0.045). No BMI differences were

observed between carrier and non carrier subjects of the Ala allele of the PPARG2 gene

(Table 2).

Meta-analysis

We pooled 109 comparisons from 75 independent studies comprising 49,092 subjects,

39,806 subjects had the genotype Pro12Pro and 9,286 carrier subjects of the Ala allele

(Figure 1).

The meta-analysis revealed a higher BMI with an overall estimation of +0.065 kg/m2

(95% CI=0.026-0.103, p=0.001) for carriers of the Ala allele of the PPARG2 gene in

comparison to non-carriers (dominant effect). The analysis also showed that there was

significant heterogeneity (p for heterogeneity < 0.001) among the different studies. The

Funnel plot for all samples and the Egger’s test (p=0.249) showed symmetrical

distribution indicating that there was no apparent publication bias (Figure 2).

We investigated possible sources of heterogeneity such as sex, ethnic group (Asian or

Caucasian population) and type 2 diabetes (presence or absence). Within the Caucasian

samples we studied separately men and women, lean and obese and also diabetic and

non diabetic subjects.

As it is reported that the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene is linked to lower

type 2 diabetes risk we performed a meta-analysis including 4,698 diabetic patients, but

no effect for the Ala allele on BMI was apparent.


78 | P á g i n a

A significant association between Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene and

increased BMI was detected in studies performed separately in Caucasian men,

Caucasian women and in obese Caucasian subjects. Following the hypothesis that the

Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene may have a stronger effect on BMI in

markedly obese individuals, we restricted the meta-analysis to Caucasian individuals

and conducted two separate assessments: in obese (6,602 subjects with BMI≥30 kg/m2)

and non-obese subjects (21,438 subjects with BMI<30 kg/m2). A significant association

between the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene and BMI in obese subjects was

observed (SMD=0.156, 95%CI=0.041-0.271, p=0.008, p for heterogeneity < 0.001).

Moreover, in a fixed model meta-analysis with 6,528 Caucasian men, carriers of the Ala

allele had significantly higher BMI than non carriers (SMD=0.090, 95%CI=0.032-

0.148, p=0.002, p for heterogeneity = 0.121). Similar results were observed in

Caucasian women (SMD=0.082, 95%CI=0.010-0.155, p=0.026, p for heterogeneity =

0.246) although after the Benjamini-Hochberg multiple comparison the results did not

remain the statistical significance.

DISCUSSION

PPARG2 is one of the most studied genes as potentially linked to obesity phenotypes.

Indeed, a large number of human studies have shown that the Ala12 allele was

associated with increased adiposity (4).

In our meta-analysis we compiled previously reported studies and have also included

novel data from a study in 972 older participants of the SUN Project. To reduce

heterogeneity different analyses were conducted for Caucasian or Asian population,

men and women, diabetic and non diabetic patients, and also obese and non-obese

subjects.

Our meta-analysis with a total of 49,092 subjects (39,806 Pro12Pro subjects and 9,286

subjects) revealed a significantly higher BMI with an overall estimation of +0.065

kg/m2 for homo-/heterozygous carriers of the Ala allele of the PPARG2 gene when

compared to non-carriers (Pro12Pro subjects).


79 | P á g i n a

A similar effect of the Pro12Ala gene variant of PPARG2 gene on BMI changes

(+0.066 kg/m2) was reported in a former meta-analysis, Masud et al. (2003). They found

heterogeneity but no apparent publication bias.

The magnitude of BMI change observed in our study is more consistent in Caucasian

men. However, it is quite modest when compared with the average BMI increment per

risk allele (+0.170 kg/m2 for 32 genetic variants with P-values <5×10−8) in the largest

meta-analysis (249,796 individuals) of GWAS for BMI thus far published (19-20).

Moreover, the following information for the Pro12Ala SNP (rs1801282) was obtained

from the GIANT consortium data files: a minor allele frequency equal to 0.075 and a p

value equal to 0.0193 (after using regression coefficients and correction for inflation) in

123,856 subjects. Unfortunately, specific information for BMI according to the presence

of the Ala12 allele is not available in the GIANT study.

Sex-differences in studies on obesity and genetic variants are extensively described in

the literature. It is known that PPARG2 expression levels are higher in subcutaneous

than visceral adipose tissue (21). And also it is worthy to mention that PPARG2 inhibits

a key enzyme in oestrogen biosynthesis the aromatase gene suggesting that the action of

PPARG2 could be modulated by sex steroids (22). This fact may be a possible

explanation for the differences observed between men and women (23). Regardless of

the biological pathways, it is important to consider that sex-specific lifestyle

components (dietary intake, alcohol consumption, physical activity levels or smoking

habits) could act as modifiers for the effect of a given genetic variant on BMI.

Other studies have suggested that Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene may

exert its effect on BMI only in markedly obese individuals, for instance, those subjects

with a BMI higher than 27 kg/m2 of the Masud´s meta-analysis (5). Our study partially

confirmed this point since statistical differences were only found for obese Caucasian

(BMI≥30 kg/m2) subjects in a random model meta-analysis. Although the potential

effect of publication bias should also to be taken into consideration.

Our meta-analysis has strengths and limitations. The lack of information on

environmental factors and also gene-gene interactions is a limitation of our work. It has


80 | P á g i n a

been described that dietary modification may influence the association between genetic

variants and obesity and they should be accounted for (4).

One advantage is that information for more 49,000 subjects is pooled together. It

derives from 75 independent studies including 109 samples of different size from 30 to

3,080 participants, which may account as a source of heterogeneity. We included

populations with Ala12 frequency similar to those described in the HapMap database

(24). The frequency of the Ala12 allele of the PPARG2 gene varies from 2% to 33% in

our meta-analysis.

In some sub-groups analysis (i.e. after distributing subjects for ethnic group or obesity

status), heterogeneity remained which suggests that there may be more than one source

of heterogeneity at play. Heterogeneity usually accompanies genetic association studies.

The level of heterogeneity in our meta-analyses by using the I2 test ranges from 13% to

69%, which corresponds to medium heterogeneity (15).

Results from both random- and fixed-effects models have been provided throughout the

article and did not differ substantially. The drawback of combining studies in the

presence of heterogeneity is less related with the pooled estimate achieved and more

with the explicit demonstration of this heterogeneity and the need for caution in

interpretation.

Finally, to address the clinical relevance of the Ala allele of the PPARG2 gene

information from weight loss intervention studies is compiled here. Lindi et al. (25) and

Franks et al. (26) showed that subjects with the Ala12 allele lost more weight after 3

years and 1 year follow-up period, respectively. But, Adamo et al. (27) showed the

opposite result: the Ala12 allele was more frequent in diet-resistant individuals. No

effect was reported for Nicklas et al. (28) and Matsuo et al. (29). They attributed the

lack of effect to specific characteristic of the population: only women, and a low

prevalence of the Ala12 allele, respectively. Other relevant point refers to the effect of

genomic information as a behavioural health intervention. A recent review observed that

simple communication of genetic information and disease susceptibility, in some

motivated groups might be sufficient to trigger lifestyle changes, for others groups,


81 | P á g i n a

additional strategies may be required (30). Unfortunately, the effect of this genotype of

PPARG2 on body weight regulation remains unclear.

In conclusion, the current meta-analysis showed that the Pro12Ala polymorphism of

PPARG2 gene has a modest role in increasing BMI, which cannot be considered very

relevant from the clinical point of view; however, this positive association was

homogeneous, statistically significant, and stronger among Caucasian men.

COMPETING INTEREST

The authors declare no conflict of interest

ACKNOWLEDGMENTS

Research relating to this paper was funded by grant from Spanish Ministry of Health

and Consumption (Grants PI01/0619, PI030678, PI040233, PI042241, PI050976,

PI070240, PI070312, PI081943, PI080819, PI1002658, PI1002293, RD06/0045,

G03/140 and 87/2010), the Navarra Regional Government (36/2001, 43/2002, 41/2005,

36/2008) and the University of Navarra, Línea Especial, Nutrición y Obesidad

(University of Navarra), Carlos III Health Institute (CIBER project, CB06/03/1017) and

RETICS network. The scholarship to C. Galbete from the Asociación de Amigos de la

Universidad de Navarra is fully acknowledged.


82 | P á g i n a

TABLES

Table 1: Prevalence of the Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene in elderly participants of the SUN cohort according to obesity status

BMI ≥ 30 (kg/m2)

BMI < 30 (kg/m2)

OR* CI 95% p

Pro12Pro 75 (0.76) 739 (0.84) 1 (ref)

Pro12Ala 22 (0.22) 134 (0.15) 1.60 0.955-2.671 0.074

Ala12Ala 2 (0.02) 7 (0.01) 3.01 0.602-15.053 0.179

Ala carriers 24 (0.24) 141 (0.16) 1.66 1.011-2.738 0.045

* OR for obesity risk adjusted by sex, age (years), physical activity practice (METs-h/week) and total energy intake (kcal/day)


83 | P á g i n a

Table 2: Characteristics of elderly participants in the SUN cohort according to the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene

Pro12Pro

(n=814)

Ala carriers

(n=164) p

Sex (% male) 70 73 0.329

Age (years) 68.8 (68.4-69.2) 70.0 (68.8-70.8) 0.071

BMI (kg/m2) 25.73 (25.51-25.95) 26.19 (25.69-26.69) 0.091

Adjusted BMI (kg/m2)* 25.74 (25.53-25.92) 26.13 (25.66-26.60) 0.139

BMI (kg/m2)† 25.54 (25.33-25.51) 25.99 (25.52-26.48) 0.089

Adjusted BMI (kg/m2)*† 25.56 (25.51-25.76) 25.93 (25.48-26.39) 0.141

Data are shown as mean (95%CI). Continuous variables were compared using a Student-t test. Categorical variables were compared using Chi squared test. * General Linear Model after adjustment for sex, age (years), physical activity practice (METs-h/week) and total energy intake (kcal/day). † Geometric means for BMI.


84 | P á g i n a

Table 3: Meta-analyses of the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene on BMI conducted in different population groups

n cases

n controls

SMD 95% CI p I2 (%) Pheterogeneity

ALL STUDIES

9286 39806 0.065 0.026-0.103

0.0010 54.1 < 0.001

Sex - Women 1034 4137 0.073 0.003-0.142 0.0394 14.1 0.275 - Men 1544 5302 0.098 0.041-0.155 0.0008* 34.5 0.054 Diabetes - Diabetic 766 3932 0.057 -0.023-0.136 0.1615 12.8 0.310 - Non diabetic 3822 15906 0.053 -0.003-0.108 0.0629 44.3 0.001 ASIAN 308 4167 0.141 -0.036-0.317 0.1188 47.8 0.024 CAUCASIAN 7979 27147 0.046 0.008-0.084 0.0168 45.4 < 0.001 Sex - Women 939 3497 0.082 0.010-0.155 0.0264 18.2 0.246 - Men 1516 5012 0.090 0.032-0.148 0.0023* 27.4 0.121 Diabetes - Diabetic 646 2559 0.058 -0.029-0.145 0.1936 31.0 0.161 - Non diabetic 3417 11956 0.043 -0.012-0.098 0.1236 38.8 0.010 BMI - Obese 1444 5158 0.156 0.041-0.271 0.0081 68.8 < 0.001 - Non obese 5093 16345 0.031 -0.016-0.077 0.1971 43.3 0.002 SMD: Pooled Standardized Mean Differences for BMI (kg/m2) between 12Ala carriers and Pro12Pro subjects (dominant model). I2: percentage of the total variability in a set of effect sizes due to true heterogeneity *: p value < 0.05 after correcting for Benjamini-Hochberg multiple comparisons


85 | P á g i n a

Study Masud's meta-analysis

Tonjes' meta-analysis

Galbete's meta-analysis

N Controls N Cases % Ala12 Description

Beamer et al., 1998 • • • 141 28 16.57 Obese, non diabetic Caucasian men (n=57) and women (n=112) analyzed separatelyBeamer et al., 1998 • • • 408 109 21.08 Non obese, non diabetic Caucasian men (n=316) and women (n=201) analyzed separatelyDeeb et al., 1998 • • • 257 76 22.82 Non diabetic Caucasian subjectsDeeb et al., 1998 • • • 695 278 28.57 Caucasian subjectsMori et al., 1998 • • • 203 12 5.58 Asian (Japanese) subjectsEk et al., 1999 • • • 540 212 28.19 Obese Caucasian men Ek et al., 1999 • • • 641 228 26.24 Non obese Caucasian subjectsKoch et al., 1999 • 75 33 30.56 Non obese, non diabetic Caucasian subjectsMancini et al., 1999 • • 114 17 12.98 Non obese, diabetic Caucasian menMancini et al., 1999 • • 255 57 18.27 Non obese, non diabetic, Caucasian men Ringel et al., 1999 • • 388 134 25.67 Non obese Caucasian subjectsRingel et al., 1999 • • 372 131 26.04 Non obese, diabetic Caucasian SubjectsValve et al., 1999 • • • 107 34 24.11 Obese, non diabetic, Caucasian womenClement et al., 2000 • • 246 49 16.61 Diabetic Caucasian subjectsClement et al., 2000 • • 294 78 20.97 Non obese, non diabetic Caucasian subjectsClement et al., 2000 • • • 339 63 15.67 Obese, non diabetic Caucasian subjectsCole et al., 2000 • • 711 210 22.80 Diabetic Caucasian subjectsHara et al., 2000 • • 496 45 8.32 Asian (Japanese) subjectsHara et al., 2000 • • • 400 15 3.61 Asian (Japanese) subjectsHegele et al., 2000 • 90 29 24.37 Diabetic Oji-Cree (Canadian) women

Hegele et al., 2000 • • 148 23 13.45 Non diabetic Oji-Cree (Canadian) women

Lei et al., 2000 • • 553 43 7.21 Asian (Taiwanese) subjectsMeirhaeghe et al., 2000 • • 661 177 21.12 Non obese Caucasian subjectsMeirhaeghe et al., 2000 • • 136 34 20.00 Obese Caucasian subjectsOh et al., 2000 • • • 211 18 7.86 Asian (Korean) subjectsPoirier et al., 2000 • • • 507 168 24.89 Non obese, non diabetic Caucasian menEk et al., 2001 • • • 456 160 25.97 Non obese, non diabetic Caucasian menEk et al., 2001 • • • 270 94 25.82 Non obese, non diabetic Caucasian menHseuh et al., 2001 • • 234 66 22.00 Mexican-American subjectsLindi et al., 2001 • • 93 26 21.85 Non obese CaucasianLuan et al., 2001 • • • 203 56 21.62 Non obese, non diabetic Caucasian menLuan et al., 2001 • • • 265 68 20.42 Non obese, non diabetic Caucasian womenNicklas et al., 2001 • • 56 14 20.00 Obese, non diabetic Caucasian womenSchaffler et al., 2001 • • 276 83 23.12 Non obese CaucasianSwarbrick et al., 2001 • • 215 77 26.37 Obese Caucasian subjectsSwarbrick et al., 2001 • • 277 94 25.34 Non obese Caucasian subjectsAhluwalia et al., 2002 • 139 44 24.04 Non obese, diabetic Caucasian subjectsDoney et al., 2002 • 869 238 21.50 Obese, diabetic Caucasian subjects Eriksson et al., 2002 • • • 324 152 31.93 Non obese Caucasian subjectsFrederiksen et al., 2002 • • • 1671 574 25.57 Non obese, non diabetic Caucasian subjects

Gonzalez-Sanchez et al., 2002 • • 37 14 27.45 Caucasian men

Gonzalez-Sanchez et al., 2002 • • 82 12 12.77 Caucasian woman

Gonzalez-Sanchez et al., 2002 • • 137 22 13.84 Non obese Caucasian menGonzalez-Sanchez et al., 2002 • • 127 31 19.62 Non obese Caucasian womenLindi et al., 2002 • • • 337 153 31.22 Obese Caucasian subjectsMasud et al., 2002 • • 813 271 25.00 Non obese Caucasian subjectsSchneider et al., 2002 • 156 38 19.59 Non obese, non diabetic Caucasian subjects Schneider et al., 2002 • • 87 13 13.00 No obese, diabetic Caucasian subjectsStumvoll et al., 2002 • • 135 42 23.73 Non obese, non diabetic Caucasian subjectsStumvoll et al., 2002 • • • 391 128 24.66 Non obese, non diabetic Caucasian subjects Thamer et al., 2002 • • 73 25 25.51 Non obese Caucasian men Yamamoto et al., 2002 • • • 454 24 5.02 Asian (Japanese) subjectsYamamoto et al., 2002 • • 109 8 6.84 Asian (Japanese) subjectsYamamoto et al., 2002 • • 77 4 4.94 Asian (Japanese) subjects

Baratta et al., 2003 • • 296 42 12.43 Non diabetic Caucasian subjects

Eurlings et al., 2003 • • 57 22 27.85 Familiar combined hyperlipidemia Caucasian subjects

Eurlings et al., 2003 • • 93 31 25.00 Non diabetic Caucasian subjects

Kahara et al., 2003 • • 117 6 4.88 Asian (Japanese) subjects

Kolehmainen et al., 2003 • • 22 8 26.67 Obese Caucasian subjects

Lindi et al., 2003 • • 114 36 24.00 Caucasian subjects

Muller et al., 2003 • • 678 117 14.72 Pima Indian subjects

Poulsen et al., 2003 • • 161 47 22.60 Caucasian subjects

Poulsen et al., 2003 • • 268 77 22.32 Caucasian subjects

Robitaille et al., 2003 • • 586 134 18.61 Caucasian subjectsRosmond et al., 2003 • • 186 82 30.60 Non obese Caucasian menThamer et al., 2003 • • 500 148 22.84 Caucasian subjects

Andrulionyte et al., 2004 • • 592 178 23.12 Obese Caucasian subjectsBuzzetti et al., 2004 • • 1008 207 17.04 Obese, non diabetic Caucasian subjects

Franks et al., 2004 • • 86 27 23.89 Non diabetic Caucasian women

Franks et al., 2004 • • 114 26 18.57 Non diabetic Caucasian women

Franks et al., 2004 • • 91 22 19.47 No diabetic Caucasian men

Franks et al., 2004 • • 108 32 22.86 No diabetic Caucasian menKim et al., 2004 • 977 74 7.04 Asian (Korean) subjectsPihlajamaki et al., 2004 • 208 103 33.12 Non obese Caucasian subjectsPisabarro et al., 2004 • 39 6 13.33 No diabetic Caucasian subjectsTai et al., 2004 • • 2796 284 9.22 Non diabetic Asian (Chinese, Malaya, Indian) subjectsTai et al., 2004 • • 499 39 7.25 Impair glucose Asian (Chinese, Malaya, Indian) subjectsTai et al., 2004 • • 374 46 10.95 Diabetic Asian (Chinese, Malaya, Indian) subjectsTakata et al., 2004 • • 139 7 4.79 Non diabetic Asian menTakata et al., 2004 • 90 11 10.89 Non diabetic Asian subjectsBarbieri et al., 2005 • 362 67 15.62 Non obese Caucasian subjectsDanawati et al., 2005 • 196 7 3.45 Non diabetic Indian subjectsDanawati et al., 2005 • 330 7 2.08 Diabetic Indian subjectsFornage et al., 2005 • • 1765 79 4.28 African-americans subjectsFornage et al., 2005 • • 1581 473 23.03 Non obese Caucasian subjectsGhoussaini et al., 2005 • • 673 192 22.20 Non obese, non diabetic Caucasian subjectsGhoussaini et al., 2005 • • 397 110 21.70 Obese Caucasian subjectsMeirhaeghe et al., 2005 • • 893 240 21.18 Caucasian subjectsMousavinasab et al., 2005 • • 173 79 31.35 Non diabetic Caucasian subjectsOstergard et al., 2005 • 61 18 22.78 Non diabetic, non obese Caucasian subjectsRhee et al., 2005 • 226 27 10.67 Asian (Korea) subjectsTanko et al., 2005 • 1088 386 26.19 Non obese, non diabetic Caucasian women

Weiss et al., 2005 • • 24 8 25.00 Non diabetic Caucasian men

Weiss et al., 2005 • • 37 4 9.76 Non diabetic Caucasian womenStefanski et al., 2006 • 154 60 28.04 Obese, diabetic Caucasian subjects Canizales-Quinteros et al., 2007 • 105 26 19.85 Non diabetic Amerindian-Mexican subjects (IMC<25)Canizales-Quinteros et al., 2007 • 76 32 29.63 Non diabetic Amerindian-Mexican subjects (IMC>25)Helwig et al., 2007 • 515 193 27.26 Non obese, non diabetic Caucasian menKim et al., 2007 • 115 14 10.85 Asian( Korea) women Mattevi et al., 2007 • 130 23 15.03 Non obese, non diabetic Caucasian menMattevi et al., 2007 • 153 29 15.93 Non obese, no diabetic Caucasian womenVaccaro et al., 2007 • 301 42 12.24 Diabetic, obese Caucasian subjectsMorini et al., 2008 • 501 65 11.48 Non obese, non diabetic Caucasian men (n=211) and women (n=355) analyzed separatelyBen Ali et al., 2009 • 197 18 8.37 Tunisian womenBen Ali et al., 2009 • 151 21 12.21 Tunisian menEreqat et al., 2009 • 179 23 11.39 Palestinian subjectsMilewicz et al., 2009 • 222 96 30.19 Non obese, non diabetic Caucasian womenRazquin et al., 2009 • 837 138 14.15 Caucasian (high cardiovascular risk) subjectsPresent Study • 814 165 16.85 Caucasian subjects

Table 4: Brief description of each population included in the meta-analysis


86 | P á g i n a

Effect size meta-analysis plot(random effect)

Test for heterogenity Qh = 235.36, I2 = 54.1%, p < 0.0013.51 3.51

DL pooled effect size, SMD = 0.065p = 0.001 (95% CI = 0.026-0.103)

Figure 1Study n mean (SD) n mean (SD)Beamer et al., 1998 a, b 141 35.30 (8.31) 28 41.50 (8.46)Beamer et al., 1998 a, b 408 26.10 (4.04) 109 27.30 (4.18)Deeb et al., 1998 a, b 257 26.20 (3.20) 76 25.00 (3.50)Deeb et al., 1998 a, b 695 27.30 (5.30) 278 27.74 (4.79)Mori et al., 1998 a, b 203 24.40 (3.30) 12 24.00 (3.00)Ek et al., 1999 a, b 540 35.50 (5.50) 212 36.29 (5.9)Ek et al., 1999 a, b 641 26.20 (3.70) 228 25.90 (3.19)Koch et al., 1999 75 25.70 (2.22) 33 25.80 (2.44)Mancini et al., 1999 a 114 27.50 (3.60) 17 27.50 (2.90)Mancini et al., 1999 b 255 25.60 (3.30) 57 25.60 (3.10)Ringel et al., 1999 a 388 24.20 (3.60) 134 24.66 (3.49)Ringel et al., 1999 a 372 28.00 (5.00) 131 27.21 (4.71)Valve et al., 1999 a, b 107 34.50 (3.80) 34 35.58 (3.70)Clement et al., 2000 a 294 47.00 (7.50) 78 48.00 (7.50)Clement et al., 2000 a 339 29.50 (5.40) 63 29.70 (5.37)Clement et al., 2000 a, b 246 22.00 (1.90) 49 22.30 (1.90)Cole et al., 2000 a 711 28.90 (4.40) 210 30.29 (4.22)Hara et al., 2000 a 400 23.50 (4.00) 15 22.90 (3.56)Hara et al., 2000 a, b 496 23.70 (3.18) 45 24.40 (3.29)Hegele et al., 2000 90 30.80 (4.60) 29 30.90 (5.70)Hegele et al., 2000 b 148 28.20 (5.60) 23 27.30 (6.00)Lei et al., 2000 a 553 24.20 (2.35) 43 25.90 (3.28)Meirhaeghe et al., 2000 a 661 25.50 (4.40) 177 26.20 (4.50)Meirhaeghe et al., 2000 a 136 29.90 (3.6) 34 30.70 (3.70)Oh et al., 2000 a, b 211 26.10 (4.90) 18 25.10 (2.10)Poirier et al., 2000 a, b 507 23.30 (2.25) 168 23.45 (2.52)Ek et al., 2001 a, b 456 25.60 (3.00) 160 25.66 (3.25)Ek et al., 2001 a, b 270 23.50 (3.60) 94 23.10 (3.18)Hseuh et al., 2001 a 234 29.60 (4.4) 66 30.50 (4.22)Lindi et al., 2001 a 93 27.50 (4.90) 26 28.53 (3.34)Luan et al., 2001 a, b 203 26.54 (2.47) 56 26.77 (2.52)Luan et al., 2001 a, b 265 25.93 (3.32) 68 25.72 (3.58)Nicklas et al., 2001 b 56 31.80 (4.49) 14 33.30 (4.86)Schaffler et al., 2001 a 276 27.20 (6.40) 83 27.47 (6.31)Swarbrick et al., 2001 a 215 32.90 (2.60) 77 32.90 (2.60)Swarbrick et al., 2001 a 277 22.00(1.80) 94 22.10 (2.00)Ahluwalia et al., 2002 139 29.60 (3.10) 44 29.50 (2.90)Doney et al., 2002 869 30.70 (6.00) 238 31.28 (6.87)Eriksson et al., 2002 a, b 324 27.50 (4.40) 152 28.00 (4.30)Frederiksen et al., 2002 a, b 1671 25.80 (4.20) 574 25.65 (3.94)Gonzalez-Sanchez et al., 2002 b 37 32.80 (2.50) 14 31.80 (1.60)Gonzalez-Sanchez et al., 2002 b 82 33.50 (3.50) 12 33.60 (4.10)Gonzalez-Sanchez et al., 2002 b 137 25.90 (2.60) 22 25.70 (1.90)Gonzalez-Sanchez et al., 2002 b 127 25.50 (2.70) 31 25.80 (2.40)Lindi et al., 2002 a, b 337 31.10 (4.40) 153 31.54 (4.94)Masud et al., 2002 a 813 27.50 (4.30) 271 27.56 (4.14)Schneider et al., 2002 87 28.70 (4.10) 13 27.60 (3.40)Schneider et al., 2002 a 156 27.50 (3.50) 38 27.70 (3.30)Stumvoll et al., 2002 a 135 24.70 (4.60) 42 24.40 (3.24)Stumvoll et al., 2002 a, b 391 25.80 (7.90) 128 24.40 (5.70)Thamer et al., 2002 a 73 23.40 (1.70) 25 23.05 (2.00)Yamamoto et al., 2002 a, b 77 24.70 (2.60) 4 24.80 (3.80)Yamamoto et al., 2002 b 454 23.20 (2.60) 24 23.70 (3.70)Yamamoto et al., 2002 b 109 20.80 (2.90) 8 19.80 (2.60)Baratta et al., 2003 b 296 27.00 (6.00) 42 27.00 (5.00)Eurlings et al., 2003 b 57 27.20 (2.90) 22 27.20 (3.50)Eurlings et al., 2003 b 93 25.30 (3.60) 31 25.70 (4.70)Kahara et al., 2003 b 117 23.40 (2.90) 6 22.70 (2.10)Kolehmainen et al., 2003 b 22 49.30 (1.80) 8 54.40 (2.70)Lindi et al., 2003 b 114 26.40 (3.00) 36 26.90 (2.50)Muller et al., 2003 b 678 36.80 (7.80) 117 34.20 (7.57)Poulsen et al., 2003 b 161 25.90 (5.08) 47 25.00 (4.11)Poulsen et al., 2003 b 268 25.70 (4.91) 77 25.51 (3.51)Robitaille et al., 2003 b 586 26.90 (7.20) 134 28.20 (7.00)Rosmond et al., 2003 b 186 25.90 (3.40) 82 26.84 (4.86)Thamer et al., 2003 b 500 26.70 (6.71) 148 26.50 (6.08)Andrulionyte et al., 2004 b 592 30.65 (4.00) 178 31.11 (4.45)Buzzetti et al., 2004 b 1008 32.80 (9.00) 207 32.40 (10.00)Franks et al., 2004 b 86 27.00 (4.08) 27 27.80 (3.33)Franks et al., 2004 b 114 26.90 (5.55) 26 25.50 (4.59)Franks et al., 2004 b 91 26.90 (3.43) 22 26.50 (3.80)Franks et al., 2004 b 108 25.60 (4.36) 32 25.90 (3.85)Kim et al., 2004 977 25.46 (4.06) 74 26.64 (4.90)Pihlajamaki et al., 2004 208 25.70 (4.40) 103 26.03 (4.26)Pisabarro et al., 2004 b 39 32.60 (7.10) 6 25.80 (3.50)Tai et al., 2004 b 2796 23.50 (6.87) 284 24.12 (4.72)Tai et al., 2004 b 499 25.66 (7.60) 39 25.78 (4.81)Tai et al., 2004 b 374 26.99 (7.74) 46 27.48 (5.70)Takata et al., 2004 b 139 22.90 (3.20) 7 22.70 (3.10)Takata et al., 2004 b 90 19.80 (1.90) 11 19.10 (1.40)Barbieri et al., 2005 362 25 .00(2.90) 67 23.50 (2.60)Danawati et al., 2005 196 22.60 (3.60) 7 26.70 (4.60)Danawati et al., 2005 330 23.70 (3.40) 7 25.90 (5.50)Fornage et al., 2005 b 1765 25.30 (4.20) 79 24.30 (5.33)Fornage et al., 2005 b 1581 23.50 (3.85) 473 24.20 (4.35)Ghoussaini et al., 2005 b 673 23.61 (3.63) 192 24.02 (3.60)Ghoussaini et al., 2005 b 397 40.82 (8.37) 110 40.08 (7.34)Meirhaeghe et al., 2005 b 893 26.50 (5.00) 240 27.00 (5.20)Mousavinasab et al., 2005 b 173 26.30 (3.80) 79 26.50 (5.00)Ostergard et al., 2005 61 25.70 (2.70) 18 25.90 (2.20)Rhee et al., 2005 226 23.99 (2.39) 27 24.98 (2.86)Tanko et al., 2005 1088 26.10 (2.80) 386 26.09 (3.90)Weiss et al., 2005 b 24 27.00 (4.09) 8 29.00 (2.83)Weiss et al., 2005 b 37 29.00 (6.08) 4 28.00 (4.00)Stefanski et al., 2006 154 34.00 (3.70) 60 34.60 (3.80)Canizales-Quinteros et al., 2007 105 25.40 (3.10) 26 27.00 (5.00)Canizales-Quinteros et al., 2007 76 27.00 (5.00) 32 29.50 (5.50)Helwig et al., 2007 515 27.36 (4.08) 193 27.54 (4.33)Kim et al., 2007 115 24.44 (2.89) 14 25.81 (4.66)Mattevi et al., 2007 130 26.20 (4.56) 23 28.30 (5.28)Mattevi et al., 2007 153 25.70 (4.95) 29 25.50 (4.31)Vaccaro et al., 2007 301 31.30 (5.80) 42 33.60 (7.1)Morini et al., 2008 501 25.30 (4.40) 65 26.00 (5.20)Ben Ali et al., 2009 197 43.24 (5.70) 18 43.14 (7.40)Ben Ali et al., 2009 151 34.55 (4.50) 21 37.67 (5.90)Ereqat et al., 2009 179 31.50 (6.20) 23 31.50 (6.70)Milewicz et al., 2009 222 27.20 (4.70) 96 28.06 (4.90)Razquin et al., 2009 837 29.30 (3.30) 138 29.20 (3.20)Present Study 814 25.70 (3.20) 165 26.20 (3.30)

TOTAL 39806 9286

Pro12Pro 12AlaFIGURES

Figure 1: Meta-analysis of the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene effect on BMI comprising 49,092 subjects. aStudies included in Masud’s meta-analysis. bStudies included in Tonjes’ meta-analysis


87 | P á g i n a

Figure 2: Funnel plot of 109 samples included in the meta-analysis Egger’s test: p=0.249. SMD: Standardized Mean Difference


88 | P á g i n a

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CAPÍTULO 2

Lifestyle factors modify obesity risk linked to PPARG2 and FTO variants in an elderly population: a cross-sectional analysis in the

SUN Project


93 | P á g i n a


SUN Project

Cecilia Galbete, Jon Toledo, Miguel Ángel Martínez-González, J. Alfredo Martínez, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti

Enviado a Genes & Nutrition 30-Nov.-2011, Primera revisión 4-Ene.-2012,

Aceptado 4-Abr.-2012 (DOI 10.1007/s12263-012-0296-4)

Resumen

Los factores genéticos pueden interaccionar con los estilos de vida modificando el

riesgo de obesidad asociado a ellos. El objetivo de este estudio fue explorar el efecto de

los polimorfismos Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 y rs9939609 del gen FTO en

el riesgo de desarrollar obesidad y estudiar su interacción con diferentes estilos de vida

en una población adulta mayor.

Con este objetivo se reclutaron 978 sujetos (edad 69±6 años) de la cohorte SUN

(“Seguimiento Universidad de Navarra”) mayores de 55 años en el momento en el que

empezaron a formar parte de él. Se obtuvo su ADN a partir de muestras de saliva y los

datos de estilo de vida y dieta a partir de cuestionarios auto-referidos validados. Las

muestras se genotiparon mediante PCR a tiempo real seguida de discriminación alélica.

El estudio de nuestros datos demostró que aquellos sujetos que portaban el alelo de

riesgo Ala del gen PPARG2 mostraban un aumento significativamente mayor del riesgo

de sufrir obesidad que los sujetos Pro12Pro (OR=1,66, IC95%=1,01-2,74, p=0,045).

Además, se observó que este riesgo asociado al alelo de riesgo Ala se veía incrementado

en aquellos sujetos con un bajo nivel de actividad física así como en aquellos con un

alto consumo de carbohidratos. Asimismo, se advirtió que aquellos sujetos que

presentaban el alelo minoritario del gen PPARG2 y también el alelo de riesgo A del gen

FTO el elevado consumo de carbohidratos hacía que se incrementase en más de tres

veces su riesgo de sufrir obesidad (OR=3,26, IC95%=1,19-8,89, p=0.021)

comparándolos con los sujetos Pro12Pro/TT.


95 | P á g i n a


SUN Project

Cecilia Galbete, Jon Toledo, Miguel Ángel Martínez-González, J. Alfredo Martínez, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti


2 Department of Pathology and Laboratory Medicine, Center for Neurodegenerative Disease Research, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, PA,

USA 3 Department of Preventive Medicine and Public Health, University of Navarra,

Pamplona, Spain 4Division of Preventive Medicine, University of Navarra Clinic, Pamplona, Spain








96 | P á g i n a

ABSTRACT

Genetic factors may interact with lifestyle factors to modify obesity risk. FTO and

PPARG2 are relevant obesogenes. Our aim was to explore the effect of Pro12Ala

(rs1801282) of PPARG2 and rs9939609 of FTO, on obesity risk and to examine their

interaction with lifestyle factors in an elderly population.

Subjects (n=978, aged 69±6) were recruited from the SUN (“Seguimiento Universidad

de Navarra”) Project. DNA was obtained from saliva and lifestyle and dietary data were

collected by validated self-reported questionnaires. Genotyping was assessed by RT-

PCR plus allele discrimination.

Subjects carrying the Ala allele of PPARG2 gene had a significantly increased obesity

risk compared to non carrier -Pro12Pro- subjects (OR 1.66, 95% CI: 1.01-2.74,

p=0.045). Greater obesity risk was also found in inactive or high carbohydrate intake

subjects with the Ala12 allele of PPARG2 gene. Interestingly, subjects carrying the Ala

allele of the PPARG2 gene and with a high CHO (>246 g/d) intake had an increased

obesity risk compared to Pro12Pro subjects (OR 2.67, 95%CI: 1.3-5.46, p=0.007, p for

[CHO xPPARG2] interaction=0.046). Moreover, in subjects with a high CHO intake the

co-presence of the Ala allele of PPARG2 gene and one A minor allele (rs9939609) of

FTO gene did increase obesity risk (OR 3.26, 95%CI: 1.19-8.89, p=0.021) when

compared to non carrier (Pro12Pro/TT) subjects.

In conclusion, it appears that lifestyle factors may act as effect modifiers for obesity risk

linked to Ala12 allele of the PPARG2 gene and the A minor allele of FTO gene in an

elderly population.


97 | P á g i n a

BACKGROUND

Obesity is a complex disease with genetic and environmental basis (Marti 2008). FTO

and PPARG2 gene variants for obesity risk have been widely studied (Razquin 2011).

Several meta-analyses showed an increased BMI in subjects with the Ala allele of the

PPARG2 gene (Masud 2003; Tonjes 2006). This observation was recently confirmed,

carriers of the Ala allele of the PPARG2 gene had a significant higher BMI (+0.060

kg/m2) compared to non-carriers (Galbete et al, in press), with a total of 49,337 subjects.

As it is known the FTO gene harbours the stronger association with adiposity in GWAS

studies. Although the physiological function of FTO remains unclear (Tung 2011). In

the large meta-analysis of GWAS thus far performed with 123,865 individuals of

European ancestry the FTO locus was confirmed as one of the 32 variants associated

with BMI with P-values <5×10−8 (Speliotes 2010; Speakman 2011). A significant

association between rs9939609 SNP of FTO gene and obesity, with an overall odds

ratio (OR) for obesity of 1.31 under per-allele comparison was reported in another

meta-analysis including 111,571 subjects (Peng 2011).

Epidemiological studies have suggested that in addition to genetic factors, a variety of

lifestyle factors (e.g., dietary composition, low level of physical activity (PA)) may

contribute to the epidemic of obesity and interact with genetic factors to modify obesity

risk (Chung 2008; Walley 2009).

The interaction between lifestyle factors and these gene variants (Pro12Ala of PPARG2

(rs1801282) and rs9939609 of FTO) have been explored in different populations and

cohorts. On one hand, some studies have reported an interaction between Ala allele of

PPARG2 gene variant and carbohydrate (CHO) or fat intake, (Marti 2002; Lamri 2011)

on obesity risk whereas in others no association was found (Memisoglu 2003; Nelson

2007). A significant interaction between food intake and rs9939609 SNP of FTO gene

on BMI was detected in some populations (Corella 2011; Lappalainen 2012; Moleres

2012).

With regard to PA, recently, Kilpelainen (2011) meta-analyzed data from 45 studies

with a total of 218,166 adults. They reported a significant interaction between the minor


98 | P á g i n a

A allele of rs9939609 and PA, being the odds for obesity risk 27% smaller in active vs.

inactive subjects.

A cohort study is the best way to identify incidence and natural history of a disease, and

can be used to examine multiple outcomes after a single exposure (Grimes 2002). The

SUN Project (Seguimiento Universidad de Navarra–University of Navarra Follow-up-)

is a multi-purpose prospective Mediterranean dynamic cohort designed to study the

prospective association of diet and other lifestyle factors with various health outcomes

including cardiovascular disease, hypertension, diabetes or obesity (Martinez-Gonzalez

2002; Segui-Gomez 2006).

The aim of this study was to explore the effect of two gene variants, Pro12Ala of

PPARG2 and rs9939609 of FTO, on obesity risk and to examine their interaction with

lifestyle factors in an elderly population of the SUN study


Sample population

This work has been conducted within the framework of the SUN Project (Martinez-

Gonzalez 2002). The SUN Project was initiated in December 1999 in Spain and

recruitment is permanently open. All participants are university graduates and about

50% of them are health professionals themselves.

Lifestyle and dietary data is collected by self-reported biennially mailed questionnaires

(Alonso 2005; Bes-Rastrollo 2005; Martinez-Gonzalez 2005). Dietary intake was

assessed using a semi-quantitative food frequency questionnaire (136 food items)

included at baseline. Validity and reproducibility of this questionnaire has recently been

re-evaluated (de la Fuente-Arrillaga 2010). Nutrient intakes of 136 food items were

calculated as frequency multiplied by nutrient composition of specified portion size for

each food item, using an ad hoc computer program developed for this purpose. A

trained dietician updated the nutrient data bank using the latest available information

from the food composition table for Spain. Baseline intake of macronutrients was

analyzed as quantitative variables (grams per day) (de la Fuente-Arrillaga 2010;

Fernandez-Ballart 2010).


99 | P á g i n a

PA was ascertained through a baseline 17-item questionnaire. The index of metabolic

equivalent task hours per week (METs-h/week) was computed by using the time spent

engaging in 17 activities and multiplying the time spent by the resting metabolic rate

(MET-score) specific for each activity. The METs-h/week for all activities were

combined to obtain a value of total METs-h/week, which adequately correlated with the

objectively measured energy expenditure in a validation study in a subsample of the

cohort (Martinez-Gonzalez 2005).

For this research, elderly participants of the SUN project (more than 55 years old when

the baseline questionnaire was completed) were invited to participate in a genetic study

in May 2008. Each participant received a kit designed to collect saliva and 1085

participants agreed to participate but 986 kits were received back. Finally, 978

volunteers were correctly genotyped for the rs1801282 SNP (PPARG2) and 967 for the

rs9939609 SNP (FTO). The mean age was 69 years (70% male). Anthropometric data

was collected from the baseline questionnaire. Self-reported information on BMI had

been previously validated in a subsample of the SUN Project (Bes-Rastrollo 2005).

Specific written informed consent was requested to participate in this study. The study

protocol was performed in accordance with the ethical standards of the Declaration of

Helsinki (as revised in Hong Kong in 1989, in Edinburgh in 2000 and in South Korea in

2008), and was approved by the Institutional Ethical Review Board of the University of

Navarra.

Genotyping

Saliva samples were collected with specially designed kits (Oragene®ADN Self-

Collector kit-OG250) and DNA was extracted according to the manufacturer’s

instructions. The genotyping for the Pro12Ala SNP of PPARG2 gene (rs1801282) and

for the rs9939609 SNP of the FTO gene were performed using Taqman assays with

allele-specific probes on the ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) according to standardized laboratory protocols.


100 | P á g i n a


Hardy-Weinberg equilibrium was tested using a chi-square test. This test was also used

to analyze if there were differences on the genotype distribution according to obesity

status.

The Odds Ratio (OR) for obesity associated with genotypes (dominant models) were

fitted with an unconditional logistic regression model after adjustment for sex, age, PA

and total energy intake as covariables. To address the combined effect of these two

polymorphisms, Pro12Ala (rs1801282) of PPARG2 and rs9939609 of FTO gene

(dominant model) a dummy variable was created. Non carrier subjects (Pro12Pro and

TT) were considered as the reference category. Three different categories according to

the genotypes were considered: having the Ala allele (rs1801282) of PPARG2 gene, the

A allele (rs9939609) of FTO gene, and the third, for the co-presence of the two risk

alleles (Ala and A allele). The association between the different possible genotypes and

BMI was analyzed using linear regression models and analysis of covariance

(ANCOVA), after adjusting for potential confounders (sex, age, PA and total energy

intake). We also evaluated the relationship between the genetic variants Pro12Ala

(rs1801282) of PPARG2 and rs9939609 of FTO and a high CHO intake or low PA

practice (dichotomized at the median) on obesity risk. Indicated interactions were

estimated for obesity risk with the likelihood ratio test. Product terms between the SNPs

and lifestyle factors were calculated firstly, with the corresponding variables

dichotomized at the median (model 1 and 3), and secondly, as continuous variables

(model 2 and 4). Interactions between the SNPs and lifestyle factors on BMI (as a

continuous variable) were also tested.

RESULTS

Anthropometrical and lifestyle characteristics of elderly subjects of the SUN cohort

according to the two genotypes (Pro12Ala SNP (rs1801282) of PPARG2 and the

rs9939609 SNP of FTO gene, dominant model) are shown in Table 1. The frequencies

of these two SNPs did fulfil the Hardy-Weinberg equilibrium.

The ORs for obesity risk were calculated for each gene variant after adjustment for sex,

age, PA and total energy intake. The presence of the Ala allele of PPARG2 gene


101 | P á g i n a

significantly increased obesity risk in the adjusted models (including total population,

subjects with high CHO intake, and those with low PA practice). The obesity risk linked

to the Ala12 allele of PPARG2 was 1.66 (95%CI: 1.01-2.74, p=0.045) in the total

population (Table 2).

Interestingly, as shown in Table 2, obesity risk was higher in subjects with a high CHO

consumption (>246 g/day) carrying the Ala allele of the PPARG2 gene (OR 2.67,

95%CI: 1.30-5.46, p=0.007). This p-value did remain statistically significant after

applying the Benjamini-Hochberg multiple comparison correction. The interaction for

obesity risk between CHO intake and PPARG2 gene was also statistically significant (p

for [CHOxPPARG2] interaction =0.046). Similar results for this interaction were also

obtained when considering CHO as a continuous trait (p for [CHOxPPARG2]

interaction =0.030).

Furthermore, subjects with a high CHO intake and carriers of the Ala allele, had an

increased obesity risk, by the co-presence of one A minor allele (rs9939609) of FTO

gene (OR 3.26, 95%CI: 1.19-8.89, p=0.021) compared to non carriers of the two alleles

(Pro12Pro and TT) subjects with a high CHO intake.

The presence of the Ala12 allele (rs1801282) of PPARG2 gene increased obesity risk to

2.14 (95%CI: 1.13-4.05, p=0.020) in subjects with a sedentary lifestyle (<18.6 METs-

h/week) compared to Pro12Pro subjects. However, there was no evidence of statistical

interaction (p for interaction = 0.243). Furthermore, in inactive carrier subjects of the

Ala12 allele of PPARG2, the co-presence of the A minor allele (rs9939609) of FTO

gene had a further rise in obesity risk to 2.51 (95%CI: 1.01-6.23, p=0.047) compared to

inactive non carrier (Pro12Pro and TT) subjects. The interactions between the genetic

variants and low PA practice for obesity risk were not statistically significant (Table 2).

Linear regression models were also fitted to confirm the association between the co-

presence of the two risk alleles (Ala of the PPARG2 and A allele of FTO gene) and

BMI (as a continuous variable) in the three models undertaken: total population, high

CHO intake and low PA practice (Table 2). Moreover, the same tendency was observed

in the ANCOVA analysis (Figure 1).


102 | P á g i n a

DISCUSSION

The main finding of this work is that a high CHO consumption seems to modify the

obesity risk linked to the Pro12Ala SNPs of the PPARG2 gene in an elderly population.

Some strengths of the SUN cohort deserve to be mentioned. The homogeneity of

participants with regard to socioeconomic status which helps to better control

confounding and the higher educational level of participants in the cohort that ensures a

higher validity in self-reported information (Beunza 2010; Sayon-Orea 2011). A

potential limitation in our study is the self-reported outcome, nevertheless, self-reported

weight and BMI had been previously validated (Bes-Rastrollo 2005). Another limitation

is that identifying interactions between genetic variants and lifestyle factors may need

much larger sample size (Smith 1984).

The present work shows that the co-presence of these two risk alleles in PPARG2 and

FTO gene increases obesity predisposition, but, novel studies are needed to elucidate the

potential mechanisms. Pro12Ala variant of PPARG2 gene is one of the most studied

genes as potentially linked to obesity phenotypes (Razquin 2011). Previous meta-

analysis had associated the Ala12 minor allele with a higher BMI (Masud 2003; Tonjes

2006; Galbete et al. in press) and this study confirmed in a larger sample of aged subject

the association of the Ala12 allele with obesity risk.

Depending on the genotype the response of individuals to a dietary component or

components could be different. The Pro12Ala genetic variant is probably the most

studied mutation in relation to the interaction with dietary components on adiposity

features. Fatty acids are natural agonist of PPARG transcription factor; consequently

most of the studies have been directed to analyze the interaction between Pro12Ala and

fat intake. However, this study replicated an earlier association of this PPARG2 genetic

variant with obesity risk linked to a high CHO intake (Marti 2002). Notably, in our

study the interaction between CHO consumption and this Ala12 allele of PPARG2 for

obesity risk was statistically significant although confirmation if needed in larger

sample studies.

The PPARG Pro12Ala genotype seems to be associated with obesity, type 2 diabetes

and CHD risk (Dallongeville 2009). This variant is a diet-dependent sensor, and in the


103 | P á g i n a

presence of a positive energy balance, the adipogenic capacity of the Ala allele exceeds

that of the Pro12 genotype, being partially attributed to diet-dependent effects of the

PPARG2 Pro12Ala genotype on adiponectin signaling and on the interaction of

PPARG2 with several transcriptional coregulators (Anderson 2010). From a

mechanistic point of view it is shown that the Ala12 allele alters ligand interaction

between PPARG2 and its cofactors (Pgc1alfa, SRC1, Ncor) leading to an effect beyond

decreased DNA binding efficiency (Heikkinen 2009) .The enhancement in obesity risk

linked to a high CHO intake may be partly explained by the fact that CHO are not able

to activate the PPARG protein and could worsen the action of the Ala12 substitution on

the receptor activity.

The impact of this rs9939609 SNP of FTO gene on human body weight is mainly

through energy intake, however some results are contradictory (Berentzen 2008; Do

2008; Speakman 2008, Goossens 2009; Haupt 2009). In our elderly population no effect

of FTO on obesity was found. This observation agrees with former findings in mature

subjects. Hardy (2010) described a weak association between FTO and BMI at age of

50 years. Jacobsson (2011) suggested that the effect of FTO on corporal adiposity may

decrease by age. Our limited sample size could also impair our ability to find significant

results.

In regard to PA it is well known that there is an inverse relationship with obesity

(Levine 1999; Levine 2005; Kuliczkowska 2008). Previous studies had reported that a

high PA practice was linked to a lower fasting insulin level in Pro12 homozygous

subjects of PPARG2 gene (Franks 2004) but no studies were found on association

between Pro12Ala polymorphism and inactivity on obesity risk. Nevertheless, our

results suggested an association of this genetic variant with obesity risk linked a low PA

practice.

To our knowledge we assessed for the first time the joint association of PPARG2 and

FTO gene variants on obesity risk when modulated by lifestyle factors. Previous studies

have found a higher obesity risk associated with the combined effect of several

polymorphisms. Some research work reported the combined effect of PPARG and

ADRB3 or ACE I/D gene variants for increasing BMI (Huang 2011; Passaro 2011)

stated that the combined effect of FTO and MC4R genetic variants was strongly

associated with obesity risk and BMI. Similarly, Cauchi (2009) observed that these two


104 | P á g i n a

genetic variants increased obesity risk by 24% and low PA levels did accentuate this

effect. Our study showed that the effect of PPARG2 (Ala12 allele) and FTO

(rs9939609) gene variants on obesity effect might depend on high CHO intake.

In summary, it seems that lifestyle factors may act as effect modifiers for obesity risk

linked to Ala12 allele of the PPARG2 gene and the A minor allele of FTO gene in an

elderly population.

ACKNOWLEGMENTS

The SUN Study has received funding from the Spanish Government (Grants PI01/0619,

PI030678, PI040233, PI042241, PI050976, PI070240, PI070312, PI081943, PI080819,

PI1002658, PI1002293, RD06/0045, G03/140 and 87/2010), the Navarra Regional

Government (36/2001, 43/2002, 41/2005, 36/2008) and the University of Navarra,

Línea Especial, Nutrición y Obesidad (University of Navarra), Carlos III Health

Institute (CIBER project, CB06/03/1017) and RETICS network. The scholarship to C.

Galbete from the Asociación de Amigos de la Universidad de Navarra is fully

acknowledged. The authors have no competing interests.


105 | P á g i n a

TABLES

Table 1: Baseline characteristics according to genotype for elderly subjects from the SUN project

PPRG2 rs1801282

FTO rs9939609

Pro12Pro (n=814)

Ala12 (n=164)

p-valuea

TT (n=336)

TA/AA (n=631)

p-valuea

% Male 70% 74% 0.275 72% 70% 0.657

Age (years) 69 (6) 70 (7) 0.071 69 (6) 69 (6) 0.484

BMI (kg/m2) 25.7 (3.2) 26.2 (3.2) 0.091 25.6 (3.1) 25.9 (3.2) 0.173

Total Energy Intake (kcal/day) 2378 (903) 2484 (1021) 0.182 2412 (1038) 2384 (862) 0.654

CHO intake (g/day) 267 (129) 281 (147) 0.200 272 (147) 267 (123) 0.647

Protein intake (g/day) 107 (40) 109 (37) 0.686 109 (46) 107 (36) 0.449

Fat intake (g/day) 91 (39) 93 (42) 0.392 91 (41) 91 (39) 0.883

Physical activity (METs-h/week) 23.9 (20.7) 24.3 (21.5) 0.828 23.3 (20.1) 24.5 (21.3) 0.387

Values are expressed as mean (SD), unless otherwise state a Continuous variables were compared using a Student-t test. Categorical variables were compared using chi squared test.


106 | P á g i n a

Table 2: Odds Ratios (OR) for obesity risk and linear regression coefficients for the association between the rs9939609 of FTO gene and Pro12Ala SNPs of the PPARG2 gene and BMI in elderly participants of the SUN project

OR (95% CI)

for obesity p value p for

interactiona B (95% CI)b p value p for

interactionc PPARG2 (rs1801282) Pro12Pro 1 (ref) 0 (ref) Ala12 1.66 (1.01-2.74) 0.045 0.40 (-0.13-0.90) 0.139 FTO (rs9939609) TT 1 (ref) 0 (ref) TA/AA 1.03 (0.66-1.60) 0.892 0.33 (-0.08-0.74) 0.112

Genotype FTO e PPARG2 e

- - 1 (ref) 0 (ref) - + 1.92 (0.86-4.27) 0.111 0.46 (-0.36-1.30) 0.287 + - 1.10 (0.66-1.84) 0.704 0.34 (-0.11-0.79) 0.135 + + 1.71 (0.84-3.48) 0.138 0.79 (0.08-1.50) 0.030

High CHO intake (> 246 g/day) model 1/model 2

PPARG2 (rs1801282) 0.046/0.030

0.260

Pro12Pro 1 (ref) 0 (ref) Ala12 2.67 (1.30-5.46) 0.007d 0.49 (-0.21-1.20) 0.169

FTO (rs9939609) 0.609/0.449

0.739

TT 1 (ref) 0 (ref) TA/AA 1.15 (0.57-2.31) 0.697 0.46 (-0.11-1.03) 0.111

Genotype FTO e PPARG2 e 0.814/0.844

0.973

- - 1 (ref) 0 (ref) - + 1.92 (0.79-6.76) 0.312 0.28 (-0.03-1.43) 0.639 + - 1.04 (0.60-2.41) 0.924 0.41 (-0.22-1.03) 0.204 + + 3.26 (1.19-8.89) 0.021 1.07 (0.10-2-03) 0.031

Low physical activity practice (< 18.6 METs-h/week) model 3/model 4

PPARG2 (rs1801282) 0.266/0.243

0.741

Pro12Pro 1 (ref) 0 (ref) Ala12 2.14 (1.13-4.05) 0.020 0.93 (0.16-1.69) 0.017d

FTO (rs9939609) 0.366/0.152 0.417

TT 1 (ref) 0 (ref) TA/AA 1.14 (0.64-2.06) 0.652 0.56 (-0.05-1.16) 0.070

Genotype FTO e PPARG2 e 0.346/0.230

0.360

- - 1 (ref) 0 (ref) - + 2.31 (0.79-6.76) 0.125 0.63 (-0.65-1.90) 0.334 + - 1.21 (0.60-2.41) 0.594 0.48 (-0.18-1.14) 0.156 + + 2.51 (1.01-6.23) 0.047 1.67 (0.63-2.71) 0.002d

Adjusted for gender, age, physical activity and total energy intake (a) p value for Likelihood Ratio Test for obesity risk. (b) Adjusted differences in average BMI (kg/m2) between genotypes. (c) p value for interaction for BMI (as continuous variable). (d) p value < 0.05 after correcting for Benjamini-Hochberg multiple comparisons. (e) (-) Non carriers of the minor risk alleles (+) Subjects carrying the minor risk alleles, either Pro12Ala of PPARG2 gene or rs9939609 of FTO gene. Model 1: interaction term = genotype*CHO (dichotomized at the median); model 2: interaction term = genotype*CHO (continuous); model 3: interaction term = genotype*PA (dichotomized at the median); model 4: interaction term = genotype*PA (continuous)


107 | P á g i n a

FIGURE

Figure 1: BMI differences according to genotype (dominant models for Pro12Ala and rs9939609 SNPs) for the three population groups (total population, only subjects with a high CHO intake or a low physical activity practice) Adjusted for sex, age, physical activity and total energy intake * p<0.05 between Ala12+TA/AA and Pro12Pro+TT genotypes


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CAPÍTULO 3

Physical activity and gender modulate obesity risk linked to 3111T/C gene variant of the CLOCK gene in an elderly population:

The SUN Project


115 | P á g i n a


The SUN Project

Cecilia Galbete, Rafael Contreras, J. Alfredo Martínez, Miguel Ángel Martínez-González, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti

Enviado a Chronobiology International 7-May.-2012

Primera revision 4-Jun.-2012

Resumen

El efecto de los factores genéticos implicados en el desarrollo de la obesidad puede

interaccionar con la actividad física modificando su repercusión. El objetivo de este

estudio fue explorar el efecto del polimorfismo 3111T/C (rs1801260) del gen CLOCK

en el desarrollo de la obesidad así como examinar su posible interacción con los estilos

de vida, en este caso la actividad física, en una población adulta mayor del Proyecto

SUN.

Con este objetivo se reclutaron aquellos sujetos de la cohorte SUN (“Seguimiento

Universidad de Navarra”) mayores de 55 años en el momento en el que empezaron a

formar parte de ésta (n=903, edad=69±6 años). Su ADN se obtuvo a partir de muestras

de saliva y los datos sobre el estilo de vida se recogieron mediante cuestionarios auto-

referidos. Las muestras se genotiparon mediante PCR a tiempo real seguida de

discriminación alélica.

El análisis de los datos mostró interacción entre el polimorfismo 3111T/C del gen

CLOCK y el sexo para el riesgo de desarrollar sobrepeso/obesidad. (p de interacción

CLOCK*sexo <0,001). Se observó también que las mujeres portadoras del alelo C

presentaban un menor riesgo de padecer sobrepeso/obesidad comparándolas con las

mujeres con el genotipo TT (OR=0,61, IC95%=0,36-1.04, p=0.069). Este efecto se vió

acentuado si las mujeres portadoras del alelo de riesgo C tenían altos niveles de

actividad física (OR=0,36, IC95%=0,17-0.79, p=0.011). En este sentido también se

observó interacción entre el polimorfismo rs1801260 del gen CLOCK y la actividad

física en las mujeres (p de interacción CLOCK*actividad física = 0,015) para el riesgo

de sobrepeso/obesidad.


117 | P á g i n a


The SUN Project

Cecilia Galbete, Rafael Contreras, J. Alfredo Martínez, Miguel Ángel Martínez-González, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti


2 Department of Preventive Medicine and Public Health, University of Navarra, Pamplona, Spain

3 Division of Preventive Medicine, University of Navarra Clinic, Pamplona, Spain








118 | P á g i n a

ABSTRACT

Genetic factors may interact with physical activity levels to modify obesity risk. Our

aim was to explore the influence of rs1801260 SNP (3111T/C) of CLOCK gene on

obesity risk, and to examine their potential interaction with lifestyle factors in an elderly

population within the SUN Project. Subjects (n=903, aged 69±6 years old) were

recruited from the SUN (“Seguimiento Universidad de Navarra”) Project. DNA was

obtained from saliva while lifestyle and dietary data were collected by validated self-

report questionnaires. Genotype was assessed by RT-PCR plus allele discrimination. A

significant interaction between the 3111T/C SNP of CLOCK gene and sex for

overweight/obesity risk was observed (p for [Sex*CLOCK] interaction <0.001). Our

results showed that women carrying the C allele of CLOCK gene had a marginally

significant lower risk of overweight/obesity compared to non carrier -TT- subjects (OR:

0.61, 95% CI: 0.36-1.04, p=0.069). Moreover, this association of the C allele with a

decreased overweight/obesity risk might be enhanced in those women with a high

physical activity level. Women practicing more than 16.8 METs-h/week had a

significantly lower overweight/obesity risk (OR 0.36, 95%CI: 0.17-0.79, p=0.011).

Furthermore, a significant interaction between the 3111T/C gene variant and physical

activity for overweight/obesity risk was observed but only in women (p for

[PA*CLOCK] interaction <0.050). In conclusion, it appears that physical activity levels

may act by modifying the association of the 3111T/C SNP (rs1801260) of the CLOCK

gene with overweight/obesity risk in elderly women in the SUN Project.

Keywords: CLOCK, rs1801260, cross-sectional study, obesity risk, body mass index


119 | P á g i n a

BACKGROUND

Circadian rhythms are biological events generated by endogenous mechanisms

composed of circadian clocks. The clocks are synchronized or adjusted to coincide with

periodical environmental events such as the day/night cycle. If clocks are not well-

synchronized the coordination between physiological and behavioural rhythms over the

24-h period is not guaranteed (Reppert & Weaver 2001). Clock genes are expressed in

all tissues and circadian clocks participate in the daily regulation of metabolic functions

such as glucose and lipid metabolism (Yamamoto et al., 1987; Rudic et al., 2004). One

of the first clock genes studied was CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput

gene). Mutant mice for this gene display severe metabolic alterations, including

hypercholesteronemia, hypertriglyceridemia, hepatic steatosis, and hyperglycemia

(Turek et al., 2005). The Clock protein is part of the positive regulatory arm of the

circadian system. It belongs to a family of proteins that generates auto-regulatory

mechanisms of positive and negative transcriptional feedback loops (Albrecht & Eichele

2003).

Several studies have examined the association between CLOCK gene variants and

obesity or other related diseases (Sookoian et al., 2008; Garaulet et al., 2009, 2010a).

Specifically, the 3111T/C locus (rs1801260) has been studied concerning mood, eating

disorders and obesity (Benedetti et al., 2003; Mishima et al., 2005; Benedetti et al.,

2007; Tortorella et al., 2007). Some intervention studies with obese subjects have

reported that this polymorphism might influence the weight loss response. It appears

that obese carriers of the C allele are more resistant to weight loss than TT subjects.

Also they showed shorter sleep duration, delayed breakfast time, evening preference

and less compliance with a Mediterranean dietary pattern (Garaulet et al., 2010b;

Garaulet et al., 2011; Garaulet et al., 2012).

The association of the 3111T/C SNP of CLOCK gene with BMI or obesity has been

examined in cross-sectional studies. (Scott et al., 2008) stated that in Caucasian men, a

haplotype including the C allele of this gene variant could protect against obesity. These

authors also noted that this haplotype including the C allele of the 3111T/C genetic

variant was less prevalent in subjects with the metabolic syndrome and in those with


120 | P á g i n a

increased waist circumference, and was related to lower BMI (Scott et al., 2008).

Moreover, in Caucasian women with eating disorders, (Tortorella et al., 2007) showed

an association of the C allele of this SNP with lifetime lower body weight. Negative

results for this association are also described in the literature (Monteleone et al., 2008).

Epidemiological studies have suggested that in addition to genetic factors, a variety of

lifestyle factors such as dietary composition and physical activity (PA) levels may

modify the obesity risk linked to genetics. Some papers document the association

between 3111T/C SNP of CLOCK gene and fatty acid intake or energy intake (Garaulet

et al., 2009, 2010a).

The inverse association between PA and obesity is well documented. In fact, PA is the

most common environmental factor assessed in gene x environmental studies

concerning obesity phenotypes (Lee et al., 2011). Previous genotype-PA interactions on

BMI have been reported for several polymorphisms of genes including ADRB2

(Corbalan et al., 2002; Macho-Azcarate et al., 2002), ADRB3 (Marti et al., 2002), MC4R

(Jozkow et al., 2011), INSIG2 (Andreasen et al., 2008b), LIPE (Garenc et al., 2009) ,

PPARGC1A (Ridderstrale et al., 2006), UCP2 (Berentzen et al., 2005), UCP3 (Otabe et

al., 2000; Berentzen et al., 2005), FTO (Andreasen et al., 2008a; Rampersaud et al.,

2008; Hakanen et al., 2009; Jonsson et al., 2009; Vimaleswaran et al., 2009; Lee et al.,

2010; Liu et al., 2010; Ruiz et al., 2010; Scott et al., 2010; Demerath et al., 2011). In

recent years, the role of physical activity in modulating an increased BMI associated

with the strongest obesity-related gene variant, FTO: rs9939609, has been characterized

(Razquin et al., 2011). Specifically, after conducting a meta-analysis including data

from 218,166 subjects Kilpelainen et al. (2011) showed a significant FTO-PA

interaction, meaning that the minor FTO allele increased the odds ratio for obesity less

in the physically active group (odds ratio = 1.22/allele) than in the inactive group (odds

ratio = 1.30/allele). They concluded that the odds of obesity linked to this rs9939609

FTO gene variant were attenuated by 27% in physically active adults.

Clock gene variants appear to be associated with other environmental factors such as

energy intake, fatty acid consumption, sleep duration, or evening preference. On the

other hand, it has been shown in animals that PA contributes to important timing


121 | P á g i n a

information for synchronization of circadian clocks throughout the body (Wolff & Esser

2012). Thus, our aim was to evaluate the association of the 3111T/C SNPs of CLOCK

gene with obesity risk and examine its interaction with physical activity levels in an

elderly population within the SUN Project.

Cohort studies have proved to be a very useful tool for identifying the incidence and

natural history of diseases. These can be used to examine multiple outcomes after a

single exposure (Grimes & Schulz 2002). The SUN Project (Seguimiento Universidad

de Navarra-University of Navarra Follow-up) is a prospective multi-purpose

Mediterranean cohort designed to study the association of lifestyle factors with various

health outcomes including cardiovascular disease, diabetes or obesity (Martinez-

Gonzalez et al., 2002; Segui-Gomez et al., 2006).


Sample population

This work has been conducted within the framework of the SUN Project (Martinez-

Gonzalez et al., 2002). The SUN Project was initiated in December 1999 in Spain and

recruitment is permanently open. All participants are university graduates and about

50% of them are health professionals. MDs, pharmacists, nutritionists, dentists,

odontologists, psychologists, nurses, and ophthalmologists are included as “health

professional” in the SUN cohort. Specifically, 6.4% of participants (mean age 67) had a

Nursing Degree and they may have been exposed to shift work until the age of 55.

Lifestyle and dietary data were collected by biennially mailed self-report questionnaires

(Alonso et al., 2005; Bes-Rastrollo et al., 2005; Martinez-Gonzalez et al., 2005). Dietary

intake was assessed using a semi-quantitative food frequency questionnaire (136 food

items) included at baseline. The validity and reproducibility of this questionnaire has

recently been re-evaluated (de la Fuente-Arrillaga et al., 2010).

Physical activity (PA) was ascertained through a baseline 17-item questionnaire. The

index of metabolic equivalent task hours per week (METs-h/week) was computed by

using the time spent engaging in 17 activities and multiplying the time spent by the


122 | P á g i n a

resting metabolic rate (MET-score) specific for each activity. The METs-h/week for all

activities were combined to obtain a value of total METs-h/week, which adequately

correlated with the objectively measured energy expenditure in a validation study in a

subsample of the cohort (Martinez-Gonzalez et al., 2005).

Elderly participants in the SUN Project (more than 55 years old when the baseline

questionnaire was completed) were invited to participate in a genetic study. In May

2008, 1085 participants agreed to participate. Each of them received a kit designed to

collect saliva and 986 kits were received back. Finally, 972 volunteers were correctly

genotyped for the rs1801260 SNP (CLOCK). Among them, 69 subjects who reported

their total energy intake outside of predefined values (<800 kcal/d for men, <500 kcal/d

for women or >4000 kcal/d for men, >3500 kcal/d for women) were excluded, leaving a

total of 903 participants available for the analysis (Figure 1).The mean age was 69 years

(70% male). Anthropometric data was collected from the baseline questionnaire. Self-

reported information on BMI (body mass index, kg/m2) had been previously validated

in a subsample of the SUN Project (Bes-Rastrollo et al., 2005). Specific written

informed consent was requested to participate in this study. The study protocol was

performed in accordance with the ethical standards of the Declaration of Helsinki (as

revised in Hong Kong in 1989, in Edinburgh in 2000 and in South Korea in 2008), and

was approved by the IRB (Institutional Review Board) of the University of Navarra

Moreover, the experimental protocol is in conformity with international ethical

standards (Portaluppi et al., 2010) and the Spanish legislation (LEY 14/2007 de

Investigación biomédica, BOE-A-2007-12945).

Genotyping

Saliva samples were collected with specially designed kits (Oragene®ADN Self-

Collector kit-OG250) and DNA was extracted according to the manufacturer’s

instructions. A total of 106 SNPs including 6 tag SNPs are described in the CLOCK

gene in Caucasian populations based on the information obtained from HapMap release

24/phase II, on NCBI B36 assembly, dbSNP b126. Moreover, the 3111C/T SNP of

CLOCK gene (rs1801260) is the only tag-SNP in which several potential microRNA

target sites are annotated by RANDA and Sanger (FuncPred,


123 | P á g i n a

http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm). The genotyping for this SNP was performed

using Taqman assays with allele-specific probes on the ABI Prism 7900HT Sequence

Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to

standardized laboratory protocols. We obtained an average genotyping success rate of

more than 95% and an average genotyping accuracy of more than 98% by regenotyping

25% of the samples.


Hardy-Weinberg equilibrium was tested using a Chi-square test. This test was also used

to analyze if there were differences in the genotype distribution according to obesity

status. The threshold for statistical significance was p < 0.05.

The Odds Ratios (OR) for obesity associated with genotype (dominant model) were

fitted with an unconditional logistic regression model after adjustment for sex, age

(years, continuous), PA (METs-h/week, continuous) and total energy intake (kcal/day,

continuous) as covariates. The associations between the genotypes and BMI were

analyzed using linear regression models after adjusting for the same potential

confounders. We also evaluated the relationship between the variant 3111C/T

(rs1801260) of CLOCK gene and PA practice (sex-specific dichotomized at the median)

with regard to obesity risk. Interactions for obesity risk were estimated with the

likelihood ratio test. Product terms between the CLOCK gene variant and lifestyle

factors were calculated with the corresponding variables as continuous trait. Interactions

between the CLOCK gene variant and lifestyle factors on BMI were also analyzed.

RESULTS

The frequency of the C allele of the 3111T/C gene variant of the CLOCK gene was 29%

in our elderly population. Specifically, 51% of the subjects had the TT genotype, 41%

were heterozygous for the mutation (TC) and 8% were homozygous (CC genotype).

The allele distribution fulfilled the Hardy-Weinberg equilibrium (Table 1). In

overweight/obese women the TC/CC genotype (43%) was slightly less frequent than in

normal weight subjects (55%, p=0.075).

http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm


124 | P á g i n a

The characteristics of elderly participants in the SUN Project (n=903) according to the

3111T/C genotype (dominant model) are shown in Table 2. Interestingly, subjects

carrying the C allele had lower BMI than TT subjects, but this difference was only

marginally significant (p=0.062). As shown in Table 3, after stratifying by sex, BMI

differences were marginally significant in women (p=0.059) but not in men (p=0.444).

Moreover, the linear regression analysis showed an association of the C minor allele

with lower BMI levels (Table 4). There is also a significant interaction between the

3111T/C SNP and sex (p<0.001) for obesity risk assessed by the likelihood ratio test.

When men and women were analyzed separately, the logistic regression analyses

showed that women with at least one C allele of the gene variant showed a trend to

lower overweight/obesity risk than TT genotype women (OR=0.61, 95%CI=0.36-1.04,

p=0.069) (Table 4). In this context, the linear regression coefficients (Table 4) showed a

lower BMI, -0.89 kg/m2 (95%CI= -1.80-0.02, p=0.056) for women with the C allele

compared to women with the TT genotype which is equivalent to -2.43 kg for a woman

1.65 m tall.

It was also observed that among physically active women (higher than the median, more

than 16.8 METs-h/week) those who were carriers of the C allele had a significantly

lower BMI (-1.36 kg/m2 95%CI= -2.57-(-0.15), p=0.028) than TT (active) women.

However, no significant interaction was observed for BMI between the 3111T/C gene

variant of the CLOCK gene and PA practice (p=0.137) in women after the analysis of

covariance. On the other hand, there was a significant interaction for overweight/obesity

risk (likelihood ratio test) between the 3111T/C SNP and PA (p for interaction CLOCK

*PA=0.015) in women. In this context, we observed that in high PA levels women

(>16.8 METs-h/week) carriers of the C allele had a significantly lower

overweight/obesity risk (OR=0.36, 95%CI=0.17-0.79, p=0.011) than non carriers (TT

genotype).

DISCUSSION

This study found that the C allele of the 3111T/C SNP of CLOCK gene could be

associated with a decreased overweight/obesity risk in women from an elderly


125 | P á g i n a

population of the SUN Project. Moreover, this association seemed to be reinforced by

high physical activity levels.

Our study has strengths and limitations. A potential limitation in our study is the self-

reported outcome, although self-reported weight and BMI had been previously validated

(Bes-Rastrollo et al., 2005). Another limitation is that there is no population group for

replication of findings and that identifying interactions between genetic variants and

lifestyle factors may require a larger sample size (Smith & Day 1984). Moreover, it

could be more informative to examine a number of SNPs in clock related pathway genes

and not just one. On the other hand, some strengths of our study deserve to be

mentioned. The 3111T/C SNP is one out of six tag SNPs that are described in the

CLOCK gene, with potential functional relevance. Other strengths are the homogeneity

of the SUN participants with regard to socioeconomic status, which helps to better

control for confounding factors, and the higher educational level of the participants in

the cohort, which ensures a higher validity in self-reported information (Willett &

Colditz 1998; Beunza et al., 2010; Sayon-Orea et al., 2011).

Sex could be considered as an “environmental” risk factor, which incorporates

established anatomical, physiological, and behavioral differences between males and

females (Ober et al., 2008). It is plausible that sex may interact with common genetic

variants resulting in allelic associations that differ between males and females (Magi et

al., 2010). Our study found an interaction between sex and the 3111T/C gene variant for

overweight/obesity risk, and sex-specific associations of the C allele were observed.

Women presented a lower overweight/obesity risk associated with the C allele, while no

association was observed in men. Interestingly, a sexual dimorphism has also been

reported for clock genes expression levels in human adipose tissue (Gomez-Abellan et

al., 2012)

The effect of some genetic variants on obesity phenotypes has been reported to be

modulated by gender. For instance, several studies with the Pro12Ala SNP of the

PPARG gene or rs4712652 adjacent to the prolactin gene found associations with

obesity risk or BMI, but only in men (Ben Ali et al., 2009; Nilsson et al., 2011). Some

authors have reported different associations in women (Tortorella et al., 2007) and in


126 | P á g i n a

men (Scott et al., 2008) between the 3111T/C CLOCK gene variant and obesity. It has

been suggested that sex-specific lifestyle components such as diet, alcohol consumption,

physical activity practice or smoking habits could act as modifiers of the association of

gene variants with obesity.

Our results confirmed an association between the 3111T/C CLOCK gene variant and

obesity risk in line with the literature. The C allele of CLOCK gene was associated with

lower overweight/obesity risk in women was observed. This finding agrees with those

of Tortorella et al. (2007), who described an association of the C allele of this SNP with

lifetime lower body weight in a group of Caucasian women with eating disorders.

Interestingly, our work identifies an interaction between PA levels and the 3111T/C

variant of CLOCK gene, which is important because it states that genetic susceptibility

to obesity is modifiable by lifestyle factors. In the literature there are few studies

concerning this CLOCK gene variant and PA. Recently, Tsuzaki et al. (2010) reported

an association between the 3111T/C gene variant and small dense low-density

lipoprotein that was independent of several factors, including physical activity.

On the other hand, concerning obesity, one of the most studied SNPs is the rs9939609

of the FTO gene. In a large meta-analysis Kilpelainen et al. (2011) found that obesity

risk linked to the FTO risk allele was reduced by 27% in physically active compared

with non active subjects. Our study suggested a similar decreased obesity risk in women

with high PA levels who were carriers of the C risk allele of CLOCK gene.

One potential explanation of the biological meaning of the interaction between PA and

CLOCK gene variant could derive from the observation that scheduled PA seems to

modulate circadian rhythms and clock gene expression (Wolff & Esser 2012). It appears

that this gene variant could potentially work to synchronize rhythms in humans, thus

lowering obesity risk, since there is an increasing association between clock disruption

and metabolic diseases. However, more studies need to be performed to elucidate this

important question.

In summary, our study suggests that the C allele of the 3111T/C gene variant of CLOCK

gene might be associated with a decreased overweight/obesity risk, and that physical

activity may strengthen this association, but only in women.


127 | P á g i n a

ACKNOWLEGMENTS

The SUN Study has received funding from the Spanish Government (Grants PI01/0619,

PI030678, PI040233, PI042241, PI050976, PI070240, PI070312, PI081943, PI080819,

PI1002658, PI1002293, RD06/0045, G03/140 and 87/2010), the Navarra Regional

Government (36/2001, 43/2002, 41/2005, 36/2008) and the University of Navarra,

Línea Especial, Nutrición y Obesidad (University of Navarra), Carlos III Health

Institute (CIBER project, CB06/03/1017) and RETICS network. The scholarship to C.

Galbete from the Asociación de Amigos de la Universidad de Navarra is fully

acknowledged. The authors have no competing interests.

DECLARATION OF INTEREST

The authors declare no conflict of interest.


128 | P á g i n a

TABLES

Table 1: Prevalence (%) of the 3111T/C polymorphism of the CLOCK gene in an elderly SUN population according to BMI

WHOLE POPULATION (n=903) WOMEN (n=246) MEN (n=657)

Normal weight

Overweight/ Obesity p* Normal

weight Overweight/

Obesity p* Normal weight

Overweight/ Obesity p*

Allele T 516 (69.5%) 789 (72.7%) 209 (67.0%) 133 (73.9%) 307 (71.4%) 640 (72.4%) Allele C 226 (30.5%) 297 (27.3%) 103 (33.0%) 47 (26.1%) 123 (28.6%) 255 (27.6%)

TT 181 (48.8%) 278 (52.2%) 70 (44.9%) 51 (56.7%) 111 (51.6%) 227 (51.4%) CT 154 (41.5%) 217 (40.8%) 69 (44.2%) 31 (34.4%) 85 (39.5%) 186 (42.1%) CC 36 (9.7%) 37 (7.0%) 0.274 17 (10.9%) 8 (8.9%) 0.203 19 (8.9%) 29 (6.5%) 0.534 TT 181 (48.8%) 278 (52.3%) 70 (44.9%) 51 (56.7%) 111 (51.6%) 227 (51.4%) TC/CC 190 (51.2%) 254 (47.7%) 0.305 86 (55.1%) 39 (43.3%) 0.075 104 (48.4%) 215 (48.6%) 0.948

*Chi-square test


129 | P á g i n a

Table 2: Characteristics of an elderly SUN Population according to the 3111T/C polymorphism of CLOCK gene

TT (n = 459)

TC + CC (n = 444) p

Male (%)* 74 72 0.546 Age (years) 69 ± 6 69± 6 0.916 Weight (kg) 74.2 ± 12.0 73.1± 11.6 0.153 BMI (kg/m2) 26.1 ± 3.3 25.7± 3.0 0.062 Total energy intake (kcal/day) 2256 ± 660 2232 ± 637 0.581

Carbohydrates (kcal/day) 1014 ± 398 981 ± 357 0.180 Proteins (kcal/day) 410 ± 114 408 ± 113 0.811 Fat (kcal/day) 762 ± 264 777 ± 275 0.414

Physical activity (METs h/week) 24.1 ± 21.3 23.7 ± 20.4 0.770 Sleep time (hours/day) 7.7 ± 1.0 7.5 ± 0.8 0.115 Night (hours/day) 7.2 ± 1.0 7.2 ± 0.9 0.277 Nap (hours/day) 0.4 ± 0.8 0.4 ± 0.7 0.346 Smoking (%)* Current smokers 13 15 Former smokers 54 49 0.203 Data are shown as mean±SD. n for sleep time is 402 for TT genotype and 394 for TC+CC genotype. *Chi-square test


130 | P á g i n a

Table 3: Characteristics of an elderly SUN population according to sex and the rs1801260 polymorphism of the CLOCK gene

WOMEN MEN

TT (n = 121)

TC + CC (n = 125) p

TT (n =338)

TC + CC (n =319) p

Age (years) 67 ± 5 67 ± 5 0.908 70 ± 6 70 ± 6 0.950 Weight (kg) 63.5 ± 9.9 61.6 ± 8.8 0.112 78.1 ± 10.3 77.6 ± 9.1 0.552 BMI (kg/m2) 24.97 ± 3.75 24.10 ± 3.45 0.059 26.5 ± 3.0 26.3 ± 2.6 0.444 Total energy intake (kcal/day) 2194 ± 625 2276 ± 644 0.313 2279 ± 671.7 2216 ± 634 0.216

Carbohydrates (kcal/day) 986 ± 370 1023 ±348 0.411 1024 ± 408 963 ± 359 0.042 Proteins (kcal/day) 415 ± 118 417 ± 116 0.868 408 ± 113 405 ± 112 0.678 Fat (kcal/day) 763 ± 276 810 ± 315 0.211 762 ± 259 764 ± 258 0.928

Physical activity (METs h/week) 19.7 ± 14.1 20.3 ± 17.8 0.743 25.7 ± 23.1 25.1 ± 21.2 0.696 Sleep time (h/day) 7.7 ± 1.1 7.5 ± 1.1 0.114 7.6 ± 1.0 7.5 ± 1.0 0.388 Night (hours/day) 7.4 ± 0.8 7.1 ± 0.9 0.035 7.2 ± 0.8 7.2 ± 0.9 0.990 Nap (hours/day) 0.4 ± 1.0 0.4 ± 0.8 0.961 0.4 ± 0.8 0.4 ± 0.6 0.251 Smoking (%)* Current smokers 7 13 15 16 Former smokers 37 32 0.090 60 56 0.561

Data are shown as mean±SD. *Chi-square test


131 | P á g i n a

Table 4: Odds Ratios (OR) for overweight/obesity risk and linear regression coefficients (B) for the association between the rs1801260 of CLOCK and BMI gene in elderly participants in the SUN project

OR (95% CI) p value p for

interaction* B (95% CI)† p value p for

interaction ‡ WHOLE POPULATION WOMEN < 0.001 0.139 TT 1 (ref.) 0 (ref.) TC/CC 0.61 (0.36-1.04) 0.069 -0.89 (-1.80-0.02) 0.056 MEN TT 1 (ref.) 0 (ref.) TC/CC 1.00 (0.72-1.39) 0.996 -0.19 (-0.62-0.24) 0.387 PHYSICAL ACTIVITY PRACTICE (METs-h/week) WOMEN Low (< 16.8 METs-h/week) TT 1 (ref.) 0 (ref.) TC/CC 0.97 (0.47-2.06) 0.970 0.015 -0.43 (-1.80-0.95) 0.542 0.137 High (>16.8 METs-h/week) TT 1 (ref.) 0 (ref.) TC/CC 0.36 (0.17-0.79) 0.011 -1.36 (-2.57-(-0.15)) 0.028 MEN Low (< 20.6METs-h/week) TT 1 (ref.) 0 (ref.) TC/CC 0.77 (0.48-1.25) 0.291 0.957 -0.33 (-0.95-0.30) 0.303 0.887 High (> 20.6METs-h/week) TT 1 (ref.) 0 (ref.) TC/CC 1.26 (0.80-1.99) 0.312 0.063 (-0.66-0.53) 0.834 Adjusted for gender, age, physical activity and total energy intake * p value for Likelihood Ratio Test for obesity risk. † Adjusted differences in average BMI (kg/m2) between genotypes. ‡ p value for interaction for BMI (as continuous variable)


132 | P á g i n a

FIGURE

Figure 1: Flow chart of participants included in the analysis

19,919 SUN Participants

1919 proposed to participate(age more than 55)

1247 answered108 decide not to participate

1085 decide to participate

987 saliva-kits received

972 correctly genotyped

69 out of predefined values fortotal energy intake

903 participants fullyavailable


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DISCUSIÓN GENERAL

D i s c u s i ó n g e n e r a l

143 | P á g i n a

1. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO

En los últimos años la prevalencia del sobrepeso y la obesidad ha alcanzado

proporciones epidémicas en todo el mundo lo que conlleva problemas de salud de

diferente índole (Finucane et al., 2011). Por un lado aparecen complicaciones desde el

punto de psicológico y estético pero más importantes son las complicaciones

metabólicas a las que este trastorno puede acompañar. Entre éstas se encuentran la

diabetes, la hipertensión, alteraciones inflamatorias, aumento de riesgo de padecer

cáncer, insuficiencia respiratoria u osteoartritis, entre otras. Además, en la personas de

mayor edad aunque el riesgo de mortalidad asociado a la obesidad es menor que en el

rango de población de adultos de mediana edad, los gastos en sanidad debidos a esta

patología son muy elevados en este rango de población (Wee et al., 2005; Salas-Salvado

et al., 2007)

Según el estudio ENRICA España es uno de los países europeos con las tasas más

elevadas de sobrepeso y obesidad, casi el 40% de la población adulta padece sobrepeso

y más del 20% obesidad (Gutierrez-Fisac et al., 2012). En este sentido se cuenta

también con los datos de Basterra-Gortari et al. (2011) que demuestran que la

prevalencia autodeclarada de obesidad mórbida en España aumentó de un 1,8% en 1993

a un 6,1% en 2006 según los datos de la Encuesta Nacional de Salud (2006).

Como ya se ha comentado en la introducción el desarrollo de la obesidad se debe a

un desequilibrio en el balance energético que conlleva una acumulación anormal o

excesiva de grasa (Martinez, 2000; OMS, 2011). Sin embargo, es evidente que no todos

los sujetos responden de la misma manera a los estímulos externos, es decir, nuestro

perfil genético nos puede hacer más o menos susceptibles a desarrollar una determinada

patología. Así, estudios en familias de adopción demostraron que el peso de los hijos

adoptados se correlacionaba con el del los padres biológicos pero no con el de los

padres adoptivos (Stunkard et al., 1986). Esto hizo pensar que la genética tenía un

importante papel sobre la adiposidad corporal. Sin embargo, un estudio desarrollado en

34 gemelos monocigóticos separados al nacer concluyó que eran los factores

ambientales durante el crecimiento y no la predisposición genética lo que determinaba

el grado de adiposidad en la madurez (Price & Gottesman, 1991).


144 | P á g i n a

Todos estos datos sugieren que el peso corporal viene determinado por una

combinación de factores genéticos y ambientales relacionados con el estilo de vida, así

como por las interacciones entre ellos (Marti et al., 2008; Hetherington & Cecil, 2010).

En este trabajo hemos estudiado la relación entre diversas variantes genéticas y

diferentes factores ambientales con el riesgo de desarrollar sobrepeso y obesidad en un

estudio observacional transversal englobado dentro de la cohorte SUN.

2. LA COHORTE SUN: FORTALEZAS Y DEBILIDADES

El presente trabajo forma parte del Proyecto SUN, una cohorte dinámica iniciada en

el año 1999 y diseñada con el propósito de estudiar mediante la evidencia científica los

beneficios de la Dieta Mediterránea en relación con la aparición de enfermedades. Al

inicio se enfocó hacia el estudio de la dieta sobre la prevención de ciertas enfermedades

pero finalmente se amplió para abarcar algunas cuestiones sobre el estilo de vida. Se

trata de una cohorte multi-propósito que permite la evaluación de condiciones tales

como la obesidad, la hipertensión, la diabetes, enfermedad cardiovascular y cáncer. En

la actualidad cuenta con más de 20.000 participantes, todos graduados universitarios,

hecho que aporta una mayor fiabilidad y validez, junto con mayores tasas de retención

(Willett & Colditz, 1998; Martinez-Gonzalez et al., 2002; Segui-Gomez et al., 2006).

Para este subestudio se contó con la participación voluntaria de 986 sujetos de la

cohorte SUN con una edad media de 69 años. Este tipo de estudios transversales resulta

muy adecuado cuando se examinan factores de riesgo que no se alteran en el tiempo, en

este caso las variantes genéticas, anteriores al desenlace, la obesidad.

Además, el alto nivel educativo de nuestros participantes, todos ellos graduados

universitarios, aumenta su validez interna y hace que disminuya la confusión asociada al

estatus socioeconómico. Este factor se asocia con una mayor calidad en la exposición

principal así como en las covariables y en el desenlace.

Otro punto fuerte del estudio es la validación previa de nuestras variables

principales como son el peso y el IMC (Bes-Rastrollo et al., 2005), la actividad física

(Martinez-Gonzalez et al., 2005) y el cuestionario semi-cuantitativo de frecuencia de


145 | P á g i n a

consumo de alimentos (CSFC) varias veces validado en España (Martin-Moreno et al.,

1993; de la Fuente et al., 2010; Fernandez-Ballart et al., 2010).

El hecho de que los datos sean auto-referidos, lo que facilita mucho el trabajo

realizado, es cierto que puede ser considerado como una cierta limitación. En el caso del

IMC se sabe que existe una tendencia de los participantes a infraestimar su peso y

sobreestimar su estatura, y una tendencia a la preferencia de cifra (Mikolajczyk et al.,

2010). Sin embargo, los estudios previos de validación (Bes-Rastrollo et al., 2005)

constatan la validez de los datos, no afectando a la infraestimación de nuestras medidas

de asociación.

Otra de las limitaciones de este estudio la encontramos en los cuestionarios de

actividad física y en el CSFC. Aunque han sido previamente validados este problema es

inherente a la evaluación del ejercicio físico y de la ingesta dietética, ya que son

variables difíciles de medir en epidemiología debido a que los individuos pueden

cambiar su actividad física o su dieta de un día para otro.

Los datos obtenidos provienen de una población muy concreta y podría pensarse

que los resultados observados no son aplicables o generalizables a toda la población.

Sin embargo, el objetivo de este trabajo fue estudiar los posibles efectos causales de una

exposición (variantes genéticas y estilos de vida) sobre un desenlace (niveles de IMC y

riesgo de sobrepeso/obesidad) por lo que los resultados podrían ser aplicados a otros

colectivos, pues no hay datos que nos hagan pensar que los mecanismos implicados

serán diferentes en otras poblaciones (Rothman, 2008).

En este sentido, un problema del estudio SUN sería la validez externa, es decir, si

se puede extrapolar los datos de una cohorte basada en universitarios a la población

general (Rothman & Greenland, 1998). Lo ideal serían estudios de cohorte de base

poblacional tales como los de Noruega (Lund et al., 2003), la cohorte multiétnica de

Hawái y Los Ángeles (Kolonel et al., 2000), el estudio del millón de mujeres en el

Reino Unido (The Million Women Study, 1999), la cohorte de mujeres holandesas (van

den Brandt et al., 1990), la Malmö en Suecia (Manjer et al., 2001) etc. Pero también

hay muchas cohortes, entre las que se encuentra el Proyecto SUN, que se han realizado


146 | P á g i n a

con poblaciones concretas como enfermeras (Belanger et al., 1980; Willett et al., 1981;

Myers et al., 1987) profesoras francesas (Clavel-Chapelon et al., 1997) , adventistas del

séptimo día (Phillips et al., 1980) y profesores de California (Bernstein et al., 2002).

El problema de la validez externa ocurre no sólo en las cohortes basadas en grupos

especiales (médicos, enfermeras, universitarios) sino también en aquellas de base

poblacional. Así, por ejemplo, una cohorte de base poblacional como el EPIC

(European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) podría tener problemas

de validez externa, ya que la muestras se obtuvieron de donantes de sangre (Rohrmann

et al., 2012).

El proceso de comprobación de la validez externa de una cohorte poblacional es

extremadamente costoso desde el punto de vista económico ya que implica el estudio de

los no respondedores mediante entrevistas o encuestas postales y la comparación de los

respondedores con los no respondedores mediante la conexión (record linkage) de

registros (Lund et al., 2003). Además podría haber cuestiones éticas, relacionadas con el

uso de información de personas que muchas veces por cuestiones de privacidad se han

negado a responder la encuesta.

La baja participación en el primer cuestionario de la cohorte podría dar lugar a un

sesgo de selección lo que se ha denominado “efecto voluntario”. Aquellas personas más

preocupadas por la salud, y más propensas a controlar el peso, hacer ejercicio físico y

llevar un estilo saludable serían aquellas que participan más en la encuesta. El problema

de la baja participación ocurre tanto en las cohortes de base poblacional como en las

cohortes de poblaciones especiales, así la cohorte de base poblacional holandesa tuvo

una participación relativamente baja de un 30%, y la multiétnica un 20% en los latinos.

A pesar de todos estos inconvenientes la fortaleza de los estudios de cohorte radica

en la validez interna, en poder probar que la exposición ha ocurrido antes que la

enfermedad.

A continuación se expondrá por separado la parte correspondiente a la discusión de

los tres capítulos en los que se divide la presente Memoria.


147 | P á g i n a

3. ESTUDIO DE LAS VARIANTES GENÉTICAS ASOCIADADAS CON

OBESIDAD

3.1. Efecto del polimorfismo Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2

El primer capítulo de este trabajo examina el efecto del polimorfismo Pro12Ala del

gen PPARG2 sobre el IMC. Este SNP ha sido extensamente estudiado en relación con la

obesidad. Algunos estudios avalan su asociación con la adiposidad (Masud & Ye, 2003;

Danawati et al., 2005; Tanko et al., 2005; Tonjes et al., 2006; Mattevi et al., 2007)

aunque otros presentan resultados negativos (Weiss et al., 2005; Ereqat et al., 2009).

Por otro lado, en la plataforma GIANT (Genetic Investigation of Anthropometric Traits)

no se ha encontrado asociación significativa de esta variante genética con el IMC a

pesar de que se combina información de casi 250.000 sujetos.

Con el objetivo de conseguir resultados concluyentes se ha recopilado la

información disponible en la literatura (Pubmed) –junto a los datos de 972 sujetos del

estudio SUN- en un meta-análisis para cuantificar el efecto del polimorfismo Pro12Ala

del gen PPARG2 sobre el IMC.

En el meta-análisis de Masud & Ye (2003), que incluye 31 estudios y un total de

19.136 sujetos, se concluye que el alelo 12Ala de esta variante genética está relacionado

con un IMC significativamente mayor (+0,066 kg/m2). En nuestro meta-análisis, con 75

estudios y 49.092 sujetos, encontramos un efecto muy similar para el alelo 12Ala sobre

el IMC, +0,065 kg/m2, lo que correspondería con 189 g en una persona de 170 cm de

altura. Sin embargo, este efecto sigue siendo modesto si se compara con el incremento

del riesgo por alelo observado (+0,170 kg/m2) en un “score” genético que incluye 32

variantes genéticas asociadas al IMC en el mayor meta-análisis de GWAS de obesidad

que incluye 249.796 sujetos (Speliotes et al., 2010).

La variante genética Pro12Ala del gen PPARG2 no es la única para la que se

encuentran resultados controvertidos en la bibliografía sobre su asociación con la

adiposidad (Allison et al., 1998; Fujisawa et al., 1998; Kurokawa et al., 2001; Heo et

al., 2002; Masud & Ye, 2003; Marti et al., 2006; Qi et al., 2006; Kurokawa et al.,


148 | P á g i n a

2008). Es por ello, en los últimos años el meta-análisis se ha convertido en una

herramienta muy útil que aporta resultados concluyentes sobre estas asociaciones.

Tonjes et al. (2006) realizaron otro meta-análisis sobre esta variante genética en

relación con la diabetes. Recopilaron 55 estudios (29.214 sujetos) y concluyeron que el

alelo de riesgo 12Ala se asociaba con un mayor IMC en la población caucásica, aunque

no incluían información cuantitativa sobre el efecto del polimorfismo sobre el IMC.

En ambos meta-análisis se observa heterogeneidad entre los estudios recogidos pero

no sesgo de publicación (Golder et al., 2011). Con el fin de controlar la heterogeneidad

realizamos el análisis por subgrupos. La magnitud del efecto del alelo de riesgo 12Ala

sobre el IMC en nuestro estudio es más consistente en varones de origen caucásico

(+0,090 kg/m2 = 260 g en un sujeto de 170 cm de alto). Además, en este subgrupo no se

encontró heterogeneidad entre los estudios incluidos.

El estudio de Masud & Ye et al. (2003) encontró diferencias significativas en el

IMC debidas al alelo de riesgo 12Ala del gen PPARG2 en sujetos con IMC mayor de 27

kg/m2, pero no en los sujetos con un IMC menor. Nuestro estudio confirma de forma

parcial estos resultados, así en sujetos caucásicos con IMC mayor de 30 kg/m2 (obesos)

los portadores del alelo 12Ala tenían niveles significativamente mayores de IMC.

Nuestro meta-análisis presenta limitaciones y fortalezas. La falta de información

sobre factores del estilo de vida así como sobre las interacciones gen-gen son algunas de

las limitaciones de este estudio. En concreto, se debería tener en cuenta el efecto de los

hábitos dietéticos ya que pueden modificar la asociación entre las variantes genéticas y

la obesidad (Razquin et al., 2011).

Una de las ventajas de este trabajo es el número total de sujetos, más de 49.000. Se

incluyen 75 estudios y 109 poblaciones de diferente tamaño, entre 30 y 3.080 sujetos.

Además, únicamente se incluyen estudios cuyas poblaciones presentan frecuencias del

alelo de riesgo 12Ala (2% - 33%) similares a la anotada en la base de datos HapMap.

En estudios de intervención se ha puesto de manifiesto la relevancia clínica del

alelo 12Ala del gen PPARG2. Así, Lindi et al. (2002) y Franks et al. (2007) observaron

que aquellos sujetos portadores del alelo de riesgo 12Ala perdían más peso tras la


149 | P á g i n a

intervención. Sin embargo, Adamo et al. (2007) mostraron resultados opuestos: el alelo

12Ala del polimorfismo Pro12Ala del gen PPARG2 era más frecuente en sujetos

“resistentes” a la pérdida de peso. Otros estudios no observaron efecto del alelo 12Ala

en la pérdida de peso (Nicklas et al., 2001; Matsuo et al., 2009), debido quizás a las

características específicas de los sujetos: uno solo incluye mujeres y en el otro la

prevalencia del alelo de riesgo 12Ala era muy baja.

En conclusión, el presente meta-análisis muestra que el alelo 12Ala del

polimorfismo Pro12Ala del gen PPARG2 aumenta el IMC en población general y el

efecto es más consistente en varones de origen caucásico.

3.2. Efecto combinado de las variantes genéticas: Pro12Ala del gen

PPARG2 y rs9939609 del gen FTO

En este capítulo se examina el efecto conjunto de los polimorfismos Pro12Ala

(rs1801282) del gen PPARG2 y rs9939609 del gen FTO sobre la obesidad, así como las

posibles interacciones con la dieta y la actividad física.

La variante genética Pro12Ala del gen PPARG2 es una de las más estudiadas en

relación a la obesidad como se ha descrito en la Introducción de esta memoria. Estudios

previos describen interacciones entre este polimorfismo y la ingesta dietética, sobre todo

con un alto consumo de algunos macronutrientes (Marti et al., 2002; Robitaille et al.,

2003; Soriguer et al., 2006). Así, Marti et al. (2002) describieron interacción entre esta

variante genética y el consumo de carbohidratos (HC) sobre el riesgo de obesidad en un

estudio de casos y controles.

La principal observación de este estudio es que un alto consumo de HC parece

aumentar el riesgo de obesidad asociado al alelo de riesgo 12Ala del gen PPARG2 en la

población mayor de 55 años de la cohorte SUN. Las bases moleculares no se conocen

pero parece ser que en presencia de un balance energético positivo, el alelo de riesgo

12Ala supera la capacidad adipogénica del alelo Pro. Este efecto ligado a la dieta podría

afectar a vías de señalización de la adiponectina a través de otras moléculas co-

reguladoras de la transcripción junto a PPARG (Anderson et al., 2010).


150 | P á g i n a

Por otro lado, se observa que la actividad física es capaz de modular el efecto del

alelo de riesgo 12Ala sobre el riesgo de desarrollar obesidad. Se mostró que el riesgo

inicial de desarrollar obesidad asociado a este alelo se veía incrementado en aquellos

sujetos con bajos niveles de actividad física. En este grupo de sujetos el alelo 12Ala

incrementaba en casi una unidad los valores de IMC respecto a los sujetos Pro12Pro.

Sin embargo, la interacción entre el locus Pro12Ala del gen PPARG2 y los niveles de

actividad física no alcanzó significación estadística.

Sobre la segunda variante genética, rs9939609 del gen FTO, no encontramos

asociación con el IMC o la obesidad. Aunque estos resultados parecen contrarios a lo

observado en la literatura (diversos estudios muestran que el alelo de riesgo A se asocia

con mayor adiposidad corporal), hay trabajos que avalan nuestros resultados. Así,

Hardy et al. (2010) describen una asociación débil entre este polimorfismo y el IMC en

una población adulta mayor de 50 años y proponen que el efecto de esta variante

genética sobre la adiposidad se atenúa con la edad. En este sentido Jacobsson et al.

(2011) obtuvieron resultados similares y concluyeron que ningún SNP o haplotipo

estudiado del gen FTO estaba relacionado con la adiposidad o con el consumo total de

energía en una población mayor de 70 años de edad.

Esta variante genética se asoció con adiposidad por primera vez en el año 2007

mediante estudios de GWAS (Frayling et al., 2007; Scuteri et al., 2007) y tras su

descubrimiento estos resultados se replicaron en diversas poblaciones caucásicas,

incluida la población infantil (Rendo et al., 2009). Hasta la fecha se ha sugerido que el

efecto parece estar mediado por un incremento en el consumo total de energía (Cecil et

al., 2008; Tanofsky-Kraff et al., 2009) pero se necesitan estudios post-transcripcionales

y post-transduccionales para entender el mecanismo molecular de este polimorfismo del

gen FTO.

En una segunda fase se analizó el efecto conjunto de los alelos de riesgo 12Ala del

gen PPARG2 y A del gen FTO sobre el IMC así como la posible interacción con

factores del estilo de vida. En el caso de la dieta, un alto consumo de HC incrementó el

riesgo de obesidad asociado a la co-presencia de ambos alelos de riesgo en más de tres

veces en comparación con sujetos no portadores de los alelos de riesgo (grupo de


151 | P á g i n a

referencia, OR=1). Algo similar ocurría con los niveles de IMC, la presencia conjunta

de ambos alelos, 12Ala (PPARG2) y A (FTO), hacía que los niveles de IMC se

incrementasen en más de una unidad, lo que en un sujeto de 170 cm de alto se

correspondería con algo más de tres kg de peso.

Resultados similares se observan en los sujetos con niveles bajos de actividad

física. El riesgo de obesidad se duplica en sujetos con poca actividad física y portadores

de los alelos 12Ala y A de los genes PPARG2 y FTO, respectivamente; en comparación

con los no portadores. El IMC de estos sujetos aumentó en más de 1,5 unidades lo que

se corresponde con casi cinco kg de peso en un individuo de 170 cm de alto.

En resumen, en nuestra población mayor de 55 años de la cohorte SUN el alelo

12Ala del polimorfismo Pro12Ala del gen PPARG2 se asocia con un mayor riesgo de

desarrollar obesidad. Además, se observa una interacción significativa con los HC de la

dieta de forma sujetos con un alto consumo de HC presentan un mayor riesgo de

obesidad. Por otro lado, la presencia conjunta del alelo de riesgo A del gen FTO y el

12Ala del gen PPARG2 incrementó el riesgo de obesidad así como los niveles de IMC.

3.3. Efecto del SNP 3111T/C (rs1801260) del gen CLOCK

El gen CLOCK codifica para un factor de transcripción implicado en la regulación

de los ritmos circadianos, y es un elemento positivo imprescindible para el correcto

funcionamiento de éstos. Estudios previos han demostrado la asociación de este

polimorfismo con la obesidad pero los resultados son controvertidos (Tortorella et al.,

2007; Monteleone et al., 2008; Scott et al., 2008; Garaulet et al., 2011). Así, Garaulet et

al. (2011) describieron diferencias en las horas de sueño, alteraciones en el

comportamiento alimentario y preferencias nocturnas en aquellos sujetos que portaban

el alelo minoritario C de este polimorfismo y sugirieron que estos sujetos eran más

resistentes a la pérdida de peso tras una intervención. Sin embargo, en nuestro estudio

no observamos diferencias en las horas de sueño entre los sujetos portadores del alelo C

y los no portadores, y tampoco observamos diferencias en cuanto a los niveles de

actividad física.


152 | P á g i n a

En nuestra población del estudio SUN encontramos que el alelo C del gen CLOCK

parece estar relacionado con un menor riesgo de sobrepeso/obesidad en mujeres y que

esta asociación parece estar modulada por los niveles de actividad física.

Tortorella et al. (2007) observaron asociación entre el alelo C del polimorfismo

3111T/C del gen CLOCK y un menor peso corporal en un grupo de mujeres con

trastornos de la conducta alimentaria. Además, Scott et al. (2008) propusieron que un

haplotipo que incluía el alelo C de esta variante genética podría proteger frente al

desarrollo de obesidad en un grupo de hombres caucásicos. Otros estudios no

encontraron ninguna asociación de este locus con el desarrollo de la obesidad

(Monteleone et al., 2008).

Se han observado diferencias para el efecto de diversos polimorfismos sobre la

adiposidad entre los sexos (Ben Ali et al., 2009; Nilsson et al., 2011). Además de las

diferencias fisiológicas se sugiere que hay componentes del estilo de vida dependientes

del sexo como la dieta, el consumo de alcohol, la actividad física o el hábito tabáquico

que podrían explicar este efecto modulador (Ober et al., 2008). Además es posible que

el sexo interaccione con ciertas variantes genéticas dando lugar a diferentes

asociaciones en varones y mujeres (Magi et al., 2010). En nuestro estudio se observa

una interacción significativa entre el sexo y el locus 3111T/C del gen CLOCK sobre el

riesgo de sobrepeso/obesidad y que el efecto protector existía únicamente en las

mujeres. Además, parece ser que los niveles de expresión de los genes clock (PER2,

BMAL1 y CRY1) en el tejido adiposo son mayores en mujeres que en varones (Gomez-

Abellan et al., 2012) lo que corrobora que hay diferencias según el sexo en los genes

clock.

En el análisis observamos además una interacción entre la variante genética

3111T/C del gen CLOCK y la actividad física para el riesgo de desarrollar

sobrepeso/obesidad. De forma que el efecto protector sobre la adiposidad observada se

acentúa en el grupo de mujeres con una mayor actividad física, superior a la mediana

(16,8 METs-h/semana). Una posible explicación deriva del trabajo de Wolff & Esser

(2012) que indica que la actividad física programada puede modular los ritmos

circadianos y los niveles de expresión de CLOCK. Se puede sugerir que esta variante


153 | P á g i n a

genética contribuya una sincronización correcta de los ritmos biológicos ejerciendo un

papel protector frente a la obesidad.

No obstante, se necesitan nuevos trabajos experimentales que aclaren la relación

entre el gen CLOCK, los ritmos circadianos y la obesidad.

4. COROLARIO

En este trabajo se recogen evidencias sobre la influencia de diversas variantes

genéticas en el desarrollo de obesidad (Pro12Ala del gen PPARG2, rs9939609 del gen

FTO y 3111T/C del gen CLOCK) así como la interacción de estas con el estilo de vida

(dieta y actividad física). El conocimiento de las variantes genéticas implicadas en la

adiposidad no solo nos ayuda a comprender los mecanismos implicados en el

mantenimiento del peso corporal sino que también nos aporta luz sobre su prevención y

tratamiento (Walley et al., 2009).

El objetivo de la nutrigenética es proporcionar recomendaciones dietéticas

personalizadas basadas en la carga genética del individuo (Ordovás et al., 2005). Para

conseguir este propósito es necesario conocer las variantes genéticas implicadas y sus

interacciones con el estilo de vida, lo que requiere grandes tamaños muestrales por la

complejidad de la evaluación de los estilos de vida (hábitos dietéticos y de actividad

física). Estudios llevados a cabo mediante colaboraciones internacionales, como el de

Kilpelainen et al. (2011) que reúnen información de más de 200.000 sujetos, resultan

muy útiles para confirmar interacciones entre variantes genéticas y el estilo de vida. Por

otro lado, para conocer los mecanismos moleculares implicados en las interacciones

observadas son necesarios trabajos in vitro e in vivo.

Con todo esto, el conocimiento de las variantes genéticas implicadas en el

desarrollo de la obesidad y de sus interacciones con los estilos de vida cambiará la

manera de prevenir y tratar la enfermedad a través de recomendaciones sobre dieta o

ejercicio físico, lo que supondrá un fuerte impacto en la salud pública (Ordovás et al.,

2005).


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CONCLUSIONES

C o n c l u s i o n e s g e n e r a l e s

165 | P á g i n a

CONCLUSIONES GENERALES

1. En el meta-análisis de 49.092 sujetos sobre la asociación entre el polimorfismo

Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 y el Índice de Masa Corporal (IMC) se

encontró que el alelo de riesgo 12Ala aumentó de forma significativa el IMC

(+0,065 kg/m2, p=0.001). Dicho efecto fue mayor en el subgrupo de varones de

origen caucásico (+0,090 kg/m2, p=0.002).

2. En la población mayor de 55 años de la cohorte SUN el alelo 12Ala del gen

PPARG2 se asoció con un mayor riesgo de desarrollar obesidad. Además, se

observó una interacción significativa entre este polimorfismo y el consumo de

carbohidratos, viéndose todavía más afectados por la presencia de este alelo los

sujetos con un alto consumo de hidratos de carbono.

3. La variante genética rs9939609 del gen FTO no se asoció con un mayor riesgo

de obesidad ni con mayores niveles de IMC en una población adulta-mayor del

estudio SUN.

4. La co-presencia de los alelos de riesgo A (rs9939609) del gen FTO y 12Ala del

gen PPARG2 incrementó el riesgo de desarrollar obesidad observado para la sola

presencia del alelo 12Ala del gen PPARG2.

5. Un elevado consumo de carbohidratos, así como bajos niveles de actividad

física, aumentaron de forma significativa el riesgo de desarrollar obesidad ligado

a la presencia conjunta de los alelos A (rs9939609) del gen FTO y 12Ala el gen

PPARG2.

C o n c l u s i o n e s g e n e r a l e s

166 | P á g i n a

6. Se encontró una interacción significativa sobre el riesgo de sobrepeso/obesidad

entre el sexo y el alelo C (rs1801260) del gen CLOCK. Se observaron menores

niveles de IMC en las mujeres portadoras del alelo C de esta variante genética

frente a las no portadoras.

7. En mujeres físicamente activas y portadoras del alelo C el riesgo de

sobrepeso/obesidad disminuyó de forma notable, observándose una interacción

significativa entre el SNP 3111T/C del gen CLOCK y la actividad física.

ANEXOS

ANEXO 1

Consentimiento informado

“DETERMINANTES NUTRICIONALES Y METABÓLICOS DEL DESARROLLO DE DETERIORO COGNITIVO”

Marca, por favor, la opción que desees (sólo una):

1) Deseo participar en este nuevo subestudio (dos llamadas telefónicas y envío de saliva).

2) Deseo recibir sólo las dos llamadas telefónicas pero NO enviar la muestra de saliva.

3) Deseo enviar la muestra de saliva, pero NO deseo recibir las dos llamadas telefónicas.

4) NO deseo participar en ningún aspecto del nuevo estudio.

- Si has contestado la opción 1 ó la 2 indica el número de teléfono al que deseas que te llamemos y tu

preferencia de horario y día de la semana:

Teléfono:______________

Horario: _______a _______ Día de la semana: _________________

- Si has contestado la opción 1 ó la 3, por favor firma este consentimiento, junto con un testigo de la

firma, que es necesario para cumplir los requisitos legales de confidencialidad y consentimiento informado.

Por la presente AUTORIZO a la Universidad de Navarra a procesar estas muestras únicamente para propósitos

científicos y de investigación y CERTIFICO que he leído y entiendo el consentimiento anterior y que las

explicaciones requeridas fueron hechas a mi satisfacción (estamos a tu disposición para aclarar cualquier otro

aspecto*), por todo ello ACEPTO VOLUNTARIAMENTE participar en este estudio.

Firma del testigo: Firma del voluntario:

Nombre y apellidos: Nombre y apellidos:

_____________________________ _____________________________

*Si tienes cualquier duda, puedes escribirnos un correo electrónico: [email protected] o llamarnos por teléfono.

#


ANEXO 2

Cuestionario basal C_0

The effect of the Mediterranean diet on plasma brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels: The PREDIMED-NAVARRA

randomized trial

ANEXO 3

Sanchez-Villegas, A., Galbete, C., Martinez-Gonzalez, M., Martinez, J., Razquin, C., Salas-

Salvado, J., & ... Marti, A. (n.d). The effect of the Mediterranean diet on plasma brain-derived

neurotrophic factor (BDNF) levels: The PREDIMED-NAVARRA randomized trial. Nutritional

Neuroscience, 14(5), 195-201.

Documents

Influencia de diversas variantes genéticas y el estilo de ...dadun.unav.edu/bitstream/10171/36780/1/TesisDoctoralCeciliaGalbete.pdf · Agradecimientos Y las últimas palabas, las