UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS MDICASESCUELA DE MEDICINACTEDRA DE GENTICAINFORME DE LABORATORIO #5Reaccin de la cadena de polimerasa PCR

Nombres: Luis Miguel Muoz FonsecaPablo David Parra ParraDiana Elizabeth Snchez MorettaBryan Jair Tern Llumitaxi

Paralelo: 3Grupo:2 Dr. Ramiro Lpez Ayudante de laboratorio: Peter Ramrez febrero 2015

TEMA: EXPRESION DEL ADN

1. OBJETIVOS

Comprender la replicacin y amplificacin del ADN como mecanismo de funcin celular y diagnstico de enfermedades genticas

Analizar y comprender como el mecanismo de la PCR a ayudado en la ingeniera gentica

2. INTRODUCCIN:

La reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin enzimtica in vitro que amplifica millones de veces una secuencia especfi ca de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fi elmente. Para ello, la reaccin aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las clulas. En la reaccin, si usamos como sustrato ADN genmico, entonces tpicamente hablamos de una PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (cido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en ingls). Esta conversin se logra mediante una reaccin conocida como transcripcin reversa y controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molcula de ADNc. Este mtodo fue copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en ADN duplicarse en millones de partculas virales.2 El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresin del ARNm de algn gen de inters.Los elementos importantes en la reaccin son el templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligonucletidos o primers, los desoxirribonucletidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el in magnesio (Mg +), una solucin amortiguadora o buffer y H2 O. Todos estos elementos interactan en tres etapas principales de las que se compone la PCR: desnaturalizacin, hibridacin y extensin. Los equipos en donde se realiza la reaccin son llamados termocicladores, los cuales estn diseados para establecer un sistema homogneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifi quen en cada uno de los ciclos. Al fi nal de la reaccin, para corroborar si se amplifi c la secuencia blanco de inters, los productos de la PCR o tambin llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para confi rmar si la reaccin fue exitosa. A continuacin se explicarn cada uno de los puntos mencionados.

Cmo funciona la reaccin?Recordemos que cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: desnaturalizacin, hibridacin y extensin (Figura 2). A continuacin explicaremos qu sucede en cada una. Desnaturalizacin. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95 C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, ser necesario ms tiempo para romper sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases est formado por tres enlaces, uno ms que las bases de A-T. Adems, depende de la velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto vara de acuerdo al modelo del equipo. Al fi nal de esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirn como templado para el siguiente paso. Hibridacin. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3 del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridacin o temperatura melting (Tm) sea la ptima; sta generalmente oscila entre 50-60 C. Si el diseo de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especifi cidad del complejo ser efi ciente. Extensin. En esta etapa, la Taq polimerasa acta sobre el complejo templado-primers y empieza su funcin cataltica a una velocidad muy rpida; agrega dNTPs complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensin de las cadenas es en direccin de la sntesis del ADN, es decir, de 5 a 3. La temperatura ptima para la reaccin es de 72 C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al fi nal del ciclo, se habrn formado los amplicones con un tamao dictado por el nmero total de pares de bases (pb) que deber ser conocido por el investigador.3. MATERIALES

Del Laboratorio

Muestras de ADN Kit de icro globin Termociclador en tiempo real Reactivos de PCR Tubos eppendorf, micropipetas, puntas estriles, agua estril, microcentrfuga. Cubeta de electroforesis. Fuente de alimentacin. Equipo de visualizacin de geles.

Del Estudiante

Mandil Guantes, lpiz y hoja de trabajo4.

5.

6. 7.

8. Bibliografia:http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf

https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%f3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf?sequence=1