INMUNOLOGIA Profesora Myriam Navarrete Profesora Sandra Henao
Profesor Miguel Guzmn M.D. AGLUTINACIN Es la interaccin entre un
anticuerpo y una partcula antignica que se visualiza por la
formacin de agregados o grumos macroscpicos.En este proceso, el
anticuerpo es conocidocomo aglutinina y el antgeno como el
aglutingeno.
Lasreaccionesdeaglutinacinutilizanelmismoprincipiodelasreaccionesde
precipitacin. Cuando el anticuerpo est en exceso inhibe la reaccin
de precipitacin, lo mismo ocurre en las reacciones de aglutinacin.
Esta inhibicin es llamada el efecto prozona. Esta tcnica es
ampliamente usada para la identificacin rpida de bacterias, hongos,
grupossanguneosyotrosantgenos;tambinesutilizadaparaladeteccinde
anticuerpos que pueden ser indicativos de un estado de enfermedad.
Latemperatura,elpH,laconcentracindeelectrolitos,sonimportantesparala
realizacindelaprueba.Lareaccinfinalseevidenciaporlaformacindemallao
grumos visibles macroscpicamente . Hemaglutinacin
Lasreaccionesdeaglutinacinsonrealizadasparalatipificacindeclulas
sanguneas.EnlatipificacindelosantgenosdelsistemaABO,lasclulas
sanguneassonmezcladasenunaplacaconunantisueroespecificoparalos
antgenos A y B del grupo sanguneo. Si el antgeno est presente en
las clulas, stas se aglutinaran, formando agregados visibles en la
placa. La determinacin de los antgenos que estn presentes en las
clulas sanguneas de un donador es bsico para clasificar el tipo de
sangre para las transfusiones. Hemoclasificacin Antgeno Glbulos
Rojos Anti AAnti BRho(Anti - D) A+-+ o - B-++ o - AB+++ o - O--+ o
- Aglutinacin Bacterial Una infeccin bacterial conlleva a la
produccin de anticuerpos especficos contra los
antgenosdesuperficiedelabacteria.Lapresenciadeestosanticuerpossepuede
detectar por reacciones de aglutinacin bacterial. Se toma el suero
de un paciente que ha tenido contacto con una bacteria y se
realizan diluciones seriadas en tubos, a los que se les adiciona la
bacteria. El ltimo tubo que presente aglutinacin visible, refiere
el titulo de anticuerpos en el suero del paciente. El titulo de
aglutinina es definida como el reciproco de la ultima dilucin del
suero que
presentaunareaccindeaglutinacinpositiva.Porejemplo:sepreparandiluciones
seriadasenbasedosdelsuerodeunpaciente,siladilucin1/640muestra
aglutinacin pero la dilucin 1/1280 no muestra aglutinacin, se
deduce que el titulo de anticuerpos en suero del paciente es 640.
Eltitulodeaglutininadeunantisueropuedeusarseparaeldiagnsticodeuna
infeccin bacterial. Aglutinacin En Ltex Los anticuerpos o antgenos
conocidos son unidos a partculas de ltex, con el objeto
defacilitarlavisualizacindelaprueba.Sepuedenemplearotraspartculas
insolublescomo el poliestireno o la bentonita. POSITIVONEGATIVO
Clula Antgeno Clula Antgeno Anticuerpo Anticuerpo Algunas
determinaciones que se realizan con esta prueba son la la
determinacin de
laprotenaCreactiva(PCR),FactorReumatoideo(FR),Antiestreptolisinas(ASTOS),
Staphylococccusaureus(protenaA),Haemophilusinfluenzae(antgenocapsular),Toxoplasma
gondii (IgG),etc. Factor Reumatoideo (FR)
En1937ErikWaalerdescubrielFactorReumatoideo(FR)ysusestudiosfueron
reproducidos por Rose en 1948. El Factor Reumatoideo son
autoanticuerpos circulantes de la clase IgG, IgA, IgM, IgD e IgE,
siendo los mas comunes de la clase IgG e IgMcon especificidad por
epitopes del fragmentoFc de la IgG propia. El factor reumatoideo ms
comn es de la clase IgM, est dirigido contra variosdeterminantes en
los dominios CH2yCH3 de la fraccin Fc de la IgG.El FR se
encuentrapositivo en el 80%en pacientes con manifestaciones
articulares como en la Artritis Reumatoide y en un 20% en la
Artritis Juvenil. Otras entidades conFR positivo son algunas
enfermedades autoinmunes como son el Lupus Eritematoso Sistmico,
Sndrome de Sjogrn, Escleroderma, etc.Tambin se puede encontrar
positivo en bajos ttulos en adultos mayores normales. Existen
varias tcnicas para detectarlos las ms comunes sonutilizando
glbulos rojos de carnero recubiertos con IgG humana(Tcnica de
Waaler Rose) y la aglutinacin con partculas de ltex de poliestireno
recubiertas con IgG humana. Protena C Reactiva (PCR)
En1930sedescubrilaprotenaCreactiva,Inicialmentesedetectenelsuerode
pacientesconneumonaaguda,queformabanunareaccindeprecipitacinconel
polisacrido C de ciertos grupos de Neumococo. La PCR pertenece a la
familia de las pentraxinas, protenas plasmticas que participan
enlasrespuestasinnatasalasinfeccionesbacterianas.Hacepartedelgrupode
reactantes de fase aguda, que se une al C1q (protena del
complemento) y puede de
estaformaactivarelcomplementooactuarcomoopsoninamediantelainteraccin
conlosreceptoresC1qdelosfagocitos.Normalmenteseencuentraenpequeas
cantidadesensangre,seelevaenprocesosinfecciosos,inflamatoriosotraumticos.
Su concentracin aumenta entre las 24 a 48 horas despus del estimulo
inflamatorio;
esunaayudadiagnsticayenlaevaluacinteraputicadebidoaquetambin
disminuye rpidamente.Valores menores a 6 mg/L seconsideran
normales. El diagnostico clnico no debe realizarse teniendo en
cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los
datos clnicos y de laboratorio. ELECTROFORESIS La electroforesis es
una tcnica de laboratorio en la cual el suero sanguneo se coloca
enunpapelespecialmentetratadoyluegoseexponeaunacorrienteelctrica.Las
diferentes protenas migran o se mueven en el papel con el fin de
formar bandas que
indicanlaproporcinrelativadecadafraccindeprotena.Esteexamencuantifica
aproximadamentelasdiversasfraccionesdeprotenaenlaporcinsricadeuna
muestra de sangre. Las protenas son constituyentes importantes de
todas las clulas y los tejidos y estn
hechasdeaminocidos.Existenmuchasclasesdeprotenasenelcuerpo,con
muchasfuncionesdiferentes;porejemplo,lasenzimas,algunashormonas,la
hemoglobina,elfibringeno,elcolgeno,lasinmunoglobulinas(anticuerpos),entre
otras.
Lasprotenassricasestnseparadasaproximadamenteenalbminasyglobulinas,
es decir, la protena total = albmina + globulina. La albmina es la
protena de mayor concentracin en el suero que sirve para trasportar
muchas molculas pequeas, pero
tambinjuegaunpapeldecisivoenelmantenimientodelapresinoncticadela
sangre, es decir, impedir que el lquido se filtre a los tejidos.
Lasglobulinassedividenagrandesrasgosenglobulinasalfa-1,alfa-2,betay
gammaglobulinas,lascualessepuedensepararycuantificarenellaboratorio
mediante la electroforesis y la densitometra.
Losnivelesdeprotenasalfa-1yalfa-2aumentanenpresenciadeinflamacin.La
fraccinbetaincluyelatransferrina,elplasmingenoylasbetalipoprotenas.La
fraccin gamma incluye los diferentes tipos de anticuerpos (IgM, IgG
e IgA). Valores normales Protena total: 6,4 a 8,3 g/dlAlbmina: 3,5
a 5,0 g/dlAlfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dlAlfa-2 globulina: 0,6 a
1,0 g/dlBeta globulina: 0,7 a 1,2 g/dlGammaglobulina: 0,7 a 1,6
g/dlSignificado de los resultados anormales1. La disminucin de la
protena total puede indicar: DesnutricinSndrome nefrticoEnteropata
por prdida de protenas gastrointestinal2. El aumento de las
protenas alpha-1 globulina puede indicar: Enfermedad inflamatoria
crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES)MalignidadEnfermedad
inflamatoria aguda3. La disminucin de las protenas alfa-1
globulinas pueden indicar: Deficiencia de alfa-1 antitripsina4. El
aumento de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar: Inflamacin
agudaInflamacin crnica5. La disminucin de las protenas alfa-2
globulinas puede indicar: Hemlisis6. El aumento de las protenas
beta globulinas puede indicar: Hiperlipoproteinemia (por ejemplo,
hipercolesterolemia familiar)Terapia de estrgenos7. La disminucin
de las protenas beta globulinas puede indicar: Trastorno de
coagulacin congnitoCoagulopata de consumoCoagulacin intravascular
diseminada8. El aumento de las protenas gama globulinas puede
indicar: Mieloma mltipleEnfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo
artritis reumatoidea, LES)HiperinmunizacinInfeccin
agudaMacroglobulinemia de WaldenstromEnfermedad heptica
crnicaLosmedicamentosquepuedenafectarlamedicindelasprotenastotalesincluyen
clorpromazina,corticosteroides,isoniazida,neomicina,fenacemida,salicilatos,
sulfonamidas y tolbutamida. Tipos de soportes para electroforesis
de zona
Se han empleado varios tipos de soporte para la electroforesis
de zona:
1)PAPEL.Aunquenoesexactamenteungel,sepuedeconsiderarsimilaryaque
realmenteesunamalladefibrasdecelulosa.Espocorestrictivo,peroesdifcilde
obtenerentamaosdeporoyespesorestotalmentehomogneos.Adems,muchas
macromolculasseadsorbenalasfibrasqueloforman,loquedalugaraartefactosy
separacionesdefectuosas.Seempleafundamentalmenteparamolculaspequeas,
como pptidos y aminocidos.
2) ACETATO DE CELULOSA. Este derivado de la celulosa forma un
gel de poro grande,
muypocorestrictivoparalasprotenasdetamaocorriente.Adiferenciadelpapel,es
inertefrentealamayorpartedelasprotenasysepuedeconseguirenlminasde
caractersticasestructuralesconstantesydefinidas.Esto,juntoconsufacilidadde
manejo,costorelativamentebajoylarapidezyreproducibilidadconquesepueden
efectuarseparacioneshacequeestetipodegeltengautilidadenloslaboratoriosde
anlisis clnicos (protenas sricas).
3)ALMIDON.Seempleangelesformadosconalmidnparcialmentehidrolizado
procedente de diversas fuentes naturales. El poro es menor que para
el caso del acetato
decelulosa,ysesuelenobtenermejoresseparacionesqueconsteltimo,yaquela
difusin es menor. Sin embargo, y a pesar de haber sido muy
utilizados hasta hace algn tiempo, han sido sustituidos por geles
de poliacrilamida debido a la dificultad que supone el obtener
resultados reproducibles empleando un producto de origen
natural.
Electroforesisdeprotenassricasenalmidn,teidasconAmidoBlack.Aunquela
separacinesalgomejorqueenacetatodecelulosa,elnmerodeprotenasquese
pueden diferenciar es muy pequeo. 4) AGAROSA. Uno de los dos
componentes del agar. Es un polisacrido lineal que forma geles de
tamao de poro muy grande.Se usa fundamentalmente para la separacin
de cidos nucleicos y para inmunoelectroforesis.
5)POLIACRILAMIDA.Adiferenciadelosanteriores,elgelseforma"insitu"porla
polimerizacin de una disolucin del monmero. Es posible controlar el
tamao del poro de una forma muy reproducible. Es el tipo de gel ms
empleado para la electroforesis de protenas de tamao comprendido
entre 10.000 a 250.000 dalton, y de otras molculas
detamaossimilares,incluyendocidosnucleicos.Songelescompletamenteinertes,
mecnicamenteestablesytransparentes,loquefacilitatantosumanejocomola
deteccindelasmolculasseparadasenellos.LatcnicaseconocecomoPAGE
(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO EN LA DETERMINACION DE COMPLEMENTO La
determinacin de Complemento hemoltico en unidades de CH50 es un
bio-ensayo que permite valorar in toto la actividad de este
sistema. El complemento es un sistema que constituye la columna
vertebral de los mecanismos
humoralesdedefensainespecficadelhusped.Enelhombre,estesistemaest
integradoporungrupodeprotenasplasmticasdecaractersticasfsicoqumicas
diferentesquepermitenindividualizaroncefactoresprincipalesmselnmerode
factores que cooperan en la activacin y en la regulacin.El
complemento se designa conlaletra
maysculaCyunsufijoquedesignaelfactorindividualizadoas:C1,
constituido por los subfactores C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6,
C7, C8 y C9.Estos factores circulan en el plasma en su forma
inactiva y slo entran en actividad cuando
elhuspedlorequiere,paralocualsenecesitaunasecuenciadereacciones,cuyo
efectofinal,eslaalteracinirreversible,estructuralyfuncionaldelasmembranas
biolgicas.Si tales membranas se encuentran en bacterias, hongos,
virus o parsitos,
elresultadolgicamenteeslamuertedeestosorganismos.Bsicamentese
reconocenenlaactualidad3patronesdeactivacindelsistema:lavaclsica,que
involucra la interaccin de un anticuerpo preexistente contra un
antgenos localizados en una membrana, esta reaccin se precipita
como una cascada a travs de una serie
dereaccionesenzimticasirreversiblesenlascualeselfactoractivadoactacomo
una enzima que tiene cono substrato al factor siguiente y en tal
forma se llega al efecto final de la citlisis.Igual efecto se puede
lograr por un proceso de activacin alterna, mucho ms eficiente, que
ocurre a partir del factor C3, sin la activacin de los factores
iniciales C1, C2 y C4 y que adems no requiere de la preexistencia
de anticuerpos, ya que, compuestos tales como los polisacridos
(liberados durante la muerte bacteriana) pueden inducir esta va. El
tercer mecanismo se conoce como la ruta de las lectinas, se inicia
sin la presencia de anticuerpos, involucra una protena que se liga
a mananos
(MBP),preferiblementeseuneamanosa,fucosayglucosaminadepolisacridos,
lipopolisacridos o glicoprotenasde la pared bacteriana. En la
valoracin clnica de algunos pacientes es necesario conocer como se
encuentra el sistema, lo cual se hace cuantificando algunos de sus
componentes, o valorando in toto la actividad del mismo.Bsicamente
cuando el sistema se est consumiendo por algn proceso patolgico los
niveles individuales de sus factores estn por debajo de los niveles
normales y por tanto ste no est operando bien.
Laactividadbiolgicadelcomplementosedeterminaenellaboratoriomidiendosu
actividadhemolticaentrminosdelallamadaUnidadhemolticaCH50,queesla
mnima cantidad de complemento necesaria para producir la hemlisis
del 50% de una suspensin de glbulos rojos de carnero en este caso,
previamente sensibilizados con anticuerpos anti-glbulos rojos de
carnero.
Elclnicotendrqueutilizaresteprocedimientoydebersaberlointerpretar
correctamente.
Elcomplementodebeinvestigarseenclnicaenaquellassituacionesquepromueven
suconsumo,comoporejemploanemiashemolticasautoinmunes,glomerulonefritis
post-estreptoccica,lupuseritematososistmico,inmunodeficienciasprimarias;
aunque existen algunas situaciones clnicas que aumentan sus niveles
circulantes.Su utilidad clnica es mayor en aquellas que lo
disminuyen y en donde la recuperacin del proceso patolgico conlleva
la normalizacin de los niveles de complemento. El informe del
Complemento Hemoltico CH50 se hace en UCH50/ml siendo el valor de
referencia 100 200 UCH50/ml. RESPUESTA INMUNE CELULAR
Losleucocitoscomprendendiferentestiposdeclulasmaduras:granulocitos,
megacariocitos,monocitos,macrfagos,linfocitosyplasmocitos.Estasclulasse
puedendiferenciarfcilmentealmicroscopioporlarelacinncleo/citoplasmaque
presenta cada una de ellas. - FAGOCITOSIS
Unaspectodelafagocitosisseestudiamediantelaevaluacindelaactividad
bactericidadelosleucocitos.Paraestapruebasemezclanleucocitosdesangre
perifricaconunasuspensinbacterianayanticuerposespecficospermitiendobajo
condicionesadecuadasdemedio,temperaturaytiempo,elprocesofagoctico.Aunquelatcnicaescompleja,elestudioopsnicopuedeserutilizadoenel
diagnsticodeenfermedadesasociadasadeficienciasdelsistemainmuneyenla
medicin de las defensas orgnicasdesde el punto de vista
inmunolgico. As como tambin forma parte del perfil inmunolgico de
pacientes inmunocomprometidos.
Experimentalmentesepuedeestablecerlamayoreficienciadelprocesofagoctico
cuandoelantgenoestarecubiertoporanticuerposespecficosysedeterminael
ndice opsono-citofgicorelacionandoelporcentajede
fagocitosisobtenidocuando el antgeno est opsonizado y cuando no lo
est. La capacidad funcional de los monocitos y de los neutrfilos se
mide en el laboratorio clnico como la fagocitosis de partculas o
microorganismos cubiertos por anticuerpos y muertos por calor
(valoracin de la inmunidad celular inespecfica).La mayora de
losindividuosnormalesdesarrollanunaseriedeanticuerposfrenteaantgenos
ambientales.Estos surgen a partir de infecciones clnicas o
contactos subclnicos con diferentes microorganismos.Los pacientes
con defectos en la primera barrera inmune
celularsufrenfrecuentesinfeccionesporbacteriaspigenas,normalmentepueden
deberse a un defecto en el nmero de clulas a defectos funcionales
en las mismas. - LINFOCITOS Los linfocitos presentan una estructura
microscpica homognea, pero comprenden a su vez un grupo heterogneo
de clulas. Se logr dividir este tipo leucocitario en dos grandes
grupos: los linfocitos B (que presentan Inmunoglobulinas en su
membrana) y
loslinfocitosT(quehacenrosetasenpresenciadeglbulosrojosdecarnero).Los
linfocitossonsemejantesmorfolgicamente,perosonheterogneosencuantoa
densidad,sumovilidadelectrofortica,vidamediayrespuestaamitgenos.Anivel
funcional existen varias subpoblaciones que participan por separado
o en conjunto en la respuesta inmune.
Conlaaparicindelosanticuerposmonoclonales,quesoncapacesdereconocer
marcadoresmolecularesmono-especficos,seconfirmaronlaspoblaciones
leucocitarias descritas con base en su morfologa. Esto quiere
decir, que los diferentes
linajesleucocitariosposeen,ademsdeunamorfologamicroscpicadiferente,
marcadoresdemembranadiferentes.Sinembargo,seencontrqueloslinfocitos
presentaban marcadoresintralinfocitariosexclusivos.Taleselcasodelas
molculas
CD4yCD8expresadasporsub-poblacionesdiferentesdeLinfocitosT.Estos
marcadoresdesub-poblacinseencuentranrespectivamenteen60%y30%delos
LinfocitosT(solamente3-5%delosLinfocitosTco-expresanCD4yCD8ensu
membranaaniveldesangreperifrica).Sedescribierontambinanticuerpos
monoclonalesquedefinenglobalmentealosLinfocitosT(CD3CD2),yotrosque
definen globalmente a los Linfocitos B (CD19,CD22 CD37).
Laimportanciaclnicadeestasdeterminacionesestribaenquelasdiferentes
subpoblacioneslinfocitariasejercena"grossomodo"funcionesdiferentes.La
alteracindelaproporcindereferencia2/1paraCD4/CD8,puedellevaraestados
de deficiencia inmunitaria.
LosLTsepuedendistinguirsegnsusdiferentesreceptoresdeantgeno(TCR)que
caracterizanalassubpoblacionesdelasclulasT,aunquetambinexistenciertas
molculas de superficie que se expresan en todas las clulas T
(marcadores pan-T) y
enalgunoscasosenotrostiposdeclulas(porejemplo,clulasasesinasnaturales
NKC), un buen ejemplo de los mismos es CD2, como receptor para
glbulos rojos de
carnero,permitindolesqueinvitroformenrosetasespontneas,invivoyen
circunstanciasnormales,estamolculajuntoconelcomplejoTCR-CD3 yotras
glicoprotenas de membrana, colabora con la activacin de las clulas
T. Los LB presentan inmunoglobulinas de membrana que son
sintetizadas por la misma
clulayseencuentraninsertadasenlamembranacelularendondeactancomo
receptoresdeantgenoespecficos.Estosreceptorespuedenserdetectadosenla
superficiedelasclulasmadurasmedianteanticuerposmarcadosconsustancias
fluorescentes y especficos de la inmunoglobulina en cuestin. Cuando
las clulas se tien en fro, se observa sobre la clula B una
fluorescencia con aspecto anular.Los anticuerpos divalentes frente
a las inmunoglobulinas de superficie
seunenalosreceptoresdesuperficieylosentrelazan,dandolugaraparchesde
inmunoglobulinasdistribuidosporlasuperficiecelular.Cuandolasclulasson
sometidas a calentamiento, la mayora de estos complejos se desplaza
a lo largo de la
superficiecelularyseacumulaenunextremodelaclula,observndoseentonces
unaespeciedecaperuza.Unavezformadaestacaperuza,lainmunoglobulina
penetraenelinteriordelacluladondeesdegradada.ElCAPesunatcnica
inmunolgicaenlacualseutilizaunainmunofluorescenciadirectaparaidentificacin
de la poblacin de linfocitos B.
Delapoblacinlinfoideperifricahumana,50-80%formanrosetasespontneas,15-20%
exhiben Ig de superficie de la clase IgM e IgD y 2-10% no tienen
marcadores ni
paraTniparaB,estapoblacincorrespondealoslinfocitos"nulos"quepodran
comprender la poblacin celular implicada en linfocitotoxicidad y/o
clulas precursoras de LT y/o LB. Citometra de Flujo
Esunatcnicaquepermiteobtenerinformacinsobrepoblacionescelularesapartir
declulasensuspensin(solucinisotnica),queinterfierende
formaindividualcon una fuente de luz. La interseccin de cada clula
con la luz lser provoca la emisin de
unaseriedesealesluminosasquepermitediferenciarpoblacionescelularesdentro
de la muestra analizada, por su tamao relativo, por sus
granulaciones o bien por su
reactividadconfluorocromospreviaincubacincondiversosanticuerpos
monoclonales.Esunmtododelecturarpido,quepermiteanalizarunelevadonmerodeclulas
(de10.000a50.000paracadaanticuerpomonoclonal)yproporcionaunregistro
computarizadodelosresultados.Lacitometradeflujopermiteladeterminacinde
antgenoscelularesdesuperficie,yportanto,tieneutilidadenelinmunotipajede
leucemiasagudasysindromeslinfoproliferativoscrnicos.Asmismo,permitela
cuantificacindelADNyladeterminacindela
actividadproliferativadelapoblacin celular. La cuantificacin de ARN
celular se aplica al recuento de reticulocitos.
Las clulas teidas entran en la cmara de flujo de una en una y al
pasar por delante de un haz de luz de lser, emiten una luz
fluorescente y dispersada, que es separada
deacuerdoasulongituddeondaporfiltrosapropiadosyespejos.Estasseales
luminosassonrecogidaspordetectoresylainformacinseintegrayanaliza
adecuadamente por un sistema informtico. Aplicaciones de la
Citometra de Flujo - Deteccin y cuantificacin de antgenos: La
identificacin de antgenos mediante
anticuerposmonoclonalesmarcadoscondiferentesfluorocromos,quepermitenla
identificacin y clasificacin de diferentes clulas tanto normales
como patolgicas. El
isotiocianatodefluorescena(FITC),laficoeritrinayelPerCPsonlosfluorocromos
ms empleados en el marcaje de anticuerpos
monoclonales.Enotrasreastambinsehademostradosuutilidad,comoenladeteccinde
autoanticuerpos e inmunocomplejos, en el diagnstico de
trombocitopatas adquiridas y en la realizacin del test cruzado
linfocitario.Lacitometradeflujo,utilizandoyodurodepropridio,tambinpermiterealizar
cuantificacindeclulasenapoptosis(muertecelularinducida).Estatcnicaseha
utilizado para estudiar clulas CD4+ de pacientes VIH+ con una alta
tasa de apoptosis PRUEBAS INTRADERMICAS
Laposibilidaddeconocerenunhuspedunestadodehipersensibilidadanteuna
sustanciaextraamediantelaprovocacindeunfenmenolocalintroduciendo
intradrmicamenteunamnimacantidaddedichasustanciahasidoampliamente
estudiada investigada y utilizada como herramienta inmunolgica.
Determinadoscompuestosintegrantesdeagentesbiolgicospuedencausarenel
husped un proceso que sigue exactamente el patrn normal de la
respuesta inmune bien sea esta una respuesta humoral o celular pero
cuyo resultante final al confrontar de nuevo la sustancia que
origin el proceso es exagerada y en ciertos casos nociva para el
husped cayendo en un proceso que se denomina hipersensibilidad,
dentro de la cual hay varias categoras, siendo la de tipo I o
inmediata y la de tipo IV o retardada las que pueden investigarse
por tal procedimiento. Las pruebas intradrmicas que investigan la
hipersensibilidad Tipo I que est mediada por anticuerpos tipo IgE
citotrpicos, se realizan con extractos derivados de cientos de
productos que puedan haber sensibilizado al husped y que al ser
identificado puede utilizarse para desensibilizarlo. Las pruebas
intradrmicas que investigan la hipersensibilidad retardada tipo IV
ponen enevidenciaunfenmenocelularmediadoporLinfocitosTquereconocen
especficamentelasustanciaextraayqueseevidencia48horasdespusdeque
stahasidoinoculada.EsteprocesoquefuedescubiertoporKochenlainfeccin
tuberculosasepresentacomoconsecuenciadealgunasinfeccionesbacterianas,
parasitarias,micticas y algunas virales e implica un complejo
proceso inmunolgico. Koch utiliz para sus estudios un producto
derivado de los cultivos del Mycobacterium tuberculosis denominado
por l Tuberculina que fue posteriormente purificado y que
seconocecomoPPD(PurifiedProteinDerivative)porcontraposicinalproductode
Koch llamado 0T (Old Tuberculine).
Unaterceracategoradepruebasintracutneaslaconstituyelaspruebasde
neutralizacin, cuyo ejemplo tpico es la prueba de Shick para la
difteria.Consiste en
aplicar1/50dedosismnimaletal(DML)detoxinadiftricaintracutneamentepara
determinarsiunpacientetieneonoanticuerposanti-toxinadiftricaysaber,en
consecuencia, si es susceptible o no a la difteria. En caso de
tener anticuerpos y ser resistente a la difteria, los anticuerpos
neutralizan la toxina y no hay ningn fenmeno, el paciente es Schick
positivo no requiriendo por tanto vacuna; en caso contrario, la
toxinanoesneutralizadaproduciendoalas96horasunapequeaulceracin.El
paciente es Schick negativo debe por tanto vacunarse.Esta prueba ya
no se utiliza. Las pruebas intradrmicas que investigan la
hipersensibilidad tipo IV tienen 2 grandes campos de aplicacin: el
primero, es dentro de los estudios inmunolgicos tendientes a
establecer una adecuada respuesta celular, para ello se utilizan
antgenos derivados delosagentesconlos
cualesunhuspedhaestadonormalmenteencontacto ypor
tantoun70-90delaspersonasdaranunareaccinpositiva,esassustanciasvaran
segnlasregionesgeogrficas.EnColombiaalgunosestudiosdemuestranque
sustanciastalescomo:candidina,antgenorespiratoriomixto,lisadoestafilococico,
son muy tiles para dichos estudios. La segunda gran aplicacin de
estas pruebas es en el estudio de algunas infecciones
enquepuedenutilizarsebiencomoherramientasepidemiolgicasobiencomo
recursodiagnstico;unapruebapositivaaundeterminadoantgenoindicaqueel
paciente ha estado en contacto previo con dicho antgeno. Las ms
utilizadas en clnica son: - Entidades
micticas:HistoplasmosisHistoplasmina Coccidioidomicosis Esferulina
Paracoccidioidomicosis Paracoccidioidina - Entidades parasitarias:
Leishmaniasis tegumentaria americana Reaccin de Montenegro -
Entidades Bacterianas: TuberculosisTuberculina LepraReaccin de
Mitsuda
EnlatuberculosislareaccindetuberculinaoreaccindeMantouxsehacepositiva
luegodelainfeccinolavacunacinconBCG.LareaccindeMitsudatieneuna
interpretacin diferente en el sentido que define un estado de no
respuesta o anergia,
indicandounaLepraLepromatosaodehipersensibilidadindicandounaLepra
Tuberculoide. El informe del laboratorio es: - Reaccin positiva:
formacin de una ppula indurada mayor a 0.5 mm de dimetro - Reaccin
Negativa:ninguna manifestacin hasta las 48 horas TECNICAS
INMUNOENZIMATICAS
Losensayosinmunoadsorbentesligadosaenzimassebasanenlahabilidaddelos
materialesbiolgicosdeadsorberseasuperficiesplsticastalescomopoliestireno
(fase slida).
ExistendiferentesmanerasdeconfigurarELISAs,lascualesdependendela
naturalezadelamuestra,laviabilidaddelosreactivosylaprecisinysensibilidad
requeridas.En muchassituaciones,noesnecesarioteneruna
medidaprecisadela concentracin de una muestra dada, por ejemplo en
el tamizaje de hibridomas o en las
pruebasderutinaparamedirlapresenciadeaditivosenalimentos.Bajotales
circunstancias es slo suficiente dar el resultado con un si o un
no, o baja, media o alta
concentracin.Estosmtodossemi-cuantitativosrequierenserdesarrollados
cuidadosamente. El uso de la ELISA se ha incrementado por la gran
disponibilidad de anticuerpos
monoclonalesydeantgenosrecombinantesespecficosparaunnmerodeenfermedades
autoinmunes e infecciosas. Por medio de esta tcnica tambin se
puedendeterminarnivelessanguneosdehormonas,drogas,marcadores
tumorales etc.
LapruebadeELISAestbasadaenlahabilidaddelantgenooanticuerpode:1)
Adsorberseaunsoporte-faseslida,manteniendosuactividadinmunolgica;2)
Unirse a una enzima y que el complejo antgeno o anticuerpo- enzima
conserven tanto
suactividadinmunolgicacomosuactividadenzimtica.Estemtodoesempleado
para la determinacin de antgenos o anticuerposa partir de
diferentes muestras.
Pararealizarelensayoesprecisodisponerdeunapreparacinpuradeunantgeno
(Ag)ounanticuerpo(Ac)odeambos.Elcomponente(AgoAc)seacoplaaun
soporteslidocomoporejemploaplacasdepoliestireno,papel,perlas,etc.,que
absorberunaciertacantidaddelaprotena;aunodeloscomponentesdela
reaccin,seaAgoAc,selemarcaoconjugaconunaenzimayluegoseescogeel
substrato adecuadopara la enzima utilizada. Componentes de la ELISA
-Faseslida:Sepuedeutilizarparalafaseslida:plstico,nitrocelulosa,vidrio,
celulosa, poliacrilamida, papelo dextrn. -Conjugado: Enzima + Ag o
Ac :Se conjuga o marca el Ago Ac con una
enzima.Laenzimautilizadadebeserestable,fcildeconjugar,fcildedetectarydebajo
costo.LasenzimasmsutilizadasparalaspruebasdeELISAson lafosfatasa
alcalina, la peroxidasa y la
-D-galactosidasa.-Substrato:Elsubstratoutilizadodebeproducirunareaccinconunproducto
coloreadofcilmentemedible,tambindebeserestableydebajocosto.Parala
enzimaperoxidasaseutilizaelsubstrato o-fenilendiamina(OPD)
yparalaenzima fosfatasa alcalina, el substrato ms utilizado es
elp-nitrofenilfosfato (pNPP). -Solucin frenadora: Se utiliza para
detener la reaccin, los ms utilizados son HCl, H2SO4, NaOH, H2O,
dependiendo del tipo de enzima utilizada en el conjugado. Tipos de
ELISA Mtodos no competitivos 1- Placa cubierta con antgeno
SeconocetambincomoELISAIndirectaparadeterminacindeanticuerpos.Esta
tcnica mide los niveles de Acs del paciente contra un Ag
especifico.ElAg especifico de la prueba es fijado en el
soporte-fase slida. Se agrega la muestra del paciente, si
elpacientetieneAcsespecficosparaelAgseformauncomplejoAg-Acquees
detectadoporunsegundoanticuerpoqueesunaanti-gammaglobulinamarcadacon
unaenzima.Luegoesadicionadoelsubstratoespecficoparalaenzima,
observndose el desarrollo del color el cual puede ser medido en un
espectofotmetro.LaintensidaddelcoloresproporcionalalaconcentracindeAcsenlamuestradel
paciente.Ejemplo:ELISAparaVIH,HepatitisA,B,C,Rubola,Toxoplasma,antiDNA,
Antifosfolpidos, etc. 2- Placa cubierta con anticuerpo
SeconocetambincomoELISADirectaenladeteccindeantgeno.Estatcnica
determina los niveles de antgeno en la muestra del paciente.Se
utiliza un Ac unido a
lafaseslida,estosensayossontambinllamadosELISAdecapturaoELISA
sndwich, donde el Agen la muestra es capturado por el anticuerpo
unido a la fase
slida,luegoesaadidounsegundoanticuerpoespecificocontrauneptope
antignicodiferentemarcadoconunaenzima.Ejemplo:ELISAparahormona
estimulantedelatiroides(TSH),gonadotropinacorinicasubunidadBeta(HCG),antgeno
prosttico (PSA), Inmunoglobulina E (IgE)etc. Mtodos
competitivosReaccin de color Antgeno Especfico Suero con
Anticuerpos Anticuerpos marcados con enzima Adicin del substrato
Reaccin de color Anticuerpo Especfico Suero con Antgeno Anticuerpos
marcados con enzima Adicin del substrato
Estosmtodoshacenposibleobtenerunacantidadestimadadeunparticular
anticuerpo y antgeno, an cuando stos no pueden aislarse del medio
en donde ellos
seencuentran.Ellospuedendarunainformacintilacercadelapresenciade
determinantes antignicos comunes y diferentes. 1- ELISA competitivo
para detectar Antgeno
EnestapruebaseaadensimultneamentelamuestradelpacienteconelAgoAc
marcadoconlaenzima.Luegoseadicionaelsubstrato.LosnivelesdeAgoAc
presentes en la muestra del paciente son inversamente
proporcionales a la intensidad delcolor desarrollado en la reaccin.
Ejemplos: ELISA para anticuerpos anti-coreVHB,niveles de Tiroxina
(T4). 2- ELISA competitivo para detectar Anticuerpos Tcnicas in
situ Tcnicas inmunohistoqumicasDotblot Inmunoblot Ensayo de ELISA
en placa WESTERN BLOT
Elfundamentoeslaseparacinporlatcnicadeelectroforesisengelesde
poliacrilamida(PAGESDS)deunamezcladeprotenascargadasnegativamente
graciasalusodeundetergenteaninico(DodesilsulfatodesodioSDS),dondela
posicindecadaunadeellasdependedesupesomolecular.Elgrupodeprotenas
separadas se transfiere desde el gel separador de poliacrilamida
hasta una membrana
desoporte(membranadenitrocelulosa)porcapilaridad(blotting)oporcorriente
elctrica,deformaquelamembranaadquiereunarplicadelgrupodeprotenas
separadasenelgel.Sepuededetectarlaposicindelantgenoproteicoenla
membrana colocando un anticuerpo especfico y realizando tcnicas
como ELISA para
detectarlo.Habitualmenteseutilizaunavariacindelatcnicaparadetectarla
presenciadeanticuerposantiVIHenelsuerodelospacientes.Enestecaso,se
separaunamezcladefinidadeprotenasdelVIHysetransfierealamembrana;la
Anticuerpo Especfico Adicin del substrato Suero conantgeno +Antgeno
marcado con enzima Reaccin de color Reaccin de color Suero
conanticuerpos +Anticuerpo marcado con enzima Antgeno Especfico
Adicin del substrato membranaseincubaconelsueroproblemay
secontinaconunapruebadeELISA para detectar dichos anticuerpos
anti-VIH.La tcnica de transferir protenas de un gel a una membrana
se llama "Western blotting"
Lasbandasproteicastransferidassonteidasevidenciandoassupresenciaypeso
molecular ya que se utilizan patrones de peso molecular.En el caso
de la bsqueda
deanticuerposcontraelantgeno(WesternblotparaVIH)silasbandasproteicasse
tienluegodeaplicadalatcnicadeELISA,significaquelamuestraanalizadatiene
anticuerpos contra esos antgenos protecos especficos del virus.
Seutilizaparadeterminarlapresenciaytamaodeunaprotenaenunamuestra
biolgica.EnelcasodellapruebadeWesternblotparaVIHsedetectanlos
anticuerpospresentesenlospacientescontraalgunasdelasprotenasdelvirus.Su
aplicacin es muy amplia tanto en clnica como en investigacin.
BIBLIOGRAFIA
-Alfonso-ValdsY,Bermudez-DomnguezMI,Surez-RodrguezO,etal.
EstandarizacindeunmicromtodoparaelestudiodelComplemento.Rev Cubana
Enfer. 1995; Sep: 1-3 Bates SE, Suen jY, Tranum BL.Inmunological
skin testing and interpretation.Cancer 1979; 43:2306
-BernalM,GuzmnMA.Determinacindevaloresdecomplemento
hemolticoCH50.RevistadelaFacultaddeMedicina.UniversidadNacionalde
Colombia.1999.47:3
-BlannAd,LewinI,BaconPA.Developmentandevaluationofarapidsemi-automatic
micromethod forCH50estimationusingacomputerprogram.Immunol Invest
199; 19:109-118 -Guzmn MA, Villanueva A, Bernal M.Laspruebas
intradrmicas de evaluacin de
competenciacelular.Estudiocomparativoentreantgenosclsicosyotros
antgenos.Biomdica 1982; 2:177-181
-GuzmnMA,IriondoM.Laspruebascutneasenlaevaluacininmunolgica.Serie
de Notas e Informes Tcnicos. No. 15.INS 1991 WESTERN BLOT PARA
VIHSUEROS- 21 Control positivo fuerte - 22 Control positivo dbil-
23 Control negativo- 24 Suero Pte. 1 positivo- 25 Suero Pte. 2
positivogp160gp120p66p55gp41p31p24p17VIH2WESTERN BLOT PARA
VIHSUEROS- 21 Control positivo fuerte - 22 Control positivo dbil-
23 Control negativo- 24 Suero Pte. 1 positivo- 25 Suero Pte. 2
positivogp160gp120p66p55gp41p31p24p17VIH2WESTERN BLOT PARA
VIHSUEROS- 21 Control positivo fuerte - 22 Control positivo dbil-
23 Control negativo- 24 Suero Pte. 1 positivo- 25 Suero Pte. 2
positivogp160gp120p66p55gp41p31p24p17VIH2Ling-Yocu Y, Wei-Perng Ch,
Ching-Yuang L. Lupus Nephritis. A review of 167 patients.Pediatrics
1994; 94:335-340
-RoittIvan,JonathanBrostoffandDavidMale.Immunology.Fifthedition.Mosby
International Ltd. 2000. London. Rostaing L, Modesto A, Cisterne
JM, et al.Serologic markers of autoimmunity in renal transplant
patients with cronic hepatitis C.Am JNephrol. 1998; 18:50-56. Ruddy
S, Moxley G:Clinical utility of assays for immune complexes and
complement.ImmunolAllergy Clin North Am.1994; 14:387-400
-MaryLouiseTurgeon.ImmunologyandSerologyinLaboratoryMedicine.2d
edition. Mosby Year Book, Inc. 1996. USA. -Wistreich, George A.
Microbiology Laboratory. Prentice-Hall, Inc. 1997. USA. UNHEATED
SERUM REAGIN (USR) Profesora Maye Bernal Rivera INTRODUCCIN
EnlaconfirmacindiagnsticadelasEnfermedadesInfecciosas,nosiemprees
posiblelaidentificacindirectadelagenteetiolgico;enmuchasocasionesser
posiblellegaralaprecisindiagnsticamediantelainvestigacindeanticuerpos
especficosenelsuerodepacientes,contracomponentesantignicosdelagente
etiolgico,esdecir,establecerunDiagnsticoIndirecto.LaSfilis,unadelas
InfeccionesdeTansmisinSexual(ITS)msimportante,cuyoagenteetiolgico
(treponema pallidum) slo se puede observar en las fases iniciales
de la enfermedad(Sfilis primaria y Sfilis secundaria) ; para poder
establecer el diagnstico en las otras
fases(latenteySfilisterciaria),serequierelainvesigacindeanticuerposdirigidos
contracomponentesdetreponemapallidum.Aunqueestosanticuerposnoson
altamente especficos , su hallazgo junto con la historia clnica
bien hecha, constituye
unabaseimportante,tantoparaeldiagnsticodelaenfermedad,comoparasu
seguimiento.La prueba de oro para el diagnstico serolgicode la
Sfilis, es el VDRL; el antgeno
utilizadoparalabsquedadelosanticuerposesunapreparacinartificialde;
colesterol-cardiolipinalecitina,
preparadaenalcoholabsolutoydesarrolladaporlos laboatorios de
Enfermedades de transmisin sexual de los Estados Unidos
(VenrealDiseases Research Latoratories), de donde la prueba toma la
sigla VDRL. La prueba se realiza en suero calentado a 56C, para
destruir factores que puedan interferir con la reaccin. Derivadas
de esta prueba, estla Rapid Protein Reagine (RPR) en la cual el
antgeno viene listo para usarse, no requiere el calentamiento del
suero ni el uso del microscopio para la visualizacin de la reaccin
ya que el antgeno incorpora particulas
decarbn,quefacilitanlaobservacindelfenmenocuandolapruebaesreactiva.
OtrapruebaderivadadelVDRLeslaUniheatedSerumReagin(USR)queutilizael
mismoantgenoqueelVDRL,perosuspendidoenClorhidratodecolina,quehace
innecesario el calentamiento del suerop y, viene listo para usarse
. Todas la pruebas: VDRL, RPR y USR, tienen la misma especificidad,
sensibilidad e interpretacin. OBJETIVO
Conoceryutilizarunrecursodediagnsticoindirectoenelmanejoclnicodeuna
entidad especfica : Sfilis. MATERIALES Antgeno USR Suero a procesar
Suero Control Positivo Suero Control Negativo Solucin salina 0.9%
Lminas planas con anillo de cermica de 14 mm de dimetro Pipetas de
0.1 mlAgitador de Manzzinni a 180 rpm (hoja de papl con un crculo
de 16 cm) Microscopio (objetivo de 10X) METODOS 1.Colocar 50
microlitos del suero control positivo en el primer crculo de la
lmina, 50 microlitros del suero control negativo en el segundo
crculo y 50 microlitos del suerodel paciente en el tercer
crculo.2.Mezclar fuertemente el antgeno de USR durante 10 segundos,
con movimientos de rotacin e inversin.3.Adicionar 16 microlitos del
antgeno mezclado a cada uno de los crculos. 4.Colocar las lminas en
el agitador durante 4 minutos,a 180 rpm (manualmente dibujar 4.un
crculo de 18 centmetros de dimetro y sobre l, tomar cuidadosamente
la lmina,durante 4 minutos , con movimientos suaves y constantes.
5.Colocar la lmina en el microscopio y leer en 10X. LECTURA E
INTERPRETACION La ausencia de grumos se interpreta comouna prueba
NO REACTIVA (negativa), es decir, ausencia de anticuerpos anti
Treponema
pallidum.LapresenciadegrumosseleecomoREACTIVA(positiva).Silosgrumossonmuy
tenues, la reaccin se interpreta como RECTIVA
DEBIL.CuandolareaccinesREACTIVAOREACTIVADEBIL,debehacerseunaprueba
cuantitativa.Paraellosehacedilucionesdoblesdelsuero(1:2,1:4,1:8,....)hastala
dilucinenquelareaccinsehagadbil.:Estaltimadilucin,indicaelttulode
reactividad y si por ejemplo corresponde a la dilucin 1:32,
entonces se informa como REACTIVA 32 DILS . Si el suero sin diluir
es dbil reactivo y en la dilucin siguiente es NO REACTIVO, la
prueba se informacomo REACTIVA O
DILS.UnapruebaREACTIVAindicaquehayanticuerposantipallidumesdecir,queel
pacientehaestadoinfectado.Estosanticuerpossenegativizanconeltratamientoy
porlotantoparaelmdicoconstituyenungranindicadordelaefectividadonodel
tratamiento.Lapruebaaunquealtamentesensible,noloestantoenespecificidady
bien puede ocurrir que en ciertas circunstancias la prueba sea
REACTIVA en ausencia
deinfeccinsifiltica;esaspruebassedenominanFalsasReactivasydebern
aclararse con pruebas confirmatorias especficas. BIBLIOGRAFA
Guzmn MA, Sfilis Manual de Procedimientos Diagnsticos. Serie de
ublicaciones CientficasNo. 8 Insituto de Salud.
