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Introducción a la biología celular y molecular
““ Extracción, cuantificación, electroforesis en SDS PAGE de
proteínas y
Western blot”
Alumnas : Denis Verónica Ortegas Verónica Vargas Paola
Instructores : Rubio Fernanda Romanauski Andres
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Introducción a la biología celular y molecular
Resumen
En el presente trabajo práctico se extrajeron proteínas a partir de una muestra de
tejído de hígado de ratón por medio de la aplicación de un buffer de homogeneización
( para degradar los límites celulares y obtener el extracto crudo) y la separación de las
proteínas de los restos celulares a traves de sucesivas centrifugaciones. Se estimó la
concentración de proteínas obtenidas utilizando una curva de calibración hecha a
partir de dilusiones de una proteína de concentración conocida (BSA). A estas
proteínas se las separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Antes de eso
se agregó un detergente para desnaturalizarlas y para que obtengan todas la misma
carga neta. Entonces la separación de las proteínas solo se debió al peso molecular
de las mismas sin influir la conformación ni la carga de cada una de ellas.
En el gel obtenido, teñido con el colorante coomasie blue solo se pudieron identificar
algunas manchas, por lo cual solo se calculó el peso molecular de dichas manchas.
Por otro lado, se utilizó la tecnica de Westernblot para identificar los niveles de la
proteína inmunoglobulina (IgG) antiHA. Para ello, se utilizaron anticuerpos secundarios
que reconocen la secuancia de 50KD de las proteínas transferidas a una membrana
de nitrocelulosa y un colorante (luminol) el cual permitió revelar en placas radiográficas
las bandas correspondientes a la secuencia de 50KD.
Introducción
Antes de realizar un extracto de proteínas es importante tener en cuenta la fuente de
la proteína deseada (tejido animal, vegetal o cultivo celular) y la finalidad del extracto
para determinar el buffer de extracción, dependiendo de si se quiere o no que las
proteínas conserven determinadas características biológicas.
Ambos detalles permiten programar el protocolo a utilizarse.
Preparación del extracto crudo
Una vez que la fuente de las proteínas ha sido seleccionada, el paso que sigue es la
extracción de las mismas.
1. A partir de un cultivo celular: La extracción puede realizarse adicionando un
detergente, ocasionando un shock térmico.
2. Cuando se trata de una muestra de tejido: Se debe homogeneizar el tejido y destruir
sus límites celulares mediante el uso de químicos que retienen las proteínas en
solución (extracto crudo) o con métodos mecánicos.
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Introducción a la biología celular y molecularPara formar un homogeneizado, se debe romper las membranas celulares,
fraccionándose las células de los tejidos. Se puede utilizar la centrifugación diferencial
para obtener fraccionamientos subcelulares o aislar organelas específicas. En esta
técnica, las moléculas más pesadas o más densas sedimentan con mayor rapidez que
las livianas o menos densas.
Durante todo el proceso se debe procurar que las proteínas se preserven intactas, lo
que implica trabajar con las muestras en hielo para inhibir la acción de las proteasas.
Cuantificación de las muestras mediante ensayos colorimétricos
Los ensayos colorimétricos involucran la adición de un reactivo químico capaz de
reaccionar con determinados residuos aminoacídicos. Como resultado de estas
reacciones, la solución cambia de color y se puede medir utilizando un
espectrofotómetro.
Los métodos colorimétricos más usados son:
1. Ensayo de Lowry (750 nm): Es rápido, sencillo y relativamente sensible. Es
afectado por un amplio rango de compuestos no proteicos como EDTA, sulfato
de amonio y B-mercaptoetanol, pero existen variables que pueden realizarse
para evitar estas interferencias.
2. Ensayo de Bradford (595nm): Es doblemente sensible que el ensayo anterior.
Es un método rápido y muy sencillo y además, no presenta interferencia con
sustancias reductoras como el DTT y el B-mercaptoetanol. La desventaja es
que es altamente sensible a detergentes y lípidos.
3. BCA (Bicinchoninine acid assay 562nm): Es compatible con detergentes.
Mucho más sensible que el ensayo de Lowry. Los complejos coloreados son
muy estables pero es suscepible a interferencias.
Para determinar la concentración de proteínas se construye una curva de calibración
con los resultados de absorbancia de una proteína standard de concentración
conocida (generalmente BSA, albúmina sérica bovina) y se interpolan los resultados
de absorbancia obtenidos de las muestras incógnitas. Como se trabajan con datos
reales, los gráficos que se obtienen no son tan ideales. Por eso, al realizar la curva de
calibración se suelen eliminar los valores que no forman parte de la serie de puntos
que forman una recta.
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Introducción a la biología celular y molecularComo las proteínas absorben a 280 nm y a bajas concentraciones de manera
proporcional con su concentración, puede construirse una curva de calibración que
represente la absorbancia vs. concentración, para determinar la concentración de
proteínas totales en la muestra, analizando los resultados de absorbancia e
interpolando a una curva de calibración de una proteína estándar de concentración
conocida.
Electroforesis en gel de agarosa SDS-PAGE
Los pesos moleculares de las proteínas se pueden estimar si son sometidas a
electroforesis en presencia de un detergente (SDS) y de un agente reductor
(Mercaptoetanol y DTT).
Cuando la proteína es tratada con SDS, el detergente desbarata las estructuras
secundaria, terciaria y cuaternaria para producir cadenas lineales de polipéptidos
cubiertas de la carga negativa de las moléculas del SDS. La presencia del
mercaptoetanol ayuda a la desnaturalización, reduciendo todos los puentes disulfuro.
El detergente se une a las regiones hidrofóbicas de las cadenas de proteínas
desnaturalizadas en un radio constante de 1.4 g. de SDS por gramo de proteína. Las
cargas negativas del detergente esconden la carga natural de las proteínas. Entonces
se forman cadenas polipeptídicas de forma constante. La movilidad electroforética del
complejo SDS-proteína está influenciada principalmente por el tamaño de las
moléculas: aquellas más grandes son retenidas por el gel (efecto de colador), teniendo
mayor movilidad las moléculas más pequeñas.
Después de la electroforesis, las proteínas se pueden visualizar en el gel tiñiéndolas
con plata o con un colorante como el azul de Coomassie, que revelan una serie de
bandas.
La movilidad electroforética de muchas proteínas en geles de SDS-poliacrilamida es
inversamente proporcional al logritmo de su masa: por lo que, la movilidad es medida y
los pesos moleculares son determinados graficamente.
La electroforesis en gel de poliacrilamida en SDS es rápida, sensible y tiene alto poder
de resolución.
Al ser muy sensible, puede ser afectada por muchos errores experimentales:
Temperatura durante la polimerización y la corrida del gel: La viscosidad del agua
aumenta a bajas temperaturas, afectando la movilidad de las proteínas. Este efecto
puede atenuarse manteniendo baja la temperatura durante la electroforesis.
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Introducción a la biología celular y molecularVelocidad de polimerización: Una polimerización muy rápida puede llevar a una
contracción no uniforme del gel, deformando las bandas. Por ello, se reduce la
cantidad de TEMED y de persulfato de amonio, con el objetivo de hacerla más lenta.
Pureza de los reactivos: Para tener geles de alta resolución es indispensable utilizar
reactivos de alta calidad y agua desionizada.
Tiempo de corrida: Cuando el tiempo de corrida es muy corto, los polipéptidos no
avanzan la distancia necesar para su correcta separación, aunque una corrida
relativamente rápida minimiza la disperción de la muestra y el ensanchamiento de la
banda.
Preparación de las muestras: Para evitar errores en las bandas es necesario lograr
una completa desnaturalización de las proteínas.
Tinción: Para evitar la elusión de las proteínas pequeñas son esenciales una rápida
tinción, destinción y fijación de las mismas.
WESTERN BLOT
● La inmunoelectrotransferencia se usa para idenificar la presencia de una
proteína dada en un lisado de células.
● A células no marcadas se las coloca en detergente para solubilizar todas las
proteínas celulares y el lisado se corre sobre SDS-PAGE para separar las
proteínas.
● A continuación, las proteínas separadas según su tamaño se transfieren desde
el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (soporte más estable).
● Luego se trata a las proteínas con anticuerpos que pueden reaccionar con
proteínas desnaturalizadas y solubilizadas con SDS.
● Los anticuerpos unidos se revelan por medio de anticuerpos contra
inmunoglobulina marcados con radioisótopos o una enzima.
La electroransferencia Western tiene muchas aplicaciones en investigación básica y
en el diagnóstico clínico. A menudo se usan para analizar sueros para buscar la
presencia de anticuerpos contra proteínas específicas, por ejemplo para detectar
anticuerpos contra distintos constituyentes del virus de la inmunodeficiencia humana,
VIH.
Materiales y procedimientos:
Se siguieron los pasos descriptos en la guía de trabajos prácticos de Introducción a la
biología celular y molecular.
Resultados y Discusiones:
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Introducción a la biología celular y molecular
En la siguiente tabla se muestran los valores de absorbancia de las distintas
concentraciones de la muestra (se restó el promedio de los dos blancos) y la
desviación estándar de cada uno de los puntos de la curva con respecto al promedio
de los duplicados:
Absorbancia
(595 nm)
Concentración
(ug/ul)
Desviaciónes
estándar
0.0005 0 0.0035
0.0055 0.1 0.00070
0.3775 0.15 0.0601
0.237 0.2 0.0452
0.0035 0.25 0.00919
0.4145 0.3 0.0162
0.494 0.35 0.0056
0.545 0.4 0.1781
0.806 0.45 0.0070
0.957 0.5 0.0056
Curva de calibración hecha con los valores de la tabla para lograr una ecuación que relaciona linealmente a las concentraciones de la proteína conocida con las absorbancias de las mismas:
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Introducción a la biología celular y molecular
A partir de la curva de calibración se trazó la recta de regresión correspondiente a la
misma y r2 dio un valor no tan cercano a uno; por lo que, se considera que algunos de
los puntos se desviaban bastante de la linelidad. Esto se puede ver también en las
desviaciones estándar de dichos puntos (nombradas anteriormente). El punto cinco de
la curva ( ubicado entre 0.2 y 0.3) da un valor de casi cero cuando debería dar un
valor mayor al del punto anterior, además en el momento de preparar la gradilla con
las muestras se observó que el punto cinco no tenía el color azul que se observaba en
el resto de las muestras preparadas con el reactivo de Bradford por lo cual absorbió
como si no estuviera la muestra, comparando este valor con el blanco obtenido.
Seguramente en el momento de preparar la muestra nº 5 se cometió algún error con la
cantidad de Bradford o BSA, o directamente se omitió alguno de estos dos. Igualmente
no se eliminó ninguno de los puntos ya que no se cuenta con algún criterio para poder
saber cual de los puntos son los que realmente corresponden con la concentración de
proteínas y la absorbancia que se pretendía tener.
Para el calculo de la concentración de proteína obtenida se utilizó la ecuación
resultante. Es decir que utilizando los valores de absorbancias de concentraciones
conocidas de una proteína se puede comparar la absorbancia de la muestra con ellas
y así calcular la concentración total de proteínas obtenidas.
Para calcular la concentración de proteínas obtenidas se utilizó la ecuación resultante;
es decir, se compararon los resultados de absorbancia obtenidos, con los de otra
proteína cuya concentración es conocida. Esta ecuación es calculada del promedio de
las concentraciones y absorbancias de todos los grupos para que todos tengan el
mismo error.
Se calculó la concentración necesaria de la muestra para obtener 80ug de proteínas
en la corrida electroforética SDS-page a realizar.
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Introducción a la biología celular y molecularLa intensidad de las bandas pueden ser utilizadas de forma analítica para comparar la
cantidad de proteínas en las distintas bandas, siempre y cuando se siembre la misma
cantidad de proteínas en todas las calles. Para ello se debió realizar una dilución 1 en
7 porque la cantidad calculada previamente estaba en un volumen no pipeteable.
El volumen calculado entonces es 10.5ul. (cálculos en anexo).
Corrida electroforética: sds-page de las proteínas extraídas:
El gel fue teñido overnight con coomasie blue. Y se realizaron lavados con soluciones
de metanol- acético-agua en una relación 3-1-6, respectivamente.
Sabiendo que el Ladder está en la calle número 1, se detallan a continuación la fuente
de las proteínas extraídas por los distintos grupos y su respectiva calle:
calle 2 3 4 5 6 7
fuente bazo corazón pulmón cerebro riñón hígado
grupo 2 3 4 1 5 6
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Introducción a la biología celular y molecularLadder o marcador de peso molecular:
Todas las calles se encuentran difusas y no se pueden diferenciar muy bien las
bandas por algún tipo de error experimental o por la acción de las proteasas que son
las enzimas que degradan las proteínas.
Las únicas calles que muestran bandas son la 2 y la 3.
Calle 2: presenta dos bandas, una de 10 y otra de 15 kD.
Calle 3: hay una banda de 10 kD.
A partir de esto dado que el desplazamiento de las cadenas polipeptídicas es
proporcional al logaritmo de la masa, se construyó una curva de calibración con los
datos de distancia de migración de un patrón de proteínas de peso molecular
conocido; y pudo estimarse, por extrapolación, el peso molecular de las fracciones de
proteínas.
Rf log PM (KDa) PM (KDa)0,14 2,39 2500,21 2,18 1500,3 2 1000,37 1,87 750,57 1,7 500,72 1,57 370,9 1,4 250,93 1,3 200,95 1,17 150,97 1 10
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Introducción a la biología celular y molecular
Log PM vs. Rf y = -0,7116 x + 1,7858
R2 = 0,9537
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Log PM
Rf
Reemplazando el valor de Rf de la proteína incógnita se obtiene:
Rf Log PM (kDa) PM (kDa)
Membrana con la transferencia de las inmunoglobulinas. Gel teñido con rojo
ponceau.
Se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa volumenes conocidos de la proteína
inmunoglobulina para ser utilizada en la tecnica de western blot.
En la calle que contiene al ladder ( bandas azules) se pueden observar las diferentes
bandas correspondientes a volúmenes conocidos de la proteína, pero en la otras
calles las únicas bandas que se ven son las de aproximadamente 50 KD( bandas de
color rosa fuerte). Las de 25KD no se ven en la imagen por que la misma fue
escaneada luego de haber realizado un primer lavado y, como el ponceau es un
colorante reversible algunas de las manchas se van. Antes del valado podían verse
tenues bandas de aproximadamente 25KD.
Esta técnica de tinción se utiliza simplemente con el objetivo de verificar que
efectivamente la proteína fue trasferida a la membrana, por lo cual luego se lava varias
veces para quitar el colorante y utilizar la membrana para realizar el western blot.
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Introducción a la biología celular y molecular
Westernblot (revelado):
En esta técnica se utilizaron anticuerpos secundarios que reconocen la secuencia de
50KD de la proteína inmunoglobulina (igG) antiHA.
Como se sabe que la membrana tiene mucha afinidad por las protéinas y que se
puede producir un “background”, es decir, una unión inespecífica de los anticuerpos a
la membrana ( lo que puedo dar falsos positivos) se utilizó un agente bloqueante. Este
agente (leche en polvo en este caso) se une a la mambrana en los lugares donde no
hay proteínas evitando que los anticuerpos se peguen en esos lugares. La cantidad de
bloqueante depende de lo específico que sea el anticuerpo y debe lavarse el
excedente para que no interceda en la unión de los anticuerpos.
Al revelarse la membrana se pudieron observar las distintas bandas con intensidades
diferentes que indican la presencia de las secuencias de 50KD de las proteínas. La
intensidad de las bandas dan una idea de la concentración de las mismas, es decir
que las bandas más intensas son las de mayor concentración. Puede verse en la
imagen siguiente ( donde se encuentran las cuatro calles en la misma placa (sin
cortar ) como va disminuyendo la intensidad a medida que disminuye la concentración
de la proteína. En este caso puedo compararse por que el tiempo de exposición de las
calles fue el mismo. Sin embargo en las calles cortadas y reveladas individualmente no
se puede realizar esta comparación por que el tiempo de exposición puede modificar
la intensidad de las bandas.
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Introducción a la biología celular y molecular
Conclusión
Las desviaciones en la extrapolación de la curva de calibración pudieron deberse a
factores que no necesariamente alteran a la ley de Lambert Beer, sino que
directamente afectan en la concentración de la muestra (como otros equilibrios
químicos en disolución).
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Introducción a la biología celular y molecularIgualmente el error obtenido en el cálculo de la concentración de la proteína engloba,
también, otros factores ajenos al grupo 6 ya que la ecuación utilizada fue hecha con el
promedio de las absorbancias de todos los grupos.
Lo ideal es tener en cuenta que las proteínas pueden estar formando complejos con
otro tipo de moléculas, o bien puede tener modificaciones postraduccionales,
influyendo en el tamaño de la misma y por lo tanto, en su peso molecular. Por lo que,
los pesos moleculares obtenidos con la comparación con el ladder pueden estar más
alejados del peso molecular real. Por ejemplo algunas proteínas son glucosiladas
luego de la traducción y como el azúcar no es teñido por el colorante coomassie blue,
el peso molecular calculado es menor que el real; ya que el mismo solo refleja el peso
molecular de los residuos aminoacídicos.
Los resultados obtenidos en la experiencia con coomassie blue no fueron
reproducibles por algún error experimental. En el momento de realizar el
homogeneizado es bueno considerar la acción de las proteasas en por eso que es
recomendable ubicar las muestra en hielo. Esto podría haber evitado el chorreado que
se generó y por el cual no se puedo efectuar la lectura de las bandas. Además otro
error pudo haber sido la deficiencia en la colocación de las cantidades de los reactivos
adecuados para la preparación de la muestra a sembrar.
Aunque el Rojo Ponceau tiene menor sensibilidad de detección que el colorante
Coomassie blue , es un método que permite una detección rápida; además, el rojo
Ponceau al contrario que el coomassie blue, tiene la capacidad de teñir
reversiblemente las proteínas; es decir, a medida que se lava con agua, el tinte va
desapareciendo, dejando ver paulatínamente las bandas, y si se continúa lavando
volvería a quedar todo blanco.
Es necesario llevar un control positivo y otro negativo para saber si lo que muestra el
revelado es o no la proteína de interés.
Por otro lado, la técnica de Western blot es mucho más sensible que la tinción con
Rojo Ponceau, debido a la especificidad antígeno-anticuerpo que aumenta la
capacidad de detectar concentraciones menores de la proteína presente en la
membrana. Comparando la imagen del ponceau con la del revelado se puede ver esta
diferencia de sensibilidades, ya que en el Western se ven bandas correspondiente al
volumen de 2ul de proteína que en la de ponceau no se ve. Dicha banda en el
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Introducción a la biología celular y molecularponceau deberían estar a ambos lados de la calle del ladder ( calle con bandas
azules).
Bibliografía:
● Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Damell J.
“Molecular Cell Biology”, 1995, Scientific American Books. .
● Smih y Wood, “Moléculas Biológicas”, 1998, Pearson Education.
● Rodney F. Boyer, “Modern Experimenal Biochemistry”, 1993, second edition,
The Benjamin/ Cummings Publishing Company, Inc.
● Blanco Antonio, “Química Biológica”, 1994, Sexta edición, Editorial El Ateneo.
● Guía de informes entregados por los profesores.
● Kuchel, Philip W, “Bioquímica General”, 1994, Ed. Mc Graw Hill.
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Introducción a la biología celular y molecularAnexo:
Ecuación de la recta de calibración hecha a partir de los promedios de las
absorbancias de todos los grupos:
Y= 1.1196x - 0.0368
Por lo tanto la concentración de proteínas obtenidas es:
100x (0.621 - 0.0368) / 1.1196= 48.85 ug/ul
La ecuación se multiplicó por 100 por que la muestra fue diluida 1/100 antes de llevar
ala espectrofotómetro.
Calculos del volumen de muestra a sembrar para obtener 80ug/ul:
Concentración de la muestra calculada con la curva de calibración: 48.85ug/ul
48.85ug 1ul
2453ug 50ul
Se agregaron los 50ul de la muestra en 250ul de Ripa logrando así una dilución 1/7. Y
20ul del buffer de siembra. Por lo tanto:
2453ug 320ul
80ug 10.5ul.
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