INIA TECNOLOGÍA DE PRODUCCIÓN DE CONEJOS PARA CARNE ... · INIA 47 TECNOLOGÍA DE PRODUCCIÓN DE CONEJOS PARA CARNE FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA EN EL CONEJO Fisiología de la reproducción

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TECNOLOGÍA DE PRODUCCIÓN DE CONEJOS PARA CARNE

FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA ENEL CONEJO

Fisiología de la reproducción enel macho

Las pautas de comportamiento sexualpueden observarse ocasionalmente a partirde los tres meses de edad, siendo probableobtener las primeras eyaculaciones en tor-no a los cuatro meses. A partir de esta edad,la proporción de machos que manifiestancomportamiento de monta y eyaculan depen-derá de las condiciones ambientales y de laestirpe genética.

En general, la mejor edad para la primeracubrición fértil en estirpes o líneas de forma-to medio (3,5 a 4,5 kg) se sitúa en torno alos cinco meses, alcanzando la plena pro-ducción espermática a los siete u ocho me-

ses de edad, pudiendo mantener su activi-dad sexual hasta los cuatro años, según laestirpe genética, condiciones ambientales ymanejo.

Las líneas o razas de gran formato (5 a 7kg) presentan un inicio reproductivo más tar-dío, habiéndose observado que los compor-tamientos de monta no se manifiestan hastalos cinco e incluso los seis meses de edad.

La duración de la espermatogénesis esde unos 49 días. La producción testiculardiaria de espermatozoides se sitúa en tornoa 150-250 millones con notables variacionesgenéticas y estacionales. La capacidad epi-didimaria de almacenamiento es limitada(1.300-1.900 millones), encontrándose el 15-20 % de los espermatozoides en la cabezay cuerpo del epididímo y el 80-85% en la coladel epidídimo El conducto deferente contie-ne menos del 10 % de los espermatozoidesproducidos (Theau-Clement et al., 1995).

TÉCNICAS Y MANEJO REPRODUCTIVODEL CONEJO

José S. Vicente1

Raquel Lavara1

María P. Viudes de Castro1

Francisco Marco-Jiménez1

1Instituto de Ciencia y Tecnología Animal. Universidad Politécnica de Valencia, España.

RESUMEN

En la actualidad, las granjas de conejo se deben de gestionar con criterios em-presariales para incrementar tanto la productividad como la competitividad. Unaparte importante de este desafío es la utilización correcta del manejo y de lastécnicas reproductivas en una explotación cunícola. En la presente revisión sepretende por un lado presentar las características reproductivas de la especie ypor otro lado mostrar las diferentes tecnologías reproductivas disponibles y suposible aplicación en las granjas comerciales.En relación con la fisiología reproductiva, se enumeran las características másrepresentativas de la especie así como la influencia que ejercen los diferentesfactores sobre las mismas (genéticos, ambientales y de manejo). En el apartadode tecnología reproductiva se exponen las diferentes técnicas utilizadas en laactualidad tanto para el manejo en granja como para la difusión y conservación derecursos genéticos.

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El eyaculado presenta un color blanconacarado en el que pueden observarse pe-queñas partículas microscópicas de gel o porel contrario una fracción gelatinosa fácilmen-te extraíble del eyaculado. El número deespermatozoides que contiene un eyacula-do (200-600 millones en 0,2 a 1 ml, Figura 1)disminuye sustancialmente tras el tercereyaculado si éstos se obtienen en el mismodía. El plasma seminal de conejo contienenumerosas vesículas de origen prostáticoque parecen conferir estabilidad a las mem-branas espermáticas reduciendo el estrésoxidativo y la capacitación post-eyaculación(Mouraki et al., 2010). El plasma seminalpresenta un contenido proteico que se sitúaentre 15 y 36 g/L, en torno a unos 5g/L delípidos totales, de los que el colesterol re-presenta un 30 % y, alrededor de 1,9 g/L defructosa (Yousef et al., 2005).

En general, el conejo manifiesta un ele-vado ardor sexual que, a diferencia de otrasespecies, no se corresponde con sus posi-bilidades de fecundar a un hembra. La ma-yor parte de los machos de conejo de estir-pes de formato medio son capaces de reali-zar 10-12 montas en un breve lapso de tiem-

po (30 a 60 minutos, Ambriz et al., 2002).Este comportamiento provoca en algunoscunicultores un manejo reproductivo inade-cuado. De un lado suele existir una propor-ción insuficiente de machos frente a hem-bras (menor de1:15) y de otro, se suele daruna utilización abusiva y poco eficaz de losmachos que presentan mayor ardor sexual.

La cubrición de una coneja más de unavez puede mejorar ligeramente las posibili-dades de desencadenar la ovulación, puestoque esta especie es de ovulación inducida.Sin embargo, si se establece como prácticacubrir una coneja más de dos veces con elmismo macho, no debe olvidarse que el ma-cho no produce una gran cantidad de esper-matozoides y que no dispone de unas gran-des reservas seminales, por lo que un inten-to, claramente innecesario, de asegurar lainducción de la ovulación puede desencade-nar la falta de fertilidad de ese macho en unacubrición posterior sobre otra hembra. Es-tos problemas se acentúan durante el vera-no y el otoño, en primer lugar, por una pérdi-da de ardor sexual debido a las altas tempe-raturas y, en segundo lugar, por una dismi-nución de la producción espermática (Nizzaet al., 2003; Safaa et al., 2008).

Figura 1. Espermatozoides de conejo tras su recuperación mediante vagina artificial.

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En general, desde el punto de vista de lautilización de machos para inseminación ar-tificial, una frecuencia de dos eyaculados porsemana, un fotoperiodo 16:8 y una alimen-tación rica en ácidos grasos de la serieomega 3 y 6, así como en Zn, Se y/o vitami-na E permite obtener mejora en la produc-ción espermática o en los parámetros es-permáticos indicadores de calidad (Pascualet al., 2004; Castellini et al., 2007).

Fisiología de la reproducción enla hembra

En la coneja la pubertad se alcanza, engeneral, cuando alcanzan el 70-75 % del pesoadulto (de tres meses y medio a cuatro me-ses en líneas de formato medio), si bien espreferible esperar a que hayan alcanzado loscuatro meses y medio de edad (en líneas deformato medio) para iniciar la reproducción.

Las manifestaciones externas que indi-can el celo en la coneja se limitan al reflejolordósico y al aumento de la turgencia y co-loración de los labios vulvares.

La coneja es un mamífero polítoco de ci-clo reproductivo corto. Sus cuernos uterinosestán completamente separados entre sí,desembocando en la vagina de forma inde-pendiente a través de sendos canales cervi-cales, por lo que no se producen migracio-nes de embriones de un cuerno al otro.

La coneja no presenta ciclo estral, ya quela ovulación en esta especie no es una con-

secuencia directa de la culminación del de-sarrollo folicular. Sin embargo, presenta unaalternancia entre fases de aceptación y noaceptación de la monta, que está relaciona-da con el desarrollo y la atresia de folículospre-ovulatorios responsables del aumento delos niveles de estradiol y del reflejo lordósi-co. La coneja requerirá, además, de la esti-mulación coital para desencadenar la des-carga de GnRH que conducirá a la ovula-ción unas 9-10 horas post-coito. Si la ovula-ción no es seguida por una gestación, laconeja presenta un estado de pseudogesta-ción que durará unos 17 días (Figura 2).

En el conejo, el esperma se deposita enla zona superior de la vagina. Al igual que enotros mamíferos, la fecundación se produci-rá en el ámpula unas 14 horas después dela monta o inseminación. Los estadios dedesarrollo embrionario previos a la implanta-ción se caracterizan por la influencia quesobre su desarrollo ejercen los ambientesoviductal y uterino. En las primeras 68-72horas, a su paso por el oviducto, se producela segmentación de los embriones y se ini-cia la formación del blastocisto. En este pe-ríodo se deposita la cubierta de mucina alre-dedor de la zona pélucida. La secuencia delproceso de segmentación, en función deltiempo postcoito, es la siguiente: a las 14-16 horas, expulsión del segundo corpúsculopolar; a las 21-24 horas postcoito (h.p.c.),primera división embrionaria; a las 48 h.p.c.,8-16 células; a las 60 h.p.c., mórula y a las72h.p.c., blastocisto temprano (Figura 3).

Hembrareceptiva

Palpación

OvulaciónParto

Días 30-31-32

PseudogestaciónMonta

Día 0 - 1 - 2 10 - 11 - 12 16 - 17 - 18

Figura 2. Ciclo reproductivo y pseudogestación en conejas.

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Una vez el blastocisto ha alcanzado elútero, inicia una etapa de intensa prolifera-ción y diferenciación del embrioblastema yel trofoblasto. En este período, las cubiertasembrionarias sufren importantes alteracionescomo consecuencia tanto del proceso deexpansión del blastocisto como de la activi-dad enzimática a la que se ven sometidas.La zona pelúcida y la cubierta de mucina sonprogresivamente transformadas y reemplaza-das. De esta forma, el blastocisto presentafinalmente tres capas con diferente origen.La más externa, el gliolema, que parece de-rivar de las secreciones uterinas; la capa si-tuada en el medio, que parece representarrestos de la capa de mucina; y la últimacapa, la neozona, que podría estar formadapor secreciones del trofoblasto, o bien, porsecreciones uterinas que han difundido a tra-vés de las otras capas, situándose en la zonamás interna. Las principales funciones que

se han postulado para estas capas son faci-litar el espaciamiento de los blastocistos enel cuerno uterino en el momento de la im-plantación e inmovilizar y orientar a éstosen los lugares de implantación (Denker,2000).

Una vez en el útero y hasta el quinto día,los embriones colonizan progresivamente loscuernos uterinos, entre los días seis y sietese observa ya una distribución equidistantede los mismos a lo largo del cuerno uterinoque los contiene. En esta etapa los blasto-cistos incrementan su diámetro desde 1 a5 mm. La expansión del blastocisto no sóloprovoca dicho espaciamiento sino que ade-más, determina finalmente su inmovilización,quedando ya establecida la posición definitivaque ocupará cada embrión en el cuerno uteri-no durante la gestación. Siete días post coitose observan dilataciones antimesometriales,a modo de pequeñas hinchazones traslúcidas

Figura 3. Desarrollo embrionario y fetal en el conejo.

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(decidualización), en las que se encuentrancada uno de los embriones. Entre los días 10y 17 se constituirá y desarrollará una placentacorioalantoidea y hemicorial (Hoffman et al.,1998). El parto tiene lugar 30-32 días post-coi-to, en función del número de fetos gestados yde la estirpe genética (Figura 3).

La coneja es capaz de iniciar una nuevagestación con éxito desde el mismo momentodel parto y durante toda la etapa de lacta-ción, no siendo por ello necesario esperar aldestete de los gazapos. Por ello es posibledefinir varios regímenes reproductivos (inten-sivo, semi-intensivo o extensivo) en los quelos intervalos entre partos teóricos serán de35, 42 y 60 días. En condiciones de explota-ción semi-intensiva (el más habitual hoy endía), las conejas son montadas o insemina-das 10-12 días post-parto, dando lugar a unsolape parcial de gestación y lactación (de19 a 21 días). En el sistema de explotaciónintensivo las conejas serán montadas o in-seminadas de 3 a 5 días post-parto. Es ne-cesario reseñar que las necesidades nutriti-vas de los animales y los procedimientos desincronización para alcanzar una productivi-dad óptima deben adaptarse al régimen re-productivo elegido.

En general, a menos que se utilicen mé-todos de bioestimulación basados en el con-trol del fotoperiodo, se recomienda seguir unfotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuri-dad para evitar o reducir las fluctuacionesestacionales.

El grado de receptividad de las conejas,caracterizado esencialmente por el color yturgencia de los labios vulvares, determinaen gran medida los resultados de fertilidad.La probabilidad de que una coneja con unacoloración blanquecina (pálidos) acepte lamonta es prácticamente nula (<10 %), conun color rosado se situaría entre el 40 % y el60 %, con un color rojizo entre el 80 y el100 % y con un color violáceo entre un 60 yun 80 %. A su vez la probabilidad de que lashembras montadas queden gestantes sigueuna proporcionalidad semejante. En los nue-vos sistemas en los que la explotación cuní-cola se organiza en bandas, los tratamien-tos para la sincronización de celos en unconejar son imprescindibles (una revisiónmás extensa sobre los procedimientos y fac-

tores a tener cuenta puede encontrarse enTheau-Clement, 2007).

Los tratamientos hormonales de induc-ción del celo más generalizados consistenen promover el crecimiento de una poblaciónde folículos ováricos, utilizando hormonas deacción folículo estimulante, la más utilizadaes la PMSG o eCG, que tiene como ventajasu bajo precio y la fácil aplicación (dosisúnica subcutánea o intramuscular). El incon-veniente que presenta es la variación de larespuesta individual, la formación de anticuer-pos (25 U.I., tras 10-12 aplicaciones) y, enocasiones, una posible inducción anticipa-da de la ovulación con dosis superiores de-bido a su actividad secundaria LH. Tanto enmonta natural como en inseminación artifi-cial, la PMSG se inyecta dos días antes dela monta o inseminación. La dosis recomen-dada actualmente es de 8 a 12 U.I. dePMSG. En general, alrededor del 95 % delas hembras tratadas con PMSG muestranevidentes signos de receptividad a las 48horas del tratamiento.

La prostaglandina F2α y sus análogosinducen la luteolisis y por consiguiente lareceptividad. Deben ser utilizadas tras unapalpación negativa (a los 12 días de la cubri-ción), en inyección intramuscular y las hem-bras se cubrirán de nuevo a los dos días.También es posible su utilización combina-da para provocar el parto y favorecer la cu-brición de las conejas cuando se utiliza elrégimen intensivo.

Otra posibilidad de inducir la receptividadsobre conejas en fase de lactación es el cie-rre del nidal 24-36 horas antes de la monta oinseminación (práctica cada vez mas co-mún). Este bloqueo del amamantamiento notiene efectos negativos sobre la viabilidad delos gazapos o sobre la incidencia de mami-tis. El efecto positivo que se obtiene sobrela receptividad o celo de la coneja es conse-cuencia de la disminución de la secreciónde prolactina y el aumento consecuente degonadotropinas. En el caso de hembras pri-míparas lactantes, Arias-Álvarez et al.(2010), observaron que la calidad ovocitariadependía del tipo de método de inducciónde receptividad empleado, presentando labioestimulación (cierre de nidales durante24 h) mejores resultados frente al tratamien-

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to convencional de eCG (25 UI). Las hem-bras tratadas con eCG mostraron un mayornúmero de folículos atrésicos y una menormaduración citoplasmática de los oocitos(medida como tasa de migración de los grá-nulos corticales).

Por último, también se puede sincronizara las hembras mediante la modificación delfotoperiodo. Las hembras son sometidas aun fotoperiodo 8 :16 antes del parto y traséste se incrementa progresivamente hastalas 16:8 en la semana en la que se produci-rá la cubrición (Theau-Clement et al., 2000).

TECNOLOGÍA REPRODUCTIVAPARA LA PRODUCCIÓN,DIFUSIÓN Y CONSERVACIÓNDE RECURSOS GENÉTICOSDEL CONEJO

El desarrollo alcanzado en la tecnolo-gía reproductiva permite hoy, de un ladoincrementar las posibilidades de mejora ydifusión genética de las líneas comercia-les, y de otro conservar y caracterizar losrecursos genéticos de esta especie. Así,la inseminación artificial ha contribuido no-tablemente al desarrollo de la cuniculturaindustrial, mientras que técnicas como lacrioconservación de espermatozoides oembriones han contribuido a generar ban-cos de germoplasma, tanto de líneas co-merciales como de algunas razas, favore-ciendo en ocasiones la difusión y el cono-cimiento genético así como la conserva-ción frente a posibles epizootias o pérdi-das de patrimonio genético.

Inseminación Artificial

La utilización de la inseminación artifi-cial persigue un único objetivo en granjascomerciales: incrementar la productividad.Esta mejora de la productividad debe lo-grarse por:- la reducción del número de machos en

granja (con el aumento consiguiente delnúmero de hembras)

- la introducción de nuevos sistemas de or-ganización (dos bandas o banda única)

- la utilización del semen de machos decaracterísticas deseadas, como por ejem-plo de elevada velocidad de crecimientoEn los últimos años se ha producido

una rápida expansión de la inseminaciónartificial en el conejo asociada a una me-jora organizativa del manejo en las explo-taciones y a un incremento en el tamañode las explotaciones. Esta expansión noha conllevado en España, al igual que enotros países como Italia o Francia, sus-tanciales avances en las técnicas de in-seminación que todavía se encuentra limi-tada por la variabilidad de resultados de laaplicación del semen conservado y por unadeficiente relación coste-beneficio del pro-ceso. La mayor parte de los estudios rea-lizados se han centrado sobre el controlde la receptividad de la hembra y de la in-ducción de la ovulación. Unos pocos tra-bajos han dedicado su atención al com-portamiento, manejo y optimización delmacho de inseminación. Y en muy pocoscasos se ha utilizado la inseminación arti-ficial en cunicultura para mejorar la difu-sión de animales seleccionados a las ex-plotaciones y consecuentemente la produc-tividad de las mismas. Se ha perdido asíuna de las principales ventajas de la inse-minación artificial, la difusión de los mejo-res machos.

Tecnología de la inseminaciónartificial

El semen de conejo puede utilizarse re-frigerado, los resultados obtenidos median-te inseminación artificial (I.A.) con semenrefrigerado son de un 60-80 % de fertilidad,con una prolificidad similar a la de montanatural (8-10 gazapos vivos por parto). Sinembargo, la inseminación artificial en cuni-cultura se encuentra limitada por la baja re-lación eyaculado:hembras inseminadas(1:10) y por el tiempo de refrigeración reco-mendado para el semen (24-48 horas a 15-18 ºC) así como por la tecnología de conge-lación de semen, que en esta especie, porel momento, no ofrece resultados competiti-vos a nivel de explotación, ya que la motili-dad y normalidad acrosómica post-descon-gelación desciende un 50 %, resultando unporcentaje de gestación en torno al 40 % y

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una pérdida de prolificidad alrededor de 2gazapos. En determinadas líneas y con fi-nes de conservación genética se han obte-nido buenos resultados de fertilidad (80 %) yprolificidad con semen congelado.

La técnica a aplicar se resume en:- extracción del semen del macho utilizan-

do una vagina artificial- dilución del semen (1:5 a 1:25)- conservación del semen hasta 48 horas

después de su recolección- inducción de la ovulación en el momento

de la inseminación

Recogida de eyaculadosEl uso de vagina artificial es el método

más utilizado para la recogida del semen enconejo, ya que permite utilizar temperaturas(en torno a 50 ºC) y presiones adecuadaspara estimular la eyaculación de los machos.

La extracción del semen, al igual que lamonta natural, se realiza en la jaula del ma-cho. En general, son pocos los machos quepresentan rechazo al uso de la vagina artifi-cial, bien sea utilizando como engaño unaconeja, una piel de coneja u otras dispositi-vos de simulación. En torno a un 10-30 % delos machos no son útiles por diversas cir-cunstancias entre las más importantes seencuentran la inadaptación a la vagina (fre-cuentes eyaculaciones con orina) y una bajaproducción y calidad del semen (suficientepara monta, insuficiente para rentabilizar unmacho para inseminación).

El macho realiza la eyaculación de lamisma forma que en la monta natural, em-pujando hacia adelante y posteriormentecayendo de costado o de espaldas.

La frecuencia de recogida más extendidaes la de dos eyaculaciones con un lapso detiempo de 15-30 minutos entre ellas, una odos veces por semana.

Análisis y contrastación seminalLa fertilidad del macho está relacionada

directamente con la calidad del semen. Porello, el objetivo es evaluar la calidad del se-men y predecir, a través de la misma, la ca-pacidad fecundante de los espermatozoides.Son muchos los test de valoración, pero po-

cos los que han sido correlacionados con lafertilidad y menos los que habitualmente seutilizan en la valoración rutinaria del semen.El color del eyaculado es blanco nacarado.La primera operación sobre un eyaculado esretirar cualquier partícula visible de gel paraevitar la aglutinación posterior de los esper-matozoides sobre éste.

Las técnicas o test de análisis son simi-lares a los descritos en otras especies encuanto a evaluación de la movilidad, concen-tración, viabilidad, morfoanomalías o estadodel acrosoma. Tan sólo debe tenerse encuenta que el semen de conejo presentanumerosas partículas seminales que suelendificultar la evaluación de la movilidad conlos sistemas de evaluación automáticos(CASA) y que las diluciones para su evalua-ción no deberían superan la relación 1:20,dado que algunos autores han observadomodificaciones de los parámetros de movili-dad probablemente debidas a un incrementode los daños por lipoperoxidación en eyacu-lados diluidos 1:30 (Castellini et al., 2000).

A diferencia de otras especies, en gene-ral, la inseminación artificial en conejo se lle-va a cabo con mezclas heteroespérmicas,quizás por el tradicional bajo número de do-sis obtenidas a partir de la producción es-permática de un sólo macho o por la no uti-lización de machos de alto valor genético.No obstante, los eyaculados deben evaluar-se individualmente antes de su mezcla y di-lución definitiva. Los estudios sobre las ven-tajas o desventajas de la utilización de lasmezclas heteroespérmicas frente a la utili-zación de machos individualizados sean es-casos y por lo tanto difícilmente se procedea la valoración individual de machos, lo quepermitiría localizar machos subfértiles quepodrían estar afectando al conjunto de lamezcla y reduciendo en algunos puntos lafertilidad de las granjas.

Una práctica recomendable es la dilu-ción 1:3-1:5 del eyaculado inmediatamen-te después de la recolección. Procedien-do tras su evaluación, al menos en térmi-nos de movilidad y porcentaje de esper-matozoides anormales (Lavara et al.,2005), a su mezcla y dilución definitiva enfunción de la dosis espermática a utilizar(6, 16, 40 millones de espermatozoides por

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dosis) y del periodo de conservación (8,24,48-72 h, respectivamente).

Características de los diluyentesLos diluyentes más utilizados actualmen-

te están constituidos por tampones orgáni-cos como el Tris-Cítrico (Roca et al., 2000).Este podría formularse para tener un pH entorno a 6,9 y una osmolaridad de 300-340mOsm/K con 250mM de Tris-hidrimetil-aminometano, 82,7mM de ácido cítrico,50mM de glucosa y antibióticos para con-trolar el crecimiento bacteriano (500 a1000 UI de penicilina y 500 a 1000 µg deestreptomicina por mililitro de diluyente). Conla finalidad de mejorar la distribución y facili-tar la aplicación de la técnica de insemina-ción se han desarrollado sistemas de enva-sado de semen de conejo monodosis basa-dos en la gelificación del diluyente. Esta geli-ficación se puede obtener, por ejemplo aña-diendo 1,4 % de gelatina (g/v) al diluyente yconservando la dosis seminal refrigerada has-ta su aplicación (López-Gatius et al., 2005).

Recientemente, se ha evaluado, utiliza-do y comercializado un diluyente al que sele adiciona un análogo sintético de GnRHcon la finalidad de inducir la ovulación me-diante la absorción de ésta vía mucosa vagi-nal. La utilización de este diluyente evita quetras la inseminación sea necesario inyectarintramuscularmente o subcutáneamente elanálogo.

ConservaciónRefrigeración

El semen que ha de ser conservado porrefrigeración es diluido en un medio conven-cional y enfriado lentamente hasta 15-18 ºC(método habitual) o utilizando un medio dedilución modificado por la adición de yemade huevo enfriado hasta 5 ºC (no es habi-tual).

El semen refrigerado permanecerá a latemperatura de refrigeración hasta su utili-zación. La perdurabilidad del mismo es fun-ción del genotipo, medio utilizado y calidaddel eyaculado, oscilando entre las 24-72horas en conejo. Recientemente, se han

obtenido buenos resultados en la utilizaciónde semen de conejo después de 72 horasasociado a su inmovilización en gel (López-Gatius et al., 2005). Las condiciones experi-mentales en las que se desarrolló implicanla utilización del diluyente con gelatina, unadosis en torno a los 40 millones de esper-matozoides, una temperatura de conserva-ción de 15-18 ºC e inseminación de hembrasreceptivas.

Congelación de semen

El desarrollo de los métodos de congela-ción de semen en el conejo se inició en losaños 60, quedando tempranamente descar-tado el glicerol, habitual en otras especies,como crioprotector (revisar Mocé y Vicente,2009). Actualmente, los medios utilizadospara congelar semen de conejo incluyen,además de los diluyentes tradicionales (Tris-cítrico-glucosa), un crioprotector como laacetamida o el dimetil sulfóxido y en ocasio-nes se suplementan con yema de huevo.

El semen debe ser envasado en pajuelasde inseminación (0,25 ó 0,50 ml) y sufrir unproceso de enfriamiento (entre 45 min. y4 horas a 5 ºC), para posteriormente perma-necer durante 15 minutos a -110 ºC y porúltimo ser almacenado a -196 ºC.

La posibilidad de inseminar con semencongelado con fines productivos hay quedescartarla actualmente, fundamentalmentepor sus resultados. Los menores porcenta-jes de motilidad espermática post-descon-gelación (32-50 % con dimetilsulfóxido y gli-cerol como crioprotector, y 43 % con aceta-mida como crioprotector), obligan a practi-car diluciones menores que con semen fres-co, esto junto con la obtención de una tasade fertilidad y prolificidad generalmente me-nor que con semen refrigerado cuando se haaplicado para producción (40-50 % de fertili-dad), hacen que este método no sea, hastaahora, comercializable. Existen muy pocasexperiencias en las que el semen congeladohaya dado resultados de fertilidad y prolifici-dad comparables al semen fresco. En gene-ral estos buenos resultados se asocian a lí-neas genéticas o a la utilización de un ele-vado número de espermatozoides por dosis(90-100 millones).

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En otras especies han sido localizadasproteínas seminales correlacionadas tantocon la fertilidad del semen no congeladocomo congelado (Maxwell et al., 1999;Killian et al., 1999). No sólo es necesariodesarrollar una metodología de valoración queproporcione información sobre las probabili-dades de uso con éxito de un semen conge-lado y que permita estudiar y evaluar conrapidez modificaciones en los métodos deconservación, sino además conocer si enconejo es posible localizar estas proteínasy su modo de actuación para favorecer lautilización rutinaria del procedimiento de con-gelación.

Dosis de inseminaciónEn general la mayor parte de los centros

de inseminación utilizan dosis en torno a 30-40 millones de espermatozoides. Desde1995, en la Universidad Politécnica de Va-lencia (UPV) hemos llevado a cabo variasexperiencias para determinar el número mí-nimo de espermatozoides requeridos en in-seminación artificial con los machos de lalínea R. Los resultados demostraron que con4 millones de espermatozoides podían obte-nerse tasas de fertilidad y prolificidad com-parables a los observados por otros autorescon un número de espermatozoides sensi-blemente superior (74 % de fertilidad al par-to y 9,4 nacidos vivos, Vicente y Viudes-de-Castro, 1997). Esto ha permitido multiplicar,al menos por cuatro, las posibilidades dedifusión del semen de estos machos. Si bienes cierto que todos aquellos técnicos y cu-nicultores formados por nuestro laboratoriotienen como norma utilizar un mínimo de 6millones de espermatozoides por dosis enlas primeras 12 horas, siendo los resultadosmedios obtenidos en más de un millón inse-minaciones realizadas muy satisfactorios, loque proporciona un margen de garantía paralos cunicultores. Por supuesto, al igual queotras metodologías de trabajo de otros gru-pos o centros de inseminación, la interac-ción con determinadas prácticas de manejo,ambiente o tipo de animal puede provocarque los resultados, en un porcentaje bajo deexplotaciones, no sea el deseado ni por loscentros ni por el cunicultor. En ocasiones tansólo es necesario analizar si se han esta-

blecido las condiciones necesarias que hande cumplirse en una granja que vaya a utili-zar la inseminación para corregir progresiva-mente los problemas.

El número de hembras inseminadas pormacho y semana oscila entre las 10 y 20 de latécnica tradicional, siendo posible alcanzar las50 ó 100 con la técnica anteriormente citada,aunque reduciendo el tiempo de conservación.

El volumen de semen diluido que se utili-za en inseminación artificial en coneja es de0,5 a 1 mililitro por dosis.

Posición del animal e inseminaciónEs posible inseminar con la coneja en

posición dorsal o ventral con la ayuda de unasegunda persona que inmoviliza la coneja(generalmente cabeza y lomo) mientras elinseminador utiliza una mano para separarlos labios vulvares y favorecer la introducciónde la cánula. En otras ocasiones, bien me-diante un dispositivo tipo cañón o simplemen-te inmovilizando la coneja dorsalmente conla mano (lomo y cola) y codo (cabeza y nuca)sobre su jaula, la inseminación puede serrealizada por una sola persona.

Una vez escogido y preparado el materialpara inseminar, se introduce por la vagina dela hembra el catéter o pistola de insemina-ción (si tiene acodadura, deberemos intro-ducir ésta hacia la parte dorsal), evitando suintroducción en la uretra, situada en la parteventral de la vagina. Pasada la pelvis, si elcatéter de inseminación es curvado, se giraunos 180 º y se prosigue su introducción has-ta que se alcanza el fondo de la vagina. En-tonces se presiona el émbolo para depositarel semen.

La hembra ha de ser inducida a ovularinmediatamente después de la inseminacióncon un análogo sintético de GnRH (20 µg deGonadorelina, 0,8 a 1 µg de Acetato de Bu-serilina, triptorelina o deslorelina ). Tradicio-nalmente estos análogos se suministran víaintramuscular, sin embargo, es conocido queestos péptidos sintéticos pueden ser absor-bidos vía mucosa y por ello en los últimosaños se ha añadido a la dosis de insemina-ción (Quintela et al., 2004 y 2009, Viudesde Castro et al., 2007; Vicente et al., 2008 y2011). La absorción vía mucosa vaginal de

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los análogos estudiados hasta el momentoparece ser menos eficiente que la intramus-cular, siendo necesario incrementar notable-mente la cantidad de análogo sintético aña-dido a la dosis de inseminación (por ej.: de5 a 16 µg de acetato de buserilina, 30 µgpara la deslorelina) para obtener una eleva-da tasa de inducción de la ovulación y bue-nos resultados de fertilidad y prolificidad (74-80 %, 9,6-10,0 gazapos respectivamente).

Producción y crioconservaciónde embriones. Restauración depoblaciones

Métodos de superovulación yobtención de embriones

La recuperación o producción de embrio-nes en el marco de un programa de conser-vación pretende no sólo obtener un elevadonúmero de embriones, sino además que és-tos provengan del mayor número de oríge-nes macho y hembra, con el fin de obteneruna adecuada representación de la poblaciónoriginal.

La obtención de óvulos es una etapa im-prescindible tanto para los programas deconservación ex situ de recursos genéticos,como para su aplicación en diferentes técni-cas reproductivas como ICSI, FIV o transfe-rencia nuclear. En conejo, es habitual quelas recuperaciones de ovocitos tengan lugarpost-mortem. Para la obtención de ovocitosinmaduros se suelen utilizar tanto las técni-cas de cortes foliculares -por el reducido ta-maño de los folículos antrales- como la pun-ción folicular (en torno a 0,6-2 mm de diáme-tro por folículo). En cambio, si se deseanrecuperar óvulos maduros la técnica utiliza-da con más frecuencia es la recuperaciónpost-mortem, mediante lavado oviductal, rea-lizado a las 14-16 horas tras la inducción dela ovulación. La recuperación de óvulos invivo por laparotomía o laparoscopia es téc-nicamente posible pero inusual, a diferenciade la recuperación de embriones.

La obtención de embriones in vivo por la-paroscopia ofrece la posibilidad de realizarvarias veces el procedimiento para incremen-tar u optimizar el número de embriones re-

cuperados por hembra, en especial cuandose utilizan poblaciones con escaso númerode individuos o animales de gran valor gené-tico (Besenfelder et al., 1998; Mehaisen etal., 2005; Cortell et al., 2010, Figura 4). Engeneral, la obtención de óvulos y embrionesse realiza tras un tratamiento de superovula-ción, ya que las técnicas a las que puedendestinarse posteriormente (FIV-Crioconserva-ción, Clonación o Transgénesis) presentanbajas eficiencias, además del elevado costeeconómico cuando la técnica de recupera-ción se realiza in vivo. Sin embargo, la cali-dad de los embriones y/o óvulos se ve alte-rada por los tratamientos de superovulación,ya que, en muchas ocasiones, aumentan loscasos de óvulos no fecundados, se incremen-ta el número de embriones que presentananomalías en su desarrollo y, entre los mor-fológicamente normales, se observa una dis-minución de su viabilidad.

Los resultados de los tratamientos desuperovulación son muy variables. Como yase ha descrito en otras especies, la eCG seadministra 48 a 72 horas antes de inducir laovulación en una única dosis de unas 20U.I.Los tratamientos de FSH siguen una pautatípica de dos dosis diarias cada 12 horasdurante 72 horas llegando a suministrar a lolargo del tratamiento en torno a 2 mg de ex-tractos hipofisarios (Kennelly y Foote, 1965Kauffman et al., 1998, Mehaisen et al., 2006).No obstante, para disminuir el número dedosis en los tratamientos con FSH, se hanutilizado, tanto en conejo como en otras es-pecies, diferentes protocolos introduciendopilivinilpirrolidona (PVP) para aumentar elperiodo de estimulación efectivo. En el co-nejo ha sido posible utilizar con éxito unadosis única de FSH al día de 0,6 mg durantetres días (Viudes de Castro et al., 2009;Cortell et al., 2010). Los tratamientos coneCG y FSH consiguen duplicar y en ocasio-nes triplicar la tasa de ovulación media de lapoblación que es tratada (20 a 40 frente a12-14 de los controles; Kennelly y Foote,1965; López-Béjar y López-Gatius, 2002;Mehaisen et al., 2006).

Por otra parte, si la FSH es de origenanimal, el tratamiento de superovulación ten-dría otro factor de variación, ya que al prove-nir de extracto de tejido hipofisario, la rela-

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ción FSH/LH de los preparados comercialespuede variar según el lote de fabricación; locual podría influir en la respuesta de las hem-bras sobre las que se aplique. Existen tam-bién en el mercado FSH ultrapuras, en lasque la relación FSH/LH es prácticamenteconstante, e incluso FSH y LH recombinan-tes, con las que la relación FSH/LH puedeser controlada, si bien los ensayos en cone-jo con FSH/LH ultrapura de porcino o FSH/LH recombinante humana no aportan mejo-ras en relación con el número y la viabilidadde embriones.

La recuperación de óvulos y embrionestanto postmortem como in vivo alcanzan

entre un 70 y un 90 % respecto a la tasa deovulación en las conejas de las que se ob-tienen óvulos y embriones. En un 30 % delas conejas superovuladas no es posible en-contrar óvulos o embriones.

Se ha podido observar una pérdida totalde respuesta superovulatoria tras el segun-do tratamiento tanto con eCG como con FSHde origen animal, no obstante, con FSH re-combinante, un número variable de conejaspermite realizar tres o cuatro tratamientossuperovulatorios con éxito (de un 15 a un25 % de las conejas, llegando a recuperarentre 60 y 80 embriones por coneja).

Figura 4. Procedimiento de recuperación y/o transferencia oviductal y uterina enconejo por laparoscopía.

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Crioconservación de embrionesDesde los años 70 es posible congelar

con éxito embriones de conejo (Banks yMaurer, 1974) y en los años 90 se estable-cieron los primeros procedimientos de vitrifi-cación para esta especie (Smorag et al.,1989; Kasai et al. 1992). Posiblemente jun-to con el ratón, el conejo y el vacuno seanlas especies en las que más estudios se hanrealizado de crioconservación en cuanto aprotocolos de adición-dilución, tipos de crio-protectores, congelación-descongelación,estadios embrionarios e incluso origen ge-nético de los embriones dentro de una mis-ma especie.

Entre los factores que pueden afectar aléxito de la crioconservación en conejo seencuentran la sincronización y el origen ge-nético de la hembra receptora. En generallos embriones congelados y vitrificados sontransferidos a hembras con una asincroníade 12 a 17 horas (-12-17 horas) en relacióncon la edad de los embriones.

Los programas de crioconservación aso-ciados a los grupos INRA y UPV que hanconstituido bancos de conservación de re-cursos genéticos se han desarrollado condiferentes objetivos. En el INRA, la finalidadha sido la de preservar tanto líneas comer-ciales como razas de conejo no competiti-vas desde el punto de vista productivo y quehabían quedado en manos de asociacionesy grupos de ganaderos para su exposiciónen concursos y ferias (Argentado de Cam-paña, Belier, Gigante de Flandes, Mariposa,Turingia, Blanco de Viena, Chinchilla, Peque-ño Ruso). En la UPV, el banco establecidoresponde a las necesidades científicas deevaluación y difusión de líneas sintéticasseleccionadas para mejorar la productividadde este sector.

Ambos programas utilizan embriones deconejo en estadio de mórula pero se diferen-cian en la técnica de crioconservación. Elgrupo del INRA utiliza la congelación lenta,en la que los embriones son expuestos entres etapas (de 5 minutos cada una) a unmedio de congelación de concentración cre-ciente de un crioprotector (0,5; 1 y 1,5 M dedimetilsulfóxido, DMSO) en PBS suplemen-tado con un 0,4 % (peso/volumen) de BSA.

Tras su envasado en pajuelas de 0,125 mL,se inicia el descenso de la temperatura a-1 ºC/min hasta -7 ºC en el que se induce lacongelación del medio que contiene los em-briones. Posteriormente, la temperatura des-ciende a -0,5 ºC/min hasta -35 ºC, momentoen el que son sumergidos en nitrógeno líqui-do (Renard et al., 1982, Salvetti et al., 2007).La descongelación se realiza exponiendo laspajuelas a temperatura ambiente durante 30segundos y posteriormente finaliza la des-congelación en un baño de agua a 20 ºC,eliminado el medio de congelación en tresetapas de concentración decreciente del crio-protector en PBS suplementado con BSA (1;0,5M DMSO y PBS). Mientras que el grupode la UPV utiliza la vitrificación como técni-ca de crioconservación (Vicente y García-Ximénez, 1994, Vicente et al., 1999, Lavaraet al., 2011). En este caso, los embrionesson expuestos en dos etapas a la soluciónde vitrificación compuesta por un 20 % (V/V)de DMSO y un 20 % (V/V) de etilengicol enPBS suplementado con 0,2 % (peso/volumen)de BSA. En la primera etapa los embrionespermanecen dos minutos en una soluciónal 50% de la concentración final de criopro-tectores, en la segunda, los embriones sonexpuestos a la solución de vitrificación me-nos de 1 minuto, durante el cual son carga-dos en pajuelas de 0,125mL y sumergidosen nitrógeno líquido. La desvitrificación serealiza en primer lugar en vapor de nitrógenodurante 30 segundos y posteriormente enbaño de agua a 20 ºC. La eliminación de lasolución crioprotectora se realiza en dos eta-pas, en la primera los embriones en la solu-ción de vitrificación son vertidos en un me-dio 0,33M de sacarosa en PBS suplementa-do con BSA, en la que permanecen 5 minu-tos, tras lo cual se lavan otros 5 minutos conPBS suplementado con BSA antes de sertransferidos.

Los embriones congelados y transferidossobre la línea francesa 2066 alcanzan unporcentaje medio de supervivencia en tornoal 50 % (40-60 %) en los diferentes trabajosrealizados en el INRA. En los trabajos reali-zados en la UPV, en los que se han transfe-rido más de 2500 embriones vitrificados so-bre las líneas maternales V y A, la supervi-vencia se sitúa en torno al 40 % (25-57 %).

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La supervivencia post-crioconservación, enuno y otro grupo, está influenciada tanto porel origen genético de los embriones comopor el de las hembras receptoras.

Actualmente el banco de embriones es-tablecido inicialmente por el INRA se ha in-corporado a su banco nacional de conser-vación de recursos genéticos, contabilizan-do en torno a 11.500 embriones de 35 razaso estirpes genéticas clasificadas en tres gru-pos: razas catalogadas, estirpes o líneas deinterés genético por su especificidad genó-mica y por último, líneas comerciales.

El banco de embriones y semen de laUPV contiene unos 7.200 embriones de 7líneas seleccionadas de conejo.

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