INTRODUCCIN

El contenido total de protenas en los alimentos est conformado por una mezcla compleja de protenas. Estas existen en una combinacin con carbohidratos o lpidos, que puede ser fsica o qumica. Actualmente todos los mtodos para determinar el contenido protico total de los alimentos son de naturaleza emprica. Un mtodo absoluto es el aislamiento y pesado directo de la protena pero dicho mtodo se utiliza slo a veces en investigaciones bioqumicas debido a que es dificultoso y poco prcticoEn 1883 el investigador dansJohann Kjeldahldesarroll el mtodo ms usado en la actualidad para el anlisis de protenas (mtodoKjeldahl) mediante la determinacin del nitrgeno orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico total se convierte mediante esta digestin en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solucin de cido brico. Los aniones del borato as formado se titulan conHCl (o H2SO4)estandarizado para determinar el nitrgeno contenido en la muestra.El resultado del anlisis es una buena aproximacin del contenido de protena cruda del alimento ya que el nitrgeno tambin proviene de componentes no proteicos.El mtodoKjeldahlha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utiliz permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidacin (digestin), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descart. En 1885Wilforthencontr que se poda acelerar la digestin utilizando cido sulfrico y aadiendo un catalizador.Gunningen 1889 propuso aadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullicin del cido sulfrico utilizado en la digestin para disminuir el tiempo de la reaccin.En la actualidad se utiliza principalmenteSulfato de Cobre penta hidratrado CuSO4.5H2Ocomo catalizador.

OBJETIVOS

Con la redaccin de este informe se persigue que los alumnos adquieran la capacidad de: Comprender los fundamentos del mtodo Kjeldahl para la determinacin del contenido en protena de un alimento. Conocer el procedimiento experimental del anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl, recogiendo el nitrgeno sobre cido brico y valorndolo con una disolucin de cido clorhdrico o sulfrico. Calcular el porcentaje de protena de un alimento a partir del contenido de nitrgeno obtenido por el mtodo Kjeldahl.

DESARROLLO A continuacin pasamos a describir el fundamento del mtodo Kjeldahl y las etapas que los constituyen. Despus, se describir el procedimiento experimental y los clculos implicados. Para finalizar se expondr un ejemplo prctico real.

4.1 Fundamentos del mtodo y etapas

El mtodo Kjeldahl mide el contenido en nitrgeno de una muestra. El contenido en protena se puede calcular seguidamente, presuponiendo una proporcin entre la protena y el nitrgeno para el alimento especfico que est siendo analizando, tal y como explicaremos ms adelante. Este mtodo puede ser dividido, bsicamente en 3 etapas: digestin o mineralizacin, destilacin y valoracin. El procedimiento a seguir es diferente en funcin de si en la etapa de destilacin el nitrgeno liberado es recogido sobre una disolucin de cido brico o sobre un exceso conocido de cido clorhdrico o sulfrico patrn. Ello condicionar la forma de realizar la siguiente etapa de valoracin, as como los reactivos empleados. En este informe se explica el primer procedimiento, cuando el nitrgeno se atrapa sobre cido brico. (a) Etapa de digestin: un tratamiento con cido sulfrico concentrado, en presencia de un catalizador y ebullicin convierte el nitrgeno orgnico en in amonio, segn la ecuacin 1. catalizadores/ calor n - C -NH2 + H2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 (ec. 1) Procedimiento: Se introducen de 1 a 5 g de muestra un tubo de mineralizacin y se ponen 3 g de catalizador que suele estar constituido por una mezcla de sales de cobre, xido de titanio o/y xido de selenio. De forma habitual se utiliza como catalizador una mezcla de K2SO4 : CuSO4 : Se (10:1:0,1 en peso). Despus se adicionan 10 mL de H2SO4 concentrado y 5 mL de H2O2. Posteriormente se digiere a 420 C durante un tiempo que depende de la cantidad y tipo de muestra. Se sabe que la digestin ha terminado porque la disolucin adquiere un color verde esmeralda caracterstico. En esta etapa, el nitrgeno proteico es transformado en sulfato de amonio por accin del cido sulfrico en caliente. En la actualidad, para llevar a cabo este proceso se utilizan digestores automticos que son capaces de digerir un nmero determinado de muestras al mismo tiempo (imagen 1). Imagen 1. Unidad de digestin (b) Etapa de destilacin (imagen 2): se alcaliniza la muestra digerida y el nitrgeno se desprende en forma de amoniaco (ecuacin 2). El amoniaco destilado se recoge sobre un exceso desconocido de cido brico (ecuacin 3). (NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (ec. 2) NH3 + H3BO3 NH4 + H2BO3 - (ec. 3) Procedimiento: Despus de enfriar se adicionan al tubo de digestin 50 mL de agua destilada, se pone en el soporte del destilador y se adiciona una cantidad suficiente de hidrxido sdico 10 N, en cantidad suficiente (50 mL aprox.) para alcalinizar fuertemente el medio y as desplazar el amoniaco de las sales amnicas. El amoniaco liberado es arrastrado por el vapor de agua inyectado en el contenido del tubo durante la destilacin, y se recoge sobre una disolucin de cido brico (al 4 % p/v). Imagen 2. Unidad de destilacin (c) Etapa de valoracin: La cuantificacin del nitrgeno amoniacal se realiza por medio de una volumetra cido-base del in borato formato, empleando cido clorhdrico o sulfrico y como indicador una disolucin alcohlica de una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno (ecuacin 4). Los equivalentes de cido consumidos corresponden a los equivalentes de amoniaco destilados. H2BO3 - + H+ H3BO3 (ec. 4)

4.2 CLCULOS De la valoracin se puede calcular el nmero de equivalentes de nitrgeno recogidos, y con ste dato se obtiene el porcentaje de nitrgeno en la muestra. Para calcular el porcentaje de protena basta con multiplicar por un factor de conversin el % de nitrgeno calculado. Este factor de conversin est tabulado para cada grupo de alimentos. En la tabla 1 se recogen los factores para algunos alimentos.

Es un mtodo oficial Se comienza pesando 10g de sulfato potsico que sirve para elevar el punto de ebullicin del acido sulfrico y asi favorecer la mineraizacion de la leche se adiciona 1 ml de disolucin de sulfato de cobre al 5 % que va a ctuar como catalizador aumentando la velocidad de la reaccin de mineralizacin para que la toma de muestra sea lo mas correcta posible es necesario que la grasa de la leche este perfectamente repartida por ello se agita la leche con cuidado de no hacer espumasEn un tubo de ensayo con tapon se vierte aproximadamente 5 ml de leche en el platillo de la balanzase pone un vasode precipitado que sostiene el tubo cerrado con la leche y se tara, es decir, la balanza se lleva a 0 La leche del tubo de ensayo se escha en el tubo de digestin y se pesa de nuevo , ahora con el tubo de ensayo sin leche la diferencia en la pesada es la cantidad de leche tomada para el anlisis ( se anotan todos los datos obtenidos) Por ultimo se aaden 20 ml de acido sulfrico concentrado con un dosificador de 10 ml por lo que esta accin se repite dos veces Se agita para disolver todo lo que hay en el tubo de digestin, en el momento que el acido sulfrico reacciona con la leche se produce una carbonizacin parcial de la muestra y por esta razn la disolucin toma un color marron negrusco Elobjeto de vidrio que se coloca encima de los tubos de digestin sirve para conectarlos a una bomba vacio que es ta encargada de arrastrar los vapores del agua y acido sulfrico y hacerlos burbujear en una disolucin de hidrxido sdico para neutralizarlos , los tubos de digestin que aparecen transparentes no tienen muestra solo acido sulfrico y se ponen porque el aparato calienta los 6 tubos a la vez la etapa de digestio o mineralizacin es la mas pesada ya que dura unas 4 horas Con objeto de evitar en lo posible una gran formacin de espuma se comienza calenrando suavemente y se eleva la temperatura conforme va avanzando la mineralizacin durante la mineralizacin de la muestra se observa al principio la fornacion de vapores de agua y de acido sulfrico, posteriormente la formacin de espuma y as tarde comienza a hervir si la espuma sube por encima del tubo de digestin se perdera parte de la muestra y se tendra que empezar de nuevo con el anlisis. Tras la ebullicin quedan restos en las paredes de los tubos que poco a poco van desapareciendo, el color de las disoluciones de la muestra es todava negro se continua la calefaccin al mximo y se ve como las disoluciones van perdiendo color poco a poco cuando obtienen un ligero color amarillo se mantiene durante una hora y media y despus se quita la calefaccin. En estos momentos las muestras estn totalmente transparentes con un ligero color celeste debido al sulfato de cobre aadido, se dejan enfriar los tubos a temperatura ambiente y cuando estn frios se adicionan aproximadamente 100 ml de agua destilada poco a poco iran resbalando por las paredes del tubo a la vez que se agitan de este modo se evitan salpicaduras por la reaccin energica por la reaccin entre el acido sulfrico y el agua El aparato que se ve se encarga de la adicion de hidrxido sdico para la formacin del amoniaco y del mismo, el funcionamiento del aparato es el siguiente:Dos recipientes estn conectados al aparato uno de hidrxido de sodio al 50% y otro de agua el primero de ellos va a una bomba azul que se encuentra en la parte izquierda del aparto y de arriba para introducir agua en el calderin productor de vapor, el de hidrxido sdico a otra bomba situada debajo del anterior que sirve para verter la cantidad adecuada del hidrxido sdico en la muestra, el vapor entra en la muestra por el conducto izquierdo que esta unido a un tubo de plstico para que el vapor entre en la parte mas baja de la muestra y caliente mejor a la misma el hidrxido sdico entra por el conducto de la derecha y cae sobre la muestra.Para recoger todo el amoniaco destilado se pone 50 ml de acido borico al 4% con un dosificador de 25 ml por lo que la accin se realiza dos veces se pone un exceso no medido de acido borico para que reaccione con todo el amoniaco desprendido, este acido es muy dbil reacciona con el amoniaco para dar borato amnico y lo que se valora son los iones borato con acido clorhdrico por esta razn no importa cuanto haya sido el exceso de acido borico , lo que si es importante es que todo el amoniaco que hay en la muestra reaccione con ell acido borico se ponen unas gotas de indicador shiro-tashiro que es una mezcla de los indicadores rojo de metilo y azul de metileno, este indicador tiene un color rojo violceo (el verde es pH mayor a 7 o neutro y violeta menor a 5) hay que revisar que el tubo de plstico del aparato que recoge los condensados este sumerjido dentro de la disolucin de acido borico para que no se escape nada de amoniaco, se introduce el tubo con la muestra en el aparato se pulsa el botn de adicion del hidrxido sdico y posteriormente se pulsa el botn comenzar y comienza la introduccin de vapor cuando el amoniaco destilado comieza a reaccionar con el acido borico la disolucin se va volviendo verde debido a queel indicador cambia de color en medio bsico producido por el ion borato.Durante el tiempo que demora el proceso se recoje en el Erlenmeyer sobre unos 150 ml de condensado. Este dispositivo automatico realizade una forma rpida y sin intervencin de una analista prcticamente en una 5 minutos En un laboratorio de alumnos no se cuenta con un aparato como este asi es que se utiliza un montaje por arrastre de vapor y la muestra se pone directamente al mechero se tiene que medir el hidrxido borico. En la valoracin se utiliza una bureta en la cual ira el acido clorhdrico y este se echa a la muestra hasta que cambie de coloracin, anotar el gasto.con estos datos se podrn calcular el porcentaje de protenas en la muestra de leche.

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHLDIGESTINcatalizadores(1)n - C -NH2+ mH2SO4CO2+ (NH4)2SO4+ SO2protenacalorNEUTRALIZACIN Y DESTILACIN(2)(NH2)SO4+ 2 NaOH 2NH3+ Na2SO4+ 2H2O(3)NH3+ H3BO3(cido brico) NH4+ H2BO3-(in borato)TITULACINEl anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado conHCl (o H2SO4)estandarizado:(4)H2BO3-+ H+H3BO3MATERIALJ.P SELECTAsuministra los equipos necesarios para la realizacin del procedimiento por el mtodoKjeldahl.-1 bureta electrnica Digitrate-Pro 50 resolucin 0.01 ml.Cdigo0182026

-1 balanza analtica de precisinFA-2204Bresolucin 0,1mg.Cdigo5830039

-1 Unidad de digestin (Bloc Digest) para 6, 12 y 20 plazas.Cdigos4000629, 4000630, 4000631-1 Unidad Scrubber.Cdigo4001611-1 Bomba de circulacin de agua.Cdigo4001612

-1 Aparato destilador Kjeldahl (Pro Nitro M, S o A).Cdigos4002627, 4002851, 4002430

- Material diverso de laboratorioREACTIVOSReactivos preparados:Es aconsejable la utilizacin de reactivos ya preparados, especialmente el HCl (o H2SO4) de valoracin. Cualquier error en su preparacin puede afectar directamente al resultado de la determinacin.Utilizar los siguientes, o sus equivalentes en otras marcas: cido Brico (en polvo) 99.5%PANREAC 141015 Indicador mixto 4.8 ( 5) RVPANREAC 283303(Rojo metilo + Verde de Bromocresol) Indicador mixto 4.4 RVPANREAC 282430(Rojo metilo + Azul de Metileno) HCl 0.1N SVPANREAC 171023 HCl 0.25N SVPANREAC 182318 H2SO40.1N SVPANREAC 181061 H2SO40.2N SVPANREAC 182011 Sodio Hidrxido 40% REPANREAC 171220(Para determinacin de N) Acetanilida 99% (Patrn para validacin)PANREAC 151005 Amonio sulfato (Patrn para validacin)PANREAC 131140 Catalizador Kjeldahl 6.25% Cu tabl. 8gPANREAC 174428Preparacin de la solucin fijadora de amonaco1.- Con indicador Mixto 4.8 ( 5)Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora: Pesar 10g de Acido Brico (en polvo)PANREAC 141015 Disolverlo en 1 litro de agua destilada. Aadir 15ml de Indicador mixto 5.PANREAC 2833032.- Con indicador mixto 4.4Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora: Pesar 10g de cido Brico (en polvo)PANREAC 141015 Disolverlo en 1 litro de agua destilada. Aadir 10ml de Indicador mixto 4.4.PANREAC 282430PROCEDIMIENTOREPARACIN DE LA MUESTRA1. Triturar, homogeneizar y mezclar la muestra.2. Pesar entre 1 y 2 gramos de muestra.3. En muestras con contenidos de nitrgeno muy pequeo, tomar la muestra suficiente para que contenga como mnimo 5 mg de nitrgeno.DIGESTIN Aadir entre 10 y 15 ml (tubo macro) de H2SO496-98% y 1 tableta (8 gm) de catalizador.(Para el tubo micro, el mximo de H2SO4es 5ml) Montar un sistema para la extraccin de humos o scrubber con Na2CO3. Realizar la digestin en tres pasos:1.En funcin del contenido de agua de la muestra, empezar la digestin evaporando agua a 150C entre 15 y 30 minutos.2.Realizar un segundo paso entre 270 y 300C entre 15 o 30 minutos para reducir la produccin de humos blancos.3.Continuar la digestin a 400C entre 60 y 90 minutos.Algunos ejemplos:Queso o carne:Paso1: 150C / 30 Paso 2 : 270C / 30 Paso 3: 400C / 90Cereales:Paso1: 150C / 15 Paso 2 : 300C / 15 Paso 3: 400C / 60Control Visual:El resultado es un lquido transparente ntido con coloracin azul claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros adheridos a la pared de tubo.Nota:Durante la digestin debe controlarse la produccin de espuma en las muestras. Si esta es excesiva, debe alargarse el paso n 1.DILUCIN Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a T ambiente. (Puede forzarse sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua). Aadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo. Aadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es necesario calentar ligeramente el tubo (por ej. introducindolo en el bloque digestor todava caliente) Dejar enfriar de nuevo hasta T ambiente. Para evitar prdidas de nitrgeno y reacciones violentas no introducir el tubo todava caliente al destilador.DESTILACIN Situar un Erlenmeyer de 250ml a la salida del refrigerante con 50ml de cido Brico y unas gotas de indicador. Programar una dosificacin de 50 a 75 ml de NaOH. Introducir el tubo con la muestra en el destilador. Destilar hasta recoger 250ml en el Erlenmeyer (50ml Brico + 200ml de destilado).Control Visual:Una vez se ha aadido el NaOH, la muestra debe tomar una coloracin azulada, de no ser as, aadir ms NaOH.VALORACIN Y CLCULO Valorar el destilado con HCl H2SO4hasta el cambio de color. (punto final: pH 4.65)Moles de HCl = Moles de NH3= Moles de N en la muestraMoles de H2SO4= 2Moles de NH3= 2Moles de N en la muestra Realizar el clculo:mg N = N x V x 14Donde:N =Normalidad del cido de valoracinV =Volumen de cido consumido14 =Peso atmico del nitrgeno. Para pasar a contenido de protenas corregir por el factor adecuado segn la naturaleza de la muestra. (6.25 por defecto) Peridicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.% Protenas = P2/P0x 100 x FDonde:P2:Nitrgeno (mg).P0:Peso de la muestra (mg).F:Factor protenico.(6.25 por defecto)Factor protico de algunos alimentos:Almendras 5,18Nueces 5,30Nueces - cacahuetes 5,41Gelatina 5,55Soja 5,71Cebada, avena, centeno 5.83Trigo, harina entera 5,83Harinas (no entera) 5,70Arroz 5,95Maz 6,25Todos los otros alimentos 6,25Salvado 6,31Leche y lcteos 6,38

VERIFICACIN DE LA RECUPERACIN CON AMONIO SULFATOEsta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del destilador.Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta se destila, se valora con HCl 0.25N y se calcula el Nitrgeno detectado.El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se denominarecuperacinde Nitrgeno.Preparar la muestra:Contenido de nitrgeno de una muestra de Amonio sulfato :Formula:(NH4)2 SO4Peso molecular:132.14Factor:14 * 2 / 132.14 = 0.212mg de Nitrgeno =0.212 * mg de Amonio sulfato Pesar unos 100mg de amonio sulfato. El peso exacto ser P0 La cantidad exacta de Nitrgeno es:P1 (mg) = P0 x 0,212 Destilar aadiendo 25ml de NaOH Una vez destilado y valorado obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2P2 = N x V x 14Donde:N =Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25)V =Volumen de cido consumido14 =Peso atmico del nitrgeno. Calculamos la recuperacin:R(%) = P2/ P1*100 La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.Si se utiliza HCl de normalidad diferente preparar muestras:NormalidadMuestra de Amonio sulfato.0,05 20 ... 40 mg0,140 ... 90 mg0,25 100 200 mg0,5 200 400 mgVERIFICACIN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDAEsta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del proceso completo del anlisis del nitrgenoKjeldahlque incluye las etapas de digestin, destilacin y valoracin.Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta se digiere, se destila, se valora y se calcula el Nitrgeno detectado.El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperacin de Nitrgeno.Para realizar sta verificacin se utiliza la Acetanilida.Preparar la muestra:Contenido de nitrgeno de una muestra de Acetanilida :Frmula:C8H9NOPeso molecular:135.17Factor:14 / 135.17 = 0.1035mg de Nitrgeno =0.1035 * mg de Acetanilida Pesar alrededor de 250mg de acetanilida. El peso exacto ser P0 La cantidad exacta de Nitrgeno es:P1 (mg) = P0 x 0,1035Digestin de la muestra: Colocar la acetanilida en un tubo, aadir 10ml de cido sulfrico 98% y una tableta de catalizador Kjeldahl. Digerir a 400C durante 1h. (El resultado debe ser un lquido transparente con coloracin azul.) Dejar enfriar y aadir 25ml de agua destilada en cada tubo. Tomar precauciones para evitar salpicaduras. La reaccin del agua sobre el cido sulfrico es violenta.Destilar: Destilar aadiendo 75ml de NaOH. Utilizar HCI 0.25N para la valoracin. Una vez destilado y valorado, obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2Donde:N =Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25).V =Volumen de cido consumido.14 =Peso atmico del nitrgeno.P2 =N x V x 14 Calculamos la recuperacin:R(%) = P2/ P1*100 La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.FUENTES DE ERRORLas principales fuentes de error son:En el proceso de digestin:1.-La inclusin de nitrgeno no protico (aunque la cantidad de este nitrgeno suele ser despreciable comparada con la del nitrgeno protico);2.-La prdida de nitrgeno durante la digestin. El exceso de sulfato de sodio o potasio que se aade al cido para elevar el punto de ebullicin, puede producir una descomposicin por calor y por lo tanto prdida de nitrgeno. Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre generalmente) tambin puede producir prdidas de nitrgeno3.-La digestin incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de reaccin o falta de cido sulfrico.Durante la destilacin:1.-Neutralizacin incompleta de la mezcla digerida. Es necesario aadir suficiente NaOH para neutralizar el exceso de cido sulfrico resultante de la digestin as como transformar todo el amonio formado en la digestin en amonaco.2.-Perdida de amonaco por fugas en el circuito de destilacin.3.-Perdida de amoniaco por refrigeracin insuficiente en el condensador.

Cierre A lo largo de este objeto de aprendizaje se ha descrito el mtodo Kjeldahl para la determinacin de protenas de un alimento a partir de la cuantificacin del nitrgeno, empleando cido brico como medio para atraparlo y cido clorhdrico o sulfrico para su valoracin. Adems se han expuesto los clculos necesarios para obtener el porcentaje de protena a partir del contenido en nitrgeno de la muestra y se ha ejemplificado el procedimiento con un caso real.