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I n f l u e n c i a d e l e s c u a l e n o e n e l p r o c e s oa t e r o e s c l e r ó s i c o
por el
Dr. Adolfo Toledano Jiménez Castellanos
Jefe de la Sección de Químicas del Instituto «Santiago Ramón y Cajal» del C. S. 1. C.
PRESENTADO POR EL ACADÉMICO EXCMO. SR. D. JULIÁN SAN/ IBÁREZ
Desde que se indicó que los animales alimentados con escualenoincrementan el contenido en colesterol del hígado (1, 2), se han su-cedido una serie de trabajos que implican al escualeno como precur-sor de la biosintesi« del colesterol. Así Langdon y Bloch (3 y 4) de-muestran que el escualeno es eficientemente convertido en colesterolen los tejidos del mono. Tomkius y colaboradores, consideran aesta sustancia como un precursor del colesterol en el hígado (5) ;Schwenk y colaboradores (6), en perfusiones en hígado, incluyenal escualeno C14 como posible precursor de la síntesis del coleste-rol C14; Friedeman (7), estudia el metabolismo del colesterol; Tcheny Bloch (8 y 9), la conversión «in vitro» del escualeno a lanosteroly colesterol de acuerdo con el esquema de la biosíntesis del esterolpropuesto en 1953 (10) y (11), el mecanismo bioquímico del colesterolbasado en los conocimientos actuales de los ensayos «in vitro» y sín-tesis orgánicas.
La conversión de escualeno a esteroides precipitables por la di-gitonina, en el extracto de hígado, ha sido señalada por Dituri (12),y el sistema enzimàtico de los microsomas y porción sobrenadantede homogenatos de hígado de rata, por Bucker (13).
Al estudiar en varios aspectos este problema en el hombre, seha encontrado escualeno trazado con carbono radioactivo, en el
— 214 —
sebo humano, al administrar por vía oral el «acetato» que contieneeste isótopo (14). Tomking y colaboradores (15), estudian el «escua-leno» sintético C11 en su incorporación por el hígado, Macguire (16),los efectos del escualeno sobre la incorporación de «acetato» en elhombre y Maxwell y colaboradores (17), el papel metabòlico del es-cualeno con el empleo de escualeno-T.
El objeto de este trabajo, de ateroesclerosis experimental, es se-ñalar nuestras observaciones frente a ratones y ratas, principalmentea los primeros, con el empleo de dietas normal y glúcida adicionadade escualeno —procedente del escualo— y estudiar el contenido encolesterina, de los materiales objeto de ensayo, así como su histo-logía.
Puesto que el escualeno eleva, en el animal madre, el índice dela lactancia (18), es por lo que en todos nuestros ensayos hemos em;
p'leado animales machos, en evitación de acciones secundarias.
No queremos dejar de señalar la nota preliminar de Gero y cola-boradores (19), de inhibición de la ateroesclerosis por inmunizacióncon betalipoproteínas y que será tenida en cuenta en el futuro, ennuestros trabajos sistemáticos sobre ateroesclerosis experimental,partiendo del escualeno.
MATKRIAL Y MÉTODOS
Animales.
En nuestros ensayos de escualeno frente a la ateroesclerosis, he-mos empleado ratones y ratas blancos (machos), con un peso alrej
dedor de 12 grs. (medias aritméticas), para los ratones y; de 80 a160 grs., para las ratas.
En el caso de los ratones, estos animales se agrupan en lotes de10 —los cuales a su vez se dividen en dos lotes de 5—, colocán-dolos en bocales de 4 Its., aproximadamente de capacidad, en losen los cuales se pone la dieta necesaria y el agua, por medio de! unchupón.
Las ratas se agrupan, en jaulas metálicas, en número al 5 porlote, con la dieta y el agua necesaria para un suministro normal.
El material empleado, tanto para los ratones comò para las ratas,se esteriliza, previamente, y durante el ensayo se guardan las condì-
- 215 -
(dones normales de habitabilidad, manteniéndose la temperatura en--tre los 18" y 22° C., y el grado de humedad relativa del aire en--tre 38-50 %.
„Dictas.
Las dietas empleadas corresponden a la dieta normal, la habitualen este Instituto y la dieta libre de grasa.
La composición de ambas dietas están representadas en las ta-blas I y II, respectivamente.
Ambas dietas se suministran a los animales en forma de pellet.Para la dieta libre de grasa, es necesario someter a los animales a unperíodo de adaptación, el cual se consigue en un intervalo de tiempocomprendido entre las dos y tres semanas.
T A B L A I
Composición de la dieta normal
Harina de trigo 3° °/oCebada tamizada io °/0Maíz 10 °/0
Avena integral exenta de fibra ' 5 °/oTurto de cacahuet 7 °/0
Harina de pescado 3 °/0
Harina de carne de ballena i °/0
Harina de carne 3 °/oPolvo de leche batida 2 °/0Polvo de leche descremada ' °/oGermen de trigo.. . . '. 4 %Alfalfa deshidratada 4 %Levadura 4 °/0
Concentrado minero-vitamínico 5 %
Mezcla de sales (por Kgr.).
15 nigr. yodo ; 1,5 mgr. bromo ; 100 nigr. hierro ; 7,5 mgr. cobra,'1 nigr. cobalto ; 0,2 mgr. níquel ; 0,5 mgr. zinc ; 35 mgr. mangane-so ; 0,5 mgr. magnesio, y 10,5 mgr. cloruro sódico.
— 2 l6 —
Aparte se añaden a cada 100 Kgrs. : concentrado de vit. C...0,02 Kgr. y conc. aromàtico, 0,050 Kgr.
T A B L A I I
Composición de la dieta tibie de grasa
Caseina 5iOOo grs.Almidón de cereales '3i75° »Mezcla de sales cjoo »Harina de carne desengrasada 2,500 »Vitaminas c. s.
Mescla de sales.
134,8 grs. CaCO3; 34,2 grs. Na2CO3 ; 24,2 grs. MgCOs;;141,3 grs. K2CO3; 103,2 grs. H3PO4; 53,0 grs. HC1; 9,2 grs. H2SO4;111,0 grs. ac. cítrico con 1 H2O ; 6,3 grs. citrato fèrrico con 1 H2O ;0,02 grs. KI; 0.079 grs. MnSO4 ; 0,248 grs. NaF ; 0,0245 grs. KjAl^(SO4)4 ; 0,5 grs. de levadura desecada, y 25 grs. de lechuga o re-pollo por 100 grs. de mezcla.
Vitaminas.
Para cada 10 Kgrs. de Dieta:
25.000 U. I. de vit. A.15.000 U. I. de vit. D3
20 mgrs. de vit. B3
Tratamiento.
A los animales objeto de ensayo, se les somete a tratamiento coirescualeno —procedente del escualo— en la proporción del 3 %, en urrvehículo graso —aceite de oliva refinado— con un indice de escualenode 410.
Previamente, se ha determinado la cantidad tolerada de este ve-hículo graso, por sí solo o con el 3 % de escualeno, y se ha encon-
trado, para los ratones, el valor de 5 gotas/días en una sola tomay, para las ratas, el de 25 gotas, números que representan la adicióna la dieta de 2,31 mgrs. de escualeno, para los ratones y 11,4 mgrs.de escualeno, para las ratas, por día y en una sola toma.
Métodos analíticos.
En los animales puestos en juego, se ha determinado en los mate-riales sangre, hígado, bazo, riñon y cerebro : peso del material, sus-tancias extractivas al éter y colesterina total.
Peso del materia].
Se ha determinado del modo usual, siendo la media aritmética delos animales puestos en ensayo para la dieta.
Sustancias extractivas al éter.
De todos los métodos ensayados, el que mejores resultados hadado, en conjunto, para hígado, bazo, riñon y cerebro ha sido el dejung (20), con el empleo de sulfato de cobre anhidro, previa tritura-ción del material objeto de ensayo, con arena de sílice y, el todohomogéneo obtenido, se extrae con éter sulfúrico anhidro —tratadodel modo habitual— en un aparato de Soxhhlet, por un espacio detiempo ininterrumpido, de ocho horas y, durante veinticuatro horas,en intermitentes. Con este modo de operar se obtienen resultadosanalíticos comparables en todos los casos ensayados por nosotros.
Colesterina total.
Hemos ensayado varios métodos colorimétricos con nuestros ma-teriales objeto de ensayo, siendo la técnica de Leiboff (21) —previatrituración del material con arena de sílice—, la que nos ha dadoresultados comparables.
Las medidas se han efectuado por medio de un colorímetro Leitz-Photometer U. S. patent, número 2477208 (E. Leitz, Inc. NewYork, N. Y.X con el empleo de esterilizador de corriente.
- 2l8 —
Tanto eu ias sustancias extractivas al éter, como en la coleste-rina total, se refieren los resultados obtenidos a 100 de materialfresco.
PARTE EXPERIMENTAL
En estos ensayos del escualeno frente a la ateroesclerosis, heñiosprocedido del modo indicado en el cuadro temática.
Ratones blancos (maclws). Dieta normal
A. Variable: pesò del animal.
Ì. Ratones adultos.
Estos animales sometidos a tratamiento —vehículo graso (P. B.),y vehículo graso con el 3 % de escualeno—, se comportan del modoindicado en la tabla III.
Al sacrificar los ratones después del período de tratamiento indi-cado, obtenemos la representación gráfica de la figura 1 —pesos eincrementos de peso (A P) al sacrificar—. Estos números no repre-sentan el valor real, ya que los puntos de partida han sido distintos,por lo que, para hacer estos números comparables, referimos los re-sultados a 100 de peso del animal, con lo que obtenemos la gráficafigura 2.
Una vez sacrificados los ratones, se procede a la separación delmaterial objeto de ensayo —sangre, hígado, bazo, riñon y cerebro—en los cuales, a excepción de la sangre donde únicamente se deter-mina colesterina total, se procede a valorar el peso del material, sustandas extractivas al éter y colesterina total.
Los resultados obtenidos están reseñados en la tabla IV —va-lores analíticos—, y como éstos tampoco son comparativos, por lacausa apuntada anteriormente, los referimos a la unidad 100 del pesodel animal (tabla V) y, si tomamos como unidad los valores encon:
trados para la prueba en blanco, tenemos la tabla VI, que es tabla,comparativa.
Escualeno frente a la ateroisclerosis
Cuadro de temática
Dieta normal.
A.
Ratones
Peso del animal.Ratones adultos.
Ratones jóvenes.
Cantidades crecientes de escua-leno en la dieta.
3 °/0 escualeno.6 °/0 escualeno.9 °/0 escualeno.
12 % escualeno.
Ratas
Dieta normal i
! ^
Peso del animal.
Peso del animal.
Rata adulta.
Rata joven.
A.Ratas adultas.
Días
T A B L A I I I
Medias aritméticas de peso (Ratones adultos)
Con el 8 °/o de escualeno'Prueba en blanco
7U2128
35424956637077849i98
'»SI 12
"9126135140Días
A Peso
'5.3"5,5+0,216.0 + 0,515,9 — 0,117.1 + 1,217.2 +0,117,2 0,0i7,4 + o,2
0,6•0,3
18,018,318.6 + 0,319.7 + 1,120,0 + 0,320.4 + 0,420,4 0,020,9 + 0,520,9 0,021.8 +0,922,3 +0,S22,4+0,1
135
7,i
12,91 3 , 1 + 2,014.0 + 0,914,3 + 0,3'48 + 0,514,9 + 0,1"S»° + °>
1
14,3 — 0,714,6 + 0,315.5 +°>916, i +0,616.6 + 0,517,3 + 0.7i?.6 + °,318.3 + o,718,7+0,418.7 0,0'9,5+0.820.1 + 0,620,0 — o, i20.4 + 0,4140
7.5
— 220 —
Grs.30
20
Ap.Grs
10
10
P.B. + 3°/.ESC.
P.B. +3%E.
pesos at sacrificar A p. al sacrificarRATONES ADULTOS
Fig. 1.
— 221 —
%
50
AO
30
20
10
P.B. + 3%E.
A P./100 de Unidad
RATONES ADULTOS
Fig. 2.
— 222 —
T A B L A I V
Volares analíticos (Ratones adultos)
Tratamiento Material
P. B. SHBRC
3 °/e escualeno SHBRC
Valores referido^
Tratamiento Material1
P. B. H !B iR
C i
3 "/Q esccaleno HB 1R iC
Tabla
Tratamiento Material
P. B. SHBRC
3 % escualeno SHBRC
P/U grs.
1,11700,18490,32380,3007
1,2631o, 18100,26380,3046
Sobre 100 de m
Subst. ext. éter.grs.
3,5'1,285,9°3,24
3.683,92
8,005>99
iterial Iresco
| Colesterina T¡ rngrs,
136J58379434
2.219
216446461690
2 246
T A B I. A V
a la unidad loo de f eso (Ratones adultos)
•P/U grs. |
j 1
14,98 :'0,82¡1,47 !j i ,34
j6,20
jo,881,47
' i jo ;
T A B L A V I
comparativa (Ratones
Peso
ii
,1
i
1,241,07i ,001,26
Subst. exí. éter,m grs.
'74,7910,4986,5343,4i
228.1634,49
1 17,60101,83
adultos)
Subst. ext éter.
iiiIi
1,303,2«1,362,34
Colesterina Trogrs.
.7,863,1°6,37
29,72
27,654,05
10,1438,18
Colesterina T
J , 593,5'>,3°',591,28
— 223 —
'2. Ratones jóvenes.
Este ensayo efectuado en las mismas condiciones que el anterior—vehículo graso (P. B.) y vehículo graso con el 3 % de escuale-no—, se ha comportado como se indica en la tabla VII.
Sacrificados los ratones, tenemos la representación gráfica (figu-ra 3) —pesos e incrementos de peso (A P) al sacrificar—; y los valo-res comparativos (fig. 4), referidos a 100 de peso del animal.
Los valores analíticos de los materiales objeto de ensayo (ta-bla VIII), los valores referidos a la unidad 100 de peso del animal(tabla IX) y la tabla comparativa (tabla X), son los resultados quehemos encontrado para este ensayo con ratones blancos (machos)jóvenes.
T A B L A V I I
Medias aritméticas de peso (Ratones jóvenes)
Días
0rj/
14
21
28
35424956637077859i98
'°5I 12119
126
135140
DíasA P
Prueba en blanco
8,29,8 + 1,6
I 1,0 -(- >,212,1 + 1,113,0 + 0,9
13,4 4-0,4'3.7 + 0.314,4 + 0,7'5, 5 -f- M16,2 + 0,717,2 + i, o17,8 + 0,618,7 +O,Q19,5 + 0,820,2 + 0,723,2 + 3,023,2 + 0,223.4 + 0,223,7 + 0,223.9 + °.-
'35'5,7
Con elso/odeescuatcTio
8,18,3 + o,28,5 + 0,39,4 + 0,99,8 + 0,4
10,7 + 0,91 1,6 + 0,912,5 + 0,912,8+0,312,9 + °.']3,i + °,213,4 + 0.313,6 + 0,214,0 + 0,415,0+ 1,0'•1,7 - °'3'5,2 + 0.516,1 +0,917,2 + 1,1'8,9+ 1,718,9 0,0
14010,8
En los ratones blancos machos con la variable A. Peso del ani-mal y las secuencias : 1. Ratones adultos ; y 2. Ratones jóvenes,bajo el punto de vista bioquímico, se comportan del siguiente modo :
— 224
Grs.30 15-
Ap-
Grs,-
20- 10
10 5
P.B. +3%E.
RB. +3%E'.
Pesos al sacrificar A p. al sacrificarRATONES JÓVENES
f ig. 3
Fig. 3.
- 225 -
%70
60
50
AO
30
20
10
-
-
-
-
-
P.B. -»-3%E
A p./100 de unidad
RATONES JÓVENES
Fig. 4.
^*"- os u REAL ACADIMIA DÏ CIENCIAS.—1961
— "226 —
T A B L A V I I I
Valores analíticos (Ratones jóvenes)
Tratamiento Material
P. B. SHBRC
3 % Escualeno SHBRC
Valores referidos a
Tratamiento Material
P. B. HBRC
3 % Escualeno HBRC
Tabla com
Tratamiento Material
P. B. SHBRC
3 °/o Escualeno SHBRC
P/Ugrs.
1,16420,21060.34750,3478
1,20970,20350,2704o,3258
T A B L A I X
la unidad loo peso
P/U grs.
4,890,891,461,46
6,401,07i,431,72
T A B L A X
Sobre 100 mate
Susb. ext. éter.grs.
3.571,615,^92,92
3,963,568,175.45
(Ratones Jóvenes)
Sitsb. ext. éter,rngrs.
174,7214,'783,1742,84
253,4438,19
116,8393,85
rial ïrescíi
Colesterina Tmgrs.
140421428611
1,193226478474715
i,438
Colesterina Tmgrs.
20,583,748,92
I7,4i
3°,595,07
10,22
24,73
parat iva (Ratones jóvenes)
Peso
,
Jiii
1,3°1,21
0,08
1,18
Susb. exí. éter.
iiIII
> . 452,691,402,19
Colesterina T
I[IIi
,60,48,35, '4,42
— 227 —
A. Respecto al animal.
1. Las dietas son perfectamente toleradas por los ratones blan-cos machos.
2. Se requiere, aproximadamente, siete semanas para su perfectaadaptación.
3. La adición del 3 % escualeno produce, en estos animales, au-mento de peso.
B. Respecto a los materiales analizados
1. Ratones adultos.
En la tabla XI, están representados los incrementos que se ob-tienen cuando a una dieta normal se le añade el 3 % de escualeno.
T A B L A X I
Incrementos obtenidos en los ratones adultos al ser adicionado a su alimentaciónel 3 °/0 de escualeno
Material Pesogrs. Sub. ext. èter. mgrs. Colesterina T mgrs.
S -\- 80,00H + 1,22 -f 53,37 + '9,79B -(-0,06 -f 24,00 -f- °,95R +3i,o7 + 3,77C -f 0,06 -j- 58,42 -f 8>46
En todos los materiales objeto de ensayo hay aumento de peso.Por otra parte, no se encuentra proporcionalidad manifiesta entre
el peso del órgano, las sustancias extractivas al éter y la colesterinatotal.
En el cerebro no se obtiene la colesterina total que, por conside-raciones teóricas, se pensaba obtener.
•<•• Ratones jóvenes.
Corno en el caso anterior, para los ratones adultos, la tabla XIInos indica los incrementos obtenidos.
- Û2% -
También en este ensayo se produce aumento de peso en todosios materiales tratados, menos en el caso del peso del riñon y tam-poco hay proporcionalidad entre peso, sustancia extractiva al éter ycolesterina total. Como es normal, la colesterina total encontradaen el cerebro, no corresponde al valor supuesto. En ambas varian-tes —ratones adultos y jóvenes— no se obtiene una marcada diferencia—números que pudieran quedar fuera de los limites de un ensayobiológico—, lo cual nos hace tomar la pauta de que, con estos ani-
T A B L A X I I
Incrementos obtenidos en ¡<rs ratones /avenes al ser adicionada a su alimentaciónel 3 % ¿e escitaleno
Materiales Peso grs. Susb. ext. éter. mgrs. Colesterina T mgrs.
SHBRC
+ 1,69+ 0,19— o,°3+ 0,26
+ 78,72-j- 24,02+ 33,66+ 51,01
-f 86,00+ 10,01
+ i>33+ 1.32+ 7,32
males, sólo tomaremos un tipo —ratones adultos— para los otrosensayos.
El considerar únicamente los ratones adultos, es debido a las ob-servaciones histológicas ya que, en los jóvenes, se pueden produciralteraciones que son regresivas y, por tanto, falsear los resultadosque se obtengan, por ser difícil de precisar, en esta clase de anima-les, los períodos de máxima cuantía, que son función del tiempo deadaptación a la dieta.
B. Variable. Cantidades crecientes —8,en la dieta.
G, 9 y 12— de escualeno
Los resultados obtenidos con este tratamiento —vehículo graso(P. B.), vehículo graso con el 3, fi, í) y 12 % de escualeno—, son losseñalados en la tabla XIII (medias aritméticas de peso).
En la figura f> —pesos e incrementos de peso al sacrificar—, ¡afigura O —A P/100 de unidad—, la tabla XIV —valores analíticos—, latabla XV —valores referidos a 100 de peso del animal— y la tabla XVI
— 229 —
—tabla comparativa—, son los valores encontrados en estos ensa-yos, con cantidades crecientes de escualeno, frente a los ratones blan-cos (machos).
En este caso B. Variable: cantidades crecientes de escualeno —3,O, 9 y 12 %— en la dieta, la manera de comportarse los animales —ra-tones adultos— frente a las dietas, son las siguientes :
A. Respecto al animal
1. Las dietas son perfectamente toleradas por estos animalesadultos.
2. Sobre las siete semanas oscila el periodo de adaptación.3. La adición a la dieta de escualeno 3, C, 9 y 12 %, produce
aumento de peso en el animal, en cantidad creciente, pero no en fun-ción del tanto por ciento de escualeno adicionado, como lo demues-tra el que corresponda el mayor valor al 6 % de escualeno.
B. Respecto a los materiales analisados
La tabla XVII da los valores obtenidos para este ensayo.
En todos los materiales objeto de ensayo se ha producido au-mento, excepto en el peso del bazo con el 6 % de E, del riñon, cone' $ % E y del cerebro, con el 6,9 y 12 % E, en los que se ha ob-tenido disminución.
Al mayor peso del animal —6 % de escualeno— corresponde ma-yor peso de los materiales objeto de ensayo, siendo también más ele-vadas las sustancias extractivas al éter y la colesterina total, excepíoen el bazo, presentándose las anomalías ya indicadas en el peso delcerebro. En lo que respecta a sangre total a partir del 6 % de escua-leno se obtiene el máximo valor, el cual se mantiene en el 9 y 12 %(le escualeno.
Por todo ello, el empleo de cantidades crecientes de escualeno—hasta el 12 %— en una dieta normal, frente a ratones blancosadultos, aumenta, aproximadamente, la colesterina en 0,5 partes,siendo la colesterina total de 0,4 partes, para el hígado : de 0,18 a">63 para el riñon ; de 0,5 para el bazo y valores por bajo de los de'* prueba en blanco, para el cerebro. Todo hace pensar, puesto que
— 230 —
t^.\Û ^OQO ^O t-o vn \o f*i u-» Tt --3- rt~ m Tf ^- cl M •—o" o" o' o" 6" o" o" o" o" o" o" o" o" o' o' o o" o 6+++++++++++++++-!-+++
co O *O M O in O m O co N N ' Ò O in o^ PO ""> r- CQw co co <tf- ^ in >o" <£> 1^.1-^^0000 0s O^ O*> O O O O- H H — -•-! , - . — M · - . - . - · - . l - . l - l - . k - . C H N CI M
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-M- ++H-+ I +++++++4- ++ I +o — o roc/2 i>O co O io^-o c^)O r^r^i^vi·- O M m ^ J - ^ - T ^ - J - m ^ r i - i o v C ^ O t--t- Q<i txT ^3 C> O O O
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M
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A pGra
20L 10
10k
l P.B. 13% 6% 9e/. Í12% PB. 3% 6% 9V. Í12%
pesos al sacrificar Ap. al sacrificarRATONES ADULTOS *
Fig. 5,
— 2JÏ —
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40
30
20
10 -
P.B. 3% 6% 9% 127o
A p./100 de UnidadRATONES ADULTOS
Fig. 6.
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3
2
T A B L A X V
Valores referidos a la unidad /oo de peso (Ratones)
Tratamiento
P. B.
Con el 3 "/Q. escualeno
Con el 6 °/„ escualeno
Con el g °/0 escualeno
Con el i 2 °/o escualeno
Material
H15RC
HBRC
I IlìRC
HBRC
HBRC
T A
Peso grs.
4,980,82' ,47',346,200,88i,471,70
7,44o,Si1,641,38
5.470,881,44i,746,22
0,98
' ,541,60
B L A X V I
Tabla comparativa (Kit ione
Tratamiento
P. B.
Con el 3 °/0 escualenu
("on el 6 °/0 escualeno
Con el 9 °/0 escualeno
Con el 12 % escualeno
Material
SMRBCSHR13CSHRBCSHRBCSHRBC
Peso grs.
Iriii
1,231,071,007,26
1,490,981,1 11,02
1,09
1,07
0)9S
',32
1,251,04
1,19
1,19
Sub. ext. éter,mgrs.
174,7910,4986,5343,4'
228,1634,49
117,60101,83
266,6927,70
130,8782,93
199,103',83
H5,77104,22
230,1437)63
123,89104,16
•s)
Sub ext. éter.
Iiiii
1,3«3,2«',352,34
' iS2
2,64',5'1,91
1,193,02i,332,40
',3'',433,582,39
Colesterina T.mgrs.
7,863,106,37
29,72
27,654,05
10,1438,18
3',763,679,62
22,08
22 70
3,90
9,9725,4529,17
5,06i 1,7622,03
Colesterina T.
1IIII
',593,Si',3°',59
. 1,28
1,644,041,18',5'o,741,642,88i,251,560,85
1,643,7'1,841,63o,74
235 —
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K C
— 236 —
no existe proporcionalidad manifiesta en los diferentes tantos porciento de escualeno empleados en las dietas, que cantidades superio-res al 3 % de escualeno, en las condiciones apuntadas en el ensayo,no intervienen en la biosíntesis endógena del colesterol y se excre-tan o no, sin sufrir alteración vía colesterol.
Ratas blancas (machos). Dieta normal
A. Variable: peso del animal
i. Ratas adultas (160 grs.).
La manera de comportarse las ratas adultas frente a las dietasformadas con vehículo graso (P. B.) y vehículo graso con el 3 %de escualeno, es la consignada en la tabla XVIII.
T A I Ì L A X V I I I
Atedias aritméticas de piso (Ratas adultas)
Días Prueba en blanco Con el 3 % de escualeno
o '89,0 151,07 195.2 + 6'2 'SS,6 + 7,614 190,0 —5,2 162,6 + 4,021 190,4 +0,4 164,4 +1,828 '91,6 + 1,2 163,0 — 1,435 '92,4 +0,8 164,0 +1,042 '93,6 + 1,2 165,0 + i,o49 '94,8 + 1,2 165,0 0,056 201,8 +7,0 174,4 +9,463 210,6 +8,8 170,6 —3,870 205,6 —5,0 177,0 +6,477 206,0 +0,4 176,2 —0,884 204,4 —1,6 177,2 +1,091 204,2 —0,2 176,6 —0,698 204,2 0,0 176,6 0,0105 203,8 —0,4 173,6 —3,01 1 2 2O3,8 O,O 174,0 +O,6
119 202,8 —1,0 174,8 +0,8I2Ó 201,2 — 1,6 175,6 + °fi
132 198,4 — 2,8 '75,6 °,°
Días 132 139ú Peso 9,4 24,6
- 3.3? -
Grs.200-
Grs.50-
190 40
30
180- 20
10-
P.B. r 3"/, EWQl
pesos al sacrificar
P.B. +3V.E
A p. al sacrificarRATAS ADULTAS
Fig. 7,
%
20
10
— 23s —
RB. +3%
Ap./lOO de Unidad
RATAS ADULTAS
Fifí.. 8.
— 239 —
Transcurrido el tiempo de estar sometidas las ratas a las dietasindicadas, se sacrifican y se efectúan los análisis en los materialesobjeto de ensayo. Los resultados que hemos obtenido están consig-nados en las figuras 7 —pesos y A P al sacrificar— y 8 —A P/100 uni-dad— y las tablas XIX —valores analíticos—, XX —valores refe-ridos a la unidad 100 de peso del animal— y XXI —tabla compa-rativa—.
T A B L A X I X
Valores analíticos (Ratas adultas)
P. B.
Con el
P. B.
con el
M
Tratamiento
SangreHígadoBazoRiñonCerebro
3°/0de escualeno. SangreHígadoBazoRiñonCerebro
T A B L A
Valores referidos a la unidad
Tratamiento Material
HBKC
3% de escualeno. H- B
RC
A T ' E R I A L
Sobre 100 de sub. fresca
P. U. grs.
0,05 I I0,43801,46941,4107
6,48870,52691,59201 ,4602
X X
loo de peso
Pesogrs.
3,°50,220,740,71
3,690,300,900,83
Subs. ext. éter.
3,054,468,357,84
2,733 , l i8,3°5,8?
de ratas adttìtas
Sub. ext. éter,mgrs.
93,°2
9,8 161,7955,66
100,739.33
74,7048,72
Colesterina T.mgrs.
224345537478
2'.343
2193395'757 í
2.3'S
Colesterina T.mgrs.
10,52I , l83,53
16,63
12,50'•555,13
19,21
— 140 —-
T A> i A X X I
Tabla comparativa (Ratas adultas)
Tratamiento
P. B.
Con el 3°/0 de escualeno.
Material
SHBRC
SHBRC
Peso grs.
,
iiit
1,20
1,360,82
0,85
Sub. ext. éter.
IiiIi
1, 08o,951,040,87
Colesterina T.
j
iiiI
0,981,18'.S1
i,4S1,15
En este caso de ratas adultas, el modo de comportarse estos ani-males frente a la dieta con el 3 % de escualeno, es la siguiente :
A. Respecto al animal
1. Las dietas son perfectamente toleradas por las ratas blancasmachos.
2. Alrededor de las siete semanas está el período de adaptación.3. Se produce aumento de peso en el animal, cuando a la dieta
se le adiciona el 3 % de escualeno.
B. Respecto a los materiales anafísados
En la tabla XXII tenemos los resultados obtenidos :
T A B L A X X I I
Incrementos obtenidos en las ratas adultas frente a dietascon el 3 °/0 de escualeno
Materiales
SHBRC
Pesogrs.
+ 0,64+ 0,08+ 0,1«
+ 0,12
Sus. ext. éter,mgrs.
+ 7.71— 0,48+ 12,91— 6,94
Colesterina T.mgrs.
— 50,00+ 1,98+ 0,37+ i, 6o- 2,58
— 241 —
En la colesterinemia se produce disminución y, en el cerebro, sesiguen obteniendo los incrementos negativos, así como en el bazo.En el resto de los valores obtenidos, se produce aumento y no existeproporcionalidad.
'2. Ratas jóvenes.
En esta variante, se han empleado ratas de 125 y 115 (medias arit-méticas) de peso inicial y la manera de comportarse frente a lasdietas, está representada en la tabla XXIII.
T A B L A X X II 1
Media aritmética de pesos (Ratas jóvenes)
Días P. B. C0nel.'i»A>deescualem>
0
71421
28
35424956637077849 198lot
\ peso
125123109i°3>7104,5107,5!I5"5130'32,5'37,5134,2'37,5'35141,2145, 2
———+++++++
+
+-U
20,2
2,O
14,0
5.3o,33,o7,510,05,°2,5
5,°3,33-32,56,2
4,0
1¡5I 10
I 12
114
116,8
120
130
131
13'129
127,4129
127,4128
134,4
137
—+
+
+
+
+
+
—-t-
+
—+
+
+
22,O
5,°2,0
2,0
2,8
3'2I O, O1,0
2,0
8,41,6',60,66,42,6
El ensayo se ha dado por terminado a los 101 y 102 días de trata-miento, siendo los resultados obtenidos los consignados en la figu-ra 9 —pesos al sacrificar e incrementos de peso—. La figura 10, nosindica los valores hallados al referirlos a 100 de peso del animal.
Una vez sacrificadas las ratas, los resultados obtenidos están re-presentados en la tabla XXIV y los valores comparativos, en lastablas XXV y XXVI.
R«v. DE LA REAL ACADEMIA DE CIENCIAS.—1961 16
— 242 —
Grs150-
I140h
1
130Í-
120
110
-
~
P.B.
A p.Grs
+ 3 '/.E.
30
20
10
-
-
P.B. +3V.E.
pesos al sacrificar A p. al sacrificar
RATAS JÓVENES
Fig. 9.
— 243 —
%
50f
AO
30
20
10
P.B. + 3% E.
A p./100 de Unidad
RATAS JÓVENES
Fig. 10.
- 244-
T A lì L A X X I V
Valorei analíticas (Ratas jóvenes)
Tratamiento Clase
P. li. SHBRC
3 °/o escualeno SHBRC
T A
Valores referidos a loo
Tratamiento Material
P. B. HBRC
Con el 3 °/0 escualeno HBRC
T A
Tabla compa
Tratamiento Material
P. B. S11BRC
Con el -5 °/,| escualeno SHBRC
Peso/U.
6,12720,4901I.5653i,3663
5,42200,43981,28981,2639
B L A X X V
unidad de peso
Peso/U
4,21
0,341,07o,94
3,950,32o,940,92
B L A X X V 1
Sub. exl. éter,grs.
3,004,5'8,727,42
3,013.428,005,24
(Ratones jóvenes)
Sub. ext. éter,mgrs.
126,30"S.SO93,3°69,74
118,8910,9475,2048,20
Colesterina T.mgrs.
247347566562
i,596
250341507630
1,489
Colesterina Tmgrs.
14,801,926,01
15,00
13,461,875,92
'3,69
r at iva (Ratas joignes)
Peso/U.
iiii
°,93o,940,87o,97
Sub. ext. éter.
III1
0,940,7 t0,800,69
Colesterina T.
II1II
1,01
0,QO
0,970,980,91
- 24$ -
En los ensayos de las ratas jóvenes, se obtienen los siguientesresultados :
A. Respecto al animal
!.. Las dietas son perfectamente toleradas poi las ratas jóvenes.-'. Sobre las siete semanas oscila el período de adaptación.e!. Se produce aumento de peso en los animales.
B. Respecto a los materiales analizados
La tabla XXVII nos da los resultados obtenidos en este ensayosobre ratas jóvenes.
T A B L A X X V I I
Incrementos obtenidos en las ratas jóvenes frente a dietascon el 3 °/0 de esctialeno
Materiales
SHBRC
P e s og«.
— 0,26— 0,02— 0,13— 0,02
Sub. ext. «ter.mgrs.
— 7,4'— 4,36
— 18,10- 21,54
Colesterina T,mgrs.
+ 3,°°— i,34— o,°5— 0,09— i ,3'
En este ensayo con ratas jóvenes, se obtiene disminución en to-dos los valores, excepto en la colesterinemia.
Examinando, en conjunto, las variables apuntadas para los en-sayos con ratas machos —adultas y jóvenes—, frente a dietas con el3 % de escualeno, se observa la marcada diferencia que existe en elempleo de ratas adultas o jóvenes, ya que, en las segundas, se obtienen valores que pueden distar mucho de la realidad —como ya seapuntó en el caso de los ratones y que, aunque no hay discrepanciamanifiesta entre los valores obtenidos, para cada caso, se hace pa-tente en su estudio histológico— por no poderse precisar el gradode madurez necesario para que estas anomalías no se presenten, yaque entran de lleno en fenómenos regresivos y, por tanto, falsean
— 246 —
los resultados, lo cual nos induce a descartar de estos ensayos a losanimales jóvenes, y únicamente, emplear adultos.
Ratas blancas (machos). Dicta libre de grasa
Con el empleo de la dieta libre de grasa, se han utilizado ratasblancas adultas de alrededor de ICO grs. peso unidad y, cuyo compprtamiento, durante el ensayo, está reseñado en la tabla XXVIII(medias aritméticas).
T A B L A X X V I I I
ñíedia aritmética de pesos (Ratas aduli as)
Dias P. B. Con el3»/0deesctialeno
o7
142l2&
35424956637077849198
•05I 12119
126r3J140147154161
DíasA /
137.0138,4140,8144,8I45.6
149,2150,6152,2153,8i54,o152,2158,71 60,0161,2101,2
I62,O
163,0
^4,5
l64,5165,0
169,0
I7O,O
173,0
174,0
+ 1,4+ 1,6+ 4,o+ 0,8+ 3,6+ i,4+ .,6+ 1,6+ 0,2
— 1,8+ 6,5+ i,3+ 1-2
0,0
+ 0,8+ 1,0+ '.5
0,0
+ 0,5+ 4,o+ 1,0
+ 3,o+ 1,0
152,0152,0'53,8'55,6158,8'59,o162,0165,0164,01 66,01 66,0165,2166,4167,1>67.3167,41 68,01 68, i167,9167-41 68,0168,2168,3
0,0+ 1,8+ 1,8+ 3,*+ 0,2
+ 3,°+ 3,o+ 2,0
— I, O0,0
— 0,8+ 1,3+ 0,7+ 0,2
+ 0,1
+ 0,6+ 0,1— 0,2
— 0-5+ 0,6+ 0,2
+ 0,1
1 68,0 — 0,3
141
37Ut
16
A los io dias —período de adaptación-a suministrar la dieta.
se empezó
La figura 11 —gràfica y A P al sacrificar—, y la figura 12 —valo-res referidos a la unidad 100 de peso del animai—, la tabla XXIX
— 247 ~
Grs180
170
160
P.B. + 3%E.
Grs50
AO
30
20
10
P.B. +37.E.
pesos al sacrificar A p- al sacrificarRATAS ADULTAS
Fig. il.
— 248 —
%
30
20-
10
P.B. +3%
A P./100 de Unidad
RATAS ADULTASFig. 12.
— î49 —
T A B L A X X I X
'alores analíticos (Raias /arenes)
Tratamiento Material
P. B. SHBRC
Cón el 3 u/0 escualeno SH15RC
T A B L A
Valares referidos a ¡a unidad
Tratamiento Material
P. P. HJÌRC
Con el 3 % escualeno HBRC
Peso/U.
6,87660,63262,0217i,5036
6,56900,7355i,67931,4228
X X X
IOO de peso
Peso/U.
3,950,361,1 60,86
3>96o,430,990,84
Sub ext. éter,grs.
3,573,21
12,977-7 '
2,832,33
1 1,467,45
(Ratas adultas)
Sub. ext. éter,mgrs.
140,01' « . S S
'50,4566,30
112,0610,01
113,4562,58
Colesterina T.rngrs.
«5°292447438
1,276
,67279413434
',348
Colesterina T.mgrs.
10,53i, 605 ,08
10,97
11,041,774,29
n,32
T A B L A X X X 1
Tabla comparativa
Tratamiento Material
P. B. SHBRC
Con el 3 o/0 escualeno SHBKC
(Ratas adultas)
Peso/U.
iii1
1,001,180,85o,97
Sub. ext. éter.
lilI
0,800,86o,750,94
Colesterina T.
1,1 I1,041,10
0,84i ,03 .
— ,450 —
—valores analíticos encontrados—, en la tabla XXX —referidosa 100 de peso del animal— y la tabla XXXI —tabla comparativa—,son los valores hallados en este ensayo.
En el caso de la dieta libre de grasa con el 3 % de escualeno—con animales ratas blancas—, nos encontramos con el siguientecomportamiento :
A. Respecto a los animales
1. Las dietas son perfectamente toleradaes por los animales des-pués de un período de adaptación, a la nueva dieta, de dos a tres se-manas.
2. Alrededor de las siete semanas se produce la perfecta adap-tación.
B. Respecto a ¡os materiales analizados
Los resultados obtenidos son los expresados en la tabla XXXII.
T A B L A X X X I I
¡ucreintntos obtenidos en las raías adultas frente a dietasghicidas con el 3 °/0 di cscualcno
Materiales
SHBKC
P e s ogrs.
-f- 0,0 1+ 0,07— 0,17— 0,02
Sub. cxf , éter.mgrs.
- 27,95— ',54— 37,°°- 3-72
Colesterina T.mgrs.
-f- I7,oo+ 0,5 '+ °,I7— o,79+ °,35
En estos ensayos ùnicamente se produce disminución en los co-rrespondientes a las sustancias extractivas al éter, en el peso y lacolesterina del riñon y en el peso del cerebro, sin presentarse, comoen todos los casos, proporcionalidad manifiesta.
En este caso, no obra la dieta libre de grasa como su correspon-diente dieta normal, ya que al obtener la P. B. con aceite de olivarefinado de índice de escualeno 410, el ensayo paralelo, con el 3 %de escualeno, queda elevado comparativamente en lo que respecta a
— 4 5 f -
la colesterinemiä y, francamente, se favorece la eliminación de lassustancias extractivas al éter, pero cuya cuantía está por debajo de lanecesaria, para obtener menores valores de colesterina total.
El estudio comparativo —dieta normal y dieta glúcida con el3 % de escualeno—, nos aclara este punto de vista que hemos con-siderado (tabla XXXIII).
T A U L A X X X I I I
Tabla comparativa
Materiales
SHBRC
P e s ogrs.
D. N.
+ o,53+ 0,08+ °,°5— 0,12
D. G.
-j- O, O I
+ 0,07— 0,17— 0,02
Sub. ext. eler.mgrs..
D. N.
- 13,13— 1,98— 1,19— 16,52
n. G.
— 27,95— ',54— 37,00— 3,72
D
—-f--f-~1~
+
Colesterinamgrs.
. N.52,00
2,88o,34o,340,62
D+++—
T.
. G.17,000,510,17o,79°>35
CONCLUSIONES
1. Todas las dietas empleadas son perfectamente toleradas porlos. animales machos •—ratones y ratas—'-, por un período de. tiempoalrededor de los 135-140 días, para lo cual se necesita tin período deadaptación de siete semanas, aproximadamente. En el caso del em-pleo de dieta libre de grasa, es necesario someter a los animales an-tes de empezar el ensayo, a un período de dos a tres semanas con lanueva dieta. Por los valores analíticos obtenidos, así como por suhistología, no se pueden considerar los resultados encontrados en losanimales jóvenes, ya que, como claramente nos lo han demostradolos ensayos en ratas, no se puede precisar el grado de madurez ne-cesario para que puedan eliminarse los fenómenos regresivos quefalsean los resultados. Por tanto, nos referimos única y exclusiva-mente, a animales adultos.
-• La adición del 3 % de escualeno, a la dieta, produce aumentode peso del animal y, subsecuentemente del hígado, bazo, riñon ycerebro, por regla general. Aumento de las sustancias extractivasul éter en el hígado, bazo, riñon y cerebro, en los ensayos con "rato-nes. Disminución, en los materiales indicados, cuando se emplea dieta
— 252 —
li.bre tie grasa, en las ratas. En el caso de las ratas con dieta nornulhay aumento de peso en el hígado y en el riñon y disminución en elbazo y el cerebro.
La colesterina total, de estos materiales indicados, aumenta conla excepción del cerebro, para ratas con dieta normal, y disminuyóen los ensayos con dieta glúcida.
La colisterinemía aumenta en los ratones y ratas sometidos a dietaglúcida y disminuye francamente, en el caso de las ratas con diet-inormal.
Entre los valores analíticos obtenidos —peso, sub. ext. éter ycolesterina total— para el hígado, bazo, riñon y cerebro, no existeproporcionalidad manifiesta.
En los casos ensayados, los valores encontrados para el cerebro,no corresponden a los que en hipótesis se debían hallar.
3. La adición de cantidades crecientes de escualeno —3, 6, 9 y12 %— a una dieta normal, se comporta del mismo modo que iosresultados encontrados con el 3 % de dicha sustancia, lo cual hacepensar, puesto que no existe proporcionalidad manifiesta al aumentarel tanto por ciento de escualeno, que cantidades superiores al 3 %de esta sustancia, en las condiciones apuntadas para el ensayo, nointervienen en la biosíntesis endógena del colesterol y se excretan öno, sin sufrir alteración vía colesterol.
Quiero hacer constar mi agradecimiento al Prof. Dr. D. JuliánSanz Ibáñez por la ayuda prestada en este trabajo y por la deferenciade que he sido objeto al realizar, personalmente, la comprobaciónhistológica. Mi gratitud a la Fundación «Conde de Cartagena» de laReal Academia de Ciencias.
Diciembre de 1960.
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