Informe II de Enzimología

7/25/2019 Informe II de Enzimología

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Laboratorio de Enzimología

Ingeniería en Biotecnología de los RR.NN

Docente: Valentina Venturi.

PRÁCTICA No. 2 – RECONOCIMIENTO DE LIPASAS EN SEMILLAS DE

HIGUERILLA ( Ricinus communis)

Fech !e "e#$%c$&n: 11/Noviembre/2015 Fech !e ent"e': 16/Noviembre/2015

Pamela Elizabeth Logroño López !ohana "ari#ela Lozano $alva "ar%a &el'n Poma !uan $lavi(o.

METODOLOGA.

Para el re#ono#imiento )e lipa*a* en *emilla* )e higuerilla + Ricinus communis, primero *e

trituraron la* *emilla* )e higuerilla ma)ura* hi)rata)a* - no hi)rata)a* +2 hora*, previamente pela)a* ha*ta al#anzar un pe*o )e uno* 10 gramo* )e *emilla* tritura)a*. e #olo#aron 2.0 g )ela bioma*a )e *emilla *e#a no germina)a en lo* primero* Erlenme-er* +, - luego 12 ml)e agua )e*tila)a. Luego *e agregó 2.0 ml )e #i)o a#'ti#o 0.1N al tubo 3al#on - *e hirvió el)e la mue*tra )urante 5 minuto* +la e* el #ontrol,. e realizó la mi*ma meto)olog%a para*emilla* germina)a* a)i#ionan)o lo* e4tra#to* a lo* tubo* 3al#on V +el te*tigo, V +hervi)a, -V +#on a)i#ión 2.0 ml )e #i)o a#'ti#o 0.1N,. *% *e mi)ió el p )e #a)a uno para luego#olo#arla* en una e*tu7a a 89$ )urante 2: hora*. ;ra* 2: hora* )e 7ermenta#ión *e aña)ió 2.5ml )e etanol a #a)a tubo.

Para la valora#ión #i)oba*e )e #a)a una )e la* mue*tra* *e #on*i)eró #omo rea#tivo valoranteal Na< 0.1N. nte* )e la titula#ión *e agregó 2.0 ml )e #i)o a#'ti#o 0.1N al re*to )e la*mue*tra* +VV, para igualar la* #on)i#ione* )el en*a-o. e #argó la bureta #on 5 mL )e la)i*olu#ión )e Na< 01N - 5 mL )e 7enol7tale%na al 0.1= en etanol. e enra*ó - #omenzó lavalora#ión agitan)o #ontinuamente ha*ta vira(e )el in)i#a)or.

RESULTADOS DISCUSI*N.

En la e4perien#ia )e laboratorio *e i)enti7i#ó la a#tivi)a) )e la* lipa*a* en *emilla* )e Ricinus

communis> para e*to *e tomó en #uenta )o* tipo* )e mue*tra*? *emilla* )e higuerilla* *e#a* nohi)rata)a* - *emilla* )e higuerilla germina)a* )e a#uer)o a lo )e*#rito en la meto)olog%a.

Primero *e mi)ió el p )e #a)a una )e la* *ei* mue*tra* tenien)o #omo re*ulta)o*? un pneutro para la* mue*tra* blan#o - V re*pe#tivamente - un p #i)o @ue var%a entre 5 a 6 parala* )em* mue*tra* ++e" T,#. -, gra#ia* a e*to* p *e pu)o i)enti7i#ar la pre*en#ia )e lipa*a*en la* mue*tra* )e higuerilla prepara)a* en el laboratorio.

T,# -. "ue*tra* )e *emilla* )e higuerilla* *egAn el e4perimento realiza)o en el laboratorio.

Me/t"/

Se0$##/ Ác$!o c1t$co He"$! 3H NOH (0#)

I No germina)a* +blan#o, No No 8 1B.2II No germina)a* i No :5 1III No germina)a* No i 6 16I+ Cermina)a* +blan#o, No No 8 15+ Cermina)a* No i 5 16



+I Cermina)a* i No 6 12La valora#ión )e e*ta* mue*tra* *e hizo #on hi)ró4i)o )e *o)io +01N, - #omo *e utilizó #omoin)i#a)or a la 7enol7tale%na. El volumen )el valorante para #a)a una )e la* mue*tra* en )i#hatitula#ión 7ue )i7erente *ien)o 1B2 ml )e valorante para la mue*tra blan#o )e *emilla* )ehiguerilla *e#a* - 15 ml para la mue*tra blan#o )e la* *emilla* germina)a*. + +e" T,#. -,> *in

embargo to)a* la* mue*tra* al#anzaron el punto )e e@uivalen#ia e*to *e pu)o )eterminar me)iante el #ambio )e #olor )e la* mue*tra*. $a)a una )e la* mue*tra* )e tornó )e un #olor *almón a ro*a)o pli)o (+e" Ane4o -, lo @ue in)i#a la neutraliza#ión )e )i#ha* mue*tra*.

La a#tivi)a) hi)rol%ti#a )e la* lipa*a* *e pu)o )eterminar me)iante la #uanti7i#a#ión in)ire#ta )elo* #i)o* gra*o* ++e" T,#. 2,. E*to* #i)o* gra*o* *e 7ormaron )urante la hi)róli*i* )el a#eite)e Ricinus communis por la 7ermenta#ión )el mi*mo en #a)a una )e la* mue*tra* trata)a*> parae*to *e tomó en #uenta? lo* volAmene* )e #a)a una )e la* mue*tra* el #ual #orre*pon)e a 1D5ml para to)a* ella* lo* volAmene* obteni)o* luego )e la titula#ión )e #a)a una )e la* mue*tra* -la #on#entra#ión )el valorante. En p neutro no *e pro)u#e hi)róli*i* ++e" Ane4o 2,.

T,# 2. $on#entra#ión )e #i)o* grao* libera)o* por lipa*a en la* mue*tra* @ue #ontienen*emilla* )e higuerilla.

Me/t"/

Se0$##/ Concent"c$&n !e 5c$!o/ '"/o/#$,e"!o/ 3o" #$3// (60o#70#).

I No germina)a* +blan#o, II No germina)a* 51III No germina)a* 182BI+ Cermina)a* +blan#o, + Cermina)a* 5:05+I Cermina)a* 1621

$ama#ho - $arva(al +201:, en *u e*tu)io *obre m'to)o* para #uanti7i#ar la a#tivi)a) enzimti#a)e enzima* #omer#iale*> #uanti7i#aron la a#tivi)a) enzimti#a )e la lipa*a pre*ente en unaemul*ión )e goma arbiga/a#eite )e oliva. E*ta hi)rola*a a#tAa *obre el *u*trato en la inter7a*e por e*ta razón *e re@uiere gran pre#i*ión para la evalua#ión )e *u a#tivi)a). egAn lo* autore*el m'to)o m* #omAnmente u*a)o para )eterminar la a#tivi)a) )e la* lipa*a* mi)e lo* #i)o*#arbo4%li#o* libre* o re*i)uo* )e #i)o* gra*o* genera)o* )urante la hi)róli*i* )e lo* *u*trato*nativo* por titula#ión. e e*ta manera ello* pro#e)ieron a #al#ular lo* #i)o* gra*o* a trav'* )elo* e@uivalente* )e Na< u*a)o* en la titula#ión obtenien)o en *u traba(o #omo re*ulta)o 0Fmol )e #i)o* gra*o*/ml )e mue*tra.

En #uanto a la me)i#ión )e p $anter +1BBD, al igual @ue E*#obar +2012, en *u* inve*tiga#ione*i)enti7i#an la pre*en#ia )e lipa*a* en mue*tra* )e Ricinus communis, e*to *e )ebe a @ue e*taenzima pue)e *er )ete#ta)a )urante el pro#e*o )e 7ermenta#ión )e )i#ha* *emilla*. )em* un p #i)o e* el óptimo para @ue #umpla #on *u a#tivi)a) hi)rol%ti#a pue*to @ue e*te tipo )ehi)rola*a* *e en#uentran a#tiva* entre un p )e :5 - 5.

La hi)róli*i* )e lo* trigli#'ri)o en gra*a* o a#eite* *e )ebe a la a##ión hi)rol%ti#a )e la enzimalipa*a )an)o #omo re*ulta)o la libera#ión )e #i)o* gra*o* - gli#erol. La a#tivi)a) )e e*ta*enzima* )epen)e en gran parte )el e*ta)o )e agrega#ión )el *u*trato - tienen apli#a#ione*

biote#nológi#a* en rea##ione* )e *%nte*i* e hi)roli*i* )e trigli#'ri)o* +;C, - otro* '*tere* @ue a



*u vez tienen apli#a#ione* en pro)u##ión )e *abore* 7rma#o* agro@u%mi#o* #o*m'ti#o*)etergente* bio)ie*el et#. +!aeger G Eggert 2002,.

e a#uer)o a lo* re*ulta)o* obteni)o* en la pr#ti#a )e laboratorio - *egAn la bibliogra7%a#on*ulta)a *e pue)e #on#luir @ue e*ta e4perien#ia 7ue un '4ito -a @ue *e pu)o )eterminar la

pre*en#ia )e lipa*a* en la* mue*tra* #on Ricinus communis gra#ia* a la hi)róli*i* )el a#eite )eri#ino #onteni)o en *u* *emilla*.

Conc#/$&n.

La #uanti7i#a#ión )e la a#tivi)a) enzimti#a )e la* lipa*a* pre*ente* en la* mue*tra* )e Ricinus

communis *e hizo tanto para *emilla* *e#a* #omo germina)a* e*to *e )ebe a @ue la a#tivi)a) )ee*ta* enzima* no *olo e*t pre*ente )urante la germina#ión #omo en la ma-or%a )e oleagino*a*>*ino @ue tambi'n *e en#uentran a#tiva* en la* *emilla* *in germinar. E*to *e logró ha#er me)iante un m'to)o )e e*tima#ión @ue mi)ió lo* #i)o* #arbo4%li#o* libre* o #i)o* gra*o*genera)o* )urante la hi)roli*i* )el a#eite )e ri#ino por titula#ión> )n)ono* #omo re*ulta)o*?

51 +mue*tra *e#a , 182B +mue*tra *e#a , 5:05 +mue*tra germina)a V, - 1621+mue*tra germina)a V,. Lo #ual in)i#a @ue *e en#ontró ma-or a#tivi)a) enzimti#a )e lipa*a*en la* mue*tra* #on *emilla* )e higuerilla *e#a* @ue en la* mue*tra* @ue #onten%an *emilla*germina)a*.

CUESTIONARIO.

-. De/c"$, # 0eto!o#o'8 /e'$" 3" !etect" ct$$!! !e #$3// en /e0$##/!e 3#nt/.

. Reco#ecc$&n9 #!o e4t"cc$&n !e# ce$te !e # /e0$##.

e ini#ia la re#ole##ión )e *emilla* #on )i7erente* #ara#ter%*ti#a* 7%*i#a*ob*ervan)o @ue lo* ra#imo* *e#o* *ean lo* @ue #ontienen la *emilla ma)ura @ue*e utilizara en el traba(o +"art%nez 201,.La* *emilla* re#ole#ta)a* *e lavan #on agua )e*tila)a - *e #ortan en pe@ueño*

pe)azo*> po*teriormente *on lleva)a* a un matraz #on a#etona por 2: hora* atemperatura ambiente #on agita#ión manual para e4traer el a#eite +"art%nez201,.;ran*#urri)a* 2: h la *olu#ión *e 7iltra en un embu)o &u#hner al va#%o. El

7iltra)o *e evapora en un rotavapor a 609$ para eliminar la a#etona #onteni)a. Ela#eite obteni)o *e pe*a)o para realizar lo* #l#ulo* )e ren)imiento +"art%nez201,.En el *óli)o re#upera)o en el papel 7iltro *e en#uentra la lipa*a la #ual *e )e(a*e#ar por un perio)o )e 2: hora* a temperatura ambiente una vez *e#o elmaterial e* pe*a)o - #on*erva)o a :9$ ha*ta *u u*o +&ello 2000,.

,. Recc$&n !e H$!"&#$/$/ con #$3//.

Para #omprobar la a#tivi)a) #atal%ti#a @ue realiza la enzima )e 7orma natural en

la hi)róli*i* )e '*tere* e*pe#ialmente )e tria#ilgli#'ri)o* *e prepara la rea##ión@ue *e )e*#ribe a #ontinua#ión +"art%nez 201,.



e elabora un blan#o @ue *irve )e re7eren#ia para *eguir el avan#e )e la rea##ión. En un matraz *e )epo*ita #ui)a)o*amente 1 g )e a#eite> 0.6 ml )e $

$<< 0.1N p :.8> 0.1 g )e enzima> *e agita manualmente por minuto*. e prepara el baño mar%a a 8 9$ )on)e *e #olo#a la* mue*tra* por 2: h. La rea##ión e* monitorea)a por me)io )e #romatogra7%a en #apa 7ina por 5 h

-a @ue *e reporta @ue en e*te tiempo e4i*te un avan#e )e D0= en la rea##ión+Longene#Her .E. et al. 1B5,.

Ina vez #o#lui)o el tiempo )e rea##ión *e agrega etanol al B5= #aliente - *e

pro#e a titular #on Na< 0.1 N u*an)o 7enol7tale%na #omo in)i#a)or.

c. Act$c$&n !e # En%$0.

e utilizara el m'to)o propue*to por "eleH ;Jter para a#tivar la* lipa*a* en una*olu#ión bu77er p : +;Jter " 1BBD,. e prepara en la *olu#ión bu77er p : #itrato7o*7ato +K2P<: /$6D<8, - *e

#on*erva ha*ta *u u*o a :9$. En un matraz Erlenme-er *e pe*a la enzima *e vierte la *olu#ión bu77er - *e

#on*erva a :9$ por : hora*. $on#lui)o el tiempo )e la rea##ión *e 7iltra al va#%o para obtener la enzima

@ue *e *e#ó por 2: hora* a temperatura ambiente.

!. Recc$&n !e T"n/e/te"$;$cc$&n.

$on la enzima -a a#tiva)a *e realiza la* rea##ione* )e tran*e*teri7i#a#ión @ue *ellevan a #abo en matra#e* )e 25 ml. e #olo#a en ello* tria#ilgli#'ri)o* al#ohol

lipa*a* - )i*olvente en )i7erente* propor#ione* +"art%nez 201,.

2. <L ct$$!! !e #/ #$3// 3e!e "$" en ;nc$&n !e # e!! !e # /e0$## o!e# e/t!o !e 'e"0$nc$&n !e # 0$/0=En la* *emilla* )e la* planta* la* lipa*a* *uelen apare#er prin#ipalmente #on lagermina#ión *obre to)o en la* *emilla* oleagino*a* @ue u*an lo* #i)o* gra*o*#omo 7uente )e energ%a para el )e*arrollo )el embrión. En lo* #ereale* *e )e*#ono#e*u lo#aliza#ión aun@ue *e pien*a @ue *e en#uentran en el en)o*permo a no *er @uela* e4i*tente* *e )eban a #ontamina#ione* #on algAn mi#roorgani*mo +&ello 2000,.

e e*ta manera *e pue)e #on#luir @ue la a#tivi)a) )e la* lipa*a* var%a#on*i)erablemente en 7un#ión )el e*ta)o )e germina#ión )e la* *emilla*.

>. <?1 e;ecto e@e"ce # c$!$;$cc$&n !e# 0e!$o 3" 0e!$" ct$$!! en%$05t$c=

La a#tivi)a) )e un enzima *e ve a7e#ta)a por el p al #ual *e lleva a #abo larea##ión. La #urva a#tivi)a)p pue)e *er )i7erente para #a)a tipo )e enzima +3ig.2,. En el #a*o m* general la #urva tiene 7orma )e #ampana. El valor )e p al #ualla a#tivi)a) e* m4ima *e )enomina p óptimo> )i#ho p no tiene por @u' #oin#i)ir #on el p intra#elular +;ena G !orr%n 201:,. La rela#ión entre el p - la a#tivi)a))epen)e )el #omportamiento #i)oba*e )el enzima - )el propio *u*trato. u*trato -enzima +#entro a#tivo, pue)en #ontener grupo* 7un#ionale* #i)o* - b*i#o* *ien)o



*u gra)o )e )i*o#ia#ión )epen)iente )el p lo @ue )eterminar entre otro*a*pe#to* la #on7orma#ión )e la prote%na la #apa#i)a) )e unión )el *u*trato al #entroa#tivo )el enzima +Km, - la #apa#i)a) )e tran*7orma#ión )el *u*trato +H#at, +;ena G!orr%n 201:,. Lo* e*tu)io* #in'ti#o* a )i7erente* valore* )e p no* propor#ionanin7orma#ión *obre el me#ani*mo #atal%ti#o )e lo* enzima* - la naturaleza )e lo*amino#i)o* m* )ire#tamente impli#a)o* en la #atli*i*.

. <A B1 t"t0$ento co""e/3on!e e# cont"o# !e# ,$oen/o=

e#ono#imiento )e lipa*a* en *emilla* )e higuerilla +i#inu*#ommuni*,. e(ar un e*pa#io PECIN; L P<3E.

. <C&0o 3e!e cnt$;$c" e# conten$!o !e '#$c1"$!o/ en n 0e/t" !e /e0$##/!e o#e'$no//=

ACIDOS GRASOS

El anli*i* )e lo* #i)o* gra*o* )e #ual@uier alimento re@uiere )e la* *iguiente*etapa*?-. <bten#ión )e la materia gra*a por m'to)o )e e4tra##ión en 7r%o #on mez#la )e

*olvente*.

2. erivatiza#ión )e lo* #i)o* gra*o*.Lo* m'to)o* )e )erivatiza#ión *e pue)en )ivi)ir en #uatro #ategor%a*? #atli*i* b*i#a #atli*i* #i)a b*i#a )iazometano otro* m'to)o* )e e*teri7i#a#ión

>. nli*i* por #romatogra7%a ga* l%@ui)o +3< 201:,.

. <C&0o 3e!e !etect" 3"e/enc$ !e ;o/;o#83$!o/=

e lo* pue)e )eterminar gra#ia* a la #romatogra7%a en #apa 7ina +;L$, en )on)ea#tualmente *e utiliza )o* )i7erente* m'to)o* )e anli*i* )e l%pi)o*. En el primer



en7o@ue la* )i7erente* #la*e* )e l%pi)o* e*tn *epara)amente e4tra%)o* - luego #a)a#la*e )e l%pi)o* *e analiza a trav'* )e la meto)olog%a Ani#a )e ;L$. En el *egun)oen7o@ue mez#la* #omple(a* )e l%pi)o* *e *eparan en la* pla#a* )e ;L$ - a#ontinua#ión *e #ara#teriza. La* #la*e* )e l%pi)o* *e )ivi)en en l%pi)o* neutro* #omo lo*trigli#'ri)o* +7orma @ue *e 7orma una mol'#ula )e gli#erol - tre* #i)o* gra*o*, lo*l%pi)o* polare* #omo lo* 7o*7ol%pi)o* - #ole*terol. )ealmente lo* l%pi)o* *on)epo*ita)o* en una pla#a )e gel )e *%li#e ;L$ #on *i*tema* )e *olvente* *e#uen#ial#orrien)o en la mi*ma )imen*ión. elativamente l%pi)o* no polare* #omo l%pi)o*neutro* #i)o* gra*o* - #ole*terol migran a po*i#ione* Ani#a* en la mita) *uperior )el#romatograma mientra* @ue lo* l%pi)o* relativamente polare* #omo lo* 7o*7ol%pi)o* -e*7ingol%pi)o* e*tn *epara)o* en la mita) in7erior )el #romatograma +Mitman G"o*Hovitz 2011,.

El po)er )e la te#nolog%a para la )ete##ión )e l%pi)o* )e ;L$ #uantitativo e*

impre*ionante. E* po*ible )ete#tar la pre*en#ia )e 25 ng )e 7o*7ol%pi)o* 25 ng )e#ole*terol - 50 ng )e l%pi)o* neutro* - #i)o* gra*o*o* +Mitman G "o*Hovitz 2011,.

REFRENCIAS ILIOGRÁFICAS.

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ANEOS.

Ane4o I.

F$' -. "ue*tra* #on *emilla )e higuerilla F$' 2. "ue*tra* #on *emilla )e higuerilla



germina)a* no germina)a*

Ane4o II.

a, $l#ulo )e la #on#entra#ión )e #i)o* gra*o* libera)o* por lipa*a*.

μmolde acidosgrasos

mlmuestra ( A−B)∗100∗ M

V rxn

A volumen )e Na< ga*ta)o por la mue*tra

volumen )e Na< ga*ta)o por el blan#o

M molari)a) )el Na<

V rxn volumen )el me)io )e rea##ión

Se0$##/ /ec/ no 'e"0$n!/.

Me/t" I

umoles deacidograsos

mlmuestra =¿19,2−19,2 /ml∗1000∗0,1 M

18.5ml


mlmuestra =00,00

Me/t" II.


mlmuestra =

¿13−19,2/ml∗1000∗0,1 M

18,5ml


mlmuestra =34,44

Me/t" III.




mlmuestra =

¿16−19,2 /ml∗1000∗0,1 M

18.5ml

umoles deacidograsosmlmuestra

=17,29

Se0$##/ 'e"0$n!/

Me/t" I+


mlmuestra =

¿15−15 /ml∗1000∗0,1 M

18.5ml


mlmuestra =00,00

Me/t" +


mlmuestra =

¿16−15 /ml∗1000∗0,1 M

18.5ml


mlmuestra =5,405

Me/t" +I


mlmuestra =

¿12−15/ml∗1000∗0,1 M

18.5ml


mlmuestra

=16,22



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