IntroduccionLas primeras clulas eran relativamente simples y
pequeas, similares a los organismos que actualmente conocemos como
procariontes. Con el pasar del tiempo ya la evolucin de este
organismo aparecieron las clulas eucariontes, ms grandes y de
organizacin ms compleja, que hoy forman parte de animales y
plantas.A diferencia de las clulas procariontes, las clulas
eucariontes poseen un ncleo que contiene la mayora del ADN el cual
se encuentra envuelto en una membrana. Esto deja al material
gentico en un compartimento separado del resto de los contenidos de
la clula contenidos en el citoplasma, donde ocurren las reacciones
metablicas.En el citoplasma se pueden distinguir distintos
organelos: cloroplastos, mitocondrias, retculoendoplsmico, aparato
de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los
cuales poseen diversas enzimas que cumplen funciones especficas
dentro de una clula.Cada uno de estos organelos gracias a sus
caractersticas y distintos mtodos contribuyen con el funcionamiento
de la celula como por ejemplo la mitocondria le provee energa , el
peroxisoma detoxifica a la celula, ribosomas participa en
tradunccion del RNA mensajero y citoesqueleto le da forma,
movimiento y ubica los organelos en el citosol.Para llegar a tratar
con estos organelos existen distintos mtodos pero el que trataremos
en este practico es el fraccionamiento Subcelular es una tcnica
utilizada que permite obtener los componentes celulares aislados,
en grandes cantidades y con un alto grado de pureza. Esta tcnica
consiste en la separacin de los componentes de la clula basndose en
su tamao y densidad por lo que los organelos con mayor densidad y
tamao quedan en el fondo del tubo, son llamado pellet y aquellos
que poseen una menor densidad con un menor tamao quedan suspendidos
en una solucin de nombre.Objetivo: Comprender el fundamento de la
tcnica de fraccionamiento subcelular por medio del rompimineto de
la celula y la separacin de los organelos mediante un campo
gravitacional e identificar los componente celulares.
Materiales y MtodosActividad 1 : Fraccionamiento
subcelularA)Fraccionamiento subcelular de Higado-En este
experimento el profesor tomo hgado, el cual lo puso en un vaso de
precipitado en donde corto el hgado con tijeras y lo puso en hielo
para que asi no ocurrieran reacciones en el hgado despus de esto
procedi a moler el hgado en la maquina de moler a ( )RPM y obtuvo
el homogenizado total el cual nos entrego 5 ml de este vertido en
un tubo de Falcon, el cual pusimos en hielo por unos 5 minutos y
luego y asi obtuvimos el homogenizado crudo. Despus llevamos el
homogenizado a la centrifuga y la profesora lo puso a ( ) por 10
minutos. Luego al retirarlo obtuvimos un sobredenante en la
superficie y un pellet al fondo del tubo, asi llevamos el
sobredenante a otro tubo falcon para separarlo del pellet. Luego al
pellet le agregamos 1 ml de buffer y lo resuspendimos con la pipeta
entregada y lo llevamos al hielo nuevamente. posteriormente
llevamos el sobredenante a la centrifuga nuevamente pero ahora a la
mayor velocidad por ( ) minutos , y nuevamente separamos el
sobredenante del pellet en otro tubo falcon , despus el pellet
obtuvido se le agrego Buffer, fue resuspendido y se puso en
Hielo.B)Evaluacion del fraccionamiento subcelular mediante
marcadores moleculares.-En este experimento la profesora nos
facilito succinato azul metileno y vertimos 1ml en 4 cuatro tubos
de ensayo distintos enumerndolos respectivamente , luego de esto al
tubo numero 1 le echamos 1ml de agua al numero 2 con ayuda de la
profesora le echamos un poco de el primer pellet obtenido y luego
vaselina liquida para evitar la oxidacin de la muestra. Al nmero 3
le echamos el pellet obtenido despus y la vaselina, y finalmente al
tubo numero 4 le echamos el sobredenante obtenido en la segunda
centrifugacin con vaselina, luego llevamos los tubos a un bao de
termoregulacion a 37C por unos 5 minutos aprox.B.2)Observacion
micrscopica de las fracciones-En este experimento en un portaobjeto
colocamos una gota de la suspensin de nucleos con la ayuda de una
pipeta y la observamos al microscopio. Despues realizamos lo mismo
pero ahora le agregamos una gota de azul de tripan, y asi mismo lo
realizamos con la suspensin de mitocondrias.
