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INMUNOHEMATOLOGÍA. DEFINICIÓN: Es la parte de la hematología que estudia los procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relación con los elementos sanguíneos. - PowerPoint PPT Presentation
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INMUNOHEMATOLOGÍA
DEFINICIÓN: Es la parte de la hematología que estudia
los procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relación con los elementos sanguíneos.
Uno de los aspectos más importantes de la inmunohematología es el estudio y cuantificación de los grupos sanguíneos eritrocitarios que son componentes antigénicos presentes en la superficie de los hematíes, ya que se relaciona directamente con la terapéutica transfusional y la prevención de accidentes hemolíticos graves.
GRUPOS SANGUÍNEOS
La determinación de los grupos sanguíneos constituye un requisito imprescindible para efectuar una transfusión sanguínea ya que la incompatibilidad entre donante y receptor puede ocasionar una brusca destrucción de los hematíes transfundidos, con riesgo para la vida del paciente
En primer termino se identificaron sobre los hematíes, pero luego se describieron determinantes antigénicos plaquetarios, leucocitarios y séricos.
Los genes determinantes de los grupos sanguíneos transmiten, generalmente, caracteres codominantes ( se expresan en homocigotos y heterocigotos).
Existen genes “amorfos” que no generan productos que puedan ser identificados como antígenos ( ej: gen d)
Todos los antígenos de los grupos sanguíneos han sido definidos serológicamente por la presencia de sus anticuerpos correspondientes.
Grupos Eritrocitarios y sus Antígenos
GRUPOS SANGUÍNEOS ANTÍGENOS MAS IMPORTANTES
ABO A, B, AB, O
Rh D, C, c, E, e
MNS M, N, S, s, U
Lewis Lea, Leb
P P1, P2
Lutheran Lua, Lub
Kell K, k, Kpa, Kpb
Duffy Fya, Fyb
Kidd Jka, Jkb
Karl Landsteiner (1868-1943)
GRUPOS SANGUÍNEOS
1900
SISTEMA ABO En 1900 Landsteiner descubrió que los hematíes
de algunos individuos normales aglutinaban en presencia de suero de otros individuos también normales y en 1901 se descubrieron los antígenos A, B y O, este sistema de grupo permite realizar con seguridad las transfusiones sanguíneas.
Este sistema de grupo sanguíneo es de gran importancia. Los epítopes implicados aparecen en muchas otras células aparte de los eritrocitos, y forma parte de los substituyentes glucídicos de determinadas glucoproteínas.
LOS GRUPOS SANGUÍNEOS SON ALOGÉNICOS.
La mayoría de los individuos desarrollan anticuerpos frente a los antígenos ABO alogénicos aunque no hayan sido expuestos a eritrocitos extraños; esta sensibilidad se debe al contacto con epítopos idénticos que casualmente expresan de forma rutinaria una gran cantidad de microorganismos.
Los anticuerpos frente a los antígenos ABO son muy frecuentes, lo que hace especialmente importante la verificación de los grupos del donante y del receptor antes de llevar a cabo una transfusión sanguínea.
SISTEMA ABO: GENÉTICA. Interacción con el sistema Hh
Un sistema de grupo sanguíneo consiste en un locus génico que codifica un Ag de la superficie de las células sanguíneas (generalmente de los eritrocitos). En cada uno de los sistemas puede haber 2 o mas fenotipos. Por ejemplo, en el sistema ABO existen 4 fenotipos ( A, B, AB y O ), por lo tanto son posibles 4 grupos sanguíneos.
Un individuo con un determinado grupo sanguíneo es capaz de reconocer los eritrocitos que posean antígenos de un grupo sanguíneo alogénico y producir ANTICUERPOS contra ellos.
El locus ABO tiene tres alelos: A, B y O, y por el hecho de ser diploide todo individuo será portador de dos alelos.
Los genes A y B son codominantes,y producen enzimas que actuan como transferasas específicas, capaces de transformar por glicocilación la SUSTANCIA H, presente en todos los hematíes en los ÁNTIGENOS A y B, mientras que el gen 0 es recesivo, no expresando ningún producto antigénico.
Ello hace que existan seis genotipos diferentes (AA, AO, BB, BO, AB y OO) pero solo cuatro fenotipos posibles: A, B, AB y 0.
SISTEMA ABO: Genotipos posibles para cada Fenotipo.
Grupo sanguíneo
( fenotipos)
Genotipos
posibles
Antígenos Anticuerpos séricos frente a
ABO
Frecuencia
(%)
A1
A2
A1A1
A1A2
A1 O
A2 A2
A2 O
A Anti-B 45,56
B BB
BO
B Anti-A 8,65
A1B
A2B
A1B
A2B
A y B ninguno 3,57
O OO H Anti-A y
Anti-B
42,10
SISTEMA ABO: GENÉTICA
Los genes A y B controlan la expresión de las sustancias A y B.
El gen 0 se denomina “amorfo” por no corresponderle ningun antígeno.
Sin embargo, los hematíes del grupo 0 expresan un “antígeno H”, que es reconocido por determinados antisueros y lectinas vegetales.
SISTEMA ABH (Síntesis y estructura)
Existen dos tipos posibles de substancias precursoras para los antígenos ABH. TIPO I y TIPO II. Ambos constan de azucares idénticos, pero la unión de los azucares terminales difieren en ambos.
El precursor de TIPO I tiene una galactosa terminal (Gal) unida a una N-acetilglucosamina subterminal (GlcNac) por una unión 1,3. Esos mismos azucares se unen mediante un enlace 1,4 en el precursor de TIPO II.
Sustancia precursora
TIPO I
Sustancia precursora TIPO II
Glc-NACGal GalGlc-NACGal Gal GR GR
Unión 1,3 Unión 1,4
El precursor de TIPO I tiene una galactosa terminal (Gal) unida a una N-acetil-glucosamina subterminal (GlcNac) por una unión 1,3.
Los mismos azucares se unen mediante un enlace 1,4 en el precursor de TIPO II.
GEN H: SUSTANCIA PRECURSORA La presencia de los antígenos A, B u O en los
hematíes depende de la herencia de los genes alelicos, A, B y O.
Un gen H situado en un locus separado codifica la sustancia precursora sobre la que actúan los productos de los genes A y B.
GEN H: SUSTANCIA PRECURSORA Las sustancias H, precursora de los antigenos A y
B, se forman por adición de una fucosa (Fuc) a la galactosa terminal (Gal) ya sea en las cadenas de TIPO I o en las de TIPO II.
Después de añadirse la fucosa a la cadena de TIPO II, la estructura que se obtiene se denomina “Sustancia H de TIPO II ”.
Los antígenos ABH de los hematíes derivan de las cadenas de TIPO II, mientras que, los antigenos ABH del plasma provienen de los precursores de TIPO I y de TIPO II.
Sustancia H TIPO I
Sustancia H TIPO II
Glc-NACGal GalGlc-NACGal Gal GR GR
Fuc Fuc
1,2 fucosiltransferasa
Gen H
ANTÍGENO A (TIPO II)Glc-NACGal Gal
GR
Fuc
Gal Glc-NAC Gal
GR
Fuc
NAcGal
Gal
ANTÍGENO B (TIPO II)
1,3 N-acetilgalactosaminiltransferasa
1,3 galactosiltransferasa
SUBGRUPOS ABO Von Durgern y Hirszfeld en 1910 descubrieron estos
subgrupos. Al observar que si al suero del grupo B se adiciona sangre
del grupo A, hace perder su poder de aglutinación y así mismo podía continuar aglutinando otras sangres de los grupo A y AB.
Así surgieron los subgrupos de estos grupos A1, A2, A1B y A2B.
Fenotipo A1 A2
Frecuencia 80 % 20 %
Sustancia H1 H1
Precursora H2 H2
H3
H4
DETERMINACION DE SUBGRUPOS ABO
Los subgrupos de A : A1 y A2 serològicamente se diferencian por su comportamiento frente a extractos vegetales denominados “LECTINAS”.
Se determinan con el empleo de: LECTINA anti-A1 de Dolichos
biflorus. LECTINA anti-H de Ulex europeaus.
DETERMINACION DE SUBGRUPOS ABO
Se clasificaron como fenotipo A1 los eritrocitos que reaccionaron con una intensidad de 4 cruces de aglutinación con el anti-A1 y no reaccionaron con el anti-H.
Se consideraron hematíes de fenotipo A2 aquéllos que no reaccionaron con el anti-A1 y mostraron una intensidad de 2 cruces de aglutinación con el anti-H.
GRUPO BOMBAY Los individuos con genotipo HH o Hh producen la enzima
1,2-fucosiltransferasa que transforma la sustancia precursora en Sustancia H.
Los individuios con fenotipo BOMBAY con genotipo hh no producen dicha enzima, por lo que no pueden modificar la sust. precursora, lo que hace que no puedan sitetizar SUSTANCIA H.
Esto condiciona a que los genes del sistema ABO (si los tuviesen ) no pueden expresarse, por lo que parecen ser del grupo O.
Presentan de manera constante además de anti-A y anti-B, un anticuerpo natural anti-H muy activo a 37ºC, capaz de hemolisar los hematíes de cualquier individuo que no sea de fenotipo BOMBAY.
El anti AB producido en individuos de fenotipo O no es una mezcla de anti A y anti B, sino que se trata de un tercer anticuerpo que presenta reacción cruzada con un antigeno presente en los hematíes AB. Este antigeno se denomina “Antigeno C” o “Compuesto AB”.
Los títulos de anti A y anti B con frecuencia están disminuidos en pacientes ancianos y con hipogammaglobulinemia, por lo que puedo tipificar erróneamente cuando haga el GRUPO SERICO.
Los RN no producen títulos normales de anti A y anti B hasta los 3 6 meses de edad, alcanzando el titulo máximo entre los 5 a 10 años de edad.
Grupo sanguíne
oA B AB O
Glóbulos rojos
En la membran
a
Antíge
no A
Antígeno B
Antígenos A y B
Noantígenos
En el plasma Anti-B Anti-A No anticuerpos Anti-A y
Anti-B
SISTEMA RH En 1939 Levine descubre que una mujer
embarazada forma anticuerpos contra un antigeno eritrocitario de su hijo, el Rh (D). Es asi como se descubre la existencia de ALOANTICUERPOS.
En 1940 Landsteiner y Weiner inyectaron glóbulos rojos de primates (Macacus rhesus) en conejos, luego extrajeron suero de los conejos inmunizados y observaron que aglutinaban el 85 % de los hematíes de los primates y el mismo porcentaje en humanos.
FISHER-RACE:
-Se heredan de cada progenitor 3 genes.
-Situados en loci próximos.
-Los alelos se designan: D y d, E y e, C y c.
-Cada gen codifica para un Ag especifico: D, C, c, E , e.
* -La presencia o ausencia del Ag D determina si un individuo es Rh positivo o Rh negativo.
WIENER: -Herencia de un solo gen procedente de
cada progenitor.
-Cada gen con una estructura de mosaico.
-Ej.: El gen R1, codificaría factores que corresponden a C, D y e de la nomenclatura Fisher- Race; el gen r produciría los antígenos c y e pero no D, C, ni E.
Comparación de las nomenclaturas para los Ag del Sistema Rh
Wiener Fisher –Race Rosenfield
Rho D Rh1
rh` C Rh2
rh” E Rh3
h`r c Rh4
hr” e Rh5
Fenotipos Genes
Rh+ CDE
Cde
cDE
cDe
Rh- CdE
Cde
cdE
cde
Fisher-Rice
Actualmente:
• Grupo sanguíneo complejo y polimórfico
• Está compuesto por más de 48 antígenos
• D (RhD positivo, RhD negativo)
Actualmente:
• Grupo sanguíneo complejo y polimórfico
• Está compuesto por más de 48 antígenos
• D (RhD positivo, RhD negativo)• C c E e
RhD -RhD +
Patogénesis de la EHFN, algunas AHAI y reacciones hemolíticas postransfusionales Funciones biológicas: mantenimiento de la arquitectura de la membrana eritrocitaria, proteínas transportadoras de NH4+ ?, CO2 ?
Número de antígenos: > 48
Terminología: ISBT (símbolo) RH ISBT (número) 004 Otros nombres Algunas veces llamado
incorrectamente sistema Rhesus
Expresión: en células rojas de cordón , GR de adulto, carece de formas solubles y es específico de la línea eritroide
Características del Antígeno D
10.000 a 40.000 sitios D
Ag de maduración eritroide
Polipeptidos membranales hidrófogos (28-32 Kda)
No están glicosilados ni fosforilados
Poseen residuos palmitilados y acilados
Asociados al citoesqueleto
Marcadores de línea celular
COMPLEJO RH
Polipéptidos Rh
Glicoproteína asociada Rh50
Otras glicoproteínas LW, GPB, CD47 y Banda 3
Complejo Rh
RhD
Los antígenos más comunes del sistema Rhesus son definidos por 5 antisueros:
anti-D anti-E anti-C anti-e anti-c
Haplotipos Rh
Los genes RHD y RHCE se encuentran dispuestos en tandem formando 8 posibles haplotipos:
Dce dce DCE dCe DcE dcE Dce dCE
Haplotipos Rh
Variación de frecuencias en los distintos grupos étnicos.
El gen RHD no codifica antígenos antitéticos, la cigosidad del mismo en los distintos fenotipos RhD+ no puede determinarse por métodos serológicos directos sino que es inferida en términos de probabilidad según el fenotipo Rh y las frecuencias de los haplotipos RH en los distintos grupos étnicos.
Antigeno D debil
El antígeno Du aparece como un Rh(+) con ciertos antisueros y como Rh(-) con otros
El antígeno Du se transmite según las leyes de Mendel
Existen dos tipos de Du
Determinación de Ag D debil Coombs Indirecto
Enzimas proteolíticas
Técnicas en gel
Pruebas de absorción-elución (de referencia)
Importancia
Es especialmente importante su detección en los dadores de sangre (el antígeno Du es inmunógeno)
En las mujeres embarazadas (no debe aplicarse la gamaglobulina anti-D)
Antígeno relativamente raro en la raza blanca
Haplotipos con deleción parcial GR D-- un haplotipo raro. Produce D pero no C, c, E, e Los GR D-- tienen un número de sitios
antigénicos particularmente elevado (son aglutinados en salino por anticuerpos IgG).
Otros haplotipos raros: Dc- y DCW-
Generan anti-Rh17
ANTICUERPOS anti-Rh
Todos los anticuerpos del Sistema Rh provienen de una alo-inmunización por embarazo o transfusión. Son Aloanticuerpos
Este sistema no posee anticuerpos naturales Clase IgG (IgG1 ó IgG3) no aglutinantes en salino
(enzimas, TCI) No fijan complemento Excepcionalmente IgM fuertemente aglutinantes
El antígenos D es el mas inmunógeno. Los anticuerpos anti-Rh son clínicamente significativos. Enfermedad Hemolítica Reacción Fetoneonatal Transfusional
Especificidades
Anti-D: es el mas frecuente. Puede causar RT y EHFN severa.
Anti-c: muy frecuente. Puede causar RT y EHFN severa. Anti-E: muy frecuente. Puede causar RT y EHFN
severa. Anti-C: raramente solo; está presente en mezclas:
antiC+D. Pueden provocar RT y EHFN. Anti-Cw: puede causar RT y EHFN. Anti-e: poco frecuente. Puede causar RT y EHFN.
Especificidad encontrada frecuentemente como autoanticuerpos
Asociación a enfermedades
Los individuos con fenotipos Rh null padecen anemia hemolítica compensada.
Se ha observado una expresión reducida de los Ag Rh y mosaicismo Rh en leucemias, metaplasia mieloide, mielofibrosis y policitemia.
Los genes Rh y la esferocitosis hereditaria están ligados al cromosoma 1.
En poblaciones del sudeste asiático con ovalocitosis los antígenos del Rh están expresados débilmente.
Luego de los antigenos A y B, el antigeno D es el mas importante en lo referido a la Practica Transfusional.
En contraste con A y B, las personas cuyos hematíes carecen del antigeno D, no tienen regularmente el correspondiente anticuerpo.
La formación de anticuerpos anti D es siempre consecuencia de la exposición, por transfusión o embarazo, a hematíes Rh +.
Las personas D- que reciben una unidad de sangre D +, desarrollan un anti-D en el 80% de los casos.
A diferencia del sistema ABO, los antigenos del sistema Rh se encuentran solo en los hematíes.
Los antigenos D, C, c, E y e son responsables del 90% de los casos clínicos que implican al sistema Rh. ( EHRN, Reacciones Transfusionales)
Naturaleza del anticuerpo : IgG ( atraviesa la placenta, EHFN). Es frecuente generar aloanticuerpos complejos: anti-cE, anti-CD El anti-e es un anticuerpo “caliente” que suele aparecer en
AHAI.
Determinacion del fenotipo Rh
En la practica clínica se dispone de para la tipificación del fenotipo Rh de :
anti-D, anti-C, anti-c, anti-E y anti- e
Determinacion del genotipo Rh La identificacion del fenotipo no siempre permite la deduccion
confiable del genotipo, me permite deducir el genotipo mas
probable.
Frecuencias fenotipicas del Sistema Rh
ANTIGENO Rh Frecuencia ( %)
D (+) 85
D(-) 15
C 70
c 80
E 30
e 98
Capacidad inmunogenica
C…….e….….E…….c…..…D
ESTUDIO DEL FENOTIPO Y GENOTIPO RH EN LA POBLACION
Estudios serológicos Determinación del fenotipo Rh Estudios moleculares Obtención de ADN genómico de
sangre periféricaMicro método de salting-out
Genotipificación RHD por PCR
Genotipificación Rh
La determinación de las bases genéticas del Sistema Rh ha permitido el desarrollo de métodos de biología molecular para analizar la presencia del gen RHD en ADN genómico
Los estudios realizados en la población analizada indicaron que los individuos RhD positivos poseen los dos genes RH, mientras que las personas RhD negativas tendrían solamente el gen RHCE.
Las muestras D débiles fueron genotipificadas como RhD positivas permitiendo descartar fenotipos D negativos en muestras con aglutinación muy débil y la presencia de genes híbridos responsables del fenotipo DVI.
La estrategia de PCR multiplex desarrollada es rápida, los productos de PCR pueden ser amplificados simultáneamente en una única reacción y diferenciados por electroforesis en geles de agarosa.
El método es exacto y los resultados obtenidos presentan una estricta correlación con los observados utilizando técnicas de aglutinación con anticuerpos específicos.
La genotipificación RHD es especialmente adecuada para ser utilizada en situaciones clínicas donde no son aplicables los métodos inmunohematológicos clásicos.
Otros grupos sanguíneos Sistema Kell: Los antigenos mas importantes de este sistema son: K, k ,
Kpa, Kpb, Kpc, Jsa y Jsb. Todos de importancia clínica. El anti- K es el anticuerpo irregulas mas común después
del anti-D, ya que puede causar severas reacciones transfusionales y EHFN. Es un anticuerpo del tipo IgG, que reacciona a 37 C por TCI.
El anti- k fue encontrado por primera vez en una mujer cuyo bebe desarrollo EHFN. Tiene las mismas características del anti- K.
Sistema Duffy. Sistema Kidd: Puede ocasionar EHFN y reacciones
transfusionales hemoliticas. Sistema MNSs :EHFN y reacciones transfusionales
hemoliticas. Sistema I/ i
FORMAS DE ESTUDIAR LOS FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUÍNEOSGRUPOS SANGUÍNEOS Hay diferentes formas de evidenciar una
reacción Antígeno-Anticuerpo:
Dado que los Ags eritrocitarios, se encuentran el la superfície de la células, las formas mas utilizadas para su estudio son: AGLUTINACIÓN y HEMÓLISIS.
AGLUTINACIÓN
HEMÓLISIS
INHIBICIÓN ABSORCIÓN Y ELUCIÓN
ELISA
RIA
PRECIPITACIÓN
ETAPAS DE LA AGLUTINACIÒN
La aglutinación se produce en dos etapas:
La primera es la unión Ag-Ac La segunda la formación de puentes
intercelulares que producen el fenómeno visible de la aglutinación.
PRIMERA ETAPA
Está influenciada por las siguientes variables: Temperatura: IgM reaccionan a 4ºC, IgG a37ºC Afinidad entre Ag y Ac PH optimo :6.5 y 7.6 Concentraciòn relativa del Ag y Ac.puede ocurrir
disminuciòn de la aglutinaciòn cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag (postzona)
Fuerza iónica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la uniòn Ag- Ac
Medios de potenciaciòn: *Soluciones de baja fuerza iònica :LISS: reduce la neutralizaciòn de cargas opuestas aumentando la velocidad de reacciòn y tambien la cantidad de Ac unido al hematíe.
Tiempo de incubación: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes. Incubación varía : 15 a 60 min
SEGUNDA ETAPA
Potencial Z
Densidad del Ag
Clase de Ig involucrada
Para potenciar las reacciones de aglutinaciòn se emplean diversos métodos: centrifugación controlada, adición de medios macromoleculares, de Enzimas proteolìticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizaciòn de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinaciòn
Potencial Z
Enzimas proteolíticas que eliminan las cargas (-) de la superfície celular
Papaína Bromelina Eliminan el Acido
Sálico Tripsina Otras sustancias: ● Albúmina bovina ● Dextrán
GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unión por moléculas de IgG.
Cuando en la reacción Ag-Ac intervienen Acs tipo IgM, las dos etapas se superponen y se observa fácilmente la aglutinación.
Cuando en la reacción intervienen Acs del tipo IgG, se produce solamente la primer etapa. Hay fuerzas repulsivas que impiden a los GR su acercamiento lo suficiente para que se establezcan las uniones.
Soluciòn salina de baja fuerza iónica :LISS
Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ag y Ac.
Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentración y de
baja afinidad Permite reducir el Tiempo de incubaciòn de la
Coombs de 30´ a 10´ Por esta razòn el TCI en LlSS es la prueba de elecciòn para la detecciòn e identificaciòn de Ac de tipo IgG
Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusional y detección de Ac irregulares en donantes y receptores, detección de Ac irregulares en embarazadas y tipificación de Ag eritrocitarios.
Antisueros específicos Anti-A Anti-B Anti-D :pueden ser de origen
Humanos,animal o monoclonales,tambien pueden ser extractos de tejidos vegetales (Lectinas).Se debe considerar la especificidad, tìtulo,intensidad de la aglutinaciòn, avidez
Anticuerpos obtenidos por inmunizaciòn: Son policlonales (mezcla de Ac contra
distintos epitopes d euna misma molècula) Se obtienen por imnunizaciòn de animales o
persona sensibilizadas
Anticuerpos monoclonales Se obtienen de los hibridomas son
monoclonales (clon de células que poseen especificidad contra un único epitope).
Los antisueros hemoclasificadores anti-A, anti-B y
anti-AB son monoclonales El antisuero anti-D : mezcla de monoclonal
IgM que favorece la reacciòn en placa y un Ac IgG policlonal humano para el TCI en la determinaciòn del Du
Reactivo Antiglobulina Humana Se obtiene inyectando a conejos con
globulinas humanas purificadas Reactivos poliespecíficos : Contiene 2 anticuerpos :anti-IgG y anti-
C3d en los estudios de Ac irregulares ,la presencia de anticomplemento favorece la detección de anti-Jka ,anti-JKb, anti-K
Cuando el test de CD da (+) ,debe investigarse mediante los sueros antiglobulina monoespecificos el tipo de anticuerpo o fracción del complemento unido al GR
Reactivo Monoespecifico: Anti-IgG ,Anti-IgM, Anti-IgA Anti-C3d, Anti-C3b, Anti-C4b Se obtienen de modo
análogo ,inyectándolas distintas fracciones separadas y purificadas a los conejos
TCD: Sensibilidad : permite detectar entre 100 y
500 moléculas de Ig/GR y entre 400-1100 moléculas de C3d/GR
PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs) Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del
C`adheridos a los GR. Existen dos técnicas: a) Directa: Detecta
Acs adheridos a los GR “in vivo”.
b) Indirecta: Determina Acs existentes en el suero o plasma del paciente, previa incubación del suero con GR apropiados.
Fundamentos de la prueba de la AGH1-Todas las moléculas de anticuerpos y los componentes del C’
son globulinas
2- Los animales inyectados con globulinas humanas producen anticuerpos contra la proteína extraña: suero AGH
3- El anticuerpo AGH se combina con la porción Fc de las moléculas de anticuerpos o con epitopes de las proteínas del C’
4- Si el Ac o el C’ están unidos a los eritrocitos, se produce una aglutinación visible
5- Si el Ac está libre en el suero se consume el reactivo AGH
Relevancia de la prueba de la AGHIgM
IgG
La AGH detecta estos Ac o componentes del C’ fijados al GR
La prueba de la AGH es el método de elección para la detección de todos los Ac anti-eritrocitarios excepto los del sistema ABO
pentamérica aglutinación
monomérica sensibilización
Molécula “puente” para aglutinar GR
AGH
in vivo Prueba de la Antiglobulina
Directa
in vitro Prueba de la Antiglobulina
Indirecta
Se unen a GR ó activan C’ sin producir aglutinación
Responsables de reacciones hemolíticas transfusionales y
EHFN
Anti-Kidd , anti-Duffy
DIRECTA: TCD ● Diagnostico de AH y EHRN. ● Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. ● Investigación de enfermedades autoinmunes. INDIRECTA: TCI ● Screening de sueros de donantes y pacientes
para Acs. ● Pruebas de compatibilidad previas a la
transfusión. ●Identificación y titulación de Acs encontrados
en sueros.
TEST COOMBS DIRECTO( TCD )
PAD para detectar IgG
Lavar los GR para eliminar el suero
Agregar AGH
Cfg y leer. Aglutinación: PAD +
TEST COOMBS INDIRECTO (TCI )
LAVADO INADECUADO DE ERITROCITOSLAVADO INADECUADO DE ERITROCITOS
MALA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS MALA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS DÉBILMENTE (+)DÉBILMENTE (+)
PÉRDIDA DE ACTIVIDAD DE LOS PÉRDIDA DE ACTIVIDAD DE LOS REACTIVOSREACTIVOS
CENTRIFUGACIÓN INADECUADA.CENTRIFUGACIÓN INADECUADA.
TUBOS DE VIDRIO MAL LAVADOSTUBOS DE VIDRIO MAL LAVADOS
SOBRECENTRIFUGACIÓNSOBRECENTRIFUGACIÓN
QUE LOS ERITOCITOS AGLUTINEN ANTES QUE LOS ERITOCITOS AGLUTINEN ANTES DEL AGREGADO DEL SUERO DE COOMBSDEL AGREGADO DEL SUERO DE COOMBS
DETECCIÓN DE ACS IRREGULARES
TITULACIÓN
TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9S F - 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL
100 µL 100 µL
100 µL 100 µLDEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA
SUCECIVARESERVAR 100 µL DEL TUBO 10
SUEROS 100 µL 100 µL
100 µL 100 µL
100 µL 100 µL
GR 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µLDILUCION 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
EL TÍTULO ES LA INVERSA DE LA MAYOR DILUCIÓN DE SUERO QUE PRODUCE
AGLUTINACIÓN VISIBLE
CRIOAGLUTININAS
TUBOS
1/4 1/16 1/64 1/256 1/1024 1/4096
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
SERIE 1
SERIE 2
SERIE 3
AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2GTS SUSPENSIÓN HEMATIES AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2GTS SUSPENSIÓN HEMATIES PACIENTEPACIENTE
AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS SUSPENSIÓN HEMATIES DEL AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS SUSPENSIÓN HEMATIES DEL GRUPO O IGRUPO O I
AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS DE LA SUSPENSIÓN DE AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS DE LA SUSPENSIÓN DE HEMATIES DE CORDON O iHEMATIES DE CORDON O i
Incubar los tubos a 4 º c ---- 24hsIncubar los tubos a 4 º c ---- 24hs
SERIE 1
SERIE 2
SERIE 3
PARA DETERMINAR RANGO TERMICO , EFECTUAR LAS TITULACIONES PARA DETERMINAR RANGO TERMICO , EFECTUAR LAS TITULACIONES E INCUBARLAS A 37 º C ( 1H ) ,A 20º C ( 4 HS ) y A 4 º C ( 24 HS ) E INCUBARLAS A 37 º C ( 1H ) ,A 20º C ( 4 HS ) y A 4 º C ( 24 HS )
V N : TÍTULO MAYOR 32 V N : TÍTULO MAYOR 32
SI DÁ (+ ) EN LA SERIE CON AUTOGLOBULOS Y SI DÁ (+ ) EN LA SERIE CON AUTOGLOBULOS Y GLÓBULOS GLÓBULOS DE ADULTO, LA ESPECIFICIDAD ES ANTI I DE ADULTO, LA ESPECIFICIDAD ES ANTI I SI DÁ ( + ) EN LA SERIE DE AUTOGLÓBULOS Y SI DÁ ( + ) EN LA SERIE DE AUTOGLÓBULOS Y GLÓBULOS GLÓBULOS
DE CORDÓN , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i DE CORDÓN , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i
SI DÁ ( + ) CON LAS 3 SUSPENSIONES ES NECESARIO SI DÁ ( + ) CON LAS 3 SUSPENSIONES ES NECESARIO EFECTUAR UN PANEL IDENTIFICADOR .EFECTUAR UN PANEL IDENTIFICADOR .
ALOINMUNIZACIÓN Formación de Acs en una persona al serle inyectados Ags
de los cuales carece. Efectuada por: * Inyección IV de Ags (transfusiones) * Embarazo incompatible donde el feto tenga
Ags de los cuales carece la madre. Los Acs formados pueden ser: _ IgG _ IgM * Anti-A, Anti-B: en personas grupo
O.
Acs IgG * Anti-D ( EHRN). (atraviezan la * Anti-C Barrera Placentaria) * Anti-E * Anti-K, Anti-c, …
E H F N
Conjunto de manifestaciones patológicas causadas por aloimunización materna a Ag celulares presentes en el feto heredados del padre que producen una respuesta inmune (Ac) en la madre
Causas de inmunización Embarazo (parto 0,25 ml hasta 25 ml - 3er trimestre?) Transfusión Inyecciones de sangre (intramuscular) Puede afectar 1er emb
Transplantes Drogadicción
Factores que reducen la posibilidad de inmunización Respuesta inmune deprimida de la embarazada La respuesta
inmune primaria es tardía y débil. Esto explica por qué el primer hijo no es afectado por la EHFN a pesar del pasaje de GR durante el tercer trimestre de embarazo, excepto si existe sensibilización previa.
presencia concomitante de incompatibilidad ABO
la tercera parte de la población está genéticamente determinada a no responder a la inmunización
No todas se inmunizan – frecuencia inferior a la esperada - respuesta inmune materna
Factores que incrementan el riesgo de inmunización
Placenta previa, desprendimiento placentario, versión externa, cesárea, aborto, embarazo extrauterino, obtención de vellosidades coriales, amniocentesis, cordocentesis, drogadicción.
Etiopatogenia
Estimulación antigénica durante el embarazo Pasaje de hematíes fetales a través de la placenta Ag D 38 días de gestación
Respuesta secundaria materna En sensibilizadas, una mínima cantidad de GR fetales alcanza para desarrollar una respuesta anamnésica con producción de IgG
Pasaje y acción de los anticuerpos maternos IgG1 e IgG3 - transporte activo a través de receptores específicos en la placenta. Fijación de los Ac a los Ag fetales destrucción de las células en el bazo e hígado del bebé. Anemia, hepatoesplenomegalia, edema focalizado en abdomen y cabeza, anasarca, hidrops fetalis.
Los anticuerpos maternos también se encuentran en calostro y leche.
CLASIFICACIÓNSegún la especificidad del Ac
EHFN: por acs contra ags del sistema RH ( más severa )
Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D
EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa )
Madres de grupo “ 0 “
EHFN : por acs contra ags de otros sistemas
CAUSAS DE EHFN Incompatibilidad de grupo sanguíneo materno
fetal
Aloinmunización materna específica contra un determinado Ag
fetal.
Paso de Acs maternos al organismo fetal
Acciones derivadas de la unión de los Acs maternos sobre los
hematíes fetales.
Consecuencias de la hemólisis
Prenatal Anemia
Postnatal Ictericia Bilirrubina Kernicterus
Efecto de la incompatibilidad ABO
Protección contra la inmunización Rh: anticuerpos anti-A y anti-B
ENFERMEDED HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN) * Ictericia Signos * Anemia
* Esplenomegalia * Hepatomegalia
Causas + común ( Incompatibilidad sanguínea materno-fetal)
Estudios durante el embarazo
Mujeres RhD negativas, multíparas, politransfundidas, abortos, muertes neonatales y bebés afectados de EHFN.
Estudios a la pareja
ABO, Fenotipo Rh, KellPrueba de compatibilidad conyugal
Incompatibilidad potencialIncompatibilidad real
Determinación el estado homo/heterocigota RhD en el padre - serología: genotipo más probable - biología molecular: detección de 1 caja Rhesus híbrida
DIAGNÓSTICO : Etapa prenatal + ABO , Fenotipo R D débil ( RH negativo ) Determinación Ag Kell INCOMPATIBILIDAD POTENCIAL Mujer “ O “ C c D E E k Hombre “ A “ C c D e e k
INCOMPATIBILIDAD REAL
Investigar Acs irregulares ( panel eritrocitario select) - Medio salino - Medio enzimático - LISS / Coombs
•Acs irregulares : título e identificación 16 / 18 sem Si es ( - ) repetir 28 / 32 sem Si es ( + ) repetir 20 / 22 sem ó c/ 15 dias si aumenta* Estudios de LA ( mujeres con título > 16 + historia obstetrica
* Genotipificación R H D fetal
* Feto – Ultrasonido -----EC ( hígado- bazo ) _ Muestra sangre fetal ( 18 sem )
ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA
PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN
* A la madre : Tipificación ABO Y RH ( VARIANTES DU )
Panel selector ( aloanticuerpos maternos )
* En el niño : Tipificación A B O y R H P C D H b , Hto cordón , BRR I de cordón Reticulocitos
Determinación prenatal del genotipo RHD
Protocolo de estudio
Estudios inmunohematológicos en sangre materna: RhD y Anticuerpos Irregulares.
Extracción de ADN de sangre periférica materna y líquido amniótico.
Genotipificación RHD en ADN fetal.
Determinación del origen fetal del ADN obtenido del líquido amniótico.
Determinación de la cigosidad RHD paterna.
4.TRANSFUSION.ppt
T T O de la mujer aloinmunizada
PLASMAFÉRESIS ( pueden ser removidos hasta un 75 % de alo Acs pero tienden a rebotar )
ADMINISTRACIÓN DE GAMMA GLOBULINA ( en altas dosis 400mg / kg de peso materno durante 5 días)
Postulados de acción :
* La Ig podría causar la inmunomodulación de las células T y B maternas y efectuar una supresión de las síntesis de Acs.
* Podria saturar los receptores Fc de la placenta disminuyendo el pasaje de Acs antieritrocitarios.
* Podría atravezar la placenta y bloquear el sistema monocito _ ma crófago fetal, disminuyendo la destrucción de los hematies .
T T O FETAL
Transfusión fetal intrauterina HTO 30 % 24---26 sem de gestación
• Sangre : < de 96 hs de extraída exenta de plasma y capa leucoplaquetaria libre de C M V irradiada ( evita el riesgo enf de injerto –
huesped ) hematies A B O compatibles
HIDROPESÍA FETAL: Transfusión fetal
intrauterina mediante CORDOCENTESIS.
Inducción temprana del parto
Transfusión directa de glóbulos rojos empaquetados (compatibles con la sangre del bebé) y también exanguinotransfusión del neonato para extraerle la sangre que contiene los anticuerpos maternos que están destruyendo sus glóbulos rojos.
Amniocentesis para determinar la severidad
Control de la insuficiencia congestiva y la retención de líquidos.
ETAPA POS NATAL----- T T O
Luminoterapia : oxidación de bilirrubina a bibiverdina
Exanguinotransfusión : corrige la anemia ,elimina hematies sensibilizados, e Igs libres y reduce la brr
Albuminoterapia : conjuga la Bili libre
El tratamiento del neonato ya afectado depende de la severidad de la condición.
LEVE: Aumento agresivo de
líquidos Fototerapia usando
lámpara de bilirrubina.
KERNICTERUS: Exanguinotransfusion
(pueden requerirse varias)
Fototerapia
PREVENCIÓN
Madre R H ( - ) no inmunizada : Dosis preventiva 28 sem Dosis dentro de las 72 hs pos
parto con hijo Rh ( + )
La PREVENCIÓN es fundamental, y con esta vacuna prácticamente puede evitarse la enfermedad tratando a las mujeres Rh -, que aín no han desarrollado Acs frente al factor Rh +. (durante el 1er embarazo).
Esta inyección previene la sensibilización de más del 95 % de las mujeres Rh-negativas. Sin embargo, los estudios demuestran que alrededor del 2 % de las mujeres embarazadas se sensibiliza antes de dar a luz. Por esta razón se administra la inyección de RhIg alrededor de la semana 28 del embarazo, así como también después del alumbramiento.
La gammaglobulina anti Rh, sólo es efectiva en prevenir la enfermedad.
NO LA CURA una vez que ésta se ha presentado.
DESAFORTUNADAMENTE no existen medicaciones similares para prevenir una isoinmunizaciòn debida a otro antígeno de los eritrocitos (como Kell).
¿Existe alguna manera de deshacerse de los anticuerpos de la
madre?
No. Si bien una mujer puede no presentar síntoma alguno y permanecer
enteramente sana, puede seguir produciendo anticuerpos como parte de su sangre. Si concibe y alumbra otros
bebés de sangre Rh-positiva, éstos podrían padecer la intolerancia de Rh.
E H F N ----A B O
Caso más frecuente Madre “ O “ Y feto “ A “ Frecuentemente sin significado clínico
Se puede presentar en el primer embarazo
EHFN ABO
Ac involucrados NO son los Ac naturales/regulares anti-A y/o anti-B y/o anti-ÁB (IgM)
Ac formados como respuesta al estímulo antigénico:
Transfusión (aloinmunización) Embarazo anterior (aloinmunización) Heteroantígenos (heteroinmunización):
preparaciones farmacéuticas de origen animal, vacunas (medio de cultivo cerdo), suero antitetánico (caballo)
Mecanismos de Acción de los Ac maternos
Hemolisis moderada (no hay generalmente formas graves de la enfermedad)
Neutralización parcial de los Ac por los células endoteliales, vasculares y tejidos del feto que poseen Ag A/B
Fijación débil de las IgG sobre los GR, debido a la baja avidez de los Ac y la escasa cantidad de Ag eritrocitarios en el feto. Explicaría negatividad TCD.
- Escasa actividad hemolítica de los Ac, minimiza la hemólisis intravascular.
MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS ACS MATERNOS
* Hemólisis moderada ( no hay formas graves )
* Neutralización parcial de Acs por las células endoteliales , vasculares, y tejidos del feto que poseen Ag A / B
* Fijación débil de las Igs sobre los Gr , debido a la baja avidez de los Acs y la escasa cantidad de Ags eritrocitarios en el feto. P C D neg
* Escasa actividad hemolítica de los Acs ( minimiza la hemólisis intravascular )
ESTUDIOS A REALIZAR
Prenatal (embarazadas): Podría investigarse en embarazada de grupo O y esposo
A/B los Ac anti-A/B de clase IgG (2-ME) pero solamente 1 de 3000 incompatibilidades ABO potenciales necesita exanguinotransfusión.
Imposibilidad e inutilidad de un despitaje prenatal
Posnatal Recién nacido: Grupo ABO y RhD TCD, TCD potenciado Medios macromoleculares Elución e identificación del Ac Madre Estudio de Ac anti-A y/o anti-B de origen inmune y
titulación.
ESTUDIOS A REALIZAR PRENATAL : ( embarazada ) madre “ O “ – esposo A / B Determinar título de Ig G
_ POS NATAL : recien nacido grupo A B O y R H P C D ( +, - débil )
HALLAZGOS HEMATOLÓGICOS EN EL RECIEN NACIDO
* Aumento de reticulocitos . 10- 30 % evidencia de proceso hemolítico
compensado
* Eritroblastos en sangre periférica 8---15 %
* Microesferocitos 80 %
T T O
* Luminoterapia
* exanguinotransfusión : ( sólo si la anemia es severa. Se utilizan gr “ O “ suspendidos en plasma de grupo A B )
