INFORME FINAL DEL PROYECTO PROCYT 338-2007-CONCYTEC-OAJ

“Identificación de bacterias del género Bacillus aisladas de la cadena productiva de espárrago blanco (Asparagus officinalis)”

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INFORME FINAL DEL PROYECTO PROCYT 338-2007-CONCYTEC-OAJ

“IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL GÉNERO BACILLUS AISLADAS DE LACADENA PRODUCTIVA DE ESPÁRRAGO BLANCO (ASPARAGUS OFFICINALIS)”

INVESTIGADORES:

Dra. Carmen Velezmoro UNALM

Dra. Doris Zuñiga UNALM

Dr. Arthur Teixeira U. Florida (USA)

Ing. Edgar Benites South Science S.A.C.

Ing. Adis Gomero South Science S.A.C.

ASISTENTES DE INVESTIGACIÓN:

Blga. Elena Ramos UNALM

Bach. Blgo. Carlos García UNALM

COLABORADORES

Dr. Ernesto Ormeño CCG – UNAM, México

Bach. Blgo. César La Torre UNALM

Bach. Blgo. Minoru Matsubara UNALM

INSTITUCIÓN EJECUTORA PRINCIPAL: Universidad Nacional Agraria La Molina. Av. LaMolina s/n - La Molina – Lima – Perú

CORRESPONDENCIA:

Dirección: Calle Segovia 160 Dpto. 301 Urbanización Higuereta, Surco – Lima

Correo electrónico: [email protected]

Telefax: 349 - 5678

FUENTE DE FINANCIAMIENTO: Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e InnovaciónTecnológica CONCYTEC.

mailto:[email protected]


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RESUMEN

Para la identificación de cepas del género Bacillus aisladas de diferentes etapas en el cultivo yprocesamiento de espárragos blancos, se emplearon técnicas moleculares (BOX-PCR), a finde agrupar los perfiles obtenidos. Se estandarizó la extracción del DNA mediante el kitAxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep (Axygen Scientific, Inc. – USA). Se determinóque la cantidad óptima de DNA para la realización de la amplificación BOX-PCR fue de 1 a 8µL de DNA. Se utilizó el marcador molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder Plus (FermentasInc. USA) para comparar los perfiles. Una vez formados los grupos se tomaron representantesy se realizó la amplificación del gen ribosomal 16S. Los productos de reacción fueronpurificados con el kit AxyPrep PCR Cleanup y enviados al Laboratorio Macrogen Inc.(Korea) para su secuenciamiento. Las secuencias fueron procesadas mediante los programasBIOEDIT, CHROMAS y MEGA4 para observar las relaciones filogenéticas entre cepasevaluadas y de referencia. Se obtuvieron perfiles de 169 cepas, que formaron 29 grupos deacuerdo al patrón de bandas de la amplificación BOX-PCR. El procesamiento de lassecuencias de 34 perfiles, representantes de los grupos anteriores, dio como resultado laidentificación de 7 especies del género Bacillus y 1 del género Paenibacillus. En el muestreode validación de espárragos en la línea de envasado se obtuvieron 34 perfiles de los cuales 23correspondieron a perfiles de 5 especies de Bacillus obtenidas en las evaluaciones previas y11 no correspondieron a ninguna de las especies identificadas. La identificación bioquímicamediante el Kit API 50 CHB coincidió al 99,9% de seguridad con el 64,71% de las cepasensayadas, que previamente fueron identificadas por la técnica molecular. En este trabajotambién se obtuvieron curvas de crecimiento de B. pumilus, B. licheniformis y B. subtilismediante técnicas espectrofotométricas. Se calculó el tiempo de generación de estas tresbacterias, para B. pumilus 0.531 h, para B. licheniformis 0.585 h y para B. subtilis 0.442 h.

Palabras clave: espárragos blancos, Bacillus, amplificación BOX-PCR, secuenciamiento, curvas de crecimiento


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ABSTRACT

Identification of Bacilli strains isolated from several stages of white asparagus breeding andprocessing, were performed by molecular techniques (BOX-PCR) to group obtained profiles.DNA extraction was standardized through AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep kit(Axygen Scientific, Inc. – USA) and the optimal amount of DNA in BOX-PCR reaction wasbetween 1 and 8 µL of DNA. Molecular marker GeneRuler 1 kb DNA Ladder Plus(Fermentas Inc. USA) was used to compare different profiles. Once grouping was finished,representative of each group were chosen to amplify 16s ribosomal gene. The reactionproducts were purified by AxyPrep PCR Cleanup kit and sent to Macrogen Inc. Laboratory(Korea) for its sequencing. Resulting sequence were process with BIOEDIT, CHROMAS andMEGA4 software to observe phylogenetic relations between evaluated and reference strains.169 BOX-PCR were obtained which formed 29 groups according to bands patterns in BOX-PCR amplification. Sequence processing of 34 profiles, representing those groups, resulted in7 species from genus Bacillus and 1 from genus Paenibacillus. Validation sampling ofasparagus from the packaging line resulted in 34 BOX-PCR profiles, 23 of whichcorresponded to profiles of 5 species of Bacillus obtained in the previous evaluation. 11profiles did not correspond to none of the identified species by molecular techniques. 64,71%of the species identified with Biochemical test API 50 CHB were the same as molecularidentification with 99,9% security. In this project growth curve of B. pumilus, B. licheniformisand B. subtilis were also obtained through spectrophotometrical techniques. Generation timewas calculated from growth curves of 3 Bacillus species, for B. pumilus was 0.531 h, for B.licheniformis 0.585 h and for B. subtilis 0.442 h.

Keywords: White asparagus, Bacillus, BOX-PCR amplification, sequencing, gowth curves


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I. INTRODUCCIÓN

Las bacterias del género Bacillus están presentes en la mayoría de alimentos de origenvegetal. Estas especies forman parte del ecosistema natural, comportándose algunas vecescomo benefactoras en el crecimiento de las plantas, pero en otras ocasiones como causantesde enfermedades del tracto intestinal de los humanos.

En un trabajo anterior, el grupo de investigación que presenta este informe, logró aislar 220cepas pertenecientes a este género a partir del muestreo de la cadena productiva de espárragosblancos en conserva. Si bien estas bacterias no generan un peligro mortal, como en el caso delClostridium botulimun, su destrucción es importante para la salud, por los disturbiosintestinales que pueden generar y también desde el punto de vista comercial, pues se puedepresentar un desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento térmico, causando eldeterioro de los vegetales o hinchamiento de los envases. En el monitoreo de las buenasprácticas de manufactura de alimentos enlatados, el conocimiento de las especies del géneroBacillus responsables del deterioro del producto sería de vital importancia ya que estosposeen diferentes rangos de resistencia térmica (Stumbo, 1973). De ahí la importancia de suidentificación.

Para la identificación de las cepas hoy en día se emplean técnicas bioquímicas estandarizadas,que permiten en corto tiempo la identificación de la especie, dentro de cada género. Sinembargo debido al alto costo que significa emplear estas técnicas para todas las cepasaisladas, es que se plantea el uso de técnicas moleculares que permitan la identificación anivel de especie por medio del análisis de las secuencias de nucleótidos del gen ribosomal 16s(Weisburg, 1991), el cual es muy conservado entre especies. El estudio de la evolución a nivelmolecular ha permitido la construcción de arboles filogenéticos con mayor precisión y porende una mayor especificidad al momento de identificar especies.

Reva et al. (2001) realizaron la identificación fenotípica simplificada de bacterias xenófilas,aerobias, formadoras de esporas, del género Bacillus, entre otros. Los autores recomendaronemplear técnicas de identificación rápidas para ayudar a la selección de las cepas yposteriormente aplicar técnicas modernas de identificación más precisa. Entre las cepasidentificadas se tuvieron 4 grupos, dos correspondientes a anaerobios facultativos, incluyendoaquellos que hidrolizan y no hidrolizan el almidón; y los otros dos de aerobios obligadosdiferenciados también por su capacidad de hidrolizar el almidón. Las claves para laidentificación fueron presentadas en un medio interactivo mediante una página web.

El entendimiento de la ecología de las especies de Bacillus y otros formadores de esporas, através de la cadena alimentaria, es necesario para prevenir o reducir su presencia en losalimentos procesados (Durak et al. 2006). Con este fin es esencial identificar las especies ylos géneros de bacterias formadoras de esporas, de una manera reproducible y estandarizada.El perfeccionamiento y la aplicación de estas técnicas aún no empleadas en nuestro país,permitirá a las empresas dedicadas al rubro de alimentos en conserva, diseñar sus procesostérmicos de una manera segura y confiable. Así como el monitoreo de la carga microbianadurante la línea de producción, referido a una especie en particular (análisis de riesgo).


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El objetivo general del proyecto fue la identificación de la diversidad de especies de Bacillussp. presentes en las diferentes etapas del procesamiento de espárragos blancos para conserva.

Los objetivos específicos fueron los siguientes:a. Agrupar e identificar a través de técnicas moleculares - PCR y secuenciamiento las cepas

aisladas a partir de la cadena productiva de espárrago blanco en conserva.b. Validar la presencia de los microorganismos identificados en un nuevo muestreo bajocondiciones normales de proceso en la industria.c. Confirmar a través de pruebas bioquímicas - API la identificación de cepas representativas

de algunas especies encontradas en espárrago blanco durante su procesamiento en una plantaindustrial.


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II. REVISIÓN LITERARIA

Son varias las razones por las cuales las especies de Bacillus causan dificultades en lasindustrias de alimentos, entre ellas podemos mencionar las siguientes:

1. Son difíciles de eliminar de los productos alimenticios y sistemas de procesamiento dealimentos, debido a su formación de esporas, las cuales son ubicuas y altamenteresistentes a condiciones adversas como calor, deshidratación y otras formas de estrésfísico (Kamat et al., 1989; Anderson et al., 1995; Larsen & Jørgensen, 1999).

2. Las esporas, tanto como las células viejas son hidrofóbicas y tienen característicasadhesivas, las cuales facilitan su adhesión a las superficies de los equipos deprocesamiento, con el resultado de la formación de biofilms (Anderson et al., 1995;Granum & Rönner, 1998, Peng et al., 2001; Heyndrickx & Scheldeman, 2002).

3. Tanto esporas como células vegetativas parecen haber incrementado su tolerancia oresistencia al estrés ambiental, lo que les ha permitido su supervivencia bajocondiciones o a través de tratamientos considerados para detener el crecimiento oinactivar todos los microorganismos viables (Heyndrickx & Scheldeman, 2002).

Técnicas moleculares empleadas en la identificación de microorganismos

La identificación y clasificación de bacterias es de crucial importancia en microbiologíaambiental, industrial, médica, agrícola y ecología microbiana. Existen diferentes métodosfenotípicos y genotípicos (Louws et al., 1996) que son empleados para la identificación yclasificación microbiana (Figura 1). Cada uno de estos métodos nos permite obtener un ciertonivel de identificación filogenético de género, especie, subespecie, biovar, hasta llegar a nivelde una cepa específica.

Familia Géneros Especies Subespecies CepaSecuenciamiento DNA

Secuenciamiento 16S rDNA

ARDRA

Reasociación DNA-DNA

tRNA-PCR

ITS-PCR

RFLP LFRFA PFGE

Isosima multilocus

Perfil proteico de la célula total

AFLP

RAPD’s APPCR

rep - PCRFuente: Rademaker y De Bruijn, 1997

FIGURA 1. Resolución relativa de varios perfiles y técnicas de DNA


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Actualmente los métodos moleculares son más confiables, simples y baratos en laidentificación de microorganismos; de hecho, la asignación de género/especie ha sidotradicionalmente basada en la hibridación DNA-DNA (Wayne et al., 1987) y en la filogeniamoderna el método más difundido en la actualidad está basado en el análisis delsecuenciamiento del gen ribosomal 16S (Woese, 1987; Stackebrandt & Goebel, 1994). Sinembargo, autores como Schloter et al. (2000), Stackebrandt & Goebel (1994) mencionan queeste método provee solo una resolución limitada. Ellos remarcan que el uso no crítico de losresultados de la comparación del gen ribosomal 16S pueden llevarnos a una identificaciónincorrecta y peor aún a la asociación incorrecta de secuencias de DNA con especiesparticulares, lo cual multiplicaría el error muchas veces. El empleo conjunto de métodosmoleculares y bioquímicos son útiles para corroborar la identificación obtenida delsecuenciamiento del gen ribosomal 16S (Reva et al., 2001).

La introducción de la PCR, en diagnóstico microbiano, establece una alternativa viable a losmétodos tradicionales de cultivo (Marlony et al., 2003). Esta técnica presenta diversasventajas en relación a los métodos tradicionales, como mayor poder de tipificación ydiscriminación, mayor rapidez, buen límite de detección, mayor selectividad, especificad,potencial para automatización y la posibilidad de trabajar con bacterias que no son cultivablesen medios de cultivo normalmente utilizados (Bush & Nitschcao, 1999).

Los principales obstáculos en la implementación de la técnica en la rutina de laboratorios, sonla incapacidad del método de diferenciar células vivas y muertas, la presencia de inhibidoresde enzima polimerasa en algunos alimentos, la alta inversión en equipamiento y reactivos y lafalta de aprobación y reglamentación por parte de los órganos oficiales (Marlony et al., 2003).Otra desventaja es la complejidad del método, principalmente para ser utilizado en análisis derutina, a pesar del reciente desarrollo de kits básicos en PCR, que han facilitado su utilizacióny difusión (Boer & Beumer, 1999).

Otros factores pueden influenciar en la eficiencia de la PCR, pudiendo resaltar entre ellas laconcentración de iones de magnesio, la temperatura de cada ciclo, la duración de cada una delas etapas de un ciclo, números de ciclos, la concentración de los dNTPs y la concentración dela polimerasa. Contaminantes presentes en la atmósfera también pueden inhibir la reacción(Clarke, 1992) y enzimas termoestables producidas por microorganismos pueden degradar losproductos de la amplificación (Nakajima et al., 1994; Destro, 1995).

Por otro lado, la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) es unatécnica altamente sensible por medio de la cual son obtenidas millones de secuencias deácidos nucleicos, por medio de una reacción enzimática, a partir de pequeñas cantidades desecuencias de DNA ó RNA específicas. Desarrollado inicialmente por Kary B. Mullis en1985 (Avila et al., 2008), esta técnica permite obtener millones de copias en un segmentoespecífico de DNA por medio de la acción de la enzima Taq DNA polimerasa y deoligonucleótidos iniciadores (primers) sobre un DNA molde. Es realizado en un equipoautomatizado y computarizado, denominado termociclador, que promueve la alternancia detemperaturas por determinados periodos de tiempo, posibilitando la ocurrencia de ciclosrepetitivos de desnaturalización y síntesis de DNA (Konemam et al., 2001).

La descripción de la reacción en cadena de la polimerasa (Mullis & Faloona, 1987) haposibilitado un gran avance en las técnicas de biología molecular. Se ha transformado en lasúltimas décadas en un instrumento de investigación altamente especializado y en una técnicaaplicada en diversas áreas como microbiología, inmunología, oncología, genética, medicina


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forense, transplantes de órganos entre otros (Destro, 1995). Así mismo, diversos autores handescrito la utilización de técnicas fundamentadas en PCR para la detección directa demicroorganismos en alimentos (Rossen et al., 1991; Jensen et al., 1994; Destro, 1995;Gandra, 2006).

Además, debe señalarse que las familias de elementos repetitivos intergénicos han sidodescritas en diversas especies bacterianas (Gillings & Holley, 2003), estos elementos sonsecuencias genómicas conocidas, conservadas, repetitivas y de concenso, denominadas REP(Repetitive Extragenic Palindromic), ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)y secuencias repetitivas conservadas, denominadas simplemente BOX (Farber et al., 2001).Los primers para estas secuencias son llamados primers “de consenso” han sido diseñados yutilizados para amplificar regiones entre estos elementos repetitivos por medio de PCR,generando perfiles específicos (fingerprinting), que pueden ser utilizados para tipaje eidentificación de especies bacterianas.

Extracción de DNA

La lisis bacteriana es un procedimiento común a muchas áreas de investigación enmicrobiología (Chassy & Giuffrida, 1980), así, la preparación de membranas intactas,protoplastos, esferoplastos, ácidos desoxirribonucleicos de alto peso molecular (DNA) yplásmidos constituyen unos pocos ejemplos que requieren de un procedimiento de remoción odebilitamiento de la pared celular. Para efecto de nuestros ensayos moleculares, la correctaliberación del DNA es el paso fundamental para el éxito de las pruebas de amplificación, paraello partimos de un cultivo puro de crecimiento overnight (12 – 16 horas de incubación), puesha sido observado que la resistencia a lisozima de muchas células en fase estacionaria esmayor que en cultivos en crecimiento (Brumfitt et al., 1958 y Holden & Van Balgooy, 1965),lo cual es atribuido al incremento de grupos O-acetil y la disminución de los grupos N-acetilen la pared celular.

La lisozima, (mucopéptido N-muramil-hidrolasa) hidroliza repetitivamente los enlaces N-acetilglucosamina-β-1 4-N-ácido acetil murámico, presentes en la pared celular bacteriana.Esta hidrólisis causa frecuentemente la lisis de bacterias Gram negativas a menos que esténpresentes estabilizadores osmóticos que protejan los esferoplastos osmo frágiles que resultande la acción de la muramidasa. Para el caso de bacterias Gram positivas, al cual pertenece elgénero Bacillus, la resistencia a la acción de la lisozima es mayor, debido al grosor y densidadde su pared celular. Chassy & Giuffrida (1980) han reportado que son muchos los factoresque pueden influenciar la eficiencia de lisis, por ejemplo, la duración de la incubación conexposición a lisozima, mejora el proceso. Sin embargo, la exposición prolongada de lascélulas a 37ºC puede ocasionar degradaciones en el interior celular. Así, periodos deincubación de 60 minutos han sido ensayados para Streptococcus mutans y 90 minutos paraLactobacillus casei 64H. En la misma investigación de Chassy & Giuffrida (1980), laelección de buffers se mostró determinante en el éxito de los experimentos de lisis. Basadosen su experiencia con Gram negativos, muchos investigadores han inchuído el ácido etilen-diamin-tetra acético (EDTA) en los buffers para incubación con lisozima paramicroorganismos Gram positivos, práctica que disminuye la extensión de la lisis.

Amplificación BOX

BOX-PCR, es un método de Repetitive Extragenic Polymorphism (REP) PCR, utilizado paradiferenciar cepas de bacterias, utiliza un primer oligonucleótido simple para producir un


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arreglo específico de bandas por amplificación de secuencias entre repeticiones extragénicasconservadas entre la mayoría de genomas bacterianos.

Esta técnica ha sido utilizada para evaluar la diversidad genotípica de Bacillus cereus en miel(López & Alippi, 2007) la prevalencia y diversidad de cepas de B. licheniformis en plumajesde aves (Whitaker et al, 2005), entre otros

Secuenciamiento

El término secuenciamiento se refiere a métodos para determinación del orden de las bases denucleótidos (adenina, guanina, citosina y timina) en una molécula de DNA. Las primerassecuencias de DNA fueron obtenidas utilizando métodos basados en cromatografíabidimensional a principios de 1970. Posteriormente, el desarrollo de secuenciamientosbasados en bases nitrogenadas teñidas permitió que se realice de manera fácil y rápida.

Estos métodos emplean bases nitrogenadas marcadas (dye dNTPs), que permiten elsecuenciamiento en una sola reacción de polimerización, la cual da como resultado unamolécula de DNA con bases que emiten diferentes longitudes de onda o fluorescencia,proporcionanando un cromatograma en el cual cada base nitrogenada presenta un colorcaracterístico que permite la lectura de la secuencia (Figura 2).

FIGURA 2. Secuencia de nucleóticos proporcionada por un cromatograma

Caracterización Bioquímica mediante kits de identificación API 50 CHB

La galería API 50 CHB permite el estudio de la fermentación de sustratos pertenecientes a lafamilia de los carbohidratos y derivados (heterósidos, polialcoholes, ácidos urónicos). Losensayos de fermentación se inoculan con API 50 CHB/E Medium que rehidrata los sustratosde los microtubos. Durante el periodo de incubación, la fermentación se traduce en un cambiode color en el tubo, debido a una producción de ácido en anaerobiosis revelada por elindicador de pH del medio elegido. El primer tubo sin principio activo, sirve como testigonegativo.

En la Tabla 1, se detallan las pruebas bioquímicas que sirven para la identificación de lascepas del género Bacillus.


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TABLA 1. Composición de la galería API 50 CH

TUBO ENSAYO COMPUESTO ACTIVO TUBO ENSAYO COMPUESTO ACTIVO

0 Testigo 25 ESC Esculina citrato férrico1 GLY Glicerol 26 SAL Salicina2 ERY Eritritol 27 CEL D-Celobiosa3 DARA D-Arabinosa 28 MAL D-Maltosa4 LARA L-Arabinosa 29 LAC D-Lactosa5 RIB D-Ribosa 30 MEL D-Melibiosa6 DXYL D-Xilosa 31 SAC D-Sacarosa7 LXYL L-Xilosa 32 TRE D-Trehalosa8 ADO D-Adonitol 33 INU Inulina9 MDX Metil-βD-Xilopiranosida 34 MLZ D-Melezitosa10 GAL D-Galactosa 35 RAF D-Rafinosa11 GLU D-Glucosa 36 AMD Almidón12 FRU D-Fructosa 37 GLYG Glicógeno13 MNE D-Mamnosa 38 XLT Xilitol14 SBE D-Sorbosa 39 GEN Gentiobiosa15 RHA L-Rhamnosa 40 TUR D-Turanosa16 DUL Dulcitol 41 LYX D-Lixosa17 INO Inositol 42 TAG D-Tagatosa18 MAN D-Manitol 43 DFUC D-Fucosa19 SOR D-Sorbitol 44 LFUC L-Fucosa20 MDM Metil-αD-Manopiranosida 45 DARL D-Arabitol21 MDG Metil-αD-Glucopiranosida 46 LARL L-Arabitol22 NAG N-Acetilglucosamina 47 GNT Gluconato potásico23 AMI Amigdalina 48 2KG 2-Cetogluconato potásico24 ARB Arbutina 49 5KG 5-Cetogluconato potásico


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III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIAL BIOLÓGICO

Las cepas de Bacillus sp. empleadas para la identificación mediante la aplicación de técnicasmoleculares, fueron obtenidas como producto del proyecto PROCOM - CONCYTEC“Evaluación de microorganismos de importancia para el tratamiento térmico en la cadenaproductiva de conservas de espárrago blanco (Asparagus officinalis)” desarrollado en el 2006(Velezmoro et al., 2007) en una empresa agroindustrial dedicada al cultivo y procesamientode espárragos para exportación, Trujillo – Perú, de donde se tomaron muestras en toda lacadena productiva de espárragos blancos en conservas, desde los suelos del campo de cultivo,hasta el producto envasado antes de su esterilización.

Para la construcción de curvas de crecimiento, empleando técnicas espectrofotométricas y derecuento, se ensayaron las especies identificadas en el mismo proyecto anterior, mediante API50 CHB que tuvieron una excelente identificación con 99.9 % ID (Tabla 2).

La validación de la presencia de las especies identificadas (técnicas moleculares ybioquímicas) fue realizada empleando cepas aisladas de las muestras tomadas en el segundosemestre del 2008, durante diferentes etapas de la producción en la misma industriamencionada anteriormente (Trujillo, Perú).

TABLA 2. Cepas de Bacillus ensayadas, identificadas con el sistema API 50 CHB

CódigoGrupo

Esporogénico Procedencia de la cepaTaxón significativo

(API 50 CHB)

2M3BE12 EMANA

Espárragos blancosenvasados (frasco 315) con 3horas de espera (muestra 9)

II Etapa, Muestreo 3

B. pumilusExcelente identificación

99.9 % ID

2M3BE23EMANA

Espárragos blancos frescos.recepción (muestra 2,

provenientes de suelo MóduloIII, Turno 4, Lote 77- 78)

II Etapa, Muestreo 3

B. licheniformisExcelente identificación

99.9 % ID

2M2CE EMANA

Caldo púrpura debromocresol - Control de

esterilidadII Etapa, Muestreo 2

B. subtilis/amyloliquefaciensExcelente identificación

99.9 % ID


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3.2. OBTENCION DE CURVAS DE CRECIMIENTO DE CEPAS BACILLUS PORTECNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS, DE RECUENTO Y PRODUCCIÓNDE ESPORAS EN MEDIO LÍQUIDO

Materiales y equipos

Shaker a 125 rpm Espectrofotómetro a 600 nm Estufa de incubación a 35ºC Baño de agua para templar el agar fundido, 44 – 46ºC Vórtex Asa de siembra Matraces con 100 mL de caldo TGE Botellas con 100 mL de Agar TGE Placas Petri de pyrex, 100 x 15 mm, estériles Micropipetas de 10 -100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 100 µL y 1000 µL Tubos de vidrio estériles Tubos Eppendorf Pipetas graduadas de 1mL, 5 mL y 10 mL

Procedimiento

A. PREPARACIÓN DEL INÓCULO:

1. Se realizó un lavado con solución salina de las colonias puras de la cepa seleccionada,crecidas previamente en placas de Agar TGE e incubadas por 18 - 24 horas a 35 ± 1ºC(Figura 3).

2. La suspensión obtenida fue traspasada a tubos de vidrio conteniendo solución salinaestéril, homogenizando la muestra.

3. Se ajustó la suspensión a una transmitancia de 90% medida al espectrofotómetro a unalongitud de onda de 600 nm. correspondiente a una concentración aproximada de 107

UFC/mL.

4. Se traspasó a los matraces con caldo TGE una alícuota de la suspensión anterior quecontenía aproximadamente entre 1 - 100 UFC/mL, incubándose a 28 ± 1ºC enagitación constante a 125 rpm.

5. Se determinó la concentración inicial del inóculo.


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FIGURA 3. Preparación del inóculo

Lavar con solución salina las cepas puras ytraspasar la suspensión obtenida a tubos devidrio.

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Ajustar la suspensión a unatransmitancia de 90% (600 nm.),correspondiente a una concentraciónaproximada de 107 UFC/mL

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4 Incubar a 28 ± 1ºC en agitaciónconstante a 125 rpm.

Traspasar a matraces con caldo TGE (1 -100 UFC/mL)

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B. ENUMERACIÓN DE CÉLULAS TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRÍAY RECUENTO EN PLACA

En cada tiempo de evaluación, se retiró de los matraces 2.5 mL de inóculo y se traspasó a untubo de vidrio estéril, este volumen sirvió para medir la densidad óptica en elespectrofotómetro a 600 nm, realizar el recuento de células totales, recuento de bacteriasesporogénicas, recuento directo y tinción de esporas.

B.1 RECUENTO DE CÉLULAS TOTALES

Materiales y Equipos

Placas Petri de pyrex, 100 x 15 mm, estériles Micropipetas de 10 - 100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 100 µL y 1000 µL Tubos Eppendorf Pipetas graduadas de 1mL, 5 mL y 10 mL Baño de agua para templar el agar fundido, 44 - 46° C Estufa de incubación, 35 ± 1ºC Agar TGE (Triptona Glucosa Extracto de carne)

Procedimiento

1. Se traspasó una alícuota de 100 µL de la suspensión preparada en tubos eppendorfconteniendo un volumen de diluyente igual a 9 veces la suspensión (dilución 10-1).Se homogenizó haciendo uso de vórtex (Figura 4).

2. Se realizó diluciones sucesivas, sembrando por duplicado, en placas Petri estériles,alícuotas de las diluciones menos concentradas.

3. Se incorporó agar TGE licuado y temperado a 46ºC, a cada una de las placas Petriinoculadas.

4. Se dejó solidificar el medio de las placas, invirtiéndolas e incubándolas en estufa a35 ± 1ºC por 24 -48 horas.


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FIGURA 4. Recuento de células totales

100 µL 100 µL 100 µL

100 µL

Tomar 100 µL del inóculo en900 µL de solución salina.

Realizar diluciones y sembrar en placas petri lasdiluciones menos concentradas, agregar agar TGE.

Incubarlas en estufa a 35 ± 1ºC por 24 -48 horas.


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B.2 RECUENTO DE BACTERIAS ESPOROGENICAS (APHA, 1992)

Materiales y equipos

Placas Petri de pyrex, 100 x 15 mm, estériles Micropipetas de 10 -100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 100 µL y 1000 µL Tubos Eppendorf Pipetas graduadas de 1mL, 5 mL y 10 mL Baño de agua para templar el agar fundido, 44-46° C Estufa de incubación, 35± 1ºC Baño María de 80 - 100ºC Botellas de vidrio conteniendo 100 mL de Agar TGE (Triptona Glucosa Extracto de

carne), estéril

Procedimiento

1. Se fundieron las botellas que contenían los 100 mL de agar TGE y se temperó elmedio de cultivo en baño de agua a 45° C.

2. En un juego de tres frascos de TGE se inoculó: 10 mL en el primero, 1 mL en elsegundo y 0.1 mL en el tercero, como lo visto en la Figura 5. Se pueden requerir unmayor número de diluciones, de acuerdo a la concentración esperada de esporas.

3. Se agitó vigorosamente los frascos para dispersar la muestra en el medio de cultivo.

4. Se llevaron los frascos al baño maría a una temperatura de 80° C por 30 minutos.

5. Luego se colocaron los frascos en Baño María a 45° C, por 10 minutos comomáximo.

6. El medio de cultivo fue plaqueado en cinco placas, homogenizando previamente. Sedejó solidificar el agar, las placas fueron invertidas e incubadas a 35° C por 48horas.

7. Para expresar los resultados se realizó el recuento de las colonias superficiales ysubsuperficiales de cada una de las cinco placas; la suma de ellas representó elnúmero de bacterias esporogénicas mesófilas aerobias por dilución. El número decolonias fue multiplicado por el factor de dilución, para calcular la cantidad de UFC/mL.


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FIGURA 5. Recuento de bacterias esporogénicas

Agitar

Incubar a 80° C por 30 minutos

Repartir el contenido de cada botella en 5 placas.Incubar 35° C por 48 horas

Enfriar hasta 45º C

10 mL. 0.1 mL.1 mL.

Suspensión ensolución salina.Medir 90 - 93%Transmitancia

Inocular en tres frascos con agar TGE.

Agar TGE

Medio de esporulación


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B.3 RECUENTO DIRECTO DE CÉLULAS


Microscopio Vórtex Asa de siembra Cámara de Neubauer Micropipetas de 10 -100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 100 µL y 1000 µL Tubos de vidrio estériles Láminas portaobjeto Set de coloración para esporas Set de coloración Gram

Procedimiento

1. Se traspasó 0.5 mL de los matraces con el inóculo a otro tubo para el recuentocelular en cámara de Neubauer. Se hicieron diluciones en caso fuera necesario, éstasfueron realizadas con caldo TGE. La lectura se hizo con ayuda de un colorante decontraste (Azul de metileno).

2. Se realizó el recuento de células de cada uno de los tubos con la ayuda de la cámarade Neubauer. Para calcular la cantidad de UFC/ mL se multiplicó el número decélulas totales contadas por el factor de dilución (si lo hubiera) y luego se dividióentre el factor proveniente de la cámara de Neubauer.

UFC/mL = Nº Cél. x 25 x 50 x 1000


16

B.4 TINCIÓN DEL INÓCULO

B.4.1 TINCIÓN DE ESPORAS (Método de WIRTZ)


Microscopio Mechero de Bunsen Láminas portaobjetos Asa de Kölle Pinzas de madera Verde de malaquita 5 % Safranina Agua destilada Aceite de inmersión

Procedimiento

Fijación de la muestra

1. Se rotularon convenientemente cada una de las láminas portaobjetos, cuidándose quelas láminas utilizadas se encontraran bien limpias.

2. Se colocó una gota de solución salina 0.85% sobre la lámina portaobjetos.

3. Extensión por calor: Con ayuda de un asa de Kölle previamente esterilizada a lallama, se llevó una pequeña cantidad del cultivo sobre la gota de solución salina. Seextendió el cultivo sobre la superficie de la lámina portaobjetos y se expuso a lallama del mechero hasta el secado (Figura 6).

Coloración de la muestra

1. Se agregó colorante verde de malaquita 5 % hasta cubrir toda la lámina.

2. La lámina fue calentada hasta emisión de vapores, repitiendo dicho calentamientopor tres veces (no se permitió que hierva ni que se seque el colorante. En caso deriesgo de secado, se agregó colorante sobre el preexistente, hasta cubrirlonuevamente.

3. Se enjuagó con agua destilada

4. Se agregó colorante safranina y se dejó actuar 30 segundos.

5. Se lavó la lámina con abundante agua corriente.

6. Una vez que la preparación estuvo totalmente seca, se colocó sobre ella una gota deaceite de inmersión y se observó al microscopio con el objetivo de inmersión.


17

FIGURA 6. Tinción de esporas

Colocar una colonia o una asada del inóculo en una lámina portaobjeto

AA

Lavar con agua destilada

5

AA

Agregar safranina x 30 seg

6

AA


7

Agregar verde de malaquita

3

AA

AA

Flamear la muestra 3 veces

4

AA

1

Fijar la muestra al calor

AC

2

Observación al microscopio

8

AA


18

B.4.2 TINCIÓN DE BACTERIAS (Método de GRAM)


Microscopio Mechero de Bunsen Láminas portaobjetos Asa de Kölle Pinzas de madera Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona (80:20) Safranina Agua destilada Aceite de inmersión

Procedimiento

Fijación de la muestra

Como lo descrito en el procedimiento de la técnica anterior

Coloración de la muestra

1. Se agregó cristal violeta sobre la muestra fijada, dejando reposar por 1 minuto(Figura 7).

2. Se enjuagó con agua destilada.

3. Se agregó lugol, dejando expuesto por 1 minuto.

4. Se realizó la decoloración con alcohol – acetona (80:20).

5. Se lavó con agua destilada.

6. Se adicionó colorante safranina, dejando reposar por 30 segundos.

7. Se lavó con agua corriente.

8. Una vez que la preparación estuvo totalmente seca, se colocó una gota de aceite deinmersión y se observó al microscopio con el objetivo de inmersión.


19

FIGURA 7. Tinción Gram

Colocar una colonia o una asada delinóculo en una lámina portaobjeto

AA

AA

AA

AA




AA

AA

AA

AA

Agregar cristal violeta x 1 min

Agregar safranina x 30 seg.

Decolorar con alcohol – acetona(80:20) x 15 seg

Agregar lugol y dejar x 1 min

3

Fijar la muestra al calor

AC

2

4

5

6

7

8

9

10

Observación al microscopio

AA

1


20

3.3 REACTIVACIÓN DE CEPAS DE BACILLUS Y PREPARACIÓN DE CULTIVOSPARA EXTRACCIÓN DE DNA


Placas Petri 100 x 15 mm con Agar Triptona Glucosa Extracto de carne (TGE) Tubos 13 x 100 mm con caldo TGE Asas de Kölle Estufa incubadora a 35 ± 1ºC

Procedimiento

1. Las cepas a ensayarse fueron crecidas por estría en placas de agar TGE e incubadas por18 - 24 horas a 35 ± 1ºC (Figura 8).

2. De las colonias puras se tomó una asada y se colocó en tubos con caldo TGE y seincubaron por 12 - 16 horas a 35 ± 1ºC.

FIGURA 8. Reactivación y preparación de cultivos para extracción deDNA de cepas de Bacillus sp.

Agar TGE

Caldo TGE

De un cultivo puro en agar TGE traspasaruna colonia a caldo TGE

Incubar 12-16 h a 35 ± 1ºC.


21

3.4. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE BACILLUS SP.

3.4.1 EXTRACCIÓN DE DNA DE CEPAS DE BACILLUS SP.

El aislamiento del DNA genómico bacteriano por este kit, se basa en la liberación del DNApor un buffer de lisis celular (Buffer G-A). Además, la separación del DNA de proteínas,polisacáridos y lípidos se logra durante la separación de fases (Paso 6 de la técnica deextracción). El DNA genómico purificado en la fase inferior es atrapado por la columnaMiniprep (Paso 8) la cual contiene una resina selectiva que captura el DNA y permite el pasode otras moléculas y/o residuos. Después de lavar sucesivamente con Buffer W1 y W2 pararemover impurezas residuales y sales, el DNA purificado es eluído con Buffer Tris.

Este kit es adecuado para la purificación de hasta 20 µg de DNA genómico a partir de 109

células bacterianas. El DNA purificado es predominantemente mayor a 30 kb y es adecuadopara una variedad de aplicaciones que demandan DNA altamente puro y de elevado pesomolecular, como PCR, análisis de Southern blot, RAPD, AFLP, RFLP, etc.


Cultivo overnight de cepas de Bacillus sp. en caldo TGE Vórtex Baño de agua a 37° C Baño de agua a 65° C Microcentrífuga Micropipetas de 0.1 – 2 µL, 1 – 10 µL, 10 -100 µL y de 100 – 1000 µL Tips de 10 µL, 100 µL y 1000 µL (estériles y de primer uso) Kit para extracción de DNA, AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit

(Axygen Scientific, Inc. – USA) Columnas AxyPrep Columnas de filtración Microtubos de 2 mL Microtubos de 1.5 mL Lisozima 50 mg/mL en glicerina al 50% Buffer S + RNAsa A (50 mg/mL) EDTA 0.25 M Buffer G-A Buffer G-B Buffer DV (2 mL de buffer DV-A + 125 mL de isopropanol* + 75 mL de

isobutanol*) Buffer BV Buffer W1 Buffer W2 (24 mL d buffer W2 concentrado + 168 mL de etanol Q.P.*) Eluente (Tris-HCl 2.5 mM, pH=8.5)

(*) Reactivos no provistos en el Kit


22

Procedimiento

1. Se colocó 1.5 mL del caldo TGE con las cepas crecidas (incubadas a 35 ± 1ºC) enmicrotubos de 2 mL (ver Figura 9), se centrifugaron a 12000 g x 2 minutos. Sedescartó totalmente el sobrenadante cuidando de no perturbar el pellet, y este seresuspendió con 150 mL de buffer S conteniendo la RNAsa A. Posteriormente seprocedió a homogenizar, sin dejar flóculos.

2. Se agregaron 20 µL de lisozima y se homogenizó bien. Se incubó a 37ºC por 30minutos.

3. Se le incorporó 30 µL de EDTA 0.25 M (pH=8). Se mezcló bien y se incubóinmediatamente en hielo por 5 minutos.

4. Se añadieron 450 µL de buffer G–A, agitando luego en vórtex por 15 segundos.Posteriormente se llevó a baño de agua a 65ºC por 10 minutos.

5. Se agregaron 400 µL de buffer G–B, seguido de 1 mL de buffer DV (previamenteenfriado a 4ºC). Se homogenizó vigorosamente y se procedió a centrifugarlo a 12000x g por 2 minutos.

6. Después de la formación de dos fases se procedió a extraer y descartar la fase superior(color azul). Se transfirió la fase inferior al interior de una columna de filtracióncolocada en un microtubo de 2 mL, centrifugando a 12000 x g por 1 minuto.

7. Se descartó la columna de filtración adicionando al filtrado 400 µL de buffer BV.

8. Se colocó una columna AxyPrep en otro microtubo de 2 mL al cual se transfirió elfiltrado anterior. Se centrifugó a 12000 x g por 1 minuto.

9. Se descartó el filtrado del tubo. A la columna anterior se le añadió 500 µL de bufferW1 y se centrifugó a 12000 x g por 1 minuto. Se descartó el filtrado y se agregó 700µL de buffer W2 y se centrifugó a 12000 x g por 1 minuto. Adicionalmente seagregaron 700 µL de buffer W2 a la columna AxyPrep y se centrifugó a 12000 x g por1 minuto para remover las sales, eliminando problemas potenciales en reaccionesenzimáticas subsecuentes.

10. Se descartó el filtrado y se colocó nuevamente la columna AxyPrep en el microtubo de2 mL. Se procedió a centrifugarlo a 12000 x g por 1 minuto.

11. Se transfirió la columna AxyPrep a un microtubo de 1.5 mL limpio. Para eluir elDNA se agregaron 200 µL de eluente (previamente temperado a 60ºC para aumentarla eficiencia de la elución), teniendo cuidado de verterlo al centro de la membrana. Sedejó reposar por 1 minuto a temperatura ambiente, para luego centrifugarlo a 12000 xg por 1 minuto.

12. Las muestras de DNA fueron almacenadas a -20ºC.


23

FIGURA 9. Extracción de DNA

Centrifugar 1.5 mL de caldo TGE concepas crecidas a 12000 g x 2 minutos.

Agregar 150 μl de Buffer S + RNAsa AAgregar 20 μl de lisozimaAgregar 30 μl de EDTA 0.25 MAgregar 450 μl de Buffer G-AAgregar 400 μl de Buffer G-B

Agregar 400 μl de Buffer BV

Agregar 500 μl de Buffer W1Agregar 700 μl de Buffer W2

Repetir el lavado con Buffer W2

Lisis

Agregar 1 mL de Buffer DVRepetir extracción con Buffer DV

Formación de dos fases.Descartar la fase superior

Filtrado

Agregar 100-200 μl del Eluente Elución


24

3.4.2 VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD DE DNA EXTRAÍDO (CONTROL DECALIDAD)


Balanza digital de 200 g de capacidad Probetas de 100 y 1000 mL Micropipetas de 0.1 - 2 µL y 1 - 10 µL Tips de 10 µL Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 10 cm Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable Transluminador de luz UV Cámara digital Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas Inc. USA) Marcador molecular Lambda DNA 500 µg, Fermentas Inc. USA Buffer TBE 1X Agarosa Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 µg/mL) Agua destilada

Procedimiento

A. Preparación del gel de agarosa 1%

1. Se realizó el pesado de 0.75 g de agarosa y se mezcló con agua destilada (c.s.p. 75mL) y se licuó en el horno microondas hasta la completa disolución de los cristales deagarosa.

2. La preparación anterior, temperada a 50º C, fue vertida en una bandeja electroforéticade 15 x 10 cm, previamente nivelada, a la cual se fue puesta el peine respectivo Sedejó solidificar, evitando la formación de burbujas.

3. Luego de solidificar se retiraron las paredes de goma y el peine, teniendo cuidado deno dañar los pocillos de vertido de la muestra.

4. Se transfirió la bandeja con el gel a la cámara de electroforesis.

5. La cámara de electroforesis fue cargada con buffer TBE 1X, hasta cubrir los pocillosde muestra.

B. Corrida electroforética de las muestras

1. Se mezcló 1.0 µL de buffer de carga con 5 µL de la muestra.

2. Se utilizó como marcador molecular Lambda DNA (1 µL), el cual se mezcló con 1 µLde buffer de carga.

3. Se procedió a cargar las mezclas realizadas con una micropipeta de 1 – 10 µL,dispensando cada muestra en un pocillo del gel.


25

4. Se cerró la cámara de electroforesis y se conectaron los cables en sus electrodoscorrespondientes.

5. Se programó la fuente de poder a 80 V por 60 minutos, iniciando la corrida.

C. Tinción del gel

1. Concluido el tiempo de corrida, se trasladó cuidadosamente el gel a una bandeja desolución acuosa de bromuro de etidio (0.5 µg/mL), dejando reposar durante 15minutos. Trascurrido el tiempo anterior, se trasladó el gel a la bandeja con aguadestilada y se dejó reposar durante 10 minutos para su lavado.

2. Se colocó el gel sobre el transluminador, encendiendo la luz UV

3. El gel revelado fue fotografiado.

3.4.3 AMPLIFICACIÓN BOX

El análisis de los perfiles de bandas de la caja BOX se realizó de acuerdo a Versalovic et al.,1991.


Termociclador Eppendorf Micropipetas de 0.1 - 2 µL, 1 - 10 µL, 10 - 100 µL y de 100 - 1000 µL Tips de 10 µL, 100 µL y 1000 µL (estériles y de primer uso) Microtubos de 1.5 mL Tubos para PCR de 0.2 mL (estériles y de primer uso) Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas) BOX A1R (5' – CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3') 10 pmol/mL Buffer Taq KCl 10X DMSO 100% MgCl2 25 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 mM cada uno) Taq DNA polimerasa 5U/µL Agua miliQ

Procedimiento

La PCR fue realizada en una mezcla de reacción de 25 µL contenidos en tubos para PCRdebidamente rotulados (Figura 10).

A. Mezcla de Reacción

A continuación se detalla la formulación de la mezcla de reacción requerida para unaamplificación BOX (Tabla 3). El volumen final por reacción fue de 25 µL.


26

TABLA 3. Mezcla para reacciones de amplificación BOX

Reactivos ConcentraciónInicial

ConcentraciónFinal

Volumen(25 µL)

Buffer KCl (X) 10 1,00 2,50MgCl2 (mM) 25 7,50 7,50DMSO (%) 100 10,00 2,50dNTPs (mM) 25 1,25 1,25Primer BOX A1R (pmol/mL) 10 0,80 2,00Taq DNA Polimerasa (U/µL) 5 0,08 0,40DNA (µL) 1 - 8Agua miliQ (µL) c.s.p. 25,00

Dado el volumen de muestras, se realizó un master mix, multiplicando todos los volúmenesrequeridos por el número de muestras a ensayar más una. Luego de dispensar la mezclaobtenida, se procedió a colocar el volumen respectivo de DNA y agua miliQ (c.s.p. 25 µL dereacción).

La cantidad de DNA dependió de la concentración del mismo en el eluente de extracción, elcual fue evaluado previamente en la verificación del DNA.

B. Reacción de amplificación

Los tubos para PCR fueron introducidos en el termociclador, previamente programado para lareacción de amplificación BOX.

El perfil de temperatura fue el siguiente:

Desnaturalización inicial a 95º C por 3 min; 25 ciclos de desnaturalización a 93º C por 45 segundos, annealing a 53º C (BOX) por

1 min y extensión a 65º C por 8 min Extensión final a 65º C por 16 min.

C. Comprobación de la amplificación por electroforesis


Balanza digital de 200 g de capacidad Probetas de 100 y 1000 mL Micropipetas de 0.1 - 2 µL y 1 - 10 µL Tips de 10 µL Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 15 cm Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable Transluminador de luz UV Cámara digital Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas) Marcador molecular Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Plus, Fermentas Inc. USA Buffer TBE 1X


27

Agarosa Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 µg/mL) Agua destilada

Procedimiento

1. Se preparó agarosa al 1.5 % en buffer TBE 1X y se vertió en una bandejaelectroforética para gel de 15 x 15 cm, la cual fue dispuesta dentro de la cámara deelectroforesis conteniendo la misma solución buffer anteriormente mencionada.

2. Se mezcló 1.2 µL del buffer de carga con 7 µL del amplificado

3. Se utilizó como marcador molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder Plus (1 µL), el cualse mezcló con 1.2 µL de buffer de carga.

4. Se procedió al cargado de las muestras y los marcadores moleculares.


6. Las muestras fueron corridas a 80 V por 180 minutos.

7. El gel fue revelado, como lo descrito en 3.2, C.

8. Se tomaron las fotografías del gel revelado.

3.4.4 AGRUPAMIENTO DE PERFILES BOX-PCR SEMEJANTES

Materiales

Fotografías de los geles BOX revelados

Procedimiento

1. Los perfiles BOX de cada una de las cepas ensayadas, luego de haber sido revelados,son comparados entre ellos, buscando bandas en común que muestren un mismo pesomolecular.

2. Se formaron agrupamientos de alta similitud, de manera que los patrones de losdiferentes grupos obtenidos se diferenciaron uno del otro.


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Extracción de DNA

Verificación de la calidad de DNA extraído

BOX - PCR

Gel de Agarosa al 1.5%

Comprobación de la amplificación por electroforesis

Tinción con Bromuro de Etidio

Revelado con transluminador y tomas fotográficas

Agrupamiento de perfiles similares

FIGURA 10. Caracterización molecular de cepas de Bacillus sp.

Primer BOX A1R(5' – CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G - 3')

Desnaturalización inicial: 95º C / 3 minCiclaje: 93º C / 45 seg. (25 ciclos)

53º C / 60 seg.65º C / 8 min.

Extensión final: 65º C / 16 min.


29

3.4.5 AMPLIFICACIÓN 16S

Se eligieron representantes de cada agrupamiento (Sección 3.4) para el secuenciamiento delgen ribosomal 16s, el cual fue amplificado por medio de una reacción de PCR con los primersfD1 y rD1, posteriormente se procedió a limpiar las secuencias obtenidas con el kit PCRCleanup de Axygen,

La reacción de amplificación del gen ribosomal 16S se realizó con el fin de secuenciarlo ydeterminar la especie de las cepas ensayadas.


Termociclador Eppendorf Micropipetas de 0.1 - 2 µL, 1 - 10 µL, 10 - 100 µL y de 100 - 1000 µL Tips de 10 µL, 100 µL y 1000 µL (estériles y de primer uso) Microtubos de 1.5 mL Tubos para PCR de 0.2 mL (estériles y de primer uso) Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas) Primers:

fD1: 5’ – CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG – 3’rD1: 5’ – CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC – 3’

Buffer Taq KCl 10X MgCl2 25 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 mM cada uno) Taq DNA polimerasa 5U/µL Agua miliQ

Procedimiento

La PCR fue realizada en una mezcla de reacción de 25 µL contenidos en tubos para PCRdebidamente rotulados.

A. Mezcla de Reacción

A continuación se detalla la formulación de la mezcla de reacción requerida para unaamplificación 16s (Tabla 4). El volumen final por reacción fue de 25 µL.

TABLA 4. Mezcla para reacciones de amplificación 16S

Reactivos ConcentraciónInicial

ConcentraciónFinal

Volumen(25 µL)

Buffer KCl (X) 10 1,00 2,50MgCl2 (mM) 25 1,50 1,50dNTPs (mM) 10 0,50 0,20Primer fD1 (pmol/mL) 10 0,50 0,20Primer rD1 (pmol/mL) 10 0.50 0,20Taq DNA Polimerasa (U/µL) 5 0.50 0,10DNA (µL) 5Agua miliQ (µL) c.s.p. 25,00


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Dado el volumen de muestras, se realizó un master mix, multiplicando todos los volúmenesrequeridos por el número de muestras a ensayar más una. Luego de dispensar la mezclaobtenida, se procedió a colocar el volumen respectivo de DNA y agua miliQ (c.s.p. 25 µL dereacción).

Una vez estandarizado el protocolo de extracción de DNA se llevaron los volúmenes demuestras de DNA a 5 µL.

B. Reacción de amplificación

Los tubos para PCR fueron introducidos en el termociclador, previamente programado para lareacción de amplificación del gen ribosomal 16s.

El perfil de temperatura fue el siguiente:

Desnaturalización inicial a 93º C por 2 min; 30 ciclos de desnaturalización a 93º C por 45 segundos. Annealing a 62º C por 45 seg. y extensión a 72º C por 2 min. Extensión final a 72º C por 5 min.

C. Comprobación de la amplificación por electroforesis


Balanza digital de 200 g de capacidad Probetas de 100 y 1000 mL Micropipetas de 0.1 - 2 µL y 1 - 10 µL Tips de 10 µL Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 15 cm Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable Transluminador de luz UV Cámara digital Buffer de carga (6X DNA Loading dye, Fermentas) Marcador molecular Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Plus, Fermentas Inc. USA Buffer TBE 1X Agarosa Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 µg/mL) Agua destilada

Procedimiento

1. Se preparó agarosa al 1 % en buffer TBE 1X y se vertió en una bandeja electroforéticapara gel de 15 x 10 cm, la cual fue dispuesta dentro de la cámara de electroforesisconteniendo la misma solución buffer anteriormente mencionada.

2. Se mezcló 1.2 µL del buffer de carga con 7 µL del amplificado.


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3. Se utilizó como marcador molecular Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Plus (1 µL), elcual se mezcló con 1.2 µL de buffer de carga.

4. Se procedió al cargado de las muestras y los marcadores moleculares.


6. Las muestras fueron corridas a 60 V por 150 minutos aproximadamente hasta que labanda más oscura del buffer alcance la mitad del largo del gel.

7. El gel fue revelado, como lo descrito en 3.2, C.

8. Se tomaron las fotografías correspondientes.

3.4.6 PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR

Este kit emplea una solución especial, que en combinación a una columna de PCR AxyPrep,contiene una resina con alta selectividad y recuperación de fragmentos de DNA lineal. Elproducto está diseñado para purificar fragmentos de DNA mayores a 75 bp de reacciones dePCR y otras reacciones enzimáticas, con una recuperación esperada de 70 – 90 %.

Cada columna posee la capacidad de atrapar hasta 8 μg. El protocolo de purificación puederemover los primers no constituidos (<50 nucleótidos), enzimas y mononucleótidos marcadoscon algún colorante fluorescente o sin marcar. Los fragmentos de DNA purificado estarándisponibles para una variedad de aplicaciones, tales como secuenciamiento, ligamientos,análisis de restricción, trascripción in vitro, microinyección y microarrays.


Producto de la reacción de amplificación del gen ribosomal 16S Vórtex Baño de agua a 65° C Microcentrífuga Micropipetas de 10 -100 µL Tips de 100 µL (estériles y de primer uso) Kit para purificación de DNA, AxyPrep PCR Cleanup Kit (Axygen Scientific, Inc.

– USA) Columnas de PCR AxyPrep Microtubos de 2 mL Microtubos de 1.5 mL Buffer W2 (24 mL d buffer W2 concentrado + 168 mL de etanol Q.P.*) Eluente (Tris-HCl 2.5 mM, pH=8.5)

(*) Reactivos no provistos en el Kit


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Procedimiento

1. Añadir a la muestra un volumen triple de buffer PCR – A. Para volumenes menores a100 μL, como el trabajado, agregar 100 μL de buffer PCR – A y agitar en vortexbrevemente para mezclar el contenido (Figura 11).

2. Colocar una columna en el interior de un tubo de microcentrífuga de 2 mL (provistoen el kit). Pipetear la reacción del Paso 1 dentro de la columna de PCR. Centrifugar a12000 x g por 1 minuto.

3. Descartar el filtrado del tubo de microcentrífuga. Colocar nuevamente la columna dePCR dentro del mismo tubo. Pipetear 700 μL de buffer W2 dentro de la columna ycentrifugar a 12000 x g por 1 min.Nota: Asegurarse que el volumen especificado de etanol haya sido agregadopreviamente al buffer W2 concentrado.

4. Descartar el filtrado. Colocar nuevamente la columna de PCR en el tubo demicrocentrífuga de 2 mL. Pipetear 400 μL de buffer W2 dentro de la columna ycentrifugar a 12000 x g por 1 min.Nota: Se utilizan dos enjuagues con buffer W2 para asegurar la completa remoción desales, eliminando problemas potenciales en las subsiguientes reacciones enzimáticas.

5. Transferir la columna de PCR al interior de de un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL(provisto en el kit). Para eluir el DNA, añadir 25 – 30 μL del Eluente (pre-calentado a65ºC) hacia el centro de la membrana. Dejar reposar por 1 minuto a temperaturaambiente. Centrifugar a 12000 x g por 1 min.


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FIGURA 11. Purificación del producto de amplificación PCR – 16S

Agregar 100 μl de Buffer PCR - A

Agregar 700 μl de Buffer W2

Repetir el lavado con Buffer W2

Filtrado

Agregar 25-30 μl del Eluente Elución


34

3.4.7 SECUENCIAMIENTO

Para la identificación por secuenciamiento del gen ribosomal 16s, las muestras obtenidasfueron enviadas a Macro Gen Inc. (Seúl, Korea), laboratorio que brinda dicho servicio.Tras la llegada de los resultados se procedió a limpiar y unir las secuencias dadas por cadaPrimer (fD1 y rD1), esto se realizó mediante el empleo de los programas BIOEDIT yCHROMAS y el banco de datos con el cual se obtuvieron las posibles especies fue adquiridopor medio de la “National Center for Biotechnology Information”.(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Los programas BIOEDIT y CHROMAS fueron utilizados para alinear las secuencias de lasmuestras con secuencias de especies ya conocidas y detectar posibles errores en elcromatograma (Figuras 12 a 15), ya que muchas veces este tiene bases solapadas o extras y lacorrección ayuda a la definición de las posibles especies con mayor afinidad.

FIGURA 12. Secuencias del banco de genes (genebank, NCBI) y cepa en estudio. Tras laobtención de secuencias similares a las secuencias en estudio por medio de la NCBI, se procedió alimpiar las secuencias por medio de los programas BIOEDIT (arriba) y CHROMAS (abajo), elprimero se empleo para comparar la semejanza entre las bases de la secuencia de la muestra con lassecuencia extraídas de la NCBI y el segundo se empleo para corroborar esta información con elcromatograma, ya que en este se puede observar los posibles errores de secuenciamiento

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


35

FIGURA 13. Secuencias del banco de genes (genebank, NCBI) y cepa en estudio. Aplicación deClustalW para la alineación de secuencias. La aplicación ClustalW permite alinear todas lassecuencias en el archivo, permitiendo asi la comparación entre estas.

FIGURA 14. Secuencias alineadas para la corrección de posibles errores. El programaCHROMAS, es determinante al momento de realizar las correcciones necesarias, ya que elcromatograma permite determinar si la diferencia en una base es real o un error en la lectura de este.


36

FIGURA 15. Ejemplo de cromatograma de un secuenciamiento

3.4.8 ELABORACIÓN DE DENDOGRAMAS

1. Se obtuvieron datos de secuencias del gen ribosomal 16s de distintas cepas patrón delgénero Bacillus con el fin de alinearlas con las secuencias limpias de las muestras.

2. Se alinearon todas las secuencias mediante la aplicación ClustalW Multiple Alignmentdel programa BIOEDIT (Figura16) antes mencionado. Esta aplicación es un sistemaampliamente empleado para alinear series homólogas de secuencias de nucleótidos.Para la alineación de múltiples secuencias, ClustalW utiliza métodos de alineaciónprogresiva, donde las secuencias más parecidas se alinean primero. Después, se vanalineando grupos de secuencias cada vez más distantes hasta obtener una alineaciónglobal.

3. Una vez alineadas se cortaron los extremos para que todas las secuencias tengan lamisma longitud.

4. Posteriormente se empleó el programa MEGA4, el cual utiliza distintos métodosestadísticos para la construcción de árboles filogenéticos.

5. Para la construcción de la filogenia se utilizó el método estadístico “NEIGHBORJOINING”, el cual es ampliamente empleado en estudios de evolución basados entécnicas moleculares. Este tiene la capacidad de manejar un amplio conjunto de datos,por lo que es uno de los pocos métodos que permite la rápida inclusión de todas lassecuencias homólogas en un solo árbol. En resumen este método utiliza una matriz dedistancias, la cual va agrupando en parejas según la divergencia promedio hasta llegara una base.


37

6. Para evaluar la fidelidad del árbol filogenético construido, se empleó el test defilogenias inferidas “bootstrap”, el cual crea un número arbitrario de posiblesdendogramas por medio del cambios puntales en diferentes bases de las secuencias yelige uno de consenso, así, en cada divergencia se muestra un porcentaje el cualrepresenta el número de ramas que se han repetido del total de árboles creados.

FIGURA 16. Alineación de cepas de referencia y cepas en estudio para la creación deldendograma. Se empleó nuevamente el programa BIOEDIT para al alineación de todas las secuenciasen estudio corregidas y las secuencias de cepas tipo o de referencia para la construcción deldendograma.


38

3.5. MUESTREO DE LA CADENA PRODUCTIVA DE CONSERVAS DEESPÁRRAGO BLANCO

Se tomaron muestras en diferentes puntos de la cadena productiva para procesamiento deconservas de espárragos blancos de la empresa Green Perú S.A. (Trujillo - Perú), desde elsuelo de cultivo, pasando por las diferentes etapas de procesamiento de los espárragos, hastael paso previo a la esterilización de los mismos.


Bolsas plásticas Ziploc guantes, mandiles, botas lampas y baldes cooler geles refrigerantes plumones marcadores termómetros.

Procedimiento

MUESTREO DEL SUELO (Carter, 1993)

1. Se recorrieron los lotes a lo largo y cada 50 metros se tomó una submuestra entre los20 y 30 cm de profundidad, limpiando la superficie del terreno y depositándola en elbalde.

2. Luego de tener todas las submuestras en el balde (de 15 a 20) se mezclaronhomogéneamente y se tomó 1 Kg. aproximadamente que fue colocado en una bolsaZiploc, cerrada herméticamente y rotulada inmediatamente.

3. Las bolsas fueron colocadas en el cooler con geles de refrigeración, manteniendo unatemperatura de 4ºC aproximadamente.

MUESTREO DE LOS ESPÁRRAGOS EN LA PLANTA DE PROCESAMIENTO

1. Se escogieron como puntos de muestreo (Figura 17) los espárragos frescos enrecepción de planta, después de pasar por el baño de burbujas, después delhidrocooler, los espárragos frescos sin pelar y cortados y aquellos pelados y cortados.Siguiendo con la línea de producción se muestrearon espárragos frescos pelados ycortados después de blanqueado, envasados (frasco 315) con 1, 3 y 4 horas de esperaprevio al proceso de esterilización.

2. Las consideraciones para la toma de muestras y los procedimientos detallados delmuestreo se describen en Velezmoro et al., 2007.


39

RECEPCIÓN

BAÑO DE BURBUJAS

HIDROCOOLER

CORTADO Y SIN PELARCORTADO Y PELADO

PESADO

LAVADO

COSECHA

ALMACENAMIENTO

SELECCIÓN

BLANQUEADO

ENVASADO

ESTERILIZACIÓN

MUESTREO

MUESTREO

MUESTREO

SUELOCAMPO

PLANTA DE PROCESAMIENTO

MUESTREO

PELADO

MUESTREO MUESTREO

1 h DE ESPERA

3 h DE ESPERA MUESTREO

MUESTREO

FIGURA 17. Diagrama de flujo de la línea de procesamiento de conservas deespárrago blanco en la planta de Green Perú S.A.

4 h DE ESPERA

MUESTREO


40

3.5.1 RECUENTO DE MICROORGANISMOS ESPORULADOS DEL GÉNEROBacillus sp. Y DE ANAEROBIOS SULFITO REDUCTORES

Los parámetros microbiológicos ensayados en las muestras tomadas fueron:

Recuento de esporogénicos mesófilos aerobios (EMA) Recuento de esporogénicos mesófilos anaerobios (EMANA) Recuento de esporogénicos termófilos aerobios (ETA) Recuento de esporogénicos termófilos anaerobios (ETANA) Recuento de anaerobios sulfito reductores

La metodología empleada para la cuantificación de las poblaciones de esporogénicos (Figura18), siguió los lineamientos de APHA (1992) y la del recuento de anaerobios sulfitoreductores, la del FDA (2001). (Figura 19)


41

FIGURA 18. Recuento de microorganismos esporulados

Incubar a 35ºC x 48 horas

Muestra

10 mL 1 mL 0.1 mL

Baño María a 80 ºC x 30 minutos

Baño María a 45 ºC x 10 minutos

10-1

450 mLAP 0.1%

50 g

I N C U B A C I Ó N

EMA EMANA ETA ETANA

Incubar a 55ºC x 48 horas

Introducir en jarrasde anaerobiosis

Introducir en jarrasde anaerobiosis

Lectura de cada una de las 5 placas por dilución y reporte de resultados

Repartir el contenido decada frasco en 5 placasPetri

Frascos con 100 mLde Agar TGE


42

FIGURA 19. Recuento de anaerobios sulfito reductores

1 mL

10-1

10-2 10-3225 mLAP 0.1%

1 mL

9 mLAP 0.1%

9 mLAP 0.1%

25 g

Placas con la basecubierta con medio TSC

Adicionar agar TSC con yema de huevo

Incubar en jarra de anaerobiosis a 35 ± 1 ºC por 24 horas

Elegir las placas con 20 – 200 colonias negras

Expresión de Resultados: UFC/g alimento

Test de Confirmación de colonias típicas

1 mL


43

3.5.2 AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE CEPASDE BACILLUS SP.


Agar Triptona-Glucosa-Extracto de Carne (TGE) Caldo Casoy Placas Petri descartables con agar TGE Tubos de ensayo Sistemas de anaerobiosis: Anaerocult e indicador Anaerotest Cajas criogénicas Viales criogénicos de 2 mL Glicerol Asa de Kolle Jarras de anaerobiosis Autoclave Cabina de bioseguridad Incubadoras a 35ºC y 52.5ºC Congeladora a -80ºC

Procedimiento

Aislamiento de las cepas de Bacillus sp.

1. Con ayuda de un asa de Kolle, picar las cepas más representativas de cada muestraanalizada. Sembrar en medio para Bacillus TGE. Aislar y reaislar las veces necesariaspara obtener las cepas puras.

Caracterización morfológica y crecimiento de las cepas a 35ºC y 52.5ºC en condicionesaerobias y anaerobias

1. Se determinó:

a. Características morfológicas de las cepas de Bacillus en agar TGEb. Crecimiento a 35ºC en condiciones de anaerobiosis y aerobiosisc. Crecimiento a 52.5ºC en condiciones de anaerobiosis y aerobiosisd. Crecimiento y viraje en TGE con púrpura de bromocresol.

2. Las características morfológicas de las cepas de Bacillus fueron evaluadas a las 24horas de incubación en agar TGE incubado a 35ºC. Se toman en cuenta característicasde tamaño, borde, forma y textura de las colonias aisladas.

3. En los ensayos de crecimiento en anaerobiosis se usó el medio Mossel dispensado enplacas petri. Sembrar por estría las cepas de Bacillus aisladas. Colocar las placas enjarras con sistemas de anaerobiosis Anaerocult e indicador Anaerotest. Incubar a 35ºCy 52.5ºC.

4. En los ensayos de crecimiento en aerobiosis se usó medio TGE dispensado en placaspetri. Se r las cepas bacterianas e incubar luego a 35ºC y 52.5ºC.


44

5. En el ensayo de crecimiento y viraje en TGE con púrpura de bromocresol estriar en elmedio mencionado las cepas bacterianas e incubar de 35ºC. Al término del periodo deincubación, reportar como positivo (+) aquellas cepas que hagan virar el medio haciaamarillo.

Almacenamiento de las cepas en glicerol

Materiales y Equipos Cultivos puros de cepas de Bacillus Tubos con 5 mL de caldo Casoy Cajas criogénicas Viales criogénicos de 2 mL Glicerol al 87% Asa de Kolle Cabina de bioseguridad Incubadora a 35ºC Congeladora a -80ºC

Procedimiento

1. Sembrar una asada de la cepa pura de Bacillus en caldo Casoy e incubar a 35ºCdurante 24 horas.

2. Tomar una alícuota de 1 mL del caldo bacteriano y dispensar en un vial criogénicoLuego adicionar 0.5 mL de glicerol al 87%. Las cepas se guardan por duplicado.

3. Colocar los viales en cajas criogénicas y almacenar en congeladora a -80ºC.


45

3.6 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA (API 50 CHB)

Se empleó la metodología de identificación API – Referencia para Identificaciónestandarizada de Biomeriux (España) obtenida por intermedio de la Empresa Química Suiza.Esta prueba está basada en 49 ensayos bioquímicos para investigación del metabolismo deazúcares en los microorganismos. La base de datos del sistema API 50 CHB v 2.1 incluye 24especies o taxones.


Galerías API 50 CH Cámaras de incubación para API 50 CH Medio de inoculación: API 50 CHB/E Medium Solución salina 0.85% Aceite de parafina Agua destilada o desmineralizada Pipetas Gradillas Estufa incubadora a 30ºC Mechero Bunsen Cartilla para anotación de resultados Plumón marcador Escala Standard de McFarland Programa informático de identificación APIWEB TM

Procedimiento (ver Figura 20)

Selección de las colonias

1. Verificar la pureza de la cepa.2. Verificar su pertenencia al género Bacillus: bacilo formador de esporas, aeróbico,

usualmente Gram positivo.3. Cultivar el microorganismo sobre un agar base adecuado para su crecimiento (Ejm.:

Agar Peptona de Caseína – Glucosa – Extracto de Carne, TGE).4. Las cepas mesófilas deben incubarse entre 25-45ºC por 16-18 horas, mientras que las

cepas termófilas deben crecer a 55ºC por 12-16 horas.

Preparación de las galerías

Cada galería está constituída por 5 filas, conteniendo cada una 10 tubos numerados.1. Preparar una cámara de incubación (fondo y tapa).2. Anotar la referencia de las cepas en la lengüeta lateral de la cámara.3. Repartir unos 10 mL de agua destilada o desmineralizada en los alveolos del fondo de

la cámara, para crear una atmósfera húmeda.4. Sacar cada una de las filas que constituyen las galerías de su embalaje, separar en dos

las filas 0-19 y 20-29 y colocarlas en el fondo de la cámara de incubación.5. Completar la galería con la fila 40-49.


46

Preparación del inóculo

1. Verificar la pureza de la cepa.2. Abrir un tubo conteniendo 1 mL de solución salina 0.85% y preparar una suspensión

densa, picando todas las colonias del cultivo.3. Abrir cuidadosamente una ampolla de API 50 CHB/E Medium e inocularle una

cantidad adecuada de la suspensión anterior, para obtener una turbidez equivalente aescala 2 de McFarland.

4. Homogeneizar.

Inoculación de las galerías

1. Repartir la suspensión bacteriana con ayuda de una pipeta estéril en cada uno de los 50tubos de la galería, llenar los tubos (no las cúpulas), evitando la formación de burbujasapoyando la punta de la pipeta en el borde de la cúpula.

2. La adición de aceite mineral es opcional pero recomendable, permite una mejorvisualización del color y de esta manera, una mejor distinción de los resultados. Sinembargo, para especies aerobias estrictas debe omitirse su uso.

Incubación

1. Incubar las galerías a la temperatura óptima de crecimiento:- Mesófilos a 30-37ºC por 48 horas.- Termófilos a 55ºC por 24 horas. Para especies termófilas muy activas deben

leerse luego de 3-6 horas de incubación, ya que podría ser dificultosa lainterpretación luego de las 24 horas.

Lectura e interpretación de las galerías

1. Transcurrido el periodo de incubación determinado, efectuar las lecturas de lasgalerías.

2. Un ensayo positivo corresponde a la acidificación del medio de inoculación,evidenciada por el cambio de color del indicador rojo de fenol (contenido en el medio)hacia amarillo.

3. Para el ensayo de esculina (tubo Nº 25) un ensayo positivo se observa cuando se da uncambio de color rojo hacia negro.

4. Ocasionalmente, un ensayo positivo puede evidenciarse como negativo en unasegunda lectura, esto debido a la producción de amonio a partir de peptona, lo cualneutraliza los ácidos. Estas pruebas deben ser reportadas como positivas

5. Anotar cada ensayo en la cartilla de resultados como positivo (+), negativo (-) ódudoso (?).

6. El perfil bioquímico así constituido sirve para la identificación de Bacillus ymicroorganismos próximos, con ayuda del programa informático de identificaciónAPIWEBTM.


47

FIGURA 20. Procedimiento API 50 CHB

a. Sacar de su embalaje cada una de las filas de ensayo que constituyen la galería,colocándolas en orden numérico sobre el fondo de la cámara de incubación.

b. Preparar una suspensión bacteriana densa en un tubo conteniendo 1 mL de soluciónsalina 0.85%, para ello picar todas las colonias del cultivo.

c. Inocular una cantidad adecuada de la suspensión anterior en una ampolla de API 50CHB/E Medium, la turbidez alcanzada debe ser equivalente a escala 2 de McFarland.

Homogeneizar.


48

d. Repartir la suspensión bacteriana en cada uno de los 50 tubos de la galería, llenar los tubos(no cúpulas), evitar la formación de burbujas.

e. Incubar las galerías a la temperatura óptima de crecimiento por 24/48 h.

f. Efectuar la lectura de las galerías.


49

g. El perfil obtenido de la combinación de resultados (+) y (-), determina las especie delmicroorganismo en ensayo, haciendo uso del programa informático APIWEBTM.


50

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 CURVAS DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE ESPORAS DE BACILLUSEN MEDIO LÍQUIDO

A continuación se describen los resultados encontrados para las curvas de crecimiento yproducción de esporas ensayadas en: B. pumilus, B. licheniformis y B. subtilis /amyloliquefaciens.

4.1.1 PRIMER ENSAYO PARA CURVAS DE CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO

1. Bacillus pumilus : 2M3B12

En la Tabla 5 se muestran los resultados obtenidos por recuento directo durante elproceso de crecimiento de B. pumilus en medio líquido. Se partió con unaconcentración de 23 x 103 cél/mL llegando hasta 29 x 105 cél/mL después de 63 horas.

Se puede apreciar que la D.O.600nm llega a un máximo de 1.059 de absorbancia a las 12horas.

TABLA 5. Densidad óptica y recuento directo del inóculo de B. pumilus para elprimer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

En la Figura 21 se puede observar que la fase estacionaria se da a partir de las 12 horasmanteniéndose constante hasta el final del ensayo coincidiendo con la densidad ópticaque obtuvo el mayor valor a la misma hora.

Tiempo D.O. 600 nm Recuento directoHoras Absorbancia Cél/mL Log (UFC/mL)

0 0.000 23 x 103 4.362

12 1.059 64 x 105 6.806

20 0.836 15 x 106 7.169

38 0.868 12 x 106 7.072

46 0.600 11 x 106 7.029

63 0.134 29 x 105 6.465


51

FIGURA 21. Curva de crecimiento y densidad óptica del inóculo de B. pumiluspara el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

2. Bacillus licheniformis: 2M3BE23

En la Tabla 6 se puede observar que la fase estacionaria de B. licheniformis se da a las12 horas obteniéndose 88 x 105 Cél/mL al final del ensayo, lo mismo que se refleja enla Figura 22.

TABLA 6. Densidad óptica y recuento directo del inóculo de B. licheniformispara el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

Tiempo D.O. 600 nm Recuento directoHoras Absorbancia Cél/mL Log (UFC/mL)

0 0.000 13 x 103 4.114

12 0.540 40 x 105 6.601

20 0.625 33 x 105 6.524

38 0.865 87 x 105 6.938

46 0.886 56 x 105 6.744

63 0.417 88 x 105 6.944

B . pu m ilu s - 2M 3B E12

0.000

2.000

4.000

6.000

8.000

0 6 12

18

24

30

36

42

48

54

60

Tie mpo (h)

Lo

g 10

(Cé l

/mL

)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

D.O

. (A

bso

rba

nci

a)

Re c u e n to d ire c to D .O .


52

FIGURA 22. Curva de crecimiento y densidad óptica del inóculo de B.licheniformis para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

3. Bacillus subtilis / amyloliquefaciens

La fase estacionaria de este microorganismo, al igual que los microorganismosanteriores se da a las 12 horas de haberse dado la inoculación del caldo TGE (Tabla 7,Figura 23).

TABLA 7. Densidad óptica y recuento directo del inóculo de B. subtilis /amyloliquefaciens para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

Tiempo D.O. Recuento directoHoras Absorbancia Cél/mL Log (UFC/mL)

0 0.000 15 x 103 4.176

12 0.365 30 x 105 6.480

20 0.825 27 x 105 6.438

38 1.151 86 x 105 6.932

46 0.994 45 x 105 6.653

63 0.634 99 x 106 6.998

B. licheniformis - 2M3BE23

0.000

2.000

4.000

6.000

8.000

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

Tiempo (h)

Log

10 (C

él/m

L)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

D.O

.(Abs

orba

ncia

)

Recuento directo Absorbancia


53

FIGURA 23. Curva de crecimiento y densidad óptica del inóculo de B. subtilis /amyloliquefaciens para el primer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

4.1.2 SEGUNDO ENSAYO PARA CURVAS DE CRECIMIENTO EN MEDIOLÍQUIDO

1. Bacillus pumilus : 2M3BE12

En la Tabla 8 se puede observar que partiendo de una concentración inicial de 80UFC/mL células viables en caldo de cultivo TGE, se alcanzó una concentraciónmáxima de células a las 12 horas de evaluación (70 x 107 UFC/mL), cantidad quepermaneció relativamente constante hasta el final del ensayo. También se puedeapreciar que el proceso de esporulación se inicia aproximadamente a las 24 horas deinoculado el caldo consiguiéndose un 104.71% de esporas con respecto a las célulastotales después de las 223 horas. Los valores de densidad óptica no son muy notablesal inicio del ensayo llegando a un pico máximo a las 12 horas coincidiendo con elinicio de la fase estacionaria.

B. subtilis / amyloliquefaciens

0.000

2.000

4.000

6.000

8.000

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

Tiempo (h)

Log

10 (C

él /

mL

)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

D.O

. (A

bsor

banc

ia)

Recuento directo Absorbancia


54

TABLA 8. Densidad óptica, recuento directo, recuento de células totales yrecuento de esporas del inóculo de B. pumilus para el segundo ensayo (28 ± 1º C,pH=7)

Tiempo D.O. Recuento Directo Recuento Células totales Recuento Esporas

Horas Absorbancia (Cél/mL) Log10(Cél/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL) Esporas(%)

0 0.000 <10 0.000 80 1.903 <10 0.000 0.00%

3 0.000 <10 0.000 - - - - -

6 0.002 26 x 104 5.415 30 x 104 5.477 <10 0.000 0.00%

9 0.302 94 x 104 5.974 - - - - -

12 0.760 26 x 105 6.416 70 x 107 8.844 <10 0.000 0.00%

24 0.155 16 x 106 7.197 47 x 107 8.669 3.5 0.544 6.27%

32 0.350 12 x 106 7.072 27 x 107 8.431 20 x 102 3.315 39.31%

48 0.324 59 x 105 6.767 10 x 106 7.004 94 x 102 3.972 56.71%

55 0.316 81 x 105 6.908 - - - - -

73 0.286 92 x 105 6.961 14 x 107 8.134 15 x 102 3.176 39.04%

80 0.247 80 x 105 6.903 - - - - -

147 0.126 - - 64 x 106 7.806 31 x 103 4.491 57.53%

223 - - - 50 x 106 7.702 12 x 107 8.065 104.71%

En la Figura 24 se puede apreciar que existe una diferencia de aproximadamente 1ciclo logaritmico entre el recuento directo y el recuento de células totales siendo laúltima la más exacta. La producción de esporas alcanza su punto máximo a las 223horas después de inoculado el caldo TGE.

FIGURA 24. Curva de crecimiento, aparición de esporas y densidad óptica delinóculo de B. pumilus para el segundo ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0

20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

Lo

g1

0(U

FC

/ mL

)

D. O

. (A

bso

rba

nci

a)

Tiempo (horas)

B. pumilus - 2M3BE12

D.O. Directo Células totales Esporas


55

2. Bacillus licheniformis: 2M2B23

En la Tabla 9 podemos observar que la concentración inicial de células viables fue de37 UFC/mL obteniéndose 65 x 105 UFC/mL al término de la fase exponencial (a las 6horas de incubación). El proceso de esporulación se inició entre las 24 y 32 horas deincubación.

El mayor valor obtenido en las lecturas de densidad óptica fue 1.138 correspondiente alas 48 horas de incubación.

En la Figura 25 se ha representado la variación del logaritmo de UFC/mL en el tiempodonde se aprecia el incremento de las células esporuladas a través de las horas. Elrecuento de células totales se empleó para determinar el porcentaje de esporulación.

TABLA 9. Densidad óptica, recuento directo, recuento de células totales yrecuento de esporas del inóculo de B. licheniformis para el segundo ensayo (28 ±1º C, pH=7)

Tiempo D.O.600nm. Recuento Directo Recuento de Células totales Recuento de Esporas

Horas Absorbancia (Cél/mL) Log10(Cél/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL) Esporas(%)

0 0.000 <1 0.000 37 1.567 <10 0.000 0.00%

3 0.002 11 x 104 5.033 - - - - -

6 0.007 60 x 104 5.781 65 x 105 6.813 <10 0.000 0.00%

9 0.263 17 x 105 6.225 - - - - -

12 0.569 20 x 105 6.294 10 x 107 8.004 <10 0.000 0.00%

24 0.483 40 x 105 6.602 22 x 107 8.338 <10 0.000 0.00%

32 0.592 51 x 105 6.703 75 x 107 8.875 15 1.185 13.35%

48 1.138 11 x 106 7.021 55 x 107 8.740 42 x 102 3.621 41.43%

55 1.025 12 x 106 7.072 - - - - -

73 0.865 17 x 106 7.220 26 x 107 8.415 25 x 104 5.405 64.23%

80 0.782 24 x 106 7.365 - - - - -

147 0.554 - - 96 x 106 7.982 18 x 106 7.257 90.91%

223 - - - 83 x 106 7.919 34 x 106 7.533 95.12%


56

FIGURA 25 Curva de crecimiento, aparición de esporas y densidad óptica delinóculo de B. licheniformis para el segundo ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

3. Bacillus subtilis / amyloliquefaciens: 2M2CE

En la Tabla 10 se muestran los resultados obtenidos durante el proceso de crecimientode B. subtilis / amyloliquefaciens en caldo TGE. Se observa que se alcanzó el 98.08%de esporulación a las 223 horas partiendo de una población con 68 x 10 UFC/mL. Suproceso de esporulación se dio entre las 12 y 24 horas después de la inoculación delcaldo TGE. Se puede observar también un rápido crecimiento de este microorganismollegando a su fase estacionaria antes de las 12 horas. El pico máximo de absorbanciase dio a las 32 horas.

La Figura 26 muestra el crecimiento de células (Log UFC/mL) con respecto al tiempode esporulación en caldo TGE donde se observa claramente que aproximadamente alas 223 horas se obtuvo cerca del 100% de esporulación.

012345678910

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

11.11.2

0 20 40 60 80

100

120

140

160

180

200

220

Lo

g 10(U

FC

/m

L)

D. O

. (

Ab

sor

ba

nc

i a)

Tiempo (horas)




57

TABLA 10. Densidad óptica, recuento directo, recuento de células totales yrecuento de esporas del inóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el segundoensayo (28 ± 1 ºC, pH=7)

Tiempo D.O.600nm. Recuento Directo Recuento de Células

totales Recuento de Esporas

Horas Absorbancia

(Cél/mL) Log10(Cél/mL)

(UFC/mL)

Log10(UFC/mL)

(UFC/mL)

Log10(UFC/mL)

Esporas(%)

0 0.000 <1 0.000 68 x 10 2.835 <10 0.000 0.00%

3 0.000 66 x 103 4.820 - - - - -

6 0.119 15 x 105 6.171 40 x 106 7.602 <10 0.000 0.00%

9 0.596 19 x 105 6.268 - - - - -

12 0.715 20 x 105 6.292 35 x 106 7.544 <10 0.000 0.00%

24 0.829 33 x 106 7.517 11 x 107 8.057 13 x 102 3.101 38.48%

32 1.196 26 x 106 7.413 40 x 107 8.602 32 x 102 3.500 40.68%

48 0.826 91 x 105 6.959 97 x 106 7.987 88 x 103 4.943 61.88%

55 0.739 14 x 106 7.160 - - - - -

73 0.701 14 x 106 7.143 46 x 106 7.664 46 x 104 5.660 73.85%

80 0.648 13 x 106 7.112 - - - - -

147 0.470 - - 45 x 106 7.653 67 x 105 6.829 89.23%

223 - - - 79 x 106 7.902 53 x 106 7.751 98.08%

FIGURA 26. Curva de crecimiento, aparición de esporas y densidad óptica delinóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el segundo ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

Log 1

0(U

FC

/ mL

)

D. O

. (A

bso

rban

cia)

Tiempo (horas)

B. subtilis / amyloliquefaciens - 2M2CE



58

4.2.3 TERCER ENSAYO PARA CURVAS DE CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO

1. Bacillus pumilus : 2M3BE12

En la Tabla 11 se pude observar que partiendo de una concentración inicial de 17UFC/mL células viables en caldo de cultivo TGE, se alcanzó una concentraciónmáxima de células a las 12 horas de incubación (11 x 107 UFC/mL), cantidad quepermaneció relativamente constante al finalizar el periodo de evaluación. Los datosobtenidos nos permiten calcular el tiempo de generación de dicha bacteria, que fue de0.531 horas. El ensayo nos permite apreciar también que el proceso de esporulaciónya se había iniciado a las 24 horas de inoculado el caldo (fase estacionaria del cultivo),llegando a contabilizarse 2 UFC/mL provenientes de esporas obtenidas luego detratamiento térmico y llegando hasta 62 x 106 UFC/mL pasadas 456 horas, lo cualrepresenta el 103.61% de esporulación.

TABLA 11. Densidad óptica, recuento de células totales y recuento de esporasdel inóculo de Bacillus pumilus para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

Tiempo(h)

Densidad Óptica(Absorbancia)

Recuento Células Totales Recuento EsporasEsporulación

(%)(UFC/mL) Log10(UFC/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL)

0 0.000 17 1.238 <10 0.000 0.00%

2.5 0.016 90 x 10 2.954 <10 0.000 0.00%

05 0.018 37 x 103 4.567 0.7 0.000 0.00%

7.5 0.021 48 x 104 5.679 1.0 0.000 0.00%

10 0.040 66 x 105 6.820 1.0 0.000 0.00%

12 0.161 11 x 107 8.041 1.0 0.000 0.00%

24 0.920 40 x 107 8.605 2.3 0.362 4.20%

28.5 0.977 11 x 107 8.041 23 1.362 16.93%

33 1.145 12 x 107 8.076 22 x 10 2.346 29.05%

49 0.301 13 x 107 8.100 20 x 10 2.301 28.41%

55.5 0.326 10 x 107 8.017 14 x 103 4.093 51.06%

74.5 0.294 66 x 106 7.820 15 x 104 5.170 66.12%

119 0.29 11 x 107 8.025 69 x 103 4.840 60.31%

151 0.293 66 x 106 7.869 70 x 104 5.845 74.28%

175 0.325 62 x 106 7.792 44 x 105 6.644 85.27%

293 - 71 x 106 7.851 12 x 106 7.091 90.32%

319 - 67 x 106 7.826 20 x 106 7.305 93.35%

343 - 12 x 107 8.093 18 x 106 7.248 89.55%

367 - 95 x 106 7.978 32 x 106 7.507 94.09%

391 - 82 x 106 7.914 27 x 106 7.431 93.90%

456 - 33 x 106 7.519 62 x 106 7.790 103.61%


59

Las mediciones de la densidad óptica, fueron casi imperceptibles durante las primerashoras de incubación del medio, mientras las mayores concentraciones se obtuvieronentre las 24 y 33 horas de evaluación, periodo en el que según el recuento de célulasviables ya se había alcanzado la fase estacionaria; sin embargo, mediciones posterioresrevelan una disminución de la turbidez del medio de cultivo, algo que podría deberse ala formación de agregados celulares y precipitados en el medio.

La Figura 27 muestra el crecimiento de células (Log UFC/mL) con respecto al tiempode esporulación en caldo TGE donde se observa claramente que aproximadamente alas 391 horas se obtuvo cerca del 100% de esporulación.

FIGURA 27. Curva de crecimiento, producción de esporas y densidad óptica delinóculo de B. pumilus para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

2. Bacillus licheniformis: 2M3BE23

En este ensayo la concentración inicial de células viables fue de 9 UFC/mL y la fasede crecimiento exponencial se prolongó por 12 horas, alcanzando 13 x 106 UFC/mL yobteniéndose 97 x 106 UFC/mL después de 456 horas. El tiempo de generacióncalculado para B. licheniformis es: 0.585 horas. En el transcurso de la faseestacionaria, a partir de las 24 de horas de incubación, se pudo apreciar la aparición deesporas en una concentración de 1.9 UFC/mL y llegando a 33 x 106 UFC/mL a partirde esporas después de 456 horas. De los microorganismos estudiados, es el queesporula más lentamente.

La Tabla 12 y la Figura 28 muestran el crecimiento de células (Log UFC/mL) conrespecto al tiempo de esporulación en caldo TGE donde se aprecia que en la medidade la densidad óptica, se pudieron observar picos a las 49 y 119 horas de incubación.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

0

50 100

150

200

250

300

350

400

450

D. O

. (A

bso

rba

nci

a)

Lo

g 10

(UF

C/ m

L)

Tiempo (horas)

B. pumilus - 2M3BE12

Recuento Esporas Recuento Células Totales D.O.


60

TABLA 12. Densidad óptica, recuento de células totales y recuento de esporas delinóculo de B. licheniformis para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

Tiempo(h)

Densidad Óptica(Absorbancia)

Recuento de Células Totales Recuento de EsporasEsporulación

(%)(UFC/mL)Log10(UFC/mL

)(UFC/mL)

Log10(UFC/mL)

0 0.000 9 0.930 <10 0.000 0.00%

2.5 0.019 11 x 102 3.043 <10 0.000 0.00%

05 0.016 14 x 103 4.143 <10 0.000 0.00%

7.5 0.011 15 x 104 5.188 <10 0.000 0.00%

10 0.019 29 x 105 6.462 <10 0.000 0.00%

12 0.081 13 x 106 7.107 <10 0.000 0.00%

24 0.316 28 x 106 7.447 1.9 0.279 3.74%

28.5 0.417 54 x 106 7.732 2.8 0.447 5.78%

33 0.387 65 x 106 7.813 1.0 0.000 0.00%

49 0.700 27 x 107 8.433 30 1.477 17.52%

55.5 0.546 28 x 107 8.450 10 x 10 2.000 23.67%

74.5 0.76 22x 108 9.348 40 x 102 3.602 38.53%

119 0.943 32 x 107 8.498 43 x 104 5.630 66.27%

151 0.778 24 x 107 8.382 21 x 103 4.322 51.57%

175 0.753 10 x 106 7.004 60 x 104 5.778 82.49%

293 - 12 x 106 7.079 60 x 104 5.778 81.62%

319 - 64 x 106 7.806 88 x 104 5.944 76.15%

343 - 95 x 106 7.978 12 x 105 6.086 76.29%

367 - 84 x 106 7.924 19 x 105 6.274 79.18%

391 - 12 x 107 8.072 20 x 105 6.299 78.03%

456 - 97 x 106 7.987 13 x 106 7.128 89.24%


61

FIGURA 28. Curva de crecimiento, producción de esporas y densidad óptica delinóculo de B. licheniformis para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

3. Bacillus subtilis / amyloliquefaciens: 2M2CE

En la Tabla 13 se pudo observar que la concentración inicial de células viables fue de11 UFC/mL, obteniéndose 69 x 106 UFC/mL al término de la fase exponencial (a las10 horas de incubación). Su tiempo de generación fue de 0.442 horas, por lo quepuede afirmarse que B. subtilis / amyloliquefaciens, posee el menor tiempo degeneración respecto a las otras cepas estudiadas (Tabla 14). El proceso deesporulación de B. subtilis / amyloliquefaciens se inicia entre las 24 y 28.5 horas deincubación.

La mayor densidad óptica se dio a las 33 horas de incubación (A= 1.290), luego de locual declina dado la aparición de precipitados en el caldo TGE.

La Figura 29 muestra el crecimiento de células (Log UFC/mL) con respecto al tiempode esporulación en caldo TGE.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

0 50

100

150

200

250

300

350

400

450

D. O

. (A

bso

rba

nci

a)

Lo

g 10

(UF

C/ m

L)

Tiempo (horas)




62

TABLA 13. Densidad óptica, recuento de células totales y recuento de esporasdel inóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el tercer ensayo (28 ± 1º C,pH=7)

Tiempo(h)

D. O.(Absorbancia)

Recuento de Células Totales Recuento de Esporas Esporulación(%)(UFC/mL) Log10(UFC/mL) (UFC/mL) Log10(UFC/mL)

0 0.000 11 1.03 <10 0.00 0.00%

2.5 0.018 56 x 10 2.75 <10 0.00 0.00%

05 0.017 67 x 103 4.84 <10 0.00 0.00%

7.5 0.052 22 x 105 6.33 <10 0.00 0.00%

10 0.455 69 x 106 7.84 <10 0.00 0.00%

12 0.639 20 x 106 7.31 <10 0.00 0.00%

24 0.934 15 x 107 8.18 0.2 0.00 0.00%

28.5 1.094 97 x 106 7.99 11 x 10 2.04 25.54%

33 1.290 91 x 106 7.96 17 x 102 3.23 40.64%

49 0.933 87 x 106 7.94 26 x 103 4.42 55.70%

55.5 0.838 14 x 107 8.14 11 x 104 5.05 62.10%

74.5 0.782 11 x 107 8.05 82 x 103 4.91 61.05%

119 0.673 38 x 106 7.58 36 x 105 6.56 86.50%

151 0.573 28 x 106 7.45 71 x 104 5.85 78.57%

175 0.551 17 x 106 7.238 34 x 105 6.531 90.24%

293 - 40 x 106 7.602 14 x 106 7.152 94.08%

319 - 36 x 106 7.556 14 x 106 7.140 94.49%

343 - 61 x 106 7.785 21 x 106 7.330 94.16%

367 - 30 x 106 7.477 18 x 106 7.248 96.94%

391 - 59 x 106 7.771 17 x 106 7.236 93.11%

456 - 19 x 106 7.279 16 x 106 7.212 99.09%


63

FIGURA 29. Curva de crecimiento, producción de esporas y densidad óptica delinóculo de B. subtilis / amyloliquefaciens para el tercer ensayo (28 ± 1º C, pH=7)

TABLA 14. Tiempo de generación de los microorganismos ensayados

Especie Tiempo de Generación (h)

B. pumilus 0.531

B. licheniformis 0.585

B. subtilis / amyloliquefaciens 0.442

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

0 50

100

150

200

250

300

350

400

450

D. O

. (A

bso

rba

nci

a)

Lo

g 10

(UF

C/ m

L)

Tiempo (horas)

B. subtilis / amyloliquefaciens - 2M2CE



64

4.2. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE BACILLUS SP.

Con el fin de estandarizar la técnica de extracción de DNA empleando el Kit AXYGEN, serealizaron extracciones del DNA de 171 cepas de Bacillus. Estos ensayos se realizaron con elapoyo del Dr. Ernesto Ormeño Orrillo, del Centro de Ciencias Genómicas, de la UniversidadAutónoma de México (Cuernavaca). Se realizaron varios ensayos hasta determinar lametodología que se muestra en el acápite de materiales y métodos.

En la verificación de la calidad del DNA se obtuvieron imágenes semejantes a la Figura 30.En el centro aparece el marcador fago Lambda (Fermentas Inc. USA) y hacia la derecha eizquierda las bandas correspondientes a los DNA extraídos, en las que se observa que a mayorconcentración las bandas aparecen más definidas. En general, la verificación de la calidad deDNA extraído permitió estimar la concentración adecuada del mismo para los ensayos deamplificación, empleándose entre 1 y 8 μL del lisado para las pruebas de amplificación BOX-PCR.

FIGURA 30. Gel de control del DNA extraído, cepas 9-18

En la Figura 31, se aprecia el gel revelado con perfiles de amplificación BOX –PCR, donde seobserva el marcador molecular Gene Ruler 1 kb DNA Ladder Plus (Fermentas Inc. USA) enel centro (M) y hacia los lados los perfiles obtenidos, para las cepas codificadas, de 1 a 6 y 67con diferentes disposiciones de bandas, lo que significa que se trata de especies diferentes.


65

FIGURA 31: Perfil de amplificación BOX de diferentes cepas de Bacillus sp. (izquierda),con marcador GeneRuler 1kb DNA Ladder Plus (derecha), el cual permite determinar elpeso molecular aproximado de cada una de las bandas obtenidas, es una herramientafundamental al momento de agrupar perfiles de diferentes geles, ya que permite la asociaciónde bandas comunes de acuerdo a su posición con respecto al marcador.

5000 pb

1500 pb

500 pb

1000 pb

75 pb


66

Cuando se quiere comparar múltiples muestras, de geles diferentes, uno con otro, los mejoresresultados son obtenidos cuando todos los parámetros experimentales son estandarizados.Esto es especialmente importante cuando existe o se genera una gran base de información o senecesita comparar información generada por diferentes laboratorios (Rademaker J. y BruijnF., 1997). Las condiciones estandarizadas deberían incluir la preparación y procesamiento dela muestra, uso de condiciones de crecimiento similares, el mismo método de aislamiento deDNA y el uso de las mismas condiciones REP – PCR. El uso de condiciones estandarizadasde electroforesis y el tamaño de los marcadores es esencial, así como el modo de capturar laimagen del revelado. En el desarrollo de la metodología empleada en este trabajo se cuidó deseguir todas las medidas anteriormente numeradas. Mediante ensayos previos, con algunas delas cepas aisladas, empleadas en este trabajo, se determinó la relación que existe entre laintensidad de banda obtenida en el gel de control de calidad y la cantidad de DNA óptimapara las pruebas de amplificación BOX. Las cepas así caracterizadas inicialmente sirvieron decontrol para todos los ensayos subsiguientes.

De las 224 cepas aisladas en el proyecto anterior (Velezmoro et al., 2007), se extrajo el DNAde 171 de ellas y se obtuvo el perfil BOX - PCR de 169 cepas (71.88 % del total). Cabeseñalar que la diferencia entre el número de perfiles y el total de cepas aisladas se debió a lasdificultades para la obtención de bandas bien definidas en los perfiles de amplificación BOX,por lo que se dio preferencia a la obtención de perfiles de las cepas aisladas a partir deespárragos (Tabla 15)

TABLA 15. Cantidad de perfiles de amplificación BOX-PCR obtenidos a partir de lascepas aisladas en el proyecto anterior (Velezmoro et al., 2007)

MUESTREOCEPAS AISLADAS DNA EXTRAÍDO PERFILES BOX - PCR

Suelo Espárragos Total Suelo Espárragos Total Suelo Espárragos Total

1eraEtapa

M-1 23 10 33 23 10 33 23 10 33M-2 52 9 61 40 8 48 40 8 48

M-3 32 9 41 32 8 40 31 8 39

2daEtapa

M-1 0 10 10 0 6 6 0 5 5

M-2 14 31 45 12 27 39 12 27 39

M-3 6 28 34 1 4 5 1 4 5

Total 224 171 169

Del total de perfiles obtenidos el 63.31 % provinieron del suelo de cultivo de espárragoblanco y el 36,69 % del espárrago en diferentes puntos de la cadena productiva de conservasdel mismo.

En la Tabla 16, mostrada a continuación, se muestran los agrupamientos de las cepasensayadas de acuerdo a sus perfiles de amplificación BOX-PCR. Se obtuvieron 29agrupamientos de cepas (denominados de la letra A a la X), el grupo correspondiente a ladenominación K, fue el de mayor frecuencia, con 31 representantes, seguidos del grupo A,dentro del cual se agruparon 22 cepas y el grupo M con 14 cepas. 7 perfiles fueron únicos yno fueron agrupados con otros.


67

TABLA 16. Agrupamientos de 169 perfiles de amplificación BOX-PCR

GRUPO COD. DE CEPA COD. PERFIL

A

M3BE32 220M3BE36 252M1BE3 642M1BE4 262M2BE1 2262M2BE4 2292M2BE10 2342M2BE14 2372M2BE16 2382M2BE22 2442M2BE25 2462M2BE26 2472M2BE28 2482M2BE30 2502M2BE31 2512M2BE33 2522M2BE40 2592M2BE41 2602M2BE42 2612M2CE 11

A'2M3BE14 232M3BE19 4

B

M1BE4 142M1BE11 146M1BE15 149M1BE16 150M1BE20 154M1BE22 166

B'M1BE30 172M1BE31 173

C

M1BE32 180M1BE33 181M2BE8 187M2BE10 188M2BE11 189M2BE17 162M2BE26 201M2BE27 202M2BE32 205

DM2BE34 207M2BE36 209M2BE37 210


D

M2BE40 211M2BE50 136M2BE53 123M2BE59 124M3BE10 130M3BE11 113M3BE30 122M3BE31 131

D' M2BE30 204

E

M3BE4 128M3BE18 117M3BE19 118M3BE23 1192M2BE19 2412M2BE39 2582M2BE20 2422M2BE34 253M2BE33 206M2BE35 208M2BE47 213M2BE52 138M2BE60 139

F

M2BE61 140M3BE1 125M3BE22 216M3BE25 45M3BE26 218M3BE27 120M3BE35 223M3BE38 2242M2BE21 2432M2BE36 2552M2BE37 256

G

2M2BE29 249M1BE24 168M2BE5 185M1BE8 143

G´

M1BE18 152M1BE25 169M1BE27 171M2BE4 184M2BE21 164


68


G´ M2BE28 203

HM3BE33 221M3BE34 2222M2BE38 257

I M2BE48 135

J

M1BE21 165M2BE41 17M2BE49 282M2BE35 254

J'M1BE28 179M2BE15 191M1BE29 197

K

2M2BE13 2362M2BE17 2392M1BE2 202M2BE5 2302M2BE44 2632M3BE12 92M2BE6 231M1BE9 144M2BE16 161M2BE25 195M3BE8 112M3BE29 2192M2BE2 2272M2BE9 2332M2BE12 2352M2BE43 262M1BE2 155M3BE3 127M1BE5 175M1BE7 177M1BE12 147M1BE14 178M1BE23 167M3BE6 110M3BE7 111M3BE12 24M3BE28 121M3BE39 132M3BE40 133M3BE41 134

2M2BE3 228


L M3BE13 114

M

2M3BE23 10M1BE6 176M2BE1 182M2BE22 192M2BE23 193M2BE24 194M2BE7 198M3BE21 22M1BE6 19M3BE20 212M3BE14 23M2BE55 502M1BE5 62M2BE56 68

NM3BE5 109M3BE17 116M2BE51 137

O

M1BE13 148M1BE17 151M1BE19 153M2BE13 159M2BE14 160M1BE26 170

P

M2BE42 2122M2BE7 2322M2BE18 2402M2BE23 245

Q

M3BE2 126M2BE9 199M2BE12 190M2BE19 200

RM1BE10 145M3BE24 217

S M2BE18 163

TM3BE14 214M3BE16 215

U M3BE15 115V M2BE6 186W M1BE3 141

XM2BE3 183M1BE1 196


69

Las 34 cepas, representantes de cada agrupamiento (Ver formato de envío a secuenciamientoen la sección Anexos) fueron enviadas a secuenciar y como producto de la caracterizaciónmolecular se identificaron 7 especies de Bacillus y 1 de Paenibacillus. Para la confirmaciónde las especies identificadas mediante el secuenciamiento realizado por Macro Gen Inc. (Seúl,Korea), se elaboró el dendograma o árbol filogenético mostrado en la Figura 32.

En la Tabla 17 se muestran los resultados de la identificación molecular de las cepassecuenciadas y trabajadas de acuerdo a lo explicado en la metodología (ver 3.4.7Secuenciamiento).

TABLA 17. Identificación de cepas secuenciadas y su procedencia

ESPECIE CÓD. DEPERFIL

CEPASECUENCIADA PROCEDENCIA

B. subtilis

011 2M2CE Espárragos (control comercial)113 M3BE11 Suelo149 M1BE15 Suelo172 M1BE30 Suelo117 M3BE18 Espárragos (cosecha)120 M3BE27 Suelo143 M1BE8 Suelo184 M2BE4 Suelo208 M2BE35 Suelo213 M2BE47 Suelo203 M2BE28 Espárragos (cosecha)204 M2BE30 Suelo123 M2BE53 Suelo138 M2BE52 Suelo140 M2BE61 Suelo

B. subtilis / B. amyloliquefaciens135 M2BE48 Suelo165 M1BE21 Espárragos (cosecha)179 M1BE28 Espárragos (cosecha)

B. pumilus009 2M3BE12 Espárragos (envasado, 3h espera)147 M1BE12 Suelo114 M3BE13 Suelo

B. licheniformis

010 2M3BE23 Espárragos (recepción)109 M3BE5 Suelo159 M2BE13 Suelo212 M2BE42 Espárragos (cosecha)

B. megaterium126 M3BE2 Suelo145 M1BE10 Suelo163 M2BE18 Suelo214 M3BE14 Suelo

B. thurigensis / B. cereus / B.anthracis (Grupo cereus)

115 M3BE15 Suelo

B. endophyticus 186 M2BE6 Suelo

Paenibacillus polymyxa 141 M1BE3 Suelo183 M2BE3 Suelo

N.D. 129 M3BE9 Suelo

N.D. : No determinado


70

M3BE11 113

M3BE18 117

M2BE53 123

M1BE15 149

EF433402 Bsub spizizenii BCRC17366

M1BE30 172

M2BE30 204

AF318900 Bsub spizizenii N10 W23 derivat

EF433403 Bsub spizizenii BCRC10447

2M2CE 011

EF433405 Bmoj BCRC17124

DQ993678 Bmoj BCRC17531

DQ993670 Baxa CIP108772

DQ993672 Bmal CECT5687

M2BE52 138

M3BE27 120

M2BE4 184

M1BE8 143

EF423595 Bsub subtilis BCRC14716


M2BE47 213


M2BE28 203

AL009126 Bsub subtilis 168 rrnA

M2BE61 140

M2BE35 208

EF433406 Bamy BCRC11601

DQ993675 Bamy BCRC17038


EF433404 Bval BCRC17183


EF433407 Bvel BCRC17467

M1BE28 179

M2BE48 135

M1BE21 165

EF433409 Batr BCRC17123

DQ993677 Batr BCRC17530

M3BE5 109

M2BE42 212

EF433411 Bson BCRC17416

DQ993679 Bson BCRC17532

EF433410 Blic BCRC11702

2M3BE23 010

EF423609 Blic BCRC14353

M2BE13 159

2M3BE12 009

M1BE12 147

M3BE13 114

AY876289 Bpum ATCC7061

AF234854 Bsaf FO 036b

AE017334 Bant Ames Ancestor Ba16SA

M3BE15 115

AF290545 Bthu ATCC10792

DQ207729 Bcer CCM2010

AB021192 Bmyc ATCC6462

Z84578 Bwei WSBC10204T

AF295302 Bend

M2BE6 186

D16273 B meg IAM13418

M2BE18 163

M3BE2 126

M1BE10 145

M3BE14 214

NBRC15309 Ppol

M1BE3 141

M2BE3 183

99

96

100

100

96

94

87

71

100

87

36

40

100

100

91100

99

66

10

60

49

49

46

53

43

26

28

26

74

66

58

40

51

71

70

85

99

99

51

43

100

61

4750

0.05

FIGURA 32. Dendograma ó arbol filogenético basado en el gen ribosomal 16S para 34cepas secuenciadas de Bacillus

FIGURA 32. Dendograma ó arbol filogenéticobasado en el gen ribosomal 16S para 34 cepassecuenciadas de BacillusSe observa la posición de las cepas evaluadas respecto a lascepas de referencia dentro de los géneros Bacillus yPaenibacillus. El árbol se construyó mediante el algoritmoNeighbour-Joining (Saitou & Nei, 1987) a partir de unamatriz de distancia corregida por sustitucionesmúltiples por el método Jukes & Cantor (1969).


71

Se decidió reagrupar los 169 perfiles BOX-PCR de acuerdo a su similitud con los de las cepassecuenciadas e identificadas. En el caso de B. subtilis se obtuvieron cinco grupos,denominados S1, S2, S3, S4 y S5. Se presentaron 2 grupos diferentes para las cepasidentificadas como B. megaterium y P. polymyxa, en tanto que las demás especies únicamentepresentaron un perfil. Los agrupamientos dentro de cada especie se diferenciaron de acuerdo ala intensidad de bandas específicas del perfil (Figura 33)

FIGURA 33. Agrupamiento de cepas de acuerdo a sus perfiles de amplificación BOX-PCR para su identificación

A. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. subtilis - Grupo S1

B. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. subtilis - Grupo S2


72

C D

Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. subtilis C. Grupo S3, D. Grupo S4

E. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. subtilis - Grupo S5


73

F. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. pumilus

G. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. amyloliquefaciens


74

H. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. licheniformis

Grupo M Grupo M1

I. Perfiles de amplificación BOX – PCR de B. megaterium


75

J K L

J. Perfiles BOX de Bacillus sp. (Grupo cereus), K. Perfiles BOX de B. endophyticus, L.Perfiles BOX de Paenibacillus polymyxa

B. subtilis fue la especie con la mayor frecuencia alcanzada (52.07%), seguida de B. pumilus(18.93%) y B. licheniformis (15.98%), también fueron encontrados B. megaterium (5.33%),B. subtilis / amyloliquefaciens (4.73%), Bacillus sp. (Grupo cereus) (0.59%), B. endophyticus(0.59%). Así mismo, Paenibacillus polymyxa representó el 1.78% de las cepas caracterizadas(Tabla 18)

Bacillus megaterium, Bacillus sp. (Grupo cereus), B. endophyticus y Paenibacillus polymyxasólo fueron identificados en suelo; en tanto las demás especies de Bacillus fueron encontradastanto en suelo como en espárragos en las diferentes etapas en la cadena productiva.

Dentro de la especie identificada como Bacillus subtilis, el grupo S2 fue el de mayorincidencia (29 cepas); el 89.7% de estas provinieron de muestras de suelo, todos de la primeraetapa de muestreos del proyecto anterior (Velezmoro et al., 2007). El grupo S2 (Figura 33 B)se caracterizó por poseer una banda por debajo de los 5000 pb, otra por debajo de los 1500 kby 3 bandas por encima de los 2000 pb respecto al marcador Gen Ruler DNA Ladder Plus 1kb.

Dentro del grupo S1 de esta especie se agruparon 22 cepas y el mayor porcentaje de ellas(63.64%) se aislaron a partir de muestras de espárragos en las diferentes etapas de la cadenade envasado de conservas. El perfil presenta dos bandas características y bien definidas pordebajo de los 1500 pb y dos bandas tenues por encima de los 2000 pb. En los carriles 220,224, 229, 234, 237, 238 (Figura 33 A) las bandas de menor peso molecular presentaron muy


76

baja intensidad. Cabe señalar, que la cepa correspondiente al carril 011, pertenece a la cepa2M2CE, identificada anteriormente y enviada a secuenciar, confirmando la identidad obtenidamediante el kit de pruebas bioquímicas API 50 CHB. Esta cepa fue utilizada en las pruebas decurvas de crecimiento.

El grupo S3 estuvo constituido por solo 4 perfiles (Figura 33 C), es el de menor cantidad derepresentantes de la especie B. subtilis, todos provenientes de espárragos. Los perfilespresentaron una banda muy definida por arriba de 1500 pb, otra por encima de los 2000 pb yuna a la altura de los 4000 pb aproximadamente. Además un patrón de bandas múltiples pordebajo de los 1000 pb.

La especie B. subtilis del grupo S4 presentó 20 representantes, 16 de los cuales fueron desuelo (80%). Los perfiles se caracterizaron por la presencia de 2 bandas por debajo de los2000 pb (Figura 33 D), además presentaron múltiples bandas equidistantes entre los 1500 y700 pb, las cuales no fueron bien percibidas en los perfiles correspondientes a los carriles 140,218, 223 y 224. En los carriles 253 y 255 las 2 bandas características mencionadasanteriormente no tienen la misma intensidad que el resto de carriles.

El grupo S5 presentó 13 cepas representantes, de las cuales 10 provinieron de muestras desuelo (76.9%). Su patrón de bandas fue muy parecido al del grupo S4, sin embargo, no seencontraron las múltiples bandas equidistantes características del grupo anterior, en cambiopresentó 2 bandas tenues a la altura de los 1000 pb (Figura 33 E).

El grupo de perfiles identificados como B. pumilus (Figura 33 F) estuvo constituido por 32cepas, 16 provenientes de espárragos y 16 de muestras de suelo. Los perfiles presentaron unarreglo característico constituido por 3 bandas bien definidas, la de mayor intensidadlocalizada a la altura de los 1500 pb, otra entre 1500 y 2000 pb y la última por debajo de los1000 pb. También posee una cuarta banda definida por debajo de los 700 pb. En los carriles167 y 177, esta no se encuentra muy marcada.

Los perfiles identificados como B. amyloliquefaciens agruparon 8 cepas (Figura 33 G), 5 delas cuales provinieron de cepas de aislamientos de espárragos. Se caracterizaron por lapresencia de 3 bandas entre 2000 y 3000 pb y una banda bien definida entre 4000 y 5000 pb.Otras 2 bandas de bajo peso molecular se ubican por arriba de 500 pb. En la Figura 33 G, lascepas de los carriles 017 y 028 muestran algunas bandas de alto peso molecular muytenuemente.

Se obtuvieron 27 perfiles BOX-PCR de la especie B. licheniformis (14 de suelo y 13 deespárragos). Estos mostraron un arreglo compuesto de 3 bandas muy definidas entre 5000 y3000 pb, otro, también constituido de 3 bandas, que incluye una de mayor intensidad a laaltura de los 2000 pb. Los perfiles de los carriles 116, 137, 148, 151 muestran un barrido debandas, por lo cual los perfiles se aprecian no muy definidos (Figura 33 H).

El grupo identificado como B. megaterium, agrupó 9 cepas, todas ellas provenientes demuestras de suelo del cultivo de espárragos. Se observaron 2 grupos de perfiles para estaespecie. El grupo M, constituido por 6 representantes, posee dos bandas a la altura de 3000pb, Además otras dos bandas muy marcadas a 2000 y 1500 pb. El grupo M1 tambiéncomparte las mismas bandas representativas que el grupo M, sin embargo presentaron ademásun arreglo de múltiples bandas por debajo de los 1000 pb.


77

La especie Bacillus sp. (Grupo cereus) tuvo un representante dentro de las 169 cepasevaluadas, en este perfil se pudo observar 2 bandas por debajo de 2000 pb y una banda muydefinida por debajo de los 1000 pb.

B. endophyticus tuvo un solo representante, el perfil mostró una banda gruesa ligeramente porencima de los 1000 pb, otra banda entre los 1500 pb y 2000 pb y una tercera a los 3000 pb.

La especie identificada como Paenibacillus polymyxa se caracteriza por poseer una bandaentre los 4000 y 5000 pb, otra ligeramente mayor a 3000 pb y 3 bandas entre los 1500 kb y1000 kb; presenta además una banda muy definida entre 500 y 700 pb. La especie identificadaagrupó 3 cepas aisladas de muestras de suelo.

TABLA 18. Especies identificadas y su procedencia de aislamiento

Especie GRUPOS

Procedencia

Total PorcentajeTotalSuelo Espárrago

Cantidad Porcentaje Cantidad Porcentaje

B. subtilis

S1 8 4,73% 14 8,28% 22

S2 26 15,38% 3 1,78% 29

S3 0 0,00% 4 2,37% 4

S4 16 9,47% 4 2,37% 20

S5 10 5,92% 3 1,78% 13

60 35,50% 28 16,57% 88 52,07%

B. subtilis /amyloliquefaciens

Amy 3 1,78% 5 2,96% 8

3 1,78% 5 2,96% 8 4,73%

B. pumilusP 16 9,47% 16 9,47% 32

16 9,47% 16 9,47% 32 18,93%

B. licheniformisL 14 8,28% 13 7,69% 27

14 8,28% 13 7,69% 27 15,98%

B. megateriumM 6 3,55% 0 0,00% 6

M1 3 1,78% 0 0,00% 3

9 5,33% 0 0,00% 9 5,33%

Bacillus sp. (Grupocereus)

GC 1 0,59% 0 0,00% 1

1 0,59% 0 0,00% 1 0,59%

B. endophyticusE 1 0,59% 0 0,00% 1

1 0,59% 0 0,00% 1 0,59%

Paenibacilluspolymyxa

Pol 1 0,59% 0 0,00% 1

Pol1 2 1,18% 0 0,00% 2

3 1,78% 0 0,00% 3 1,78%TOTAL 107 63,31% 62 36,69% 169 100.00%


78

En la Tabla 19, se muestra la caracterización morfológica y procedencia de cada una de lascepas identificadas, así como la codificación perteneciente al informe del ProyectoPROCOM–CONCYTEC 2006–2007, realizado por Velezmoro et al (2007).

Durak et al. refieren que históricamente los géneros Bacillus y Clostridium han sidoconsiderados los únicos géneros capaces de formar esporas resistentes al calor de importanciaen microbiología de alimentos. Sin embargo, estudios recientes, han demostrado que muchosorganismos anteriormente clasificados dentro del género Bacillus, actualmente representan unnúmero de géneros dentro de la clase Bacilli. Se han definido por lo menos 12 nuevosgéneros de bacterias aerobias formadoras de esporas, incluyendo Paenibacillus (Ash et al.,1993), Brevibacillus (Shida et al., 1996), Geobacillus (Nazina et al., 2001) Amphibacillus(Niimura et al., 1990), Alicyclobacillus (Wisotzkey et al., 1992), Aneurinibacillus (Shida etal., 1996), Filobacillus (Schlesner et al., 2001), Halobacillus (Spring et al., 1996),Gracilibacillus, Salibacillus (Wainø et al., 1999) Ureibacillus (Fortina et al., 2001) yVirgibacillus (Heyndrickx et al., 1998). La especie Paenibacillus en particular se encuentrarelacionada a la contaminación de alimentos, ha sido reportado su aislamiento tanto deproductos leche fresca como tratada al calor (Scheldeman et al., 2004).

El grupo de B. subtilis (B. licheniformis, B. subtilis y B. pumilus) ha sido asociado con unrango de condiciones clínicas, tanto como deterioro de alimentos. Así mismo, B. anthracises una especie de Bacillus considerada patogénica para humanos y animales (US EPA, 1997).

B. licheniformis ha sido asociado a enfermedades sistémicas serias tales como septicemia,peritonitis y oftalmitis (Salkinoja-Salonen et al., 1999). La contaminación de alimentos por B.licheniformis está frecuentemente asociada con alimentos preparados y vegetales. Su periodode incubación es de 2 - 14 horas y el síntoma predominante es diarrea, con vómitos en lamitad de los casos (Lund, 1990; Tatzel et al., 1994; Granum & Baird-Parker, 2000)

Después de B. cereus, B. subtilis, es el más asociado con contaminación de alimentos,frecuentemente en carnes, productos de pastelería, platos de arroz con carne o productosmarinos; y en números superiores a 105 UFC/g se han reportado casos de enfermedades(Lund, 1990; Shinagawa, 1990; Granum & Baird-Parker, 2000). Se han investigado muchosepisodios de contaminación de alimentos por B. subtilis en Japón (Shinagawa, 1990) y elReino Unido (Lund, 1990). Los síntomas de los pacientes han sido vómitos en la mayoría delos casos y un corto periodo de incubación (Lund, 1990; Jenson & Moir, 2003)

Paenibacillus polymyxa se encuentra comúnmente asociado a alimentos vegetales endescomposición, degrada la pectina y los polisacáridos de las plantas, fijan nitrógeno bajocondiciones anaeróbicas. Sus colonias son mucosas y tienden a expandirse (Kenneth, 2008)


79

TABLA 19. Listado de cepas agrupadas por especie identificada y caracterización morfológica

A. Bacillus subtilis

Cód. dePerfil

Cód. deCepa

Procedencia Grupo(Perfil)

GrupoEsporogénico

Tamaño Forma Color(PBC)

Borde Textura Viraje(PBC)

142 M1BE4 Suelo S2 EMA grande aplanada blanco irregular seca no

143 M1BE8 Suelo S5 ETANA grande aplanada blanco irregular seca no

146 M1BE11 Suelo S2 EMANA grande aplanada morado irregular seca no

149 M1BE15 Suelo S2 EMA mediano convexa morado N.D. mucosa N.D.

150 M1BE16 Suelo S2 EMANA pequeño aplanado morado irregular seca no

152 M1BE18 Suelo S5 ETANA pequeño aplanada morado irregular seca no

154 M1BE20 Suelo S2 ETANA mediano aplanada morado irregular seca no

166 M1BE22 Suelo S2 ETANA pequeño aplanada amarillo irregular seca sí

168 M1BE24 Esparrago C. S5 ETANA pequeño redonda blanco irregular seca no

169 M1BE25 Suelo S5 ETANA pequeño redonda blanco irregular seca no

171 M1BE27 Suelo S5 ETANA pequeño aplanada amarillo irregular seca sí

172 M1BE30 Suelo S2 EMANA grande redonda morado irregular acuosa no

173 M1BE31 Suelo S2 EMANA grande aplanadas morado irregular seca no

180 M1BE32 Suelo S2 EMANA grande redondas blanco irregular acuosa no

181 M1BE33 Esparrago C. S2 ETANA grande aplanadas blanco irregular seca no

184 M2BE4 Suelo S5 EMA grande aplanada Blanco irregular seca no

185 M2BE5 Esparrago C. S5 EMA grande aplanada Blanco irregular seca no

187 M2BE8 Suelo S2 EMA mediano aplanada Blanco irregular seca N.D.


189 M2BE11 Suelo S2 EMA mediano aplanada Blanco irregular seca no


164 M2BE21 Suelo S5 ETANA pequeño redonda Blanco irregular seca no

201 M2BE26 Esparrago C. S2 EMANA mediano redonda Morado irregular seca no


80

Cód. dePerfil

Cód. deCepa Procedencia

Grupo(Perfil)

GrupoEsporogénico Tamaño Forma

Color(PBC) Borde Textura

Viraje(PBC)

202 M2BE27 Suelo S2 ETA mediano aplanada Blanco irregular seca no

203 M2BE28 Suelo S5 ETA pequeño redonda Blanco irregular seca no

204 M2BE30 Suelo S2 ETA grande aplanada Morado irregular seca no

205 M2BE32 Suelo S2 ETA grande aplanada Blanco irregular seca no

206 M2BE33 Suelo S4 EMA mediano aplanada Morado N.D. N.D. N.D.

207 M2BE34 Suelo S2 ETANA grande aplanada Blanco irregular seca no

208 M2BE35 Suelo S4 ETANA grande aplanada Morado irregular seca no

209 M2BE36 Suelo S2 ETANA grande aplanada Blanco irregular seca no

210 M2BE37 Suelo S2 EMANA grande aplanada Blanco irregular seca no

211 M2BE40 Suelo S2 EMANA mediano redonda Morado irregular acuoso no

213 M2BE47 Suelo S4 EMA mediano aplanada Blanco irregular seca no

136 M2BE50 Suelo S2 EMA grande aplanada Morado irregular seca no

138 M2BE52 Suelo S4 EMANA mediano redondas Morado irregular acuoso no

123 M2BE53 Suelo S2 ETA pequeño aplanada Amarillo irregular seca sí

124 M2BE59 Suelo S2 EMA N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.



125 M3BE1 Suelo S4 EMA mediano convexa morado N.D. acuosa N.D.

128 M3BE4 Esparrago C. S3 EMA grande aplanada blanco N.D. seca N.D.

130 M3BE10 Suelo S2 EMA grande aplanada morado N.D. seca N.D.

113 M3BE11 Suelo S2 EMA mediano convexa morado N.D. seca N.D.

117 M3BE18 Esparrago C. S3 ETA grande aplanada morado N.D. seca N.D.

118 M3BE19 Esparrago C. S3 ETA mediano convexa morado N.D. mucosa N.D.

216 M3BE22 Suelo S4 ETA grande aplanada morado N.D. seca N.D.

119 M3BE23 Esparrago C. S3 ETA grande convexa morado N.D. mucosa N.D.

45 M3BE25 Suelo S4 ETA pequeño aplanada morado N.D. seca N.D.


81

Cód. dePerfil

Cód. deCepa

ProcedenciaGrupo(Perfil)

GrupoEsporogénico

Tamaño FormaColor(PBC)

Borde TexturaViraje(PBC)

218 M3BE26 Suelo S4 EMANA mediano convexa blanco N.D. seca N.D.

120 M3BE27 Suelo S4 EMANA grande convexa morado N.D. acuosa N.D.

122 M3BE30 Esparrago H. S2 EMANA mediano convexa morado N.D. mucosa N.D.

131 M3BE31 Suelo S2 EMANA mediano convexa morado N.D. acuosa N.D.

220 M3BE32 Suelo S1 EMANA mediano convexa morado N.D. acuosa N.D.

221 M3BE33 Suelo S5 EMANA pequeño convexa blanco N.D. seca N.D.

222 M3BE34 Suelo S5 EMANA mediano convexa morado N.D. mucosa N.D.

223 M3BE35 Suelo S4 EMANA grande convexa morado N.D. seca N.D.

25 M3BE36 Suelo S1 EMANA mediano convexa blanco N.D. mucosa N.D.

224 M3BE38 Suelo S4 EMANA grande convexa morado N.D. mucosa N.D.

64 2M1BE3 Esparrago 3hrs. S1 EMA pequeño redondeada regular N.D. cremosa N.D.

26 2M1BE4 Esparrago 3hrs. S1 EMA mediano aplanada irregular N.D. seca/cremosa N.D.

226 2M2BE1 Esparrago R. S1 EMA grande aplanada irregular N.D. seca N.D.

229 2M2BE4 Esparrago H. S1 EMANA pequeño aplanada regular N.D. seca N.D.

234 2M2BE10 Esparrago 1hrs. S1 EMANA pequeño difusa irregular N.D. cremosa N.D.

237 2M2BE14 Esparrago H. S1 EMANA pequeño aplanada regular N.D. cremosa N.D.

238 2M2BE16 Esparrago 1hrs. S1 EMANA mediano aplanada irregular N.D. seca N.D.

241 2M2BE19 Esparrago 1hrs. S4 EMANA pequeño aplanada regular N.D. cremosa N.D.

242 2M2BE20 Esparrago H. S4 EMANA pequeño aplanada regular N.D. cremosa N.D.

243 2M2BE21 Suelo S4 ETA grande aplanada regular N.D. cremosa N.D.

244 2M2BE22 Suelo S1 EMANA grande aplanada irregular N.D. seca/cremosa N.D.

246 2M2BE25 Suelo S1 EMANA mediano traslúcida irregular N.D. mucosa N.D.

247 2M2BE26 Suelo S1 EMANA mediano redondeada regular N.D. seca N.D.

248 2M2BE28 Suelo S1 EMANA grande aplanada irregular N.D. mucosa N.D.

249 2M2BE29 Esparrago 3hrs. S5 EMANA grande aplanada irregular N.D. cremosa/seca N.D.

250 2M2BE30 Esparrago 3hrs. S1 EMANA mediano convexa irregular N.D. seca N.D.

251 2M2BE31 Esparrago R. S1 EMANA mediano aplanada irregular N.D. cremosa N.D.


82

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



252 2M2BE33 Esparrago R. S1 EMA mediano aplanada irregular N.D. seca/mucosa N.D.

253 2M2BE34 Esparrago R. S4 EMA mediano aplanada irregular N.D. seca N.D.

255 2M2BE36 Suelo S4 EMA mediano aplanada irregular N.D. cremosa N.D.

256 2M2BE37 Suelo S4 EMA mediano aplanada regular N.D. cremosa N.D.

257 2M2BE38 Suelo S5 EMA mediano aplanada irregular N.D. cremosa N.D.

258 2M2BE39 Esparrago B. S4 EMANA pequeño redondeada regular N.D. cremosa N.D.

259 2M2BE40 Suelo S1 EMANA pequeño redondeada regular N.D. cremosa N.D.

260 2M2BE41 Esparrago 1hrs. S1 EMANA pequeño redondeada regular N.D. cremosa N.D.

261 2M2BE42 Esparrago R. S1 EMANA pequeño redondeada regular N.D. cremosa N.D.

11 2M2CE CPB S1 CE mediano redondeada irregular N.D. seca/cremosa N.D.

23 2M3BE14 Suelo S1 ETA grande aplanada irregular N.D. seca/mucosa N.D.

4 2M3BE19 Esparrago 1hrs. S1 EMANA grande aplanada irregular N.D. seca N.D.

B. Bacillus pumilus

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



155 M1BE2 Suelo P EMA mediano aplanada blanco irregular seca no

127 M3BE3 Suelo P EMA mediano convexa morado N.D. seca N.D.

175 M1BE5 Suelo P EMA mediano aplanada blanco irregular seca no

177 M1BE7 Suelo P ETANA grande aplanada blanco irregular seca no

144 M1BE9 Esparrago C. P EMANA grande aplanada morado irregular seca no

147 M1BE12 Suelo P EMA pequeño redonda blanco irregular mucosa no

178 M1BE14 Suelo P EMA pequeño aplanada amarillo irregular seca sí

167 M1BE23 Suelo P ETANA pequeño redonda amarillo irregular seca sí


83

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



161 M2BE16 Esparrago C. P EMA grande aplanada Blanco irregular seca no

195 M2BE25 Esparrago C. P ETANA pequeño redonda Blanco irregular seca no

110 M3BE6 Suelo P EMA pequeño aplanada morado N.D. seca N.D.


112 M3BE8 Esparrago C. P EMA pequeño aplanada morado N.D. seca N.D.


114 M3BE13 Suelo P EMA mediano aplanada N.D N.D. seca N.D.

121 M3BE28 Suelo P EMANA mediano convexa morado N.D. mucosa N.D.

219 M3BE29 Esparrago C. P EMANA pequeño convexa morado N.D. mucosa N.D.

132 M3BE39 Suelo P EMANA pequeño N.D. morado N.D. mucosa N.D.

133 M3BE40 Suelo P EMANA mediano N.D. morado N.D. mucosa N.D.

134 M3BE41 Suelo P EMANA mediano N.D. morado N.D. mucosa N.D.

20 2M1BE2 Esparrago 3hrs. P EMA mediano redondeada N.D. regular cremosa N.D.

227 2M2BE2 Esparrago R. P EMANA grande redondeada N.D. regular cremosa N.D.

228 2M2BE3 Suelo P ETA grande difusa N.D. irregular seca N.D.

230 2M2BE5 Esparrago 3hrs. P EMANA pequeño aplanada N.D. regular cremosa N.D.

231 2M2BE6 Esparrago B. P EMANA pequeño aplanada N.D. regular cremosa N.D.

233 2M2BE9 Esparrago R. P EMANA pequeño redondas N.D. regular cremosa N.D.

235 2M2BE12 Esparrago R. P EMA grande aplanada N.D. irregular cremosa N.D.

236 2M2BE13 Esparrago 1hrs. P EMANA pequeño aplanada N.D. irregular seca N.D.

239 2M2BE17 Esparrago 1hrs. P EMANA pequeño aplanada N.D. irregular seca N.D.

262 2M2BE43 Esparrago R. P EMANA pequeño redondeada N.D. regular cremosa N.D.

263 2M2BE44 Esparrago 3hrs. P EMANA pequeño redondeada N.D. regular cremosa N.D.

9 2M3BE12 Esparrago 3hrs. P EMANA pequeño redondeada N.D. regular cremosa N.D.


84

C. Bacillus licheniformis

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



176 M1BE6 Esparrago C. L ETANA grande aplanada blanco irregular seca no

148 M1BE13 Esparrago C. L EMA grande aplanada morado irregular seca no

151 M1BE17 Suelo L EMANA pequeño aplanada morado irregular seca no

153 M1BE19 Esparrago C. L ETA mediano aplanada blanco irregular seca no

170 M1BE26 Esparrago C. L ETANA pequeño redonda rosado irregular mucosa no

182 M2BE1 Suelo L EMA pequeño aplanada Morado irregular seca no

198 M2BE7 Suelo L EMA mediano redonda Morado irregular acuosa no

159 M2BE13 Suelo L EMA mediano aplanada Blanco irregular seca no

160 M2BE14 Esparrago C. L EMA mediano aplanada Blanco irregular acuoso no

192 M2BE22 Suelo L ETANA pequeño redonda Blanco irregular seca no

193 M2BE23 Esparrago C. L ETANA pequeño redonda Blanco irregular seca no

194 M2BE24 Suelo L ETA pequeño redonda Blanco irregular seca no

212 M2BE42 Esparrago C. L EMANA mediano aplanada Morado irregular seca no

137 M2BE51 Suelo L EMANA pequeño aplanada Amarillo irregular seca sí

50 M2BE55 Suelo L ETANA mediano aplanada Morado N.D. seca N.D.

68 M2BE56 Suelo L EMANA mediano aplanada Morado irregular seca N.D.

109 M3BE5 Suelo L EMA grande convexa morado N.D. acuosa N.D.

116 M3BE17 Esparrago C. L ETA grande convexa morado N.D. acuosa N.D.

21 M3BE20 Suelo L ETA grande aplanada morado N.D. seca N.D.

2 M3BE21 Suelo L ETA mediano aplanada morado N.D. seca N.D.

62 2M1BE5 Esparrago 3hrs. L EMA pequeño aplanada regular N.D. cremosa N.D.

19 2M1BE6 Esparrago 3hrs. L EMA pequeño aplanada regular N.D. cremosa N.D.

232 2M2BE7 Esparrago R. L ETA grande aplanada irregular N.D. cremosa N.D.

240 2M2BE18 Suelo L ETANA grande aplanada irregular N.D. seca/cremosa N.D.

245 2M2BE23 Suelo L ETA grande redondeada irregular N.D. cremosa N.D.


85

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



10 2M3BE23 Esparrago R. L EMANA grande aplanada irregular N.D. cremosa N.D.

23 2M3BE14 Esparrago R. L EMANA grande aplanada irregular N.D. cremosa N.D.

D. Bacillus megaterium

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



145 M1BE10 Suelo M EMANA mediano redonda amarillo irregular mucosa sí

199 M2BE9 Suelo M EMA mediano redondas Blanco irregular seca no

190 M2BE12 Suelo M EMA mediano redonda Morado irregular mucosa no

163 M2BE18 Suelo M EMA grande aplanada Blanco irregular seca no

200 M2BE19 Suelo M EMA mediano aplanada Morado N.D. N.D. N.D.

126 M3BE2 Suelo M EMA mediano convexa morado N.D. seca N.D.

214 M3BE14 Suelo M EMA grande aplanada blanco N.D. seca N.D.

215 M3BE16 Suelo M EMA mediano convexa morado N.D. mucosa N.D.

217 M3BE24 Suelo M ETA grande aplanada morado N.D. seca N.D.

E. Bacillus. amyloliquefaciens

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



165 M1BE21 Esparrago C. Am EMA grande aplanada blanco irregular seca no



191 M2BE15 Suelo Am EMA N.D. aplanada/convexa Blanco N.D. N.D. N.D.


86

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



17 M2BE41 Esparrago C. Am EMANA grande aplanada Blanco irregular seca no

135 M2BE48 Suelo Am EMA mediano aplanada Morado irregular seca no

28 M2BE49 Suelo Am EMANA mediano aplanada Blanco irregular seca no

254 2M2BE35 Esparrago 3hrs. Am EMANA mediano aplanada irregular N.D. seca N.D.

F. Bacillus sp. (Grupo cereus)

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



115 M3BE15 Suelo GC EMA pequeño aplanada morado N.D. seca N.D.

G. Bacillus endophyticus

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



186 M2BE6 Suelo E EMA pequeño aplanada Blanco irregular seca no

H. Paenibacillus polymyxa

Cód. dePerfil

Cód. deCepa


GrupoEsporogénico



196 M1BE1 Suelo Pol EMA mediano aplanada blanco irregular seca no

141 M1BE3 Suelo Pol EMA mediano aplanada blanco irregular seca no

183 M2BE3 Suelo Pol EMA pequeño aplanada Morado irregular seca no


87

4.3 VALIDACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOSIDENTIFICADOS EN LA CADENA PRODUCTIVA DE CONSERVAS DEESPÁRRAGO BLANCO

4.3.1 Recuento de microorganismos esporulados

El recuento de microorganismos esporogénicos y anaerobios sulfito reductores, realizado entoda la cadena productiva de conservas de espárrago, realizado en el presente proyecto,confirmó que el suelo, en especial, la muestra circundante a los turiones, presentó una mayorpoblación de microorganismos formadores de esporas que la encontrada en los mismosespárragos. Las poblaciones de EMANA en espárrago, variaron desde 82 UFC/ g en larecepción de la planta, hasta 4 UFC/ g a 1 hora de espera de la conserva lista para elesterilizado. En el caso de los termófilos, la mayoría de muestras de espárrago en lasdiferentes operaciones de la planta industrial, no presentaron esporas de estosmicroorganismos, sin embargo, se observaron 4 UFC/ g de ETANA en los espárragosenvasados con 1 hora de espera. En las etapas de espera previa a la esterilización, losanaerobios sulfito reductores no se presentaron de acuerdo al método utilizado (FDA, 2001)

TABLA 20. Resultados de recuento de microorganismos esporulados

MUESTRA

RESULTADOS DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICO (UFC / g)

EMA EMANA ETA ETANAAnaerobios

SulfitoReductores

SueloMódulo 8, Turno 1, Lote 228

12 x 103 36 x 102 39 x 10 52 x 10 90

Suelo circundante a losespárragos frescos reciéncosechados

27 x 102 47 x 10 38 x 102 30 x 102 66 x 10

Espárragos frescos en recepciónde planta (lote 28)

47 x 102 82 45 39 20

Espárragos frescos después debaño de burbujas

57 x 10 8 6 3 10

Espárragos frescos después dehidrocooler

21 x 10 6 1 <1 <10

Espárragos frescos sin pelar ycortados

22 x 10 18 1 <1 20

Espárragos frescos pelados ycortados

12 x 10 6 <1 <1 <10

Espárragos frescos pelados ycortados después de blanqueado

8 3 <1 <1 <10

Espárragos envasados (Frasco315) con 1 hora de espera

2 4 <1 4 <10

Espárragos envasados (Frasco315) con 3 horas de espera

1 <1 1 <1 <10

Espárragos envasados (Frasco315) con 4 horas de espera

<1 <1 <1 <1 <10


88

4.3.2 Aislamiento de cepas de Bacillus sp.

Se aislaron 220 cepas de Bacillus sp., de las cuales 70 provinieron del suelo de cultivo y 150cepas de los espárragos en sus diferentes etapas dentro de la cadena productiva (Tabla 21).De las cepas obtenidas, el mayor porcentaje perteneció al grupo esporogénico EMA(55.91%), seguidos de EMANA (32.73%), ETANA (5.91%) y ETA (5.45%).

TABLA 21. Cantidad de cepas aisladas de Bacillus sp en suelo y en espárragos

4.3.3 Caracterización morfológica de las cepas aisladas

La caracterización morfológica de las colonias crecidas en TGE para cada una de las cepasaisladas se muestra a continuación (Tabla 22).

TABLA 22. Caracterización morfológica de las cepas aisladas en el muestreo devalidación

Cód. de Cepa Gpo.Esporogénico

Tamaño Borde Forma Textura

3MBE1 EMA mediano irregular redonda mucoso3MBE2 EMA grande irregular arrocetada seca3MBE3 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE4 EMA pequeño regular redonda mucoso/seca3MBE5 EMA mediano irregular arrocetada seca3MBE6 EMA grande irregular convexa acuosa/seca3MBE7 EMA mediano irregular convexa mucoso/seca3MBE8 EMA mediano irregular aplanada mucoso/seca3MBE9 EMA mediano irregular redondeada seca/mucoso3MBE10 EMA grande irregular convexa acuosa/seca3MBE11 EMA grande irregular redonda seca3MBE12 EMA pequeño irregular redondeada mucoso3MBE13 EMA mediano regular redondeada mucoso/seca3MBE14 EMA grande irregular redondeada seca seca3MBE15 EMA mediano regular redondeada seca/mucosa3MBE16 EMA pequeño irregular difusa mucosa/seca3MBE17 EMA pequeño regular redonda seca3MBE18 EMA mediano irregular redondeada seca/mucoso3MBE19 EMA grande irregular estrellada mucoso3MBE20 EMA mediano irregular redondeada seca

Grupoesporogénico

Procedencia de la cepa Total Cepas/GrupoSUELO ESPÁRRAGOS Cantidad %

EMA 40 83 123 55.91EMANA 20 52 72 32.73ETA 5 7 12 5.45ETANA 5 8 13 5.91Total 70 150 220 100% 31.82 68.18 100


89



3MBE21 EMA mediano irregular redondeada seca3MBE22 EMA mediano irregular redondeada seca3MBE23 EMA mediano regular redondeada mucosa/seca3MBE24 EMA mediano regular redondeada mucosa3MBE25 EMA mediano regular convexa mucosa3MBE26 EMA mediano irregular aplanada cremoso3MBE27 EMA mediano irregular difusa seca3MBE28 EMA mediano irregular redondeada seca3MBE29 EMA mediano irregular redondeada seca3MBE30 EMA pequeño irregular aplanada seca3MBE33 EMA grande irregular aplanada seco3MBE34 EMA mediano irregular aplanada acuosa3MBE35 EMA mediano regular redondeada seco3MBE36 EMA pequeño irregular redonda mucoso3MBE37 EMA pequeño regular redonda mucoso/seco3MBE38 EMA grande irregular aplanada seco3MBE39 EMA mediano irregular redondeada mucoso3MBE40 EMA mediano irregular redonda mucoso3MBE42 EMA mediano irregular aplanada seco3MBE43 EMA pequeño irregular estrellada mucosa/seca3MBE44 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE45 EMA pequeño irregular estrellada mucoso3MBE46 EMA pequeño irregular estrellada mucoso3MBE47 EMA grande irregular redonda seca3MBE48 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE49 EMA grande regular redonda seca3MBE50 EMA mediano irregular redondeada mucoso3MBE51 EMA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE52 EMA pequeño irregular aplanada mucosa/seca3MBE53 EMA mediano irregular aplanada cremoso3MBE55 EMA mediano irregular aplanada mucoso3MBE56 EMA mediano irregular aplanada seco3MBE57 EMA mediano irregular aplanada mucoso3MBE58 EMA pequeño regular redondo mucoso3MBE60 EMA mediano regular redondo mucoso3MBE61 EMA mediano irregular aplanada seco3MBE63 EMA mediano irregular redondeada seco3MBE64 EMA mediano irregular redondeada seco3MBE65 EMA mediano irregular aplanada acuoso3MBE66 EMA grande irregular redondeada mucoso3MBE67 EMA mediano irregular redondeada seco/mucoso3MBE68 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE69 EMA pequeño regular redonda mucoso/seco3MBE70 EMA mediano irregular redondeada seco3MBE71 EMA grande irregular redondeada seco3MBE72 EMA grande irregular estrellada translucida/seco


90



3MBE73 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE74 EMA mediano irregular redonda seco3MBE75 EMA mediano irregular estrellada seco3MBE76 EMA pequeño irregular estrellada seca/mucosa3MBE77 EMA mediano irregular estrellada seca/mucosa3MBE78 EMA grande irregular redonda seco3MBE79 EMA mediano irregular redondeada mucoso3MBE80 EMA mediano irregular redondeada seco/mucoso3MBE81 EMA pequeño irregular estrellada seco/mucoso3MBE82 EMA pequeño irregular redondeada mucoso3MBE83 EMA mediano regular redondeada seca3MBE84 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE85 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE86 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE87 EMA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE89 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE90 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE92 EMA mediano irregular aplanada seco3MBE93 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE94 EMA mediano irregular convexa mucoso/seco3MBE95 EMA mediano irregular aplanada seco3MBE96 EMA pequeño irregular redondeada mucoso3MBE97 EMA pequeño irregular redondeada mucoso3MBE98 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE99 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE100 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE101 EMA pequeño irregular redonda mucoso3MBE102 EMA pequeño irregular redondeada mucoso/seco3MBE103 EMA mediano irregular redonda seco3MBE104 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE105 EMA mediano irregular redondeada mucoso/seco3MBE106 EMA mediano irregular convexo mucoso/seco3MBE107 EMA mediano irregular redondeada seco3MBE109 EMA pequeño irregular redondeada mucoso/seco3MBE110 EMA pequeño irregular redondo mucoso3MBE111 EMA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE112 EMA mediano regular redonda seco3MBE113 EMA mediano regular redonda mucoso/seco3MBE114 EMA mediano irregular redondeada seco3MBE115 EMA mediano regular redonda mucos/seco3MBE116 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE117 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE118 EMA pequeño regular redonda mucoso3MBE119 EMA pequeño irregular redondeada seco3MBE120 EMA mediano regular redonda mucoso3MBE121 EMA mediano irregular aplanada mucoso


91



3MBE122 EMA grande irregular aplanada mucoso3MBE123 EMA grande irregular aplanada mucoso3MBE124 EMA mediano irregular redondeada seco/mucoso3MBE125 EMA mediano irregular redondeada seco3MBE126 EMA mediano irregular redondeada seco3MBE127 EMA mediano irregular convexa mucoso/seco3MBE128 EMA mediano irregular redondeada mucoso3MBE130 EMA mediano irregular aplanada mucoso3MBE131 EMA mediano irregular redondeada mucoso3MBE133 EMA mediano regular redondeada mucoso/seco3MBE134 EMA mediano irregular redondeada mucoso/seco3MBE137 ETANA pequeño irregular aplanada mucoso/seco3MBE138 ETANA pequeño irregular aplanada seco3MBE141 ETANA pequeño irregular aplanada seco/mucoso3MBE142 ETANA pequeño irregular aplanada seco/mucoso3MBE143 ETANA mediano irregular aplanada seco3MBE144 ETANA pequeño irregular aplanada seco3MBE145 ETANA pequeño irregular aplanada seco3MBE146 ETANA pequeño regular aplanada seco3MBE147 ETANA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE148 ETANA mediano regular redondeada mucoso3MBE150 ETANA mediano irregular aplanada seco3MBE151 EMANA pequeño irregular convexa mucoso3MBE152 EMANA pequeño irregular convexa mucoso3MBE153 EMANA mediano irregular aplanada seco3MBE154 EMANA mediano irregular aplanada mucoso3MBE155 EMANA pequeño irregular convexa mucoso3MBE156 EMANA grande irregular aplanada seco3MBE157 EMANA mediano regular redonda seco3MBE158 EMANA mediano regular redonda seco3MBE159 EMANA mediano regular redonda mucoso3MBE160 EMANA mediano irregular redonda mucoso3MBE161 EMANA pequeño irregular estrellada mucoso3MBE163 EMANA pequeño irregular aplanada seco/mucoso3MBE164 EMANA mediano irregular aplanada cremoso3MBE165 EMANA pequeño regular aplanada mucoso3MBE166 EMANA mediano irregular aplanada mucoso3MBE167 EMANA pequeño irregular aplanada mucoso/seco3MBE168 EMANA pequeño regular convexo mucoso3MBE169 EMANA mediano irregular aplanada cremoso3MBE170 EMANA mediano irregular aplanada seco3MBE171 EMANA pequeño regular aplanada mucoso3MBE173 EMANA mediano irregular aplanada seco3MBE174 EMANA mediano regular redonda cremoso3MBE175 EMANA mediano irregular aplanada seco3MBE176 EMANA pequeño irregular aplanada acuosa


92



3MBE177 EMANA pequeño regular aplanada mucoso3MBE178 EMANA mediano irregular convexo mucoso3MBE180 EMANA mediano irregular aplanada seco3MBE182 EMANA pequeño regular convexo mucoso3MBE183 EMANA mediano regular redonda cremoso3MBE184 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE187 EMANA mediano irregular aplanada cremoso3MBE188 EMANA mediano irregular aplanada mucoso3MBE189 EMANA pequeño irregular aplanada acuosa3MBE190 EMANA mediano irregular redonda seca3MBE191 EMANA pequeño regular redondeada acuosa3MBE192 EMANA mediano regular redonda mucoso3MBE193 EMANA mediano regular redonda mucoso3MBE194 EMANA mediano regular redonda seco3MBE195 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE196 EMANA mediano irregular aplanada seco3MBE197 EMANA pequeño regular convexa mucoso3MBE198 EMANA pequeño regular aplanada mucoso3MBE199 EMANA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE202 EMANA pequeño irregular aplanada translucida3MBE203 EMANA mediano irregular aplanada seco3MBE204 EMANA mediano irregular aplanada seco3MBE205 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE206 EMANA mediano regular redonda mucoso3MBE207 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE208 EMANA mediano irregular aplanada translucida3MBE209 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE210 EMANA pequeño irregular convexo mucoso3MBE211 EMANA mediano regular convexo mucoso3MBE212 EMANA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE216 EMANA mediano irregular aplanada cremoso3MBE217 EMANA mediano irregular aplanada mucoso/seco3MBE218 EMANA mediano irregular aplanada seco/mucoso3MBE219 EMANA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE220 EMANA pequeño irregular redonda mucoso3MBE221 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE222 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE223 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE224 EMANA mediano irregular aplanada seco/mucoso3MBE225 EMANA mediano irregular aplanada cremoso/seco3MBE226 EMANA pequeño irregular aplanada seco3MBE227 EMANA pequeño irregular redonda mucoso3MBE228 EMANA mediano irregular convexa mucoso3MBE229 EMANA mediano irregular convexa mucoso3MBE230 EMANA pequeño regular redonda mucoso3MBE231 EMANA grande irregular aplanada seco


93



3MBE232 ETANA pequeño regular aplanada mucoso3MBE233 ETANA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE234 ETA pequeño irregular convexo seco/mucoso3MBE235 ETA mediano regular convexo mucoso3MBE237 ETA mediano irregular aplanada seco3MBE238 ETA pequeño irregular aplanada acuosa3MBE239 ETA pequeño irregular aplanada mucoso3MBE248 EMANA pequeño regular aplanada mucoso3MBE249 EMANA pequeño regular redondo mucoso3MBE250 ETA pequeño regular redondo mucoso3MBE252 ETA pequeño irregular convexo mucoso3MBE253 ETA pequeño irregular convexo mucoso3MBE254 ETA pequeño irregular convexo seco/mucoso3MBE255 ETA pequeño irregular convexo mucoso3MBE256 ETA pequeño irregular convexo mucoso3MBE257 ETA pequeño irregular redondo mucoso

4.3.4 Crecimiento de cepas de Bacillus sp. a 35.0ºC y 52.5ºC en medio aerobio yanaerobio

En la Tabla 23 se resume la cantidad de cepas aisladas según su temperatura de crecimiento ypresencia de oxígeno. Se aislaron 123 EMA, de los cuales, el 82.93 % (102 cepas) crecieronademás en condiciones anaerobias, por lo que puede decirse que se trata de anaerobiosfacultativos; 37 cepas crecieron a 52.5ºC, en aerobiosis (termófilos facultativos) y 28 fuerontermófilos anaerobios facultativos.

Del grupo de los EMANA (72 cepas), 34 fueron termófilos tolerantes y 25 fueron ademásanaerobias facultativas a 52.5ºC. 13 cepas aisladas inicialmente de las placas de recuento delgrupo de EMANA no crecieron a 35ºC en condiciones de anaerobiosis (3MBE155,3MBE157, 3MBE158, 3MBE182, 3MBE184, 3MBE191, 3MBE195, 3MBE197, 3MBE198,3MBE209, 3MBE216, 3MBE222, 3MBE224)

De las 12 cepas aisladas de ETA, todas demostraron ser mesófilos aerobios facultativos, 10fueron anaerobios facultativos a esta temperatura y 3 desarrollaron en condiciones deanaerobiosis a 52.5ºC. Durante las pruebas de caracterización, 3 de las cepas aisladas deplacas de recuento de ETA (3MBE235, 3MBE237, 3MBE239) no crecieron a temperatura determófilos.


94

TABLA 23. Cepas de Bacillus bajo dos diferentes temperaturas en condiciones aerobiasy anaerobias

Grupoesporogénico

Crecim. 35ºC Crecim. 52.5ºC VirajeTGE+PBCAerob. Anaerob. Aerob. Anaerob.

EMA 123 102 37 28 1

EMANA 72 56 34 25 3

ETA 12 10 9 3 0

ETANA 13 12 8 5 1

Total 220 180 88 61 5

% 100 81.45 40 27.73 2.27

En cuanto a las cepas de ETANA (13), se determinó que 4 de las cepas consideradas dentrode este grupo, después de repiques sucesivos y caracterización, no desarrollaron a 52.5ºC(3MBE142, 3MBE143, 3MBE144, 3MBE145, 3MBE232). 12 de las cepas fueron mesófilosanaerobios.

Solo el 2.27% del total de cepas aisladas mostró viraje en el medio TGE con púrpura debromocresol (Tabla 23)

En la Tabla 24, mostrada a continuación se observa en detalle la caracterización delcrecimiento de las cepas de Bacillus bajo las dos diferentes temperaturas consignadas, encondiciones aerobias y anaerobias.

TABLA 24. Crecimiento de cepas de Bacillus bajo dos diferentes temperaturas encondiciones aerobias y anaerobias

Código NºMuestra

GrupoEsporogénico

Crecim. 35ºC Crecim. 52.5ºC TGE+PBCcrecimiento

VirajeTGE+PBCAerob. Anaerob. Aerob. Anaerob.

3MBE1 1 EMA + + - - + -3MBE2 1 EMA + - - - + -3MBE3 1 EMA + + - - + -3MBE4 1 EMA + + - + + -3MBE5 1 EMA + + - - + -3MBE6 1 EMA + + + + + -3MBE7 1 EMA + + + + + -3MBE8 1 EMA + + + - + -3MBE9 1 EMA + + + + + -3MBE10 1 EMA + + + + + -3MBE11 1 EMA + + - - + -3MBE12 1 EMA + - - - + -3MBE13 1 EMA + + - + + -3MBE14 1 EMA + + + + + -3MBE15 1 EMA + + - + + -3MBE16 1 EMA + + - + + -3MBE17 1 EMA + + - - + -3MBE18 1 EMA + + - - + -


95

Código NºMuestra

GrupoEsporogénico

Crecim. 35ºC Crecim. 52.5ºCTGE+PBCcrecimiento


3MBE19 1 EMA + + - - + -3MBE20 1 EMA + + - - + -3MBE21 2 EMA + + - - + -3MBE22 2 EMA + + - - + -3MBE23 2 EMA + + + - + -3MBE24 2 EMA + - - - + -3MBE25 2 EMA + + - - + -3MBE26 2 EMA + + - - + -3MBE27 2 EMA + + - - + -3MBE28 2 EMA + + + - + -3MBE29 2 EMA + + + - + -3MBE30 2 EMA + - - - + -3MBE33 2 EMA + + - - + -3MBE34 2 EMA + - - - + -3MBE35 2 EMA + + + - + -3MBE36 2 EMA + + - - + -3MBE37 2 EMA + + - - + -3MBE38 2 EMA + + - - + -3MBE39 2 EMA + + - - + -3MBE40 2 EMA + + - - + -3MBE42 2 EMA + + - - + -3MBE43 2 EMA + + - - + -3MBE44 3 EMA + + - - + -3MBE45 3 EMA + + - + + -3MBE46 3 EMA + + - - + -3MBE47 3 EMA + + - - + -3MBE48 3 EMA + + - - + -3MBE49 3 EMA + + - - + -3MBE50 3 EMA + + - - + -3MBE51 3 EMA + + - - + -3MBE52 3 EMA + + + + + -3MBE53 3 EMA + + - - + -3MBE55 3 EMA + + + - + -3MBE56 3 EMA + - - - + -3MBE57 3 EMA + - - - + -3MBE58 3 EMA + + - - + -3MBE60 3 EMA + + + + + -3MBE61 3 EMA + + - - + -3MBE63 3 EMA + + - + + -3MBE64 3 EMA + + - + + -3MBE65 3 EMA + - - - + -3MBE66 3 EMA + + - - + -3MBE67 4 EMA + - - - + -3MBE68 4 EMA + + - - + -3MBE69 4 EMA + - - - + -3MBE70 4 EMA + - - - + -3MBE71 4 EMA + - - - + -3MBE72 4 EMA + - - - + -3MBE73 4 EMA + - - - + -


96

Código NºMuestra

GrupoEsporogénico



3MBE74 4 EMA + - - - + +3MBE75 4 EMA + + - - + -3MBE76 4 EMA + - - - + -3MBE77 4 EMA + + + + + -3MBE78 4 EMA + - - - + -3MBE79 4 EMA + + - - + -3MBE80 4 EMA + + + + + -3MBE81 4 EMA + + + + + -3MBE82 4 EMA + - - - + -3MBE83 4 EMA + + - - + -3MBE84 4 EMA + + - - + -3MBE85 4 EMA + + - - + -3MBE86 5 EMA + + + - + -3MBE87 5 EMA + + - - + -3MBE89 5 EMA + + - - + -3MBE90 5 EMA + + - - + -3MBE92 5 EMA + + + - + -3MBE93 5 EMA + + - - + -3MBE94 5 EMA + + + + + -3MBE95 5 EMA + + - - + -3MBE96 5 EMA + + + + + -3MBE97 5 EMA + + - - + -3MBE98 5 EMA + - - - + -3MBE99 5 EMA + + - - + -3MBE100 5 EMA + + - - + -3MBE101 6 EMA + + - - + -3MBE102 6 EMA + + - - + -3MBE103 6 EMA + + + - + -3MBE104 6 EMA + + - - + -3MBE105 6 EMA + + + - + -3MBE106 6 EMA + + + - + -3MBE107 6 EMA + + - - + -3MBE109 6 EMA + + - - + -3MBE110 6 EMA + + - - + -3MBE111 6 EMA + + - - + -3MBE112 6 EMA + + + - + -3MBE113 6 EMA + + - - + -3MBE114 7 EMA + + - - + -3MBE115 7 EMA + + + + + -3MBE116 7 EMA + - - - + -3MBE117 7 EMA + + - - + -3MBE118 7 EMA + - + - + -3MBE119 7 EMA + - + + + -3MBE120 7 EMA + + - - + -3MBE121 7 EMA + + + + + -3MBE122 7 EMA + + + + + -3MBE123 7 EMA + + + + + -3MBE124 7 EMA + + + + + -3MBE125 7 EMA + + + - + -


97

Código NºMuestra

GrupoEsporogénico



3MBE126 8 EMA + + - - + -3MBE127 8 EMA + + + + + -3MBE128 8 EMA + + + + + -3MBE130 8 EMA + + - - + -3MBE131 9 EMA + + + + + -3MBE133 10 EMA + + - - + -3MBE134 10 EMA + + - - + -3MBE137 1 ETANA + + + + + -3MBE138 1 ETANA + + + - + +3MBE141 2 ETANA + + + + + -3MBE142 2 ETANA + + - - + -3MBE143 2 ETANA + + - - + -3MBE144 3 ETANA + + - - + -3MBE145 3 ETANA + + - - + -3MBE146 3 ETANA + + + + + -3MBE147 3 ETANA + + + + + -3MBE148 4 ETANA + + + + + -3MBE150 4 ETANA + + + - + -3MBE151 1 EMANA + + - + + -3MBE152 1 EMANA + + + + + -3MBE153 1 EMANA + + - - + -3MBE154 1 EMANA + + + + + -3MBE155 1 EMANA + - + + + -3MBE156 1 EMANA + + - - + -3MBE157 2 EMANA + - - - + -3MBE158 2 EMANA + - - - + -3MBE159 2 EMANA + + - - + -3MBE160 2 EMANA + + - - + -3MBE161 2 EMANA + - + - + -3MBE163 2 EMANA + + + - + -3MBE164 2 EMANA + + + - + -3MBE165 2 EMANA + + + + + -3MBE166 2 EMANA + + - - + -3MBE167 2 EMANA + + + - + -3MBE168 2 EMANA + + + - + -3MBE169 2 EMANA + + - - + -3MBE170 2 EMANA + + - - + -3MBE171 2 EMANA + + - - + -3MBE173 3 EMANA + + + - + -3MBE174 3 EMANA + + - - + -3MBE175 3 EMANA + + - - + -3MBE176 3 EMANA + + - - + -3MBE177 3 EMANA + + - - + -3MBE178 3 EMANA + + - - + -3MBE180 3 EMANA + + - - + -3MBE182 3 EMANA + - - - + -3MBE183 3 EMANA + + - - + -3MBE184 3 EMANA + - - - + -3MBE187 3 EMANA + + - + + -


98

Código NºMuestra

GrupoEsporogénico



3MBE188 3 EMANA + + + + + -3MBE189 3 EMANA + + + - + -3MBE190 3 EMANA + + - - + -3MBE191 3 EMANA + - - - + -3MBE192 3 EMANA + + - - + -3MBE193 3 EMANA + + + - + -3MBE194 3 EMANA + + - - + -3MBE195 4 EMANA + - - - + -3MBE196 4 EMANA + + - + + -3MBE197 4 EMANA + - - - + -3MBE198 4 EMANA + - - - + +3MBE199 4 EMANA + + - - + +3MBE202 4 EMANA + + + - + -3MBE203 4 EMANA + + + + + -3MBE204 4 EMANA + + + + + -3MBE205 4 EMANA + + + + + -3MBE206 4 EMANA + + + + + -3MBE207 4 EMANA + + - - + -3MBE208 5 EMANA + + + + + -3MBE209 5 EMANA + - - - + -3MBE210 5 EMANA + + + + + -3MBE211 5 EMANA + + + + + -3MBE212 5 EMANA + + - + + -3MBE216 6 EMANA + - - - + -3MBE217 6 EMANA + + + - + -3MBE218 6 EMANA + + + + + -3MBE219 6 EMANA + + + + + -3MBE220 7 EMANA + + - - + -3MBE221 7 EMANA + + - - + -3MBE222 7 EMANA + - - - + +3MBE223 7 EMANA + + - - + -3MBE224 7 EMANA + - + - + -3MBE225 7 EMANA + + + + + -3MBE226 7 EMANA + + + + + -3MBE227 7 EMANA + + - + + -3MBE228 9 EMANA + + + + + -3MBE229 9 EMANA + + + + + -3MBE230 9 EMANA + + + + + -3MBE231 9 EMANA + + + + + -3MBE232 9 ETANA + - - - + -3MBE233 9 ETANA + + + - + -3MBE234 2 ETA + + + + + -3MBE235 2 ETA + + - - + -3MBE237 4 ETA + + - - + -3MBE238 4 ETA + + + - + -3MBE239 4 ETA + + - - + -3MBE248 8 EMANA + - - - + -3MBE249 8 EMANA + - - - + -3MBE250 1 ETA + - + - + -


99

Código NºMuestra

GrupoEsporogénico



3MBE252 1 ETA + + + - + -3MBE253 1 ETA + + + - + -3MBE254 3 ETA + - + + + -3MBE255 3 ETA + + + + + -3MBE256 3 ETA + + + - + -3MBE257 3 ETA + + + - + -

4.3.5 Caracterización molecular de las cepas de Bacillus aisladas en el muestreo devalidación

A continuación se muestran los perfiles de 34 cepas del género Bacillus (Figura 34 y Tabla25), todas ellas fueron aisladas a partir de muestras de espárragos blancos en las diferentesetapas del proceso industrial de elaboración de conservas (Agosto de 2008). Veintitres de losperfiles obtenidos fueron agrupados de acuerdo a su similitud con 5 especies identificadaspreviamente a través del secuenciamiento del gen ribosomal 16S. Se identificaron las especiesde B. pumilus, B. megaterium, B subtilis (grupos S1, S3 y S5), Bacillus sp. (grupo cereus) yB licheniformis.

Dentro de los perfiles de la especie de B. pumilus (Figura 29 A), l. a cepa 3MBE219 (carril30) se pudo observar la ausencia de una banda definida hacia los 700 kb. Este grupo fue elmás numeroso dentro de los Bacillus identificados en esta etapa de validación, con el 23.53 %del total de cepas evaluadas durante este periodo (Tabla 27). Los perfiles agrupados dentro deB. megaterium (correspondiente a 5 cepas), mostraron 2 patrones de bandas, el carril 22 y 25presentan un mismo patrón, en tanto que el resto de ellos pertenecen a otro grupo, el cualpresenta una banda intensa de 1000 kb aproximadamente.

Dentro de los perfiles correspondientes a B. subtilis, se observaron 3 grupos (S1, S3 y S5), losgrupos S1 y S5 presentaron 3 perfiles cada uno de ellos, en tanto que S3 presentó tan solo unperfil.

El grupo correspondiente a Bacillus sp. (grupo cereus) presentó 2 cepas representantes. Susperfiles BOX-PCR presentaron 3 bandas características alrededor de 1000 kb y 3 másalrededor de 1500 kb.

La cepa 3MBE228 fue agrupada dentro de la especie B. licheniformis y su perfil presentó elmismo patrón que el de las cepas identificadas como dicha especie en muestreos anteriores.

Se obtuvieron además tres grupos de perfiles BOX-PCR de 2 cepas cada uno y cinco perfilesúnicos que no fueron identificados (Figura 34 B, Tabla 26) pues su patrón de bandas nocoincidió con el de ninguna de las cepas aisladas e identificadas a través del secuenciamientodel gen ribosomal 16S provenientes de la investigación previa realizada en la misma empresaprocesadora de espárragos blancos. La limitación del presupuesto no permitió enviar estascepas a secuenciar, pero se espera poder realizarlo en el futuro a través del financiamiento denuevos proyectos de investigación.


100

A. CEPAS IDENTIFICADAS

B. CEPAS NO IDENTIFICADAS

FIGURA 34. Perfiles de amplificación BOX-PCR de las cepas aisladas en elmuestreo de validación

B. pumilus B. megaterium B. subtilis (S1, S3 y S5) Bacillus sp. (Gpo cereus) B. licheniformis


101

TABLA 25. Agrupamiento de por perfil molecular de las cepas aisladas en el muestreo de validación

Bacillus subtil is

Código Cepa ProcedenciaGrupo(Perfil)

Gpo.Esporogénico Tamaño Borde Forma Textura

3 3MBE131 Espárrago 1hr. S1 EMA mediano irregular redondeada mucoso

11 3MBE120 Espárrago PC S1 EMA mediano regular redonda mucoso

38 3MBE238 Espárrago B S1 ETA pequeño irregular aplanada acuosa

18 3MBE105 Esparrago SPC E EMA mediano irregular redondeada mucoso/seco

13 3MBE122 Espárrago PC S5 EMA grande irregular aplanada mucoso

14 3MBE124 Espárrago PC S5 EMA mediano irregular redondeada seco/mucoso

19 3MBE111 Espárrago B S5 EMA pequeño irregular aplanada mucoso

Bacillus pumilus



10 3MBE119 Espárrago PC P EMA pequeño irregular redondeada seco

20 3MBE112 Espárrago B P EMA mediano regular redonda seco

28 3MBE217 Espárrago SPC P EMANA mediano irregular aplanada mucoso/seco

30 3MBE219 Espárrago SPC P EMANA pequeño irregular aplanada mucoso

32 3MBE213 Espárrago H P EMANA

34 3MBE203 Espárrago B P EMANA mediano irregular aplanada seco

35 3MBE204 Espárrago B P EMANA mediano irregular aplanada seco

43 3MBE176 Espárrago R P EMANA pequeño irregular aplanada acuosa

Bacillus licheniformis



21 3MBE228 Espárrago 1hr. L EMANA mediano irregular convexa mucoso

Bacillus megaterium



2 3MBE134 Espárrago 3hrs. M EMA mediano irregular redondeada mucoso/seco

17 3MBE104 Espárrago SPC M EMA mediano regular redonda mucoso

22 3MBE222 Espárrago PC M EMANA pequeño regular redonda mucoso

25 3MBE227 Espárrago PC M EMANA pequeño irregular redonda mucoso

36 3MBE205 Espárrago B M EMANA pequeño regular redonda mucoso

Bacillus sp. (Grupo cereus)



41 3MBE174 Espárrago R GC EMANA mediano regular redonda cremoso


102

42 3MBE175 Espárrago R GC EMANA mediano irregular aplanada seco

TABLA 26. Cepas con perfiles moleculares diferentes a los identificados mediantesecuenciamiento

Bacillus sp. (Cepas no identificadas)

Codigo Cepa ProcedenciaGrupo(Perfil)


1 3MBE133 Esparrago 3hrs. A EMA mediano regular redondeada mucoso/seco

5 3MBE126 Esparrago BPC B EMA mediano irregular redondeada seco

7 3MBE128 Esparrago BPC C EMA mediano irregular redondeada mucoso

40 3MBE173 Esparrago R C EMANA mediano irregular aplanada seco

8 3MBE129 Esparrago BPC D EMA

37 3MBE150 Esparrago B D ETANA mediano irregular aplanada seco

24 3MBE226 Esparrago PC F EMANA pequeño irregular aplanada seco

33 3MBE202 Esparrago B F EMANA pequeño irregular aplanada translucida

27 3MBE216 Esparrago SPC G EMANA mediano irregular aplanada cremoso

29 3MBE218 Esparrago SPC H EMANA mediano irregular aplanada seco/mucoso

39 3MBE239 Esparrago B I ETA pequeño irregular aplanada mucoso

TABLA 27. Cepas identificadas en el muestreo de validación

Especies Cantidad Porcentaje (%)

B. subtilis 7 20,59B. pumilus 8 23,53B. licheniformis 1 2,94B. megaterium 5 14,71Bacillus sp. (Grupo cereus) 2 5,88No identificados 11 32,35Total 34 100

4.3.6 Caracterización bioquímica con el kit de identificación API 50 CHB

Se ensayaron 17 cepas de Bacillus provenientes de espárrago en sus diferentes etapas deprocesamiento en la planta industrial, 8 de estas cepas fueron aisladas en el año 2007 yconservadas en gliecerol a -80ºC; las 11 cepas restantes fueron obtenidas durante el muestreorealizado en el presente proyecto (Agosto de 2008) en la misma planta de proceso (GreenPeru S.A., Trujillo)

En la Tabla 28, se muestran los resultados obtenidos para la identificación bioquímica a travésde API 50 CHB, en comparación con la identificación molecular, donde se aprecia lacorrespondencia de ambas técnicas de identificación. Once de las cepas analizadas fueronidentificadas con una seguridad mayor al 99%, 2 cepas presentaron buena identificaciónaunque con con una seguridad alrededor del 97%, en tanto que 4 cepas mostraron perfiles


103

dudosos, sin embargo entre las alternativas de identificación se encontró la misma especieidentificada por la técnica molecular.

Según Durak et al. (2006), el API 50 CHB puede incurrir en algunos errores de identificación,para el caso de cepas de Paenibacillus spp., identificadas por este método como B. circulans.

Finalmente, en la Figura 35 se compara la ocurrencia de las especies identificadas en lasdiferentes etapas de la cadena productiva de espárragos, correspondientes a los años 2007 (A)y 2008 (B). Se aprecia que B. subtilis estuvo presente en todas las etapas del proceso (Figura35 A), en tanto que para el muestreo de validación, si bien no está presente en todas lasetapas, se mantiene hasta el final de la cadena productiva (Figura 35 B). Cabe señalar quedurante el año 2007 se presentó una lata hinchada a la que se le hizo un control de esterilidad,donde se aisló una cepa identificada mediante el secuenciamiento como B. subtilis. Se apreciatambién que durante el año 2008, la especie presente en todas las etapas de producción fue B.pumilus. Algunas otras especies de menor ocurrencia fueron identificadas en las etapasprevias al envasado, como el caso de B. megaterium y Bacillus sp. (Grupo cereus). Seobservó que en la etapa de espera de los envases listos para la esterilización se identificaronlas especies del grupo subtilis B. subtilis, B licheniformis, B. pumilus y B. subtilis /amyloliquefaciens.


104

TABLA 28. Resultados de la identificación bioquímica a través del kit API 50 CHB

CEPA GRUPOESPOROGÉNICO

PROCEDENCIA DE LA CEPAIDENTIFICADA

IDENTIFICACIÓNMOLECULAR

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA (API 50 CHB)TAXÓN SIGNIFICATIVO % ID CALIFICATIVO

2M1BE6 EMAEspárragos envasados (Frasco315) con 3 horas de espera

B. licheniformis B. licheniformis 99.9 Buena identificación

2M2BE4 EMANAEspárragos frescos despuésde hidrocooler

B. subtilis (S1) B. subtilis / amyloliquefaciens 99.5 Muy buena identificación

2M2BE5 EMANAEspárragos envasados (Frasco315) con 3 horas de espera

B. pumilus B. pumilus 99.9 Excelente identificación

2M2BE6 EMANAEspárragos frescos despuésde baño de burbujas


2M2BE29 EMANAEspárragos envasados (Frasco315) con 3 horas de espera

B. subtilis (S5)B. licheniformis 53.2 Muy buena identificación

en el géneroB. subtilis / amyloliquefaciens 34.6

2M2BE41 EMANAEspárragos envasados (Frasco315) con 1 hora de espera

B. subtilis (S1)B. subtilis / amyloliquefaciens 89.5

Excelente identificaciónen el género

B. licheniformis 9.3B. megaterium 1.1

3MBE104 EMAEspárragos frescos sin pelar ycortados

B. megaterium B. megaterium 99.9 Excelente identificación

3MBE122 EMAEspárragos frescos pelados ycortados

B. subtilis (S2)B. subtilis / amyloliquefaciens 88.1

Perfil dudosoB. licheniformis 6.4B. megaterium 4.8

3MBE131 EMAEspárragos envasados (Frasco315) con 1 hora de espera

B. subtilis (S1) B. subtilis / amyloliquefaciens 97.3 Buena identificación

3MBE134 EMAEspárragos envasados (Frasco315) con 3 horas de espera

B. megaterium B. megaterium 99.9 Muy buena identificación

3MBE174 EMANAEspárragos frescos enrecepción de planta (Lote 28)

N.D.B. anthracis 79.6

Buena identificación en elgénero

B. mycoides 15.3B. cereus 1 3.5

3MBE176 EMANAEspárragos frescos enrecepción de planta (Lote 28)



105

CEPA GRUPOESPOROGÉNICO

PROCEDENCIA DE LA CEPAIDENTIFICADA

IDENTIFICACIÓNMOLECULAR

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA (API 50 CHB)

TAXÓN SIGNIFICATIVO % ID CALIFICATIVO

3MBE204 EMANAEspárragos frescos despuésde baño de burbujas


3MBE213 EMANAEspárragos frescos despuésde hidrocooler

B. pumilus B. pumilus 99.9 Muy buena identificación

3MBE217 EMANAEspárragos frescos sin pelar ycortados


3MBE222 EMANAEspárragos frescos pelados ycortados

B. megaterium B. megaterium 97.9 Buena identificación

3MBE228 EMANAEspárragos envasados (Frasco315) con 1 hora de espera

N.D. B. licheniformis 99.8 Muy buena identificación


106

0

1

2

3

4

5

Recepc i on Burbujeo Hi drocool er 1 hora dees pera

3 hora s dees pera

Control deEs teri l i da d

Es pa rra gos Fres cos Es pa rra gos Enva s a dos

S

Am

P

L

0

1

2

3

4

5

Recepcion Burbujeo Hidrocooler Peladocortado

Sin pelarcortado

1 hora deespera

3 horas deespera

Esparragos Frescos Esparragos Envasados

S

M

P

L

GC

FIGURA 35. Frecuencia de aparición de especies de Bacillus en la cadena productiva deconservas de espárrago blanco. a partir de cepas aisladas (A) en el 2007, (B) en el 2008.S: B. subtilis, Am: B. subtilis / amyloliquefaciens, P: B. pumilus, L: B. licheniformis,M: B.

megaterium, GC: Bacillus sp. (Gpo. cereus)

A

B


107

Cabe resaltar que de las 150 cepas aisladas de espárragos en el muestreo de validación delpresente proyecto, solo se identificaron 23, las que fueron seleccionadas de las diferentesetapas de la cadena productiva, pero la limitación del tiempo y del presupuesto no permitió laidentificación total de las cepas aisladas; sin embargo, esto se considerará para un futurocercano.


108

V. CONCLUSIONES

1. Los tiempos de generación estimados para cada uno de los microorganismosensayados fueron: B. pumilus, 0.531 horas; B. licheniformis, 0.585 horas y B.subtilis/amyloliquefaciens, 0.442 horas.

2. La técnica espectrofotométrica sirvió para determinar la fase exponencial de lascurvas de crecimiento de cepas del género Bacillus desarrolladas en medio líquido.

3. El tiempo en el cual los cultivos en medio líquido (28 ºC) alcanzaron la mayordensidad óptica fue: B. pumilus, 33 horas; B. licheniformis, 49 horas y B.subtilis/amyloliquefaciens, 33 horas.

4. Se determinó que la cantidad óptima extraída de DNA para las pruebas deamplificación BOX-PCR fue de 1 a 8 µL.

5. Se aislaron 220 cepas del género Bacillus a partir de muestras de espárrago blanco delproceso productivo de conservas, en el muestreo de validación (2008)

6. Se obtuvieron 169 perfiles, producto de la amplificación BOX-PCR en cepas deBacillus sp. aislados de la cadena productiva de conservas de espárrago blanco del año2007 y 34 perfiles del muestreo de validación (2008).

7. De acuerdo a la caracterización molecular BOX-PCR, de los primeros 169 perfiles, seencontraron 16 grupos de cepas dentro de los cuales se identificaron 7 especies deBacillus y 1 de Paenibacillus, donde el 52.07 % correspondió a la especie B. subtilis,seguido de B. pumilus (18.93 %) y B. licheniformis (15.98 %), B. megaterium (5.33%), B. subtilis / amyloliquefaciens (4.73 %). Así también, se encontró que Bacillus sp.(Grupo cereus) y B. endophyticus fueron los de menor ocurrencia, con 0.59 % cadauno. Se identificó también Paenibacillus polymyxa (1.78 %) en muestras provenientesdel suelo.

8. Las cepas de B. pumilus, B. licheniformis y B. subtilis/amyloliquefaciens, identificadasen un trabajo previo a través de pruebas bioquímicas, fueron confirmadas por técnicasmoleculares.

9. De los 34 perfiles de amplificación BOX-PCR caracterizados a partir de cepas aisladasde las etapas del procesamiento industrial de espárragos blancos en conserva duranteel muestreo de validación (2008), el 23.53 % correspondió a B. pumilus, el 20.59 % aB. subtilis, 14.71 % B. megaterium, el 5.88 % a Bacillus sp (Grupo cereus) y el 2.94 %a B. licheniformis. Así también se encontraron 8 grupos de perfiles BOX-PCR, que nocorrespondieron a las especies identificadas a través de métodos moleculares.

10. De 17 cepas caracterizadas por métodos bioquímicos (API 50 CHB), el 64.71 %coincidieron (al 99,9% de seguridad) con la identificación molecular.


109

11. En la etapa de tiempos de espera de los espárragos envasados listos para laesterilización, se identificaron B. subtilis, B licheniformis, B. pumilus y B. subtilis /amyloliquefaciens

12. Mediante pruebas de control de esterilidad, se comprobó que la especie B. subtilis,sobrevivió a tratamientos de esterilización de conservas de espárrago blancorealizados en envases de vidrio y metálicos, siendo causante del deterioro delproducto.


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INFORME FINAL DEL PROYECTO PROCYT 338-2007-CONCYTEC-OAJ