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Villa de Álvarez, Colima. 28 de Abril de 2016
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE
COLIMA INGENIERÍA BIOQUÍMICA
Detección molecular de Candidatus
Liberibacter asiaticus, agente causal del
Huanglongbing (HLB) en especies de cítricos
en México
PRESENTA LUCERO MABEL CHINA TINOCO
ASESOR INTERNO
Dr. FRANCISCO JAVIER DELGADO VIRGEN
ASESOR EXTERNO M.C. MANUEL DE JESÚS BERMÚDEZ GÚZMAN
HLB en cítricos de México Página 1
TABLA DE CONTENIDO
I Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) .......2
I. INTRODUCCIÓN .........................................................................................................4
II.I ANTECEDENTES ......................................................................................................5
II.II MICROSCOPÍA DE ELECTRONES. PRIMER TÉCNICA DE LABORATORIO PARA
LA IDENTIFICACIÓN Y CONFIRMACIÓN DE HLB ............................................................. 6
II.III CANDIDATUS, GÉNEROS Y ESPECIES. Candidatus Liberibacter africanus,
americanus y Candidatus Liberibacter asiaticus. ................................................................ 7
II.IV Diaphorina Citri Kuwayama (PSÍLIDO DE LOS CÍTRICOS). ........................................ 9
II.V MORFOLOGÍA .............................................................................................................. 9
II.VI CICLO DE VIDA ......................................................................................................... 11
II.VII DETECCIÓN DE LA ENFERMEDAD ..................................................................... 12
II.VIII PCR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HLB ............................................................ 13
II.IX PCR Tiempo Real ....................................................................................................... 13
II.X PRINCIPIO QUÍMICO DEL ENSAYO ......................................................................... 15
II.XI IDENTIFICACIÓN ESPECÍFICA ................................................................................. 16
II.XII CEBADORES TaqMan primers ................................................................................ 17
III - JUSTIFICACIÓN ..................................................................................... 19
IV - OBJETIVOS .......................................................................................... 20
V - PROBLEMAS A RESOLVER ...................................................................... 21
VI - CAPACITACIÓN LABORAL ...................................................................... 22
VII - IMPLEMENTACIÓN DE METODOLOGÍA ..................................................... 28
VII.I MODIFICACIÓN REALIZADA AL MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE ADN: ................ 31
VII.II Detección de Candidatus liberibacter asiaticus mediante la reacción en cadena de
la polimerasa en tiempo real (qPCR). ................................................................................ 32
VIII - OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE TRABAJO .......................................... 35
IX - RESULTADOS ....................................................................................... 39
X - CONCLUSIONES .................................................................................... 46
XI - REFERENCIAS ..................................................................................... 47
ANEXOS ................................................................................................... 49
RECOMENDACIONES .................................................................................. 77
HLB en cítricos de México Página 2
I Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias
(INIFAP)
El Campo inició actividades de investigación en el año de 1970. Su área de influencia
comprende el estado de Colima, algunos municipios cercanos del estado de Michoacán y la zona
costa de Jalisco. Cuenta además con el Sitio Experimental Costa de Jalisco ubicado en el municipio
de "La Huerta".
El Campo tiene sus oficinas en:
Km. 35, Carretera Colima-Manzanillo
Apartado Postal Núm. 88 CP. 28100
Teléfono. 01 800-088-2222 ext 84301
Tecomán, Colima, México.
El INIFAP es una Institución de excelencia científica y tecnológica con liderazgo y
reconocimiento nacional e internacional por su capacidad de respuesta a las demandas de
conocimiento e innovaciones tecnológicas en beneficio agrícola, pecuario y de la sociedad en general.
A través de la generación de conocimientos científicos y de la innovación tecnológica
agropecuaria y forestal como respuesta a las demandas y necesidades de las cadenas
agroindustriales y de los diferentes tipo de productores, se contribuye al desarrollo rural sustentable
mejorando la competitividad y manteniendo la base de recursos naturales, mediante un trabajo
participativo y corresponsable con otras instituciones y organizaciones públicas y privadas asociadas
al campo mexicano.
El Campo Experimental cuenta con un terreno de 65 hectáreas; laboratorios de análisis de
suelo, agua, planta y el de bromatología; adicionalmente se tienen laboratorios de Parasitología,
Biotecnología, Bioetanol y Polen de cocotero. (Figura 1) (INIFAP, 2015)
Figura 1. Área de laboratorios en el Campo Experimental Tecomán, INIFAP.
HLB en cítricos de México Página 3
PRINCIPALES ACTIVIDADES
Generación de conocimiento científico y de innovación tecnológica de los
principales sistemas producto del estado de Colima, algunos municipios de Michoacán y la
zona Costa de Jalisco.
Validación y transferencia de tecnología de las innovaciones tecnológicas
generadas por el INIFAP a través de áreas demostrativas, capacitaciones y publicaciones.
Alternativas de producción que se identifican en estudios de potencial
productivo en áreas de alto potencial y mediano potencial.
Apoyo a productores, técnicos, investigadores y empresas de servicios en los
laboratorios de bromatología, suelo-agua-planta y fitopatología.
PRINCIPALES ÁREAS DE INVESTIGACIÓN
Arroz
Cultivos Alternativos Ornamentales
Cocotero
Caña de azúcar
Bovinos doble propósito
Maíz
Plátano
Pastizales y recursos forrajeros
Limón mexicano
Mango
Tamarindo
HLB en cítricos de México Página 4
I. INTRODUCCIÓN
La enfermedad Huanglongbing “HLB”, conocida también como “Dragón Amarillo”, representa
una seria amenaza para las cerca de 550 mil hectáreas de cítricos establecidas en 24 Estados que
cuentan con este cultivo en México, incluido Tecomán, Colima. Por lo anterior, se han unido
esfuerzos a nivel científico y tecnológico entre diversos Organismos Nacionales e Internacionales,
además de Universidades y Centros de Investigación para crear estrategias que permitan lograr una
vigilancia fitosanitaria oportuna, así como ser eficientes en el control del insecto vector, el psílido
asiático de los cítricos (Diaphorina citri).
La agroindustria del limón mexicano se encuentra seriamente amenazada por la enfermedad
conocida como HLB, la cual se detectó por primera vez en México en julio de 2009 en árboles de
limón mexicano, en áreas urbanas de la península de Yucatán. Posteriormente se reportó en árboles
de la misma especie en los estados de Nayarit y Jalisco. En abril de 2010 se informó de la presencia
de esta enfermedad en la región productora de limón mexicano de Tecomán, Colima (M. Manuel
Robles-González, 2013).
Entre los impactos más importantes se cuentan el desempleo que se generará a lo largo de
toda la cadena, la reducción en el beneficio del procesamiento de productos agroindustriales y en la
capacidad instalada de la industria agroalimentaria, en la cantidad de divisas que ingresaría al país
por concepto de exportaciones tanto de productos frescos como procesados y, finalmente, en el
ingreso conjunto a nivel país (Diznarda Salcedo-Baca, 2010).
El objetivo de este proyecto es validar un método ya establecido, para detectar la presencia de
Candidatus Liberibacter asiaticus, agente causal de HLB en cítricos cultivados en diferentes estados
de México; utilizando técnicas de biología molecular.
HLB en cítricos de México Página 5
II.I ANTECEDENTES
HLB es abreviatura de Huanglongbing, palabra de origen chino proveniente del Distrito
Chaozhou. “Huang” quiere decir amarillo, “long” dragón y “bing” se refiere a enfermedad. Este término
fue adoptado por los agricultores de Chaozhou para referirse a las características tempranas de la
enfermedad, la coloración amarillenta de las hojas, principal característica física que toman los árboles
infectados, formaba un patrón parecido al de un dragón a los ojos de los agricultores. En la figura 2 se
muestra el patrón de colores (Bové, 2006).
A pesar de que HLB está recién emergiendo en América, es probablemente una de las
enfermedades más antiguas conocidas de los cítricos, dándose a conocer en Asia y África.
Hasta 1995 la enfermedad fue generalmente conocida bajo el nombre sudafricano “greening”.
Figura 2. Coloración amarilla en árboles infectados de HLB
En 1967 se creía que la enfermedad se transmitía por inoculación de injerto así como por el
psílido asiático de los cítricos. Estos resultados sugirieron que el patógeno que causaba la
enfermedad era un virus, el único agente conocido en aquel tiempo que transmitía de esa manera.
En ese mismo año a los Mycoplasma se les atribuyó como agentes causales de
enfermedades en plantas. La mayoría de las enfermedades ocasionadas por mycoplasmas
presentaban síntomas de tipo “amarillos”, asemejándose a los síntomas de Huanglonbing. Por esta
razón se comenzó la búsqueda de este tipo de bacteria utilizando microscopía de electrones (EM) en
árboles infectados de HLB.
HLB en cítricos de México Página 6
Se pensaba que el vector causante de HLB era un Mycoplasma, pero al utilizar microscopía
de electrones el agente causante de la enfermedad se encontró encerrado por una envoltura de 25 nm
de espesor, la cual era mucho más gruesa que la membrana citoplasmática de 7 a 10 nm de espesor
de los Mycoplasma. Este descubrimiento sugirió que el agente que transmite HLB poseía además de
su membrana plasmática, una pared celular. Se pudo demostrar que se trataba de una bacteria de
tipo Gram negativa, la cual fue detectada por primera vez en hojas de naranja dulce infectadas en
Sudáfrica, por medio de EM (Bové, 2006).
II.II MICROSCOPÍA DE ELECTRONES. PRIMER TÉCNICA DE LABORATORIO PARA LA
IDENTIFICACIÓN Y CONFIRMACIÓN DE HLB
En manos de Monique Garnier (1949-2003) la detección de la bacteria causante de HLB por
medio de Microscopía de Electrones, se enfocó en distinguir los síntomas provenientes de la bacteria
en cuestión, ya que estos podrían ser el resultado de otra bacteria ocasionando otra enfermedad.
La fiabilidad y la especificidad de la Microscopía de Electrones se basa en dos propiedades de
la bacteria de HLB: su ubicación exclusiva en los tubos cribosos y la presencia de una pared celular
(Figura 3).
Figura 3. Tubos Cribosos de una planta y pared celular, respectivamente.
Con varios años de experiencia en la detección de HLB por medio de Microscopía de
Electrones en Asia y África han demostrado que el número de bacterias en tubos cribosos es mayor
en hojas con una fuerte moteado color amarillo que en aquellos con un moteado suave.
HLB en cítricos de México Página 7
Para la identificación indiscutible de HLB por EM, es necesario que al menos una bacteria
muestre la pared celular densa de electrones que rodea la célula, muy a menudo esta capa se ve solo
en ciertas partes de la célula (figura 4 A y B) (Bové, 2006).
Figura 4. (A) y (B) Capa densa de electrones que rodea la pared celular.
II.III CANDIDATUS, GÉNEROS Y ESPECIES. Candidatus Liberibacter africanus,
americanus y Candidatus Liberibacter asiaticus.
Con el desarrollo de la amplificación de ADN por PCR y secuenciación de ADN, se hizo
posible caracterizar los organismos no cultivados, a nivel molecular y nivel filogenético. Murray y
Schleifer (1994) propusieron el término "Candidatus”.
El nombre trivial Liberobacter fue reemplazado por Liberibacter, del latín “Liber” que quiere
decir corteza y “bacter” bacteria.
Las cepas Liberibacter HLB de África se pueden distinguir de los de Asia en la base de la
sensibilidad a la temperatura y serología. Por esta razón Murray y Schleifer (1994) denominaron a las
cepas existentes en Asia, Candidatus Liberibacter asiaticus y Candidatus Liberibacter africanus a las
cepas existentes en África (Bové, 2006).
HLB causado por Candidatus Liberibacter asiaticus (Clas) fue detectado y confirmado por
primera vez en Florida por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos, servicio de inspección
A
B
HLB en cítricos de México Página 8
de la salud en animales y plantas (USDA) y el Departamento de Agricultura y Servicios del
Consumidor de Florida, en Septiembre de 2005 (Wenbin Li J. S., 2005).
Un tercer tipo de Candidatus Liberibacter se descubrió en Marzo de 2004 cuando se
observaron síntomas de HLB en árboles de naranja dulce cerca de la ciudad Araraquara en São
Paulo, Brasil, convirtiéndose en el primer caso reportado de HLB proveniente del continente
Americano. Árboles afectados podían ser vistos desde la distancia debido a sus notables manchas
amarillas. Estos síntomas en hojas en São Paulo eran idénticos a los de África y Asia, con el
característico moteado amarillo
(Figura 5 A). Las frutas eran pequeñas y desequilibradas, fuerte inversión de color, aborto de semillas,
entre otras (Figura 5 B) (Bové, 2006).
Figura 5 (A). Síntomas en hojas de naranja dulce en el estado de São Paulo en Brasil. (B) síntomas en
naranja dulce en São Paulo en Brasil.
HLB existe en la naturaleza en tres formas que difieren por una combinación de condiciones
ambientales e insectos vectores. HLB causado por Candidatus Liberibacter asiaticus (Clas) es
tolerante al calor y transmitida por el vector Diaphorina citri, HLB causado por Ca. L. africanus (Claf)
es sensible al calor y transmitida por el vector Trioza erytreae, Y HLB causado por Ca. L. americanus
(Lam) también es tolerante al calor y transmitida por el vector por D. citri.
Los métodos basados en PCR utilizando primers universales para amplificar la secuencia 16S
rDNA han sido utilizados para detectar y diferenciar Ca. spp. (Wenbin Li J. S., 2005)
B
A
HLB en cítricos de México Página 9
II.IV Diaphorina Citri Kuwayama (PSÍLIDO DE LOS CÍTRICOS).
Este insecto es un problema de los cítricos a nivel mundial principalmente como transmisor de
la enfermedad conocida como HLB. Se desarrolla en los brotes tiernos de las plantas hospederas,
desarrolla altas poblaciones, produce, ondulaciones de cera que sirven para identificar su presencia,
las fases en que adquiere la bacteria: son el 4to. Y 5to. instar ninfal y el adulto (Martínez-Carrillo,
2015). Las plantas preferidas de este insecto se muestran enlistadas en el cuadro 1
Cuadro 1. Plantas con mayor frecuencia de contagio de HLB
II.V MORFOLOGÍA
Los huevecillos son de color amarillo claro brillante (cuando son recién depositados) y se
tornan a brillante anaranjado (Figura 6). Presentan una forma ovoide, con una prolongación alargada
hacia una de las puntas. Miden aproximadamente 0.30 mm de longitud y 0.14 mm de ancho. Los
huevecillos, son colocados generalmente en los brotes tiernos, sobre y entre las hojas desplegadas,
apareciendo con frecuencia un gran número en un mismo brote, una hembra puede llegar a depositar
más de 800 huevecillos (Martínez-Carrillo, 2015).
Figura 6. Huevecillos de Diaphorina Citri.
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Este insecto pasa por cinco instares ninfales (Figura 7), que varían en tamaño después de
cada muda. El último instar se caracteriza por presentar los primordios alares de mayor tamaño. Las
ninfas son de color anaranjado-amarillo, sin manchas abdominales, aplanadas dorso ventralmente,
con esbozos alares (alas pequeñas en formación) abultados, un par de ojos rojos compuestos y dos
antenas de color negro. Presentan filamentos a lo largo del abdomen. Los primordios de las alas son
conspicuos; hilos cerosos cortos, pueden estar presentes sólo en el ápice del abdomen. Se alimentan
de tejidos tiernos y pueden doblar las hojas en desarrollo para protegerse durante el proceso de
alimentación. El ciclo ninfal se puede completar en 15 días bajo condiciones adecuadas de
temperatura de 28ºC (Martínez-Carrillo, 2015).
Figura 7. Instares ninfales de Diaphorina Citri
Características de los instares ninfales:
1er instar miden 0.30 mm de longitud y 0.17 mm de ancho.
2do instar miden 0.45 mm de ancho y 0.25 de ancho.
3er instar miden 0.74 mm de longitud y 0.43 de ancho.
4to instar miden 1.01 mm de longitud y 0.70 mm de ancho.
5to instar miden 1.60 mm de longitud y 1.02 mm de ancho.
Las ninfas de quinto instar dan lugar a los adultos (machos y hembras). Las hembras son
sedentarias. Los machos son levemente más pequeños que las hembras y con la punta del abdomen
roma, mientras que el abdomen de las hembras termina en punta bien marcada (Figura 8). El tamaño
del insecto es pequeño (3-4 mm), tiene la cabeza de color café claro (marrón) o pardo, antenas largas
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con puntas negras y dos manchas grises (casi negras) en los segmentos medios del abdomen. El
cuerpo es de color gris y el abdomen de las hembras se torna rojizo o anaranjado antes de ovipositar.
Las alas son de color marrón con patrones de manchas distintivos, con pocas venas y la cabeza es
café marrón (Martínez-Carrillo, 2015).
Figura 8. Estado adulto de Diaphorina Citri.
II.VI CICLO DE VIDA
La duración del ciclo de vida de este insecto se encuentra relacionado con las oscilaciones de
la temperatura en cada estación del año. (Martínez-Carrillo, 2015)
Duración del periodo embrionario: 9.7 días - 15º C / 3.5 días - 28º C
Duración del ciclo biológico (huevo-adulto): 14.1 días - 28º C / 49.3 días-15º C
La longevidad promedio de las hembras: 39.6 a 47.5 días - 25º C
Temperaturas más adecuadas para su desarrollo: 25 a 28º C
El psílido no se desarrolla a temperaturas: 33º C y 10º C
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II.VII DETECCIÓN DE LA ENFERMEDAD
El HLB es una enfermedad que afecta a toda la planta. La expresión de síntomas por lo
general se retrasa hasta por varios meses después de que la planta se ha infectado. El síntoma inicial
es un color amarillo en las hojas de algunas ramas que contrasta con el color verde de toda la planta.
Estos son más evidentes durante la época otoño-invierno, observándose amarillamiento y moteado
intenso (Figura 9) (Bové, 2006).
Figura 9. Síntoma inicial en hojas.
En las ramas hay una defoliación intensa cuando la enfermedad ha evolucionado. Los
síntomas pueden aparecer en toda la copa y los árboles pueden secarse y morir. En frutos se observa
deformación y asimetría, reducción del tamaño, aparición de áreas de color verde claro que contrastan
con el color amarillo o naranja normal del fruto. Internamente se observan diferencias en maduración y
el aborto de semillas (figura 10), desviación del eje y en algunos casos, la parte blanca de la cáscara
(albedo) se presenta con una espesura mayor de lo normal (Bové, 2006).
Figura 10. Síntomas en frutas infectadas, Reducción de tamaño y semillas abortivas.
HLB en cítricos de México Página 13
II.VIII PCR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HLB
Para el diagnóstico de HLB se han utilizado dos técnicas: reacción en cadena de la
polimerasa convencional (PCR) y la PCR en tiempo real, también conocida como PCR cuantitativa o
qPCR; las cuales se basan en el uso de iniciadores de PCR que amplifican las secuencias de ADN de
los Liberibacters asociados con HLB. El método de PCR convencional emplea iniciadores específicos
que amplifican las secuencias de los genes 16s rDNA de ambos Liberibacter asiaticus y africanus. Es
una técnica conocida por ser simple, rápida y sensible (Sandrine Jagoueix, 1995; NAPPO, 2012).
Aunque la PCR convencional y la qPCR son técnicas aceptadas como confirmatorias de
árboles sintomáticos para el HLB en Brasil y Estados Unidos, la qPCR es mucho más sensible que la
PCR convencional (NAPPO, 2012)
La baja concentración y la distribución desigual del patógeno en plantas huésped y las
complicaciones de la prueba del insecto vector, así como inhibidores de la PCR presentes en los
extractos de cítricos, puede hacer que los patógenos sean difíciles de detectar.
PCR en tiempo real y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), han sido
recientemente desarrollados para la detección o la diferenciación de 'Ca. Liberibacter spp (Wenbin Li
L. L., 2008).
II.IX PCR Tiempo Real
La Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, también conocida como Real Time
PCR (qPCR) muestra la capacidad de monitorear el progreso de la reacción de PCR a medida que
esta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso de PCR y no al final como se realizaba
antes. La RT-PCR usa moléculas de un reportero fluorescente para monitorear la amplificación de
productos durante cada ciclo de reacción. Esta técnica combina los pasos de amplificación de ADN y
la detección en un único ensayo y evita tener que preparar geles de electroforesis para detectar los
productos amplificados. Su simplicidad, especificidad y sensibilidad junto con su potencial como
técnica en aplicaciones futuras y la evolución hacia nuevos conocimientos de la química, además de
la confiabilidad en la instrumentación y protocolos mejorados, han hecho de qPCR una tecnología
altamente competitiva para la detección de ADN y ARN. Antes que revisar la cantidad de ADN blanco
producido después de un número fijo de ciclos, las pruebas de qPCR determinan el punto en el tiempo
durante el proceso de ciclado cuando se detecta por primera vez la amplificación de un producto. Este
se determina identificando el número del ciclo en el cual la intensidad de la emisión del reportero
marcado se levanta sobre el ruido de fondo (Bioq. Mabel Rodriguez G., 2006).
HLB en cítricos de México Página 14
Este número del ciclo está referido como el ciclo umbral o “threshold cycle” (Ct). El Ct se
determina en la fase exponencial de la reacción de PCR y es inversamente proporcional al número de
copias del blanco. Por lo tanto cuanto más alto es el número de copias iniciales de los ácidos
nucleicos a amplificar, más pronto se observa un aumento significativo en la fluorescencia, y son más
bajos los valores de Ct. (Bioq. Mabel Rodriguez G., 2006)
La técnica de PCR en Tiempo Real ha ganado aceptación, debido a su mayor velocidad,
sensibilidad, reproducibilidad y reducción del riesgo de contaminación. Una cuantitativa, múltiple y
fluorogénica PCR en tiempo real fue desarrollada en el año 2005 utilizando una sonda primer fija
específica para Ca. Liberibacter spp. y una enzima llamada Citocromo Oxidasa (COX) basada en un
conjunto de primer-sonda como control interno positivo. Este ensayo permite un diagnóstico de campo
en tiempo real en menos de 1 hora utilizando un termociclador marca Applied biosystems step one
(Figura 11). EN el ensayo de PCR tiempo real se diferencian cepas de HLB mediante el uso de
diferentes cebadores directos para cada cepa HLB pero el mismo cebador inverso y la sonda (John
Bash, 2012).
Dado que la detección del patógeno puede ser difícil debido a la variación de concentración
del patógeno, es importante tener en cuenta que el resultado negativo de la prueba indica que no se
ha detectado el patógeno, pero podría estar presente a niveles muy por debajo de las capacidades de
detección del ensayo (John Bash, 2012).
Figura11. Termociclador marca Applied biosystems step one, utilizado para PCR tiempo real.
HLB en cítricos de México Página 15
II.X PRINCIPIO QUÍMICO DEL ENSAYO
PCR en Tiempo Real (qPCR), puede utilizar fluoróforos generales de unión no específica a
ADN como el Bromuro de Etidio o el SYBR Green I, sondas de hidrólisis (Sondas 5’ nucleasa), sondas
de hibridización, molecular beacon o sondas de secuencias específicas (Ej. Scorpions). Este
compuesto aumenta notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble
cadena (ADNdc). El más utilizado en RT-PCR es el SYBR Green I, (Figura 12) el cual interacciona con
el surco menor del ADNdc, emitiendo 1000 veces más fluorescencia que cuando está libre en
solución. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la
fluorescencia emitida (Bioq. Mabel Rodriguez G., 2006).
Figura 12. Representación de la interacción de SYBR green I con el ADN de doble cadena.
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II.XI IDENTIFICACIÓN ESPECÍFICA
La secuencia completa del gen 16S rRNA se encuentra disponible en Gen Bank bajo el
numero de acceso L22532 para Candidatus liberibacter asiaticus (figura 13 A), y L22533 para
Candidatus liberibacter africanus (figura 13 B) (Don J. Brenner, 2006).
Figura 13. (A) Secuencia de genes 16S rRNA de Candidatus liberibacter asiaticus. (B)
Secuencia de genes 16S rRNA de Candidatus liberibacter africanus.
A
B
HLB en cítricos de México Página 17
Cebadores para la amplificación específica de la secuencia de genes 16S rDNA de
Candidatus liberibacter se han desarrollado y producido un amplicón de 1160 pb con ambas especies.
Las secuencias de oligonucleótidos complementarios a regiones únicas de la secuencia de
genes 16S rDNA son (Don J. Brenner, 2006):
Para Candidatus liberibacter asiaticus:
5´- GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA- 3´
Para Candidatus liberibacter africanus:
5´- GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA- 3´
II.XII CEBADORES TaqMan primers
El cebador inverso (HLBr) es específico para el género liberibacter y reconoce las tres
especies (Las, Laf y Lam) en el género pueden ser utilizados en combinación con los otros cebadores.
HLBas, HLBaf y HLBam son cebadores específicos a Las, Laf y Lam, respectivamente (Cuadro 2).
En el cuadro 3 se muestran las sondas utilizadas para PCR en tiempo real (Real-time PCR).
La sonda HLBp está marcada en el nucleótido 5’ terminal con el colorante reportero 6-carboxi-
fluorescencia (FAM), y en el nucleótido 3’ terminal con un “agujero negro” (BHQ) – 1.
La secuencia del control interno positivo primer-sonda fue diseñada sobre la base de la
secuencia (GenBank CX297817) de citocromo oxidasa (COX) de plantas conservadas. La sonda
interna COX se marca con tetracloro-6-carboxi-fluoresceína (TET) colorante indicador en el nucleótido
5’-terminal y con BHQ-2 en el nucleótido 3’-terminal. En el cuadro 4 se aprecia la secuencia de
citocromo oxidasa (COX) (Wenbin Li J. S., 2005).
Primer Primer Mix Secuencia (5’- 3’) Específico para:
HLBas HLBas primer mix
TCG AGC GCG TAT GCA ATA CG
Las HLBr GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG
HLBam HLBam primer
mix
GAG CGA GTA CGC AAG TAC TAG
Lam HLBr GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG
Cuadro 2. Cebadores utilizados en PCR-RT con sus respectivas secuencias y la especie de
candidatus a la cual pertenece.
HLB en cítricos de México Página 18
Sonda Secuencia
HLBp probe 56-FAM/AGA CGG GTG AGT AAC GCG/3BHQ-1
WGp probe (COX) 5-TET/TTA CTG ACC ATC ACT CTG GAC
GC/3BHQ-2
Cuadro 3. Sondas utilizadas para PCR-RT
Enzima Secuencia
Citocromo Oxidasa (COX) 5’GGTATGCCACGTCGCATTCCAGATTATCCAGATGCTTACGCTGGATGG
AATGCCCTTAGCAGTTTTGGCT3’
Cuadro 4. Secuencia del control interno positivo primer-sonda.
HLB en cítricos de México Página 19
III - JUSTIFICACIÓN
“El Dragón Amarillo” como vulgarmente se le conoce al Huanglongbing (HLB), representa hoy
en día una amenaza para las más de 500 mil hectáreas de plantas de cítricos ubicadas en 24 estados
que practican su cultivo.
La identificación de esta enfermedad es reciente, ya que apenas en 2009 se detectó por
primera vez en México, en árboles de limón mexicano en la península de Yucatán Los siguientes
estados afectados en el mismo año fueron Nayarit y Jalisco, en árboles de la misma especie. A
principios del 2010 se informó por primera vez la presencia de esta enfermedad en cultivos de limón
mexicano en el municipio de Tecomán, Colima.
Esta enfermedad que destruye plantas cítricas representa una gran amenaza para la industria
mundial de estos, invadiendo lentamente nuevos cultivos.
Con el objetivo de identificar el agente etiológico responsable del proceso infeccioso y para
conocer las implicaciones patogénicas/patológicas, la evolución clínica, y aplicar una terapia
antimicrobiana eficaz, un área fundamental en la práctica de la microbiología lo constituye la
asignación de especie a un aislamiento microbiano.
La ausencia de concordancia entre las características observables, morfológicas y/o
fenotípicas del aislamiento en estudio y las correspondientes a la cepa de la especie tipo, hacen que
los métodos fenotípicos realicen la identificación más probable y no definitiva. Para solventar los
problemas presentados por los sistemas de identificación fenotípica (no todas las cepas de una misma
especie muestran una característica específica, una misma cepa puede generar diferentes resultados
en ensayos repetidos y las limitaciones en la base de datos de bacterias correspondiente, entre otros),
(Germán Boua, 2011), los métodos moleculares se han erigido como procedimientos
complementarios, alternativos o incluso de referencia a los fenotípicos (Ana Fernández Olmos, 2010).
Por esta razón es conveniente utilizar métodos moleculares que permiten la identificación de una
bacteria (Candidatus liberibacter spp.) en plantas infectadas, mediante la amplificación de un
fragmento de ADN anteriormente identificado y aislado para su uso.
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IV - OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Validar un método para detectar la presencia del Candidatus liberibacter asiaticus, agente
causal del HLB en cítricos, utilizando técnicas de biología molecular.
OBJETIVO ESPECÍFICO
Extraer ADN con pureza e integridad òptimas para la PCR, utilizando el método del
CTAB.
Analizar la presencia de Clas en 93 muestras de cítricos, utilizando la PCR tiempo
real.
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V - PROBLEMAS A RESOLVER
Los síntomas que presentan las plantas, los cuales son representativos de HLB pueden ser
confundidos o enmascarados con los síntomas de otras enfermedades como deficiencias de
minerales como zinc, hierro, manganeso, calcio, etc (Bové, 2006).
Para esto han ido apareciendo diferentes tecnologías cuyos protocolos están dirigidos al
estudio del ADN; probablemente, la más importante sea la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), se aplica en diferentes áreas de las ciencias biológicas y de la salud, formando parte del
quehacer científico de muchos laboratorios de investigación que la utilizan principalmente para
expresión génica, genotificación, detección de patógenos y análisis de mutaciones. Una de las formas
recientes para detectar y cuantificar a los ácidos nucleicos es a través de la PCR en tiempo real, la
cual es una modalidad de la PCR considerada como una técnica cuantitativa. Actualmente, la PCR en
tiempo real es el método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos. Aun teniendo
una cantidad muy pequeña de templado, el sistema garantiza una alta sensibilidad, especificidad y
eficiencia, una de las ventajas la cantidad de ARNm que puede detectar la reacción puede ser a partir
de concentraciones bajas a diferencia de la PCR convencional (Tamay de Dios L, 2013).
El diagnóstico de enfermedades de forma precisa y confiable es la base para la aplicación
exitosa de programas de producción de material de propagación certificado. Los programas de
saneamiento y certificación, así como la protección de las fuentes de material de propagación contra
insectos, ayudan a limitar la diseminación de bacterias, fitoplasmas, virus y viroides que infectan las
plantas de cítricos. Los programas de certificación garantizan que el material de propagación que se
lleve a las plantaciones esté sano, es decir libre de aquellos patógenos incluidos en la certificación. El
material libre de patógenos transmisibles por injerto, se mantiene bajo control y es reanalizado
periódicamente para detectar la presencia de fitopatógenos, antes de su distribución a los productores
(Lochy Batista).
HLB en cítricos de México Página 22
VI - CAPACITACIÓN LABORAL
Para el uso adecuado de cualquier equipo dentro de las instalaciones del Campo
Experimental Tecomán, se llevó a cabo una semana de capacitación la cual fue del día 19 al 23de
Enero de 2015 por el M.C. Manuel de Jesús Bermúdez Guzmán, para conocer el uso correcto de cada
equipo que utilizaremos en las diferentes técnicas a implementar.
Los equipos a utilizar son los siguientes:
Para la extracción de ADN:
Microcentrifuga Refrigerada marca Prism r
Incubadora marca labgenius
Termo Baño marca Felisa
NanoDrop 2000
Para la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
Termociclador marca Applied biosystems step one
A continuación se explica de manera breve el uso adecuado de estos equipos antes mencionados.
HLB en cítricos de México Página 23
Microcentrifuga Refrigerada marca Prism R (Figura 14A)
Se enciende el equipo 30 minutos antes de utilizarla, para que al momento de
utilizarla la temperatura este a 4°C. Cuidar que la centrifuga se encuentre cerrada, para que
se enfrie de manera adecuada.
Se introducen las muestras dentro de las cavidades de la centrifuga, cuidando
el balance entre ellas (Figura 14B).
Programar el equipo con las condiciones siguientes: 10min, 14000rpm y 4°C
(Figura 14C).
Presionar la tecla START.
Figura 14. (A) Microcentrifuga Refrigerada marca Prism R, (B) cavidades de la centrifuga. (C)
Condiciones utilizadas en la extracción.
START
A B
C
HLB en cítricos de México Página 24
Incubadora marca labGENIUS (Figura 15A)
Este equipo se utiliza para incubar máximo 40 tubos de 1.5 y 2ml, los cuales contienen
muestras inoculadas con RNAsa tipo A.
Encender el equipo 10 a 15 minutos antes de utilizarla para que la
temperatura se encuentre a 37°C.
Incubar muestras por 15 minutos (figura 15B).
Figura 15. (A) Incubadora marca labGENIUS. (B) Colocación de tubos dentro de la incubadora.
A B
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Termo Baño marca Felisa (Figura 16A)
Para usar este equipo, se necesita que este a una temperatura de 65°C, para esto se debe
encender 20-30 minutos antes de utilizarlo.
Ya que llega a esta temperatura, utilizaremos este equipo en 2 ocasiones:
Incubar por 60 minutos nuestros tubos con muestra y buffer CTAB dentro de
una gradilla pequeña. (paso 5 del protocolo de Extracción de ADN modificado) (Figura 16B)
Mantener el buffer CTAB a 65°C colocándolo en una gradilla dentro del termo
baño, antes de utilizarlo (Figura 16C).
Figura 16. (A) Termo Baño marca Felisa. (B) Gradillas pequeñas que contendrán los tubos con buffer
CTAB en la extracción de ADN. (C) Gradilla donde se deposita el CTAB para mantenerlo a 65°C.
A
B C
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NanoDrop 2000 (Figura 17A).
Instalar el software en una laptop.
Conectar el equipo en el puerto USB, de preferencia utilizar una computadora
personal, la cual guardara todos los datos obtenidos de las lecturas en el NanoDrop.
Abrir el software en la computadora
Seleccionar la opción Nucleic Acid, esperar que la computadora detecte el
equipo, para comenzar a leer nuestras muestras (Figura 17B).
Levantar el brazo de muestreo y pipetear buffer TE en el pedestal de medición
inferior, 1µL. Baje el brazo de muestreo y proceder a leer el buffer como muestra blanco
(blank). Este paso se hace para calibrar el equipo (Figura 17C).
Una vez calibrado el equipo, se comienza a leer cada una de las muestras de
interés, levantando el brazo de muestreo y colocando la misma cantidad con la que se calibra
(1µL) en el pedestal de medición inferior. Presionar la opción Measure para proceder a leer.
El software guardara cada medición que se realice, enlistándolas con el
nombre de muestra que se introduzca en cada medición (Figura 17D).
Figura 17. (A) Equipo utilizado para conocer la pureza del ADN extraído. (B) Menú general del
software,. (C) Brazo de muestreo y pedestal de medición donde se coloca la muestra. (D) En el cuadro
lila se observa el listado de muestras registrado.
A
B
C D
HLB en cítricos de México Página 27
Termociclador. Applied biosystems step one (Figura 18)
Encender computadora y equipo 30 minutos antes de iniciar la corrida.
Iniciar Windows.
Abrir software HID Real Time PCR, y hacer clic a invitado. Esperar a que el software
haga conexión con el equipo.
Seleccionar Custom Assay, seguido de Open, Escritorio y se buscara la plantilla de
nombre CuantificaciónHLBinifap.edt
De la columna 3 en adelante se colocan las muestras a analizar.
En el comando Setup, seleccionar la pestaña Assign Targets and samples, y se
procede a escribir los nombres de las muestras a cuantificar.
Asignar a cada pozo (espacio en la placa virtual) el nombre de la muestra que
corresponde.
Seleccionar las opciones Unkown en cada muestra.
Borrar los pozos de la placa que no se vayan a utilizar.
Guardar corrida en Save as… con el nombre de archivo deseado y .edt y dar click en
Start Run.
Figura 18. Termociclador para PCR en tiempo real. Marca Applied biosystems step one.
HLB en cítricos de México Página 28
VII - IMPLEMENTACIÓN DE METODOLOGÍA
Material vegetal. Se colectó tejido foliar de plantas de limón que presentaron síntomas típicos
de la enfermedad del HLB (figura 19). El material vegetal fue almacenado en bolsas de papel y
trasladado en hieleras de unicel al laboratorio de Biotecnología de plantas del INIFAP, Campo
Experimental Tecomán, donde fueron almacenadas en un congelador a -20°C hasta el momento de su
uso.
Figura 19. Muestras de hojas de árboles de cítricos con síntomas de HLB.
Extracción de ADN.
Método utilizado: Método del CTAB (Doyle y Doyle, 1990) Anexo 1.
Fundamento Teórico: Provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar
los ácidos nucleicos de los restos de células (M. Somma, 2015).
Las hojas fueron lavadas con agua corriente y jabón y enjuagadas con agua destilada (Figura
20A). Posteriormente, se colocaron en papel absorbente para secar los excesos de agua y se les
extrajo la nervadura central. Este material fue colocado en morteros pequeños (Figura 20B) y
macerado con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino (Figura 20C), del cual se colocaron
aproximadamente 300 mg en tubos eppendorf de 2 ml (Figura 20D). Seguido se adicionó 800µL de
HLB en cítricos de México Página 29
buffer CTAB a cada tubo (Figura 20E, Anexo 4), a estos tubos se le adicionó 10µL de mercaptoetanol
y 5µL de proteinasa K. Se colocaron en termo baño a 65°C por 60min (Figura 20F). Pasado este
tiempo se llevaron a centrifugar por 10min, 14000rpm y 4°C, para después recuperar el sobrenadante
(500 µL) en tubos de 1.5ml y agregar la RNAsa A (Figura 20G). Los tubos se incubaron por 15min a
37°C, pasado este tiempo se agregó 1 volumen de la solución fenol: cloroformo: alcohol isoamílico
(25:24:1) (Figura 20H) y se centrifugaron por 10min, 14000rpm y 4°C. Finalizado este proceso se
recuperó aproximadamente 350µL del sobrenadante en tubos de 1.5ml para adicionarle 0.6
volúmenes de Isopropanol frío y 0.1 volúmenes de Acetato de Sodio. Se colocaron los tubos a -20°C
por 30min y se llevaron a centrifugar por 10min, 14000rpm y 4°C, posteriormente se desechó la fase
acuosa y se agregó 500µL de Etanol al 70%, finalizado este paso se centrifugaron las muestras por
10min, 14000rpm y 4°C. Para finalizar se desechó la fase acuosa de cada tubo y se colocaron sobre
papel absorbente por 10min para después re suspender la pastilla de ADN en 100µL de buffer TE
(Figura 20i, Anexo 4I).
El ADN resultante se cuantificó midiendo la relación de la absorbancia 260 nm/280 nm (M.
Somma, 2015) utilizando el nanodrop y fue almacenado a -20°C.
Se utilizó el método del CTAB, descrito por Doyle y Doyle (1990), con algunas modificaciones
para la extracción de ácidos nucleicos, ver Anexo 2, estas modificaciones se realizaron con el objetivo
de obtener como resultado de la extracción un ADN con mayor pureza (M. Somma, 2015). En la tabla
1-5 en el Anexo 3 se muestran las lecturas de extracciones a muestras de árboles de limón con
presencia de síntomas a HLB y sus lecturas de pureza bajas a 1.8 (M. Somma, 2015).
HLB en cítricos de México Página 30
Figura 20. Protocolo de Extracción de ADN.
A B
F
E D C
J
I
H G
HLB en cítricos de México Página 31
VII.I MODIFICACIÓN REALIZADA AL MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE ADN:
Se decidió que la RNAsa A se agregara después de la incubación de 60 min en baño maría
con el buffer CTAB, y antes de agregar el fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), ya que al
hacer esta modificación se logró obtener ADN con mayor pureza, en el Anexo 5 se muestran las
tablas 6-22 en las cuales se registran las lecturas de pureza de muestras de árboles de limón, las
cuales ya se encuentran dentro del rango aceptado.
HLB en cítricos de México Página 32
VII.II Detección de Candidatus liberibacter asiaticus mediante la reacción en cadena de
la polimerasa en tiempo real (qPCR).
Fundamento Teórico: Sintetizar muchas veces un segmento, sección o fragmento de ADN
utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la
bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de ahí su nombre comercial
más conocido: taq polimerasa (Ortega, 2012).
Esta técnica está basada en la detección de una señal fluorescente producida
proporcionalmente durante la amplificación del ADN blanco (Bioq. Mabel Rodriguez G., 2006).
PRINCIPIOS DE LA RT-PCR (M. Somma, 2015)
Consiste en ciclos repetitivos de:
Desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN
bicatenario en ADN monocatenario (Figura 21)
Alineamiento de primer/hibridación de sonda: se une el primer (cebador) en el área de
reconocimiento complementaria de la cadena de ADN líder, al igual que la sonda marcada
fluorescentemente.
Extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los cebadores utilizando
ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+.
PERFIL DE TEMPERATURAS NECESARIAS EN CADA CICLO
Figura 21. Temperaturas en cada ciclo en la PCR.
HLB en cítricos de México Página 33
La reacción de PCR en Tiempo Real se realizó en un termociclador marca Applied Biosystems
Step one (Figura 22A) utilizando un conjunto de primers y una sonda marcada fluorescentemente los
cuales son específicos para Ca. L asiaticus y Ca. L. americanus y han sido utilizados ampliamente
para su detección (Wenbin Li L. L., 2008; Wenbin Li J. S., 2005). Estos cebadores y la sonda se
mandaron a hacer a life technologies para la realización de estas reacciones. Las secuencias de estos
se muestran en el cuadro 5 (John Bash, 2012).
Figura 22. (A) Termociclador marca Applied Biosystems Step one.
Primer Primer Mix Secuencia (5’- 3’) Específico para:
HLBas HLBas primer mix
TCG AGC GCG TAT GCA ATA CG Las
HLBr GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG
HLBam HLBam primer mix
GAG CGA GTA CGC AAG TAC TAG Lam
HLBr GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG
Sonda Secuencia
HLBp probe 56-FAM/AGA CGG GTG AGT AAC GCG/3BHQ-1
WGp probe (COX) 5-TET/TTA CTG ACC ATC ACT CTG GAC
GC/3BHQ-2
Cuadro 5. Secuencia de primers necesarios para el ensayo de RT-PCR, los cuales son
específicos para Ca. L asiaticus y Ca. L. americanus.
A
HLB en cítricos de México Página 34
Los tubos con cebadores y sondas provenientes de life technologies, se centrifugaron
brevemente (10-20 segundos a 10.000 rpm) antes de la apertura para garantizar que el material
liofilizado se encuentra en la parte inferior del tubo. Para preparar la solución stock de sondas y
primers a una concentración de 100 µM, los primers y las sondas se re-hidrataron con una solución
stock de buffer TE 1X, almacenándolos en tubos para centrifuga de color ámbar, a una temperatura de
-20°C. Se preparó una solución de primers HLBas/HLBr, HLBam/HLBr, y WG/WGr, mediante la
adición de 20 µl de la solución stock 100 µM a cada par de primers y 960 µl del buffer TE 1X, esta
solución tiene una concentración final de 2 µM. La solución de la sonda se preparó diluyendo 10 µl de
la solución stock de sondas 100 µM con 990 µl de agua de grado molecular, obteniendo una solución
1 µM. Se guardaron alícuotas de esta solución en tubos de 1,5 ml de micro centrífuga de color ámbar
para evitar la degradación debido a la exposición a la luz. Se etiquetaron tubos Cepheid de 25 µl igual
al número de muestras de trabajo más los controles positivo y negativo. Se preparó el mix de PCR
tiempo-real (Anexo 4) dentro de una zona limpia y manteniéndolo siempre en hielo. Se colocaron 23 µl
en cada tubo Cepheid, pipeteando arriba y abajo, manteniendo los tubos en hielo. Las muestras de
ADN se descongelaron a temperatura ambiente por varios minutos, y se colocaron en vortex por 5-10
segundos y se llevaron a centrifugar de 10-20 segundos 10,000 rpm para obtener una pastilla,
manteniendo los tubos en hielo. Se colocaron 2 µl de muestra de ADN en su tubo Cepheid
correspondiente, el volumen total de reacción fue de 25 µl. Como control positivo se utilizó el HLB-
positivo-Las, colocando 2 µl en la misma cantidad de mix, para el control negativo se agregó 2 µl de
agua grado molecular en la misma cantidad de mix. Se colocaron los tubos cerrados a centrifugar por
10 segundos 10,000 rpm vigilando que no quedaran burbujas en el fondo del tubo, pasado ese tiempo
se colocaron en el termociclador. El termociclador se enciende primero y después se abre el software
para evitar cualquier mensaje de error, teclear las condiciones de cada ciclo (Anexo 4) y comenzar la
amplificación.
HLB en cítricos de México Página 35
VIII - OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE TRABAJO
Se analizaron muestras de diferentes cítricos (Limón persa, Limón mexicano, Toronja,
Naranja, y Lima) provenientes de diferentes estados de la República, como lo son: Colima (Figura 23
A, B), Michoacán (Figura 23 C, D), Puebla (Figura 23 E, F), Jalisco (Figura 23 G, H), Baja California
Sur (Figura 23 I, J, K, L), Sinaloa (Figura 23 M, N) y Nayarit (Figura 23 O, P, Q).
Figura 23. (A) Estado de Colima, del cual se obtienen muestras del municipio de Tecomán (B).
Figura 23. (C) Estado de Michoacán, del cual se analizaron muestras de los municipios de
Tepalcatepec y Bellavista (D).
A B
C D
HLB en cítricos de México Página 36
Figura 23. (E) Estado de Puebla, del cual se analizaron muestras del municipio de San José
de Acateno (F).
Figura 23. (G) Estado de Jalisco, del cual se analizaron muestras del municipio de Cabo
Corrientes (H).
E
F
G H
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Figura 23. (I) Estado de Baja California Sur, del cual se analizaron muestras de los municipios
de Cabo San Lucas (J), Los Cabos (K) y San José del Cabo (L).
Figura 23. (M) Estado de Sinaloa, del cual se analizaron muestras del municipio de Mazatlán
(N).
M N
HLB en cítricos de México Página 38
Figura 23. (O) Estado de Nayarit, del cual se analizaron muestras de los municipios de
Chapalilla (P) y Ahuacatlán (Q).
O
P Q
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IX - RESULTADOS
EXTRACCION DE ADN
En el Anexo 3, se observa en las tablas 1-5 una recopilación de datos obtenidos del Nanodrop
2000, que reflejan resultados fuera de rango en cuanto a la pureza del ADN extraido, lo cual hace que
se realice una modificación en el protocolo de extracción de ácidos nucleicos (Doyle, 1990), misma
que consistió en intercambiar el orden de algunos pasos de dicho protocolo, se agregó la RNasa A en
cada muestra de interés, interrumpiendo su acción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1),
contrario a como se hacía originalmente.
En el Anexo 5, de las tablas 6-23 se observa un listado de 85 muestras, las cuales fueron
procesadas con el protocolo modificado, se obtiene un rango de pureza de ADN entre 1.75-2.0, esto
nos indica que el ADN obtenido es puro, y se prosigue a realizar PCR en tiempo real.
Se analizaron 90 muestras provenientes de los diferentes estados de la republica ya
mencionados, utilizando el Método del CTAB (Doyle y Doyle, 1990) Modificado para la extracción de
ADN, se cuantificaron por medio de la técnica PCR en tiempo real en un termociclador marca Applied
Biosystems Step one. Como resultado se obtuvieron las siguientes gráficas:
HLB en cítricos de México Página 40
En el eje X se tiene el número de ciclos y en el eje Y la fluorescencia (ΔRn).
La ventaja más importante de llevar a cabo PCR en tiempo real (qPCR) es que se puede
apreciar el progreso de dicho proceso. Como se observa en la gráfica anterior, se analizaron todas las
muestras al mismo tiempo, el primer umbral que se obtiene, automáticamente del software, es el del
control positivo a HLB, el cual se representa con la línea roja.
En la gráfica siguiente se aprecia el segundo umbral, el cual pertenece al control Citocromo
Oxidasa (COX), presente en todas las muestras analizadas, este también se obtiene automáticamente
del software.
HLB en cítricos de México Página 41
El número de ciclos (ct) necesarios para que la cantidad de ADN obtenida en cada extracción
se amplifique lo suficiente y sobrepase ambos umbrales para detectar Clas, es de 36 ciclos, esto lo
determina el software utilizado. Si la muestra necesita menos de 36 ciclos (ct<36) para que sobrepase
los umbrales, se considera que la muestra es positiva a Clas; de lo contrario, si sobrepasa los 36
ciclos (ct>36) y no cruza los umbrales, se considera que es negativa a Clas.
Dicho lo anterior, en los cuadros 6-9 se muestra un listado de las muestras representadas por
las gráficas anteriores, incluye también:
La concentración de ADN en ng/µl
La pureza (260/280)
Ct COX y la amplificación de este
El valor de Ct y su amplificación
Resultado positivo a HLB
HLB en cítricos de México Página 42
Cuadro 6. Concentrado de muestras analizadas.
Numero de muestra
Concentración (ng/ µl )
260/280 Ct
COX Amplificación
COX ct
16s Amplificación
16s Resultado
HLB
M1-VM 827 1,88 18,8 Si 40 No Negativo
M3-VM 842 1,87 19 Si 29,8 Si Positivo
M4-VM 870 1,87 19,1 Si 30,3 Si Positivo
M5-VM 644 1,78 18,7 Si 40 No Negativo
M6-VM 887 1,96 18,6 Si 32,3 Si Positivo
M7-VM 490 1,96 19,6 Si 34,4 Si Positivo
M8-VM 1284 1,95 18,2 Si 25,5 Si Positivo
M9-VM 709 1,94 18,4 Si 40 No Negativo
M10-VM 972 1,89
M11-VM 731 1,89 18,9 Si 30,5 Si Positivo
M12-VM 396 1,99 23,1 Si 40 No Negativo
M13-VM 518 1,97 22 Si 40 No Negativo
M14-VM 832 1,94 19,8 Si 40 No Negativo
M15-VM 780 1,81 19,7 Si 31,3 Si Positivo
M16-VM 699 1,87 19,8 Si 30,6 Si Positivo
M17-VM 440 1,94 19,9 Si 26,4 Si Positivo
M20-VM 719 1,96 21 Si 29,6 Si Positivo
M26-VM 161 1,75 19,8 Si 31,1 Si Positivo
M27-VM 433 1,84 17,8 Si 34,4 Si Positivo
M46-VM 315 1,87 19,3 Si 40 No Negativo
M47-VM 221 1,84 18,1 Si 40 No Negativo
M50-VM 578 1,84 17,8 Si 25 Si Positivo
M53-VM 120 1,8 20,5 Si 36,9 Si Negativo
M56-VM 1364 1,85 18,2 Si 25,8 Si Positivo
M57-VM 1211 1,95 17,6 Si 23,2 Si Positivo
M58-VM 300 1,92 20,2 Si 26,5 Si Positivo
HLB en cítricos de México Página 43
Numero de muestra
Concentración (ng/ µl) 260/280 ct COX Amplificación
COX ct
16s Amplificación
16s Resultado
HLB
M59-VM 2222 1,9 17,6 Si 24,8 Si Positivo
M60-VM 1226 1,86 23,6 Si 22,8 Si Positivo
M61-VM 1168 1,97 18 Si 27,1 Si Positivo
M62-VM 539 1,84 19,7 Si 26,1 Si Positivo
M63-VM 1036 1,96 18,6 Si 24 Si Positivo
M64-VM 998 1,94 18 Si 22,4 Si Positivo
M65-VM 1430 1,96 18,3 Si 38,7 No Negativo
M66-VM 2346 1,75 25,1 Si 40 No Negativo
M67-VM 1935 1,9 17,4 Si 40 No Negativo
M68-VM 1228 1,88 17,6 Si 21,6 Si Positivo
M69-VM 812 1,87 19,9 Si 23,3 Si Positivo
M70-VM 1005 1,95 19,2 Si 29,6 Si Positivo
M71-VM 829 1,88 19,2 Si 22,7 Si Positivo
M74-VM 1118 1,79 19 Si 22,5 Si Positivo
M75-VM 811 1,89 19,1 Si 24,9 Si Positivo
M76-VM 1223 1,95 18,2 Si 26,2 Si Positivo
M77-VM 1491 1,95 18,3 Si 40 No Negativo
M78-VM 823 1,9 19,5 Si 22,3 Si Positivo
M79-VM 1255 1,96 18,3 Si 24,8 Si Positivo
M80-VM 665 1,88 19,7 Si 27,7 Si Positivo
M81-VM 807 1,86 18,5 Si 25,7 Si Positivo
M83-VM 808 1,88 18,5 Si 40 No Negativo
M84-VM 594 1,95 27,5 Si 38,3 No Negativo
M85-VM 831 1,87 20 Si 21,8 Si Positivo
M86-VM 4201 1,96 16,9 Si 20,5 Si Positivo
M87-VM 571 1,91 18,9 Si 22,3 Si Positivo
HLB en cítricos de México Página 44
Numero de muestra
Concentración (ng/ µl)
260/280 ct COX Amplificación COX ct 16s Amplificación
16s Resultado HLB
M88-VM 1147 1.93 18.3 Si 21.0 Si Positivo
M89-VM 755 1.91 20.5 Si 40 No Negativo
M90-VM 1240 1.96 18.7 Si 35.3 Si Positivo
M91-VM 691 1.92 22.6 Si 26.1 Si Positivo
M92-VM 1494 2.00 18.2 Si 40 No Negativo
M93-VM 946 1.93 18.5 Si 40 No Negativo
M94-VM 542 1.95 21.0 Si 38.6 Si Positivo
M95-VM 685 1.93 19.3 Si 30.6 Si Positivo
M96-VM 1123 1.97 18.5 Si 40 No Negativo
M97-VM 827 1.91 19.9 Si 40 No Negativo
M98-VM 801 1.90 19.0 Si 40 No Negativo
M99-VM 328 1.93 19.8 Si 40 No Negativo
M100-VM 733 1.87 17.8 Si 40 No Negativo
M101-VM 1202 1.93 18.1 Si 40 No Negativo
M102-VM 747 1.92 18.2 Si 40 No Negativo
M103-VM 741 1.89 19.1 Si 40 No Negativo
M104-VM 549 1.89 18.4 Si 40 No Negativo
M105-VM 500 1.93 19.6 Si 40 No Negativo
M106-VM 605 1.92 20.8 Si 40 No Negativo
M107-VM 527 1.96 22.9 Si 40 No Negativo
M108-VM 1239 1.90 18.0 Si 40 No Negativo
M109-VM 571 1.90 19.2 Si 40 No Negativo
M111-VM 1378 1.62 40.0 No 40 No Negativo
M112-VM 685 1.83 19.0 Si 40 No Negativo
M113-VM 887 1.86 18.9 Si 40 No Negativo
M114-VM 523 1.83 18.6 Si 40 No Negativo
HLB en cítricos de México Página 45
Numero de muestra
Concentración (ng/µl)
260/280 ct COX Amplificación
COX ct 16s
Amplificación 16s
Resultado HLB
M115-VM 982 1.82 17.9 Si 40 No Negativo
M116-VM 743 1.85 19.0 Si 40 No Negativo
M117-VM 903 1.88 18.5 Si 40 No Negativo
M118-VM 1563 1.98 18.0 Si 40 No Negativo
M119-VM 903 1.86 21.7 Si 40 No Negativo
M120-VM 823 1.93 18.8 Si 40 No Negativo
M122-VM 471 1.90 19.7 Si 40 No Negativo
M124-VM 500 1.94 18.7 Si 40 No Negativo
M125-VM 454 1.87 18.3 Si 40 No Negativo
M126-VM 523 1.85 18.9 Si 40 No Negativo
M127-VM 461 1.92 17.9 Si 40 No Negativo
M129-VM 273 1.87 20.4 Si 37.0 No Negativo
HLB en cítricos de México Página 46
X - CONCLUSIONES
La enfermedad de los cítricos, o también conocida como dragón amarillo, ya se encuentra
ampliamente distribuida en la mayoría de los estados del país; representando una gran amenaza para
aquellos que tienen gran productividad de cítricos; generando desempleo, reducción de los beneficios
que nos proporciona el procesamiento de productos cítricos, también se ve afectado el concepto de
exportaciones, ya que se reduce la producción de estos insumos, generando así una baja en el
ingreso económico en el país.
Esta enfermedad afecta a la planta por completo, el síntoma más importante es el color
amarillo presente en las hojas de algunas ramas. Para confirmar la presencia de HLB es necesario
realizar análisis utilizando técnicas moleculares a los cultivos que presenten estas anomalías, ya que
algunas veces los cultivos presentan ciertas diferencias en color, debido a falta de nutrientes; tamaño
de la planta o tamaño del fruto, y no necesariamente son síntomas de alguna enfermedad.
La técnica utilizada en este proyecto fue PCR cuantitativa, ya que es mucho más sensible
para detectar ácidos nucleicos en comparación con la PCR convencional. En este proyecto, la
cantidad de ADN utilizada fue la contenida en 1µl de cada muestra a analizar, indicativo de la alta
sensibilidad de esta técnica.
Es necesario realizar monitoreos a los cultivos de cítricos con mayor frecuencia y analizar
cuando se observen anomalías físicas en las plantas, así se evitan pérdidas en su producción y con
ello un mayor ingreso económico a nuestro país. Esto también ayuda a disminuir el impacto
ocasionado al medio ambiente, ya que la tala masiva de árboles enfermos no es la solución a este
problema, la prevención sí.
HLB en cítricos de México Página 47
XI - REFERENCIAS
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HLB en cítricos de México Página 49
ANEXOS
1.- EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NÚCLEICOS.
Para la extracción de ADN se utilizó el Método del CTAB (Doyle y Doyle, 1990).
Utilizando hojas de plantas de cítricos, con síntomas característicos de la enfermedad.
Lavado de material vegetal, con agua para retirar los excesos de impurezas.
Pulverizar el tejido con N2 líquido, colocar 200 mg. dentro de tubos de 2 ml.
Mantener el tejido congelando los tubos en un recipiente con N2 líquido.
Homogeneizar el tejido con 800 µL de buffer CTAB precalentado a 65°C.
Adicionar 10 µL de 2-β-mercaptoetanol concentrado y 5 µL de proteinasa K
(20 mg mL-1
). Mezclar en Vortex.
Incubar 60 minutos a 65°C en baño maría y mezclar por inversión cada 5-10
minutos.
Adicionar 800 µL de la solución fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1),
mezclar usando vortex y centrifugar a 14,000 rpm a 4°C durante 10 minutos.
Recuperar el sobrenadante en tubos de 1.5 mL pre enfriados en hielo,
precipitar el ADN con 0.6 volúmenes de isopropanol frío y 0.1 volúmenes de acetato de sodio
3M, pH 5.2. Mezclar los tubos por inversión e incubar durante 30 minutos a -20°C para
precipitar el ADN.
Centrifugar a 14,000 rpm a 4°C durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante
y agregar 500 µL de etanol al 70%. Agitar manualmente hasta desprender la pastilla de ADN.
Centrifugar a 14,000 rpm a 4°C durante 5 minutos, decantar la fase acuosa.
Invertir los tubos abiertos sobre papel absorbente para retirar el exceso de
etanol. Mantener los tubos de esta forma y secar a temperatura ambiente por aprox. 10-15
minutos.
Resuspender el ADN en 50-100 µL de agua estéril o buffer TE según el
tamaño de la pastilla.
Agregar 1 µL de RNasa A (10mg/ml) e incubar durante 5 minutos a 37°C.
Posteriormente incubar a 65°C durante 20 minutos. Almacenar el ADN a 4 o -20°C.
HLB en cítricos de México Página 50
Anexo 2
Método del CTAB (Doyle y Doyle, 1990) Modificado.
Lavado de material vegetal, con agua para retirar los excesos de impurezas.
Pulverizar el tejido con N2 líquido, colocar 200 mg. dentro de tubos de 2 ml.
Mantener el tejido congelando los tubos en un recipiente con N2 líquido.
Homogeneizar el tejido con 800 µL de buffer CTAB precalentado a 65°C.
Adicionar 10 µL de 2-β-mercaptoetanol concentrado y 5 µL de proteinasa K
(20 mg mL-1
). Mezclar en Vortex.
Incubar 60 minutos a 65°C en baño maría y mezclar por inversión cada 5-10
minutos.
Colocar tubos en una gradilla y llevarlos a centrifugar a 14000rpm, 10 minutos
y a 4°C.
Recuperar sobrenadante en tubos de 1.5ml, aproximadamente 500µL.
Agregar 5 µL de RNasa A (10mg/ml) e incubar durante 15 minutos a 37°C.
Adicionar 1 volumen de la solución fenol:cloroformo:alcohol isoamílico
(25:24:1), mezclar usando vortex y centrifugar a 14,000 rpm a 4°C durante 10 minutos.
Recuperar el sobrenadante en tubos de 1.5 mL pre enfriados en hielo,
precipitar el ADN con 0.6 volúmenes de isopropanol frío y 0.1 volúmenes de acetato de sodio
3M, pH 5.2. Mezclar los tubos por inversión e incubar durante 30 minutos a -20°C para
precipitar el ADN.
Centrifugar a 14,000 rpm a 4°C durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante
y agregar 500 µL de etanol al 70%. Agitar manualmente hasta desprender la pastilla de ADN.
Centrifugar a 14,000 rpm a 4°C durante 5 minutos, decantar la fase acuosa.
Invertir los tubos abiertos sobre papel absorbente para retirar el exceso de
etanol. Mantener los tubos de esta forma y secar a temperatura ambiente por aprox. 10-15
minutos.
Resuspender el ADN en 50-100 µL de agua estéril o buffer TE según el
tamaño de la pastilla.
HLB en cítricos de México Página 51
Anexo 3
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
1 m 39 INIFAP 03/06/2015 01:34:06 p. m. 87.2 ng/µl 1.744 1.072 1.63
1.63 99.06 DNA 50
2 m 39 D INIFAP 03/06/2015 01:34:39 p. m. 88.3 ng/µl 1.766 1.084 1.63 45.02 DNA 50
3 m 40 INIFAP 08/06/2015 01:07:20 p. m. 289.7 ng/µl 5.795 4.147 1.4
1.385 1.12 DNA 50
4 m 40 D INIFAP 08/06/2015 01:08:30 p. m. 229.4 ng/µl 4.587 3.36 1.37 1.37 DNA 50
5 m 42 INIFAP 08/06/2015 01:10:13 p. m. 3.1 ng/µl 0.063 0.143 0.44
0.895 -0.13 DNA 50
6 m 42 D INIFAP 08/06/2015 01:12:16 p. m. 32.5 ng/µl 0.651 0.481 1.35 1.72 DNA 50
7 m 43 INIFAP 08/06/2015 01:13:22 p. m. 446.9 ng/µl 8.939 6.53 1.37
1.375 0.77 DNA 50
8 m 43 D INIFAP 08/06/2015 01:13:48 p. m. 505.5 ng/µl 10.11 7.315 1.38 0.79 DNA 50
9 m 44 INIFAP 08/06/2015 01:14:31 p. m. 89.7 ng/µl 1.794 1.125 1.59
1.585 1.59 DNA 50
10 m 44 D INIFAP 08/06/2015 01:14:57 p. m. 88.9 ng/µl 1.778 1.129 1.58 1.52 DNA 50
Tabla 1. Lecturas de extracciones a muestras de árboles de limón con presencia de síntomas a HLB bajas a 1.8. Extracciones realizadas con el
Método del CTAB (Doyle y Doyle, 1990)
HLB en cítricos de México Página 52
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
11 m 48 INIFAP 08/06/2015 01:16:40 p. m. 318.3 ng/µl 6.365 5.091 1.25
1.28 0.48 DNA 50
12 m 48 D INIFAP 08/06/2015 01:17:02 p. m. 2700.1 ng/µl 54.002 41.268 1.31 0.79 DNA 50
13 m 147 INIFAP 08/06/2015 01:25:53 p. m. 99.7 ng/µl 1.995 1.201 1.66
1.66 1.68 DNA 50
14 m 147 D INIFAP
08/06/2015 01:26:16 p. m. 97.1 ng/µl 1.943 1.168 1.66 1.72 DNA 50
15 m 148 INIFAP 08/06/2015 01:26:52 p. m. 111.2 ng/µl 2.224 1.362 1.63
1.645 1.6 DNA 50
16 m 148 D INIFAP 08/06/2015 01:27:14 p. m. 107.9 ng/µl 2.158 1.297 1.66 1.84 DNA 50
17 m 152 INIFAP 09/06/2015 11:53:14 a. m. 36.3 ng/µl 0.726 0.47 1.55
1.415 -0.66 DNA 50
18 m 152 D INIFAP 09/06/2015 11:54:34 a. m. 50.7 ng/µl 1.015 0.791 1.28 -1.41 DNA 50
19 m 153 INIFAP 09/06/2015 11:55:29 a. m. 29 ng/µl 0.581 0.427 1.36
1.36 -0.55 DNA 50
20 m 153 D INIFAP 09/06/2015 11:56:28 a. m. 29.4 ng/µl 0.589 0.432 1.36 -0.54 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 53
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
21 m 154 INIFAP 09/06/2015 12:05:10 p. m. -21.7 ng/µl -0.434 -0.274 1.58
1.595 0.24 DNA 50
22 m 154 D INIFAP
09/06/2015 12:05:43 p. m. -21 ng/µl -0.42 -0.262 1.61 0.23 DNA 50
23 m 155 INIFAP 09/06/2015 12:06:23 p. m. 19.1 ng/µl 0.382 0.289 1.32
1.31 -0.33 DNA 50
24 m 155 D INIFAP
09/06/2015 12:06:53 p. m. 22.3 ng/µl 0.446 0.343 1.3 -0.41 DNA 50
25 m 159 INIFAP 09/06/2015 12:08:35 p. m. 121.7 ng/µl 2.433 1.646 1.48
1.46 -6.69 DNA 50
26 m 159 D INIFAP
09/06/2015 12:08:53 p. m. 123.1 ng/µl 2.462 1.713 1.44 -8.97 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 54
# Sample ID User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
1 m 162-A vm INIFA 09/06/2015 12:11:17 p. m. 10.2 ng/µl 0.204 0.229 0.89
1.01 -0.08 DNA 50
2 m 162-A vm D INIFA
09/06/2015 12:11:43 p. m. 27.1 ng/µl 0.541 0.48 1.13 -0.3 DNA 50
3 m 170-A vm INIFA 09/06/2015 12:39:09 p. m. 77.7 ng/µl 1.553 0.949 1.64
1.65 1.88 DNA 50
4 m 170-A vm D INIFA
09/06/2015 12:39:32 p. m. 78 ng/µl 1.56 0.942 1.66 1.98 DNA 50
5 m 171-A vm INIFA 09/06/2015 12:40:15 p. m. 38.5 ng/µl 0.769 0.48 1.6
1.575 1.8 DNA 50
6 m 171-A vm D INIFA
09/06/2015 12:40:33 p. m. 39 ng/µl 0.78 0.503 1.55 1.58 DNA 50
7 m 173-A vm INIFA 09/06/2015 12:42:15 p. m. 31.5 ng/µl 0.63 0.396 1.59
1.61 1.66 DNA 50
8 m 173-A vm D INIFA
09/06/2015 12:42:35 p. m. 30.5 ng/µl 0.61 0.374 1.63 2.25 DNA 50
9 m 174-A vm INIFA 09/06/2015 12:43:13 p. m. 54.9 ng/µl 1.099 0.693 1.58
1.6 1.04 DNA 50
10 m 174-A vm D INIFA
09/06/2015 12:43:32 p. m. 55.4 ng/µl 1.108 0.682 1.62 1.23 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 55
# Sample ID User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
11 m 176-A vm INIFA
09/06/2015 12:49:08 p. m. 90.5 ng/µl 1.811 1.28 1.41
1.41 1.42 DNA 50
12 m 176-A vm D INIFA
09/06/2015 12:49:59 p. m. 89.7 ng/µl 1.795 1.27 1.41 1.48 DNA 50
13 m 177-A vm INIFA
09/06/2015 12:50:50 p. m. 58.7 ng/µl 1.173 0.751 1.56
1.57 1.56 DNA 50
14 m 177-A vm D INIFA
09/06/2015 12:51:14 p. m. 58.4 ng/µl 1.169 0.739 1.58 1.65 DNA 50
15 m 179-A vm INIFA
09/06/2015 12:52:06 p. m. 68.9 ng/µl 1.378 0.898 1.53
1.495 1.64 DNA 50
16 m 179-A vm D INIFA
09/06/2015 12:52:29 p. m. 74.7 ng/µl 1.494 1.023 1.46 1.37 DNA 50
17 m 180-A vm INIFA
09/06/2015 12:53:10 p. m. 109.2 ng/µl 2.183 1.476 1.48
1.49 1.39 DNA 50
18 m 180-A vm D INIFA
09/06/2015 12:53:32 p. m. 107.7 ng/µl 2.155 1.435 1.5 1.53 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 56
Anexo 4
Preparación de soluciones
(Humana, 2008)
Ácido Clorhídrico
COMPUESTO CANTIDAD
HCL concentrado 8.62 mL
H2O 91 mL
Aforar a 100ml
Hidróxido de Sodio
COMPUESTO CANTIDAD
NaOH 40 g
H2O 40 mL
Aforar a 100ml
Tris HCL
COMPUESTO CANTIDAD
Tris base 121 grs
H2O 800 mL
pH* 8.0
Aforar a 1000ml
*Ajustar pH con 1M HCl
HLB en cítricos de México Página 57
EDTA
COMPUESTO CANTIDAD
Na2EDTA-2H2O 186.1 grs
H2O 700 ml
pH* 8.0
Aforar a 1000ml
*Ajustar pH con 10M NaOH
Buffer CTAB
COMPUESTO CANTIDAD
CTAB 1.2gr
NaCL 1ml
PVP 40 0.4gr
Tris HCL 11.2ml
EDTA 11.2ml
H2O 20ml
Aforar a 40ml
Buffer TE
5ml 10ml 50ml 100ml 250ml 500ml 1000ml
1M TrisHCl 50 µl 100 µl 500 µl 1 ml 2.5 ml 5 ml 10 ml
0.5M EDTA 10 µl 20 µl 100 µl 0.2 ml 0.5 ml 1 ml 2 ml
H2O 4.94 ml 9.88 ml 49.4 ml 98.8 ml 247 ml 494 ml 988 ml
HLB en cítricos de México Página 58
PREPARACION DE SOLUCIONES PARA RT-PCR
Mix para PCR en tiempo real
Reagents 1 Reacción
Molec. Grade wáter
4.7 µl
10x PCR buffer
2.5 µl
MgCl2 (50mM)
3 µl
dNTPs (10 mM each) (Invitrogen)
0.6 µl
Platinum Taq (5U/μl) Invitrogen
0.2 µl
HLB primer Mix* (2μM each)
3 µl
HLBp probe (1μM)
3 µl
WG primer Mix (2μM each)
3 µl
WGp probe (1μM)
3 µl
Total 23 µl
* HLB primer Mix* en la tabla se refiere HLBas/HLBr or HLBam/HLBr y WG primer mix se refiere a
WG/WGr
CONDICIONES PARA TERMOCICLADOR DE PCR-TIEMPO REAL
Temperatura °C Tiempo (segundos) Ciclos
95 20 40
95 1
58 40
HLB en cítricos de México Página 59
Anexo 5
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
1 m1 vm INIFAP 14/04/2015 07:01:38 p. m. 908 ng/µl 18.161 9.332 1.95 1.95 2.02 DNA 50
2 m2 vm INIFAP 14/04/2015 07:02:41 p. m. 1088.6 ng/µl 21.772 10.538 2.07
2.065 2.33 DNA 50
3 m2 d vm INIFAP 14/04/2015 07:03:36 p. m. 1080.2 ng/µl 21.605 10.509 2.06 2.25 DNA 50
4 m3 vm INIFAP 14/04/2015 07:05:01 p. m. 743.7 ng/µl 14.875 7.915 1.88 1.88 1.86 DNA 50
5 m4 vm INIFAP 14/04/2015 07:06:01 p. m. 963.8 ng/µl 19.276 10.037 1.92 1.92 2.2 DNA 50
6 m5 vm INIFAP 14/04/2015 07:06:53 p. m. 642.7 ng/µl 12.854 7.204 1.78
1.795 2.04 DNA 50
7 m5d vm INIFAP 14/04/2015 07:07:48 p. m. 700.1 ng/µl 14.003 7.716 1.81 2.17 DNA 50
8 m6 vm INIFAP 14/04/2015 07:08:59 p. m. 1051.5 ng/µl 21.029 10.175 2.07
2.055 2.23 DNA 50
9 m6d vm INIFAP 14/04/2015 07:09:44 p. m. 3013 ng/µl 60.26 29.562 2.04 2.2 DNA 50
10 m7 vm INIFAP 14/04/2015 07:11:22 p. m. 1158.6 ng/µl 23.172 11.341 2.04
2.035 2.26 DNA 50
11 m7d vm INIFAP 14/04/2015 07:12:23 p. m. 1164.1 ng/µl 23.282 11.458 2.03 2.25 DNA 50
12 m8 vm INIFAP 14/04/2015 07:14:03 p. m. 1393.2 ng/µl 27.863 14.058 1.98 1.98 2.16 DNA 50
13 m9 vm INIFAP 14/04/2015 07:15:41 p. m. 839.9 ng/µl 16.799 8.512 1.97 1.97 2.04 DNA 50
14 m10 vm INIFAP 14/04/2015 07:16:56 p. m. 1417 ng/µl 28.341 14.701 1.93 1.93 2.19 DNA 50
Tabla 6. Lecturas de extracciones a muestras de árboles de limón con presencia de síntomas a HLB y sus lecturas de pureza dentro del rango
aceptado. Extracciones realizadas con el Método del CTAB (Doyle y Doyle, 1990) Modificado.
HLB en cítricos de México Página 60
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
15 m11 vm INIFAP 14/04/2015 07:18:12 p. m. 721.4 ng/µl 14.428 7.514 1.92 1.92 2.33 DNA 50
16 m12 vm INIFAP 14/04/2015 07:18:55 p. m. 418.3 ng/µl 8.366 4.262 1.96 1.96 1.68 DNA 50
17 m13 vm INIFAP 14/04/2015 07:20:15 p. m. 549.3 ng/µl 10.986 5.36 2.05 2.05 1.89 DNA 50
18 m14 vm INIFAP 14/04/2015 07:25:38 p. m. 378.2 ng/µl 7.564 3.86 1.96 1.96 2.01 DNA 50
19 m15 vm INIFAP 14/04/2015 07:27:13 p. m. 876.6 ng/µl 17.531 9.604 1.83 1.83 1.8 DNA 50
20 m16 vm INIFAP 14/04/2015 07:28:57 p. m. 835.8 ng/µl 16.717 8.759 1.91 1.91 1.93 DNA 50
21 m17 vm INIFAP 14/04/2015 07:30:16 p. m. 409.2 ng/µl 8.184 4.189 1.95 1.95 1.85 DNA 50
22
m 18-A vm INIFAP
03/06/2015 01:19:02 p. m. 229.5 ng/µl 4.59 2.457 1.87
1.87 1.99 DNA 50
23
m 18-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:20:31 p. m. 232.8 ng/µl 4.656 2.487 1.87 2.01 DNA 50
24
m 19-A vm INIFAP
10/06/2015 01:51:20 p. m. 213.5 ng/µl 4.27 2.511 1.7
1.705 6.2 DNA 50
25
m 19-A vm D INIFAP
10/06/2015 01:52:14 p. m. 213.7 ng/µl 4.274 2.502 1.71 5.81 DNA 50
26 m20 vm INIFAP 14/04/2015 07:37:09 p. m. 628.4 ng/µl 12.569 6.349 1.98 1.98 2.77 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 61
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
27
m 21-A vm INIFAP
03/06/2015 01:21:03 p. m. 52.5 ng/µl 1.049 0.582 1.8
1.815 2.31 DNA 50
28
m 21-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:21:39 p. m. 53.5 ng/µl 1.07 0.586 1.83 2.25 DNA 50
29
m 22-A vm INIFAP
03/06/2015 01:22:09 p. m. 252.4 ng/µl 5.049 3.819 1.32
1.31 0.65 DNA 50
30
m 22-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:22:38 p. m. 480 ng/µl 9.601 7.377 1.3 0.78 DNA 50
31
m 23-A vm INIFAP
03/06/2015 01:23:13 p. m. 113 ng/µl 2.259 1.117 2.02
2.015 2.34 DNA 50
32
m 23-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:23:38 p. m. 115.7 ng/µl 2.313 1.153 2.01 2.3 DNA 50
33
m 24-A vm INIFAP
03/06/2015 01:24:05 p. m. 94 ng/µl 1.881 0.969 1.94
1.945 2.25 DNA 50
34
m 24-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:24:35 p. m. 95.4 ng/µl 1.907 0.98 1.95 2.22 DNA 50
35
m 25-A vm INIFAP
03/06/2015 01:25:05 p. m. 506.9 ng/µl 10.139 4.846 2.09
2.09 2.44 DNA 50
36
m 25-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:25:30 p. m. 508 ng/µl 10.16 4.868 2.09 2.44 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 62
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
37 m26 vm INIFAP
17/04/2015 09:27:51 a. m. 158.2 ng/µl 3.164 1.834 1.73
1.725 1.78 DNA 50
38 m26d vm INIFAP
17/04/2015 09:29:39 a. m. 168.4 ng/µl 3.368 1.963 1.72 1.76 DNA 50
39 m27d vm INIFAP
17/04/2015 09:31:59 a. m. 342.1 ng/µl 6.842 3.689 1.85
1.85 1.58 DNA 50
40 m27 vm INIFAP
17/04/2015 09:31:15 a. m. 321.4 ng/µl 6.429 3.474 1.85 1.64 DNA 50
41
m 28-A vm INIFAP
10/06/2015 01:52:49 p. m. 293.4 ng/µl 5.868 3.297 1.78
1.775 4.09 DNA 50
42
m 28-A vm D INIFAP
10/06/2015 01:53:47 p. m. 286.3 ng/µl 5.727 3.238 1.77 4.09 DNA 50
43
m 29-A vm INIFAP
03/06/2015 01:26:00 p. m. 96.1 ng/µl 1.922 0.965 1.99
1.99 -5.04 DNA 50
44
m 29-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:26:26 p. m. 96.6 ng/µl 1.933 0.969 1.99 -5.07 DNA 50
45
m 30-A vm INIFAP
03/06/2015 01:27:05 p. m. 629.9 ng/µl 12.598 5.989 2.1
2.095 2.29 DNA 50
46
m 30-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:27:42 p. m. 622.6 ng/µl 12.452 5.949 2.09 2.3 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 63
# Sample ID User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
47 m 31-A vm INIFAP 03/06/2015 01:28:18 p. m. 299.8 ng/µl 5.995 2.93 2.05
2.045 2.19 DNA 50
48
m 31-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:28:45 p. m. 297.6 ng/µl 5.952 2.919 2.04 2.21 DNA 50
49 m 32-A vm INIFAP 03/06/2015 01:29:17 p. m. 45.7 ng/µl 0.915 0.468 1.96
1.93 2.54 DNA 50
50
m 32-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:30:03 p. m. 46.5 ng/µl 0.93 0.488 1.9 2.23 DNA 50
51 m 33-A vm INIFAP 03/06/2015 01:31:01 p. m. 56 ng/µl 1.121 0.647 1.73
1.72 2.04 DNA 50
52
m 33-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:31:27 p. m. 56 ng/µl 1.119 0.653 1.71 2.02 DNA 50
53 m 34-A vm INIFAP 03/06/2015 01:31:56 p. m. 57.6 ng/µl 1.152 0.591 1.95
1.97 2.68 DNA 50
54
m 34-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:32:20 p. m. 57.8 ng/µl 1.156 0.582 1.99 2.73 DNA 50
55 m 37-A vm INIFAP 10/06/2015 01:54:49 p. m. 1456.3 ng/µl 29.126 16.222 1.8
1.795 2.22 DNA 50
56
m 37-A vm D INIFAP
10/06/2015 01:55:16 p. m. 1511.3 ng/µl 30.225 16.889 1.79 2.04 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 64
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
57
m 38-A vm INIFAP
03/06/2015 01:33:02 p. m. 247.9 ng/µl 4.958 2.723 1.82
1.82 1.9 DNA 50
58
m 38-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:33:27 p. m. 248.7 ng/µl 4.974 2.728 1.82 1.91 DNA 50
59
m 39-A vm INIFAP
03/06/2015 01:34:06 p. m. 87.2 ng/µl 6.75 4.07
1.66
1.73 2.04 DNA 50
60
m 39-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:34:39 p. m. 88.3 ng/µl 3.76 2.08
1.81 1.11 DNA 50
61
m 40-A vm INIFAP
08/06/2015 01:07:20 p. m. 289.7 ng/µl
5.80
3.15
1.84
1.89 2.06 DNA 50
62
m 40-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:08:30 p. m. 229.4 ng/µl
4.59
2.36
1.94 2 DNA 50
63
m 39-A vm INIFAP
03/06/2015 01:34:06 p. m. 87.2 ng/µl 6.75 4.07 1.65847666
1.73 2.04 DNA 50
64
m 39-A vm D INIFAP
03/06/2015 01:34:39 p. m. 88.3 ng/µl 3.76 2.08 1.80769231 1.11 DNA 50
65
m 40-A vm INIFAP
08/06/2015 01:07:20 p. m. 289.7 ng/µl
5.80
3.15
1.84
1.89 2.06 DNA 50
66
m 40-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:08:30 p. m. 229.4 ng/µl
4.59
2.36
1.94 2 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 65
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
67
m 41-A vm INIFA
08/06/2015 01:09:17 p. m. 106 ng/µl 2.121 1.141 1.86
1.855 6.2 DNA 50
68
m 41-A vm D INIFA
08/06/2015 01:09:37 p. m. 111 ng/µl 2.22 1.197 1.85 5.11 DNA 50
69
m 42-A vm INIFAP
08/06/2015 01:10:13 p. m. 3.1 ng/µl 6.033 5.161
1.17
2.16 2.01 DNA 50
70
m 42-A vm INIFAP
08/06/2015 01:12:16 p. m. 32.5 ng/µl 4.601 1.46
3.15 1.72 DNA 50
71
m 43-A vm INIFAP
08/06/2015 01:13:22 p. m. 446.9 ng/µl 28.939 10.553
2.74
2.08 2.77 DNA 50
72
m 43-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:13:48 p. m. 505.5 ng/µl 28.911 20.315
1.42 1.55 DNA 50
73
m 44-A vm INIFAP
08/06/2015 01:14:31 p. m. 89.7 ng/µl 46.794 21.125
2.22
1.73 1.59 DNA 50
74
m 44-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:14:57 p. m. 88.9 ng/µl 38.778 31.129
1.25 1.52 DNA 50
75
m 45-A vm INIFAP
08/06/2015 01:15:40 p. m. 298.8 ng/µl 5.976 3.214 1.86
1.88 1.71 DNA 50
76
m 45-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:16:02 p. m. 287.8 ng/µl 5.757 3.028 1.9 1.84 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 66
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
77 m46 vm INIFAP
17/04/2015 09:48:28 a. m. 1301.6 ng/µl 26.032 14.951 1.74 1.74 1.62 DNA 50
78 m47 vm INIFAP
17/04/2015 09:49:04 a. m. 412 ng/µl 8.24 4.625 1.78 1.78 1.91 DNA 50
79
m 48-A vm INIFAP
08/06/2015 01:16:40 p. m. 318.3 ng/µl 63.365 39.091
1.62
1.83 2.01 DNA 50
80
m 48-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:17:02 p. m. 2700.1 ng/µl 62.002 30.268
2.05 2.5 DNA 50
81
m 49-A vm INIFA
10/06/2015 01:46:20 p. m. 205.5 ng/µl 4.111 2.246 1.83
1.735 0.44 DNA 50
82
m 49-A vm D INIFA
10/06/2015 01:46:44 p. m. 167.5 ng/µl 3.35 2.041 1.64 1.64 DNA 50
83 m50 vm INIFAP
17/04/2015 09:50:05 a. m. 678.8 ng/µl 13.576 7.449 1.82 1.82 1.76 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 67
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
84
m 51-A vm INIFAP
08/06/2015 01:17:39 p. m. 221.1 ng/µl 4.422 2.279 1.94
1.9 2.11 DNA 50
85
m 51-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:17:58 p. m. 239.9 ng/µl 4.798 2.581 1.86 1.81 DNA 50
86 m52 vm INIFAP
17/04/2015 09:51:12 a. m. 170.3 ng/µl 3.406 1.624 2.1 2.1 2.32 DNA 50
87 m53 vm INIFAP
17/04/2015 09:51:42 a. m. 134.6 ng/µl 2.693 1.542 1.75 1.75 2.39 DNA 50
88
m 54-A vm INIFAP
08/06/2015 01:18:33 p. m. 284.3 ng/µl 5.686 2.927 1.94
1.93 2.14 DNA 50
89
m 54-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:18:54 p. m. 291.4 ng/µl 5.827 3.039 1.92 2.02 DNA 50
90
m 55-A vm INIFAP
08/06/2015 01:19:22 p. m. 146.4 ng/µl 2.928 1.594 1.84
1.83 2 DNA 50
91
m 55-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:19:44 p. m. 149.4 ng/µl 2.987 1.639 1.82 1.87 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 68
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
89
m 56 vm INIFAP
30/04/2015 02:36:09 p. m. 1461.1 ng/µl 29.223 15.204 1.92
1.925
2.16 DNA 50
90
m 56 vm d INIFAP
30/04/2015 02:36:52 p. m. 1468.2 ng/µl 29.364 15.212 1.93 2.19 DNA 50
84 m57 vm INIFAP
20/04/2015 02:53:15 p. m. 853.9 ng/µl 17.079 9.138 1.87 1.87 1.75 DNA 50
69
m 58 vm INIFAP
30/04/2015 02:37:29 p. m. 305.2 ng/µl 6.104 3.221 1.9
1.895
3.42 DNA 50
70
m 58 vm D INIFAP
30/04/2015 02:37:48 p. m. 308.1 ng/µl 6.162 3.263 1.89 3.29 DNA 50
71
m 59 vm INIFAP
30/04/2015 02:38:21 p. m. 2078.4 ng/µl 41.568 21.853 1.9
1.895
2.09 DNA 50
72
m 59 vm D INIFAP
30/04/2015 02:38:39 p. m. 2067.1 ng/µl 41.342 21.858 1.89 2.04 DNA 50
73 m60 vm INIFAP
20/04/2015 03:04:44 p. m. 1304.1 ng/µl 26.082 14.272 1.83
1.89
1.49 DNA 50
74 m60 vm INIFAP
20/04/2015 03:05:12 p. m. 1186.3 ng/µl 23.726 12.16 1.95 1.58 DNA 50
75 m61 vm INIFAP
20/04/2015 02:48:15 p. m. 1185.5 ng/µl 23.709 11.417 2.08
2.05
2.18 DNA 50
76 m61 vm INIFAP
20/04/2015 02:48:46 p. m. 1043.8 ng/µl 20.875 10.327 2.02 1.97 DNA 50
77 m62 vm INIFAP
20/04/2015 02:58:32 p. m. 321.7 ng/µl 6.435 3.489 1.84
1.865
2.03 DNA 50
78 m62 vm INIFAP
20/04/2015 02:59:00 p. m. 587.6 ng/µl 11.752 6.204 1.89 1.93 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 69
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
79
m63 vm INIFAP
20/04/2015 03:06:19 p. m. 1162 ng/µl 23.24 11.657 1.99
1.99
2.03 DNA 50
80
m63 vm INIFAP
20/04/2015 03:05:50 p. m. 1185.9 ng/µl 23.718 11.947 1.99 2.01 DNA 50
81
m 64 vm INIFAP
30/04/2015 02:39:16 p. m. 977 ng/µl 19.539 10.022 1.95
1.965
2.48 DNA 50
82
m 64 vm D INIFAP
30/04/2015 02:39:37 p. m. 1179.4 ng/µl 23.588 11.936 1.98 2.43 DNA 50
83
m 65 vm INIFAP
30/04/2015 02:40:12 p. m. 1470.4 ng/µl 29.409 15.036 1.96
1.955
2.37 DNA 50
84
m 65 vm D INIFAP
30/04/2015 02:40:29 p. m. 1593.4 ng/µl 31.867 16.34 1.95 2.2 DNA 50
85
m66 vm INIFAP
20/04/2015 02:51:05 p. m. 1784.6 ng/µl 35.692 19.843 1.8
1.8 1.23 DNA 50
86
m67 vm INIFAP
20/04/2015 02:50:27 p. m. 2323.3 ng/µl 46.466 23.629 1.97
1.97 2.01 DNA 50
87
m 68 vm INIFAP
30/04/2015 02:41:17 p. m. 1152.9 ng/µl 23.058 12.358 1.87
1.87
1.98 DNA 50
88
m 68 vm D INIFAP
30/04/2015 02:41:57 p. m. 1010.8 ng/µl 20.215 10.812 1.87 2.25 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 70
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
89 m69 vm INIFAP
20/04/2015 03:07:31 p. m. 863.6 ng/µl 17.271 8.905 1.94
1.94
1.97 DNA 50
90 m69 vm INIFAP
20/04/2015 03:08:04 p. m. 885.7 ng/µl 17.713 9.143 1.94 1.99 DNA 50
91 m70 vm INIFAP
20/04/2015 03:11:37 p. m. 886.9 ng/µl 17.738 8.919 1.99
2.015
2.06 DNA 50
92 m70 vm INIFAP
20/04/2015 03:12:07 p. m. 1065.1 ng/µl 21.303 10.458 2.04 2.19 DNA 50
93 m 71 vm INIFAP
30/04/2015 02:42:26 p. m. 786 ng/µl 15.72 8.538 1.84
1.855
2.56 DNA 50
94
m 71 vm D INIFAP
30/04/2015 02:42:47 p. m. 933.1 ng/µl 18.663 9.967 1.87 2.51 DNA 50
95
m 72-A vm INIFAP
08/06/2015 01:20:19 p. m. 242.3 ng/µl 4.845 2.528 1.92
1.895 2.03 DNA 50
96
m 72-A vm D INIFAP
08/06/2015 01:20:37 p. m. 248.6 ng/µl 4.973 2.658 1.87 1.86 DNA 50
97 m73 vm INIFAP
20/04/2015 03:09:16 p. m. 1584.1 ng/µl 31.683 15.406 2.06
2.06
2.11 DNA 50
98 m73 vm INIFAP
20/04/2015 03:08:52 p. m. 1558.7 ng/µl 31.174 15.118 2.06 2.11 DNA 50
99 m 74 vm INIFAP
30/04/2015 02:44:28 p. m. 1173.2 ng/µl 23.463 13.004 1.8
1.795
1.73 DNA 50
100
m 74 vm D INIFAP
30/04/2015 02:44:50 p. m. 1129.5 ng/µl 22.591 12.623 1.79 1.76 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 71
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
101 m75 vm INIFAP
20/04/2015 03:04:07 p. m. 852.9 ng/µl 17.059 8.667 1.97
1.985
1.8 DNA 50
102 m75 vm INIFAP
20/04/2015 03:03:43 p. m. 985 ng/µl 19.701 9.874 2 1.84 DNA 50
103 m 76 vm INIFAP
30/04/2015 03:04:13 p. m. 1337.2 ng/µl 26.744 13.923 1.92
1.92
2.37 DNA 50
104
m 76 vm D INIFAP
30/04/2015 03:04:37 p. m. 1405.9 ng/µl 28.117 14.612 1.92 2.34 DNA 50
105 m77 vm INIFAP
20/04/2015 02:56:26 p. m. 1604.9 ng/µl 32.098 15.762 2.04
2.04 2.21 DNA 50
106 m 78 vm INIFAP
30/04/2015 03:05:09 p. m. 776.1 ng/µl 15.522 8.011 1.94
1.945
2.65 DNA 50
107
m 78 vm D INIFAP
30/04/2015 03:05:26 p. m. 794.6 ng/µl 15.892 8.146 1.95 2.55 DNA 50
108 m79 vm INIFAP
20/04/2015 02:57:08 p. m. 1405.9 ng/µl 28.118 14.154 1.99
2.02
1.57 DNA 50
109 m79 vm INIFAP
20/04/2015 02:57:46 p. m. 1357.4 ng/µl 27.148 13.275 2.05 2.15 DNA 50
110 m80 vm INIFAP
20/04/2015 03:10:45 p. m. 704 ng/µl 14.081 7.128 1.98
1.965
2.02 DNA 50
111 m80 vm INIFAP
20/04/2015 03:11:08 p. m. 705 ng/µl 14.099 7.214 1.95 2.03 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 72
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
112 m81 vm INIFAP
20/04/2015 03:09:52 p. m. 870.4 ng/µl 17.408 8.838 1.97
1.965
1.87 DNA 50
113 m81 vm INIFAP
20/04/2015 03:10:18 p. m. 869.4 ng/µl 17.389 8.864 1.96 1.85 DNA 50
114 m82 vm INIFAP
20/04/2015 03:01:55 p. m. 1290.1 ng/µl 25.802 12.593 2.05
2.06
1.96 DNA 50
115 m82 vm INIFAP
20/04/2015 03:01:02 p. m. 1174.1 ng/µl 23.481 11.369 2.07 2.04 DNA 50
116
m 83 vm INIFAP
30/04/2015 03:05:58 p. m. 848.1 ng/µl 16.962 9.102 1.86
1.865
2.39 DNA 50
117
m 83 vm D INIFAP
30/04/2015 03:06:16 p. m. 871.4 ng/µl 17.429 9.338 1.87 2.26 DNA 50
118
m 84 vm INIFAP
30/04/2015 03:06:48 p. m. 625.2 ng/µl 12.505 6.401 1.95
1.955
2.54 DNA 50
119
m 84 vm D INIFAP
30/04/2015 03:07:07 p. m. 625.6 ng/µl 12.512 6.397 1.96 2.56 DNA 50
120
m 85 vm INIFAP
30/04/2015 03:07:36 p. m. 812.7 ng/µl 16.255 8.837 1.84
1.83
2.42 DNA 50
121
m 85 vm D INIFAP
30/04/2015 03:07:56 p. m. 824.8 ng/µl 16.496 9.048 1.82 2.27 DNA 50
122
m 86 vm INIFAP
30/04/2015 03:08:28 p. m. 8114.8 ng/µl 162.296 84.482 1.92
1.945
2.19 DNA 50
123
m 86 vm D INIFAP
30/04/2015 03:08:46 p. m. 3774.3 ng/µl 75.486 38.236 1.97 2.28 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 73
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
124
m 87 vm INIFAP
30/04/2015 03:09:15 p. m. 634.1 ng/µl 12.681 6.714 1.89
1.85
2.29 DNA 50
125
m 87 vm D INIFAP
30/04/2015 03:09:30 p. m. 851 ng/µl 17.021 9.404 1.81 1.8 DNA 50
126 m88 vm INIFAP
20/04/2015 03:02:36 p. m. 2447.3 ng/µl 48.946 24.013 2.04
2.05
2.03 DNA 50
127 m88 vm INIFAP
20/04/2015 03:03:05 p. m. 1610.9 ng/µl 32.217 15.658 2.06 2.13 DNA 50
128
m 89 vm INIFAP
30/04/2015 03:09:58 p. m. 671.6 ng/µl 13.432 6.993 1.92
1.91
2.71 DNA 50
129
m 89 vm D INIFAP
30/04/2015 03:10:39 p. m. 694 ng/µl 13.881 7.306 1.9 2.6 DNA 50
130
m 90 vm INIFAP
30/04/2015 03:11:14 p. m. 1397 ng/µl 27.94 14.134 1.98
1.975
2.42 DNA 50
131
m 90 vm D INIFAP
30/04/2015 03:11:36 p. m. 1300.7 ng/µl 26.013 13.205 1.97 2.46 DNA 50
132
m 91 vm INIFAP
30/04/2015 03:12:03 p. m. 684.1 ng/µl 13.683 7.247 1.89
1.9
2.58 DNA 50
133
m 91 vm D INIFAP
30/04/2015 03:12:20 p. m. 696.7 ng/µl 13.934 7.301 1.91 2.55 DNA 50
134
m 92 vm INIFAP
30/04/2015 03:12:49 p. m. 1502.9 ng/µl 30.059 14.953 2.01
2.005
2.5 DNA 50
135
m 92 vm D INIFAP
30/04/2015 03:13:15 p. m. 1526.1 ng/µl 30.523 15.299 2 2.47 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 74
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type Factor
136 m93 vm INIFAP
20/04/2015 02:55:35 p. m. 2958.1 ng/µl 59.163 29.571 2
2.015
2.25 DNA 50
137 m93 vm INIFAP
20/04/2015 02:54:59 p. m. 1340.1 ng/µl 26.803 13.177 2.03 2.09 DNA 50
138
m 94 vm INIFAP
30/04/2015 03:13:56 p. m. 641.1 ng/µl 12.821 6.915 1.85
1.87
2 DNA 50
139
m 94 vM D INIFAP
30/04/2015 03:14:15 p. m. 588.7 ng/µl 11.774 6.225 1.89 2.32 DNA 50
140
m 95 vm INIFAP
30/04/2015 03:14:55 p. m. 667.4 ng/µl 13.349 7.02 1.9
1.915
2.57 DNA 50
141
m 95 vm d INIFAP
30/04/2015 03:15:14 p. m. 669.7 ng/µl 13.394 6.958 1.93 2.56 DNA 50
142 m96 vm INIFAP
20/04/2015 02:59:41 p. m. 1138.1 ng/µl 22.762 11.095 2.05
2.045
2.09 DNA 50
143 m96 vm INIFAP
20/04/2015 03:00:16 p. m. 1183.1 ng/µl 23.661 11.603 2.04 2.02 DNA 50
144 m97 vm INIFAP
20/04/2015 02:52:24 p. m. 998.8 ng/µl 19.975 9.853 2.03 2.03 1.97 DNA 50
145 m98 vm INIFAP
28/04/2015 12:00:41 p. m. 815.3 ng/µl 16.307 8.668 1.88
1.88
2.13 DNA 50
146
m98 vm D INIFAP
28/04/2015 12:03:03 p. m. 813.6 ng/µl 16.273 8.661 1.88 2.36 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 75
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
147 m99 vm INIFAP
28/04/2015 12:04:53 p. m. 362.6 ng/µl 7.252 3.82 1.9
1.92
3.22 DNA 50
148
m99 vm D INIFAP
28/04/2015 12:05:16 p. m. 316.5 ng/µl 6.33 3.263 1.94 4.49 DNA 50
149
m100 vm INIFAP
28/04/2015 12:06:21 p. m. 760.9 ng/µl 15.218 8.25 1.84
1.835
2.16 DNA 50
150
m100 vm D INIFAP
28/04/2015 12:08:53 p. m. 843.9 ng/µl 16.878 9.203 1.83 1.9 DNA 50
151
m101 vM INIFAP
28/04/2015 12:09:50 p. m. 1436.4 ng/µl 28.728 14.901 1.93
1.935
2.17 DNA 50
152
m101 vM D INIFAP
28/04/2015 12:10:15 p. m. 1336.7 ng/µl 26.734 13.763 1.94 2.37 DNA 50
153
m102 vm INIFAP
28/04/2015 12:21:59 p. m. 924.2 ng/µl 18.484 9.438 1.96
1.955
2.48 DNA 50
154
m102 vm D INIFAP
28/04/2015 12:22:23 p. m. 863.1 ng/µl 17.262 8.846 1.95 2.44 DNA 50
155 m103 m INIFAP
28/04/2015 12:23:00 p. m. 848.7 ng/µl 16.973 8.695 1.95
1.955
2.39 DNA 50
156
m103 m D INIFAP
28/04/2015 12:23:25 p. m. 840.8 ng/µl 16.816 8.581 1.96 2.37 DNA 50
157 m104 m INIFAP
28/04/2015 12:24:03 p. m. 594 ng/µl 11.881 6.04 1.97
1.97
3.21 DNA 50
158
m104 m D INIFAP
28/04/2015 12:24:22 p. m. 542.4 ng/µl 10.849 5.511 1.97 2.89 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 76
# Sample ID
User name
Date and Time Nucleic Acid
Unit A260 (Abs)
A280 (Abs)
260/280 Abs. Promedio
260/230 Sample Type
Factor
159 m105 m INIFAP
28/04/2015 12:24:57 p. m. 537.4 ng/µl 10.749 5.654 1.9
1.9
2.47 DNA 50
160
m105 m D INIFAP
28/04/2015 12:25:17 p. m. 554.5 ng/µl 11.091 5.851 1.9 2.37 DNA 50
161 m106 m INIFAP
28/04/2015 12:26:26 p. m. 619.1 ng/µl 12.381 6.236 1.99
1.99
2.78 DNA 50
162
m106 m D INIFAP
28/04/2015 12:26:53 p. m. 677.5 ng/µl 13.55 6.813 1.99 2.56 DNA 50
163 m107 m INIFAP
28/04/2015 12:27:32 p. m. 604.1 ng/µl 12.083 6.343 1.9
1.91
2.11 DNA 50
164
m107 m D INIFAP
28/04/2015 12:27:51 p. m. 593.3 ng/µl 11.867 6.193 1.92 2.16 DNA 50
165
m108 m D INIFAP
28/04/2015 12:28:44 p. m. 1295 ng/µl 25.9 13.486 1.92
1.915
1.87 DNA 50
166 m108 m INIFAP
28/04/2015 12:28:22 p. m. 1306.1 ng/µl 26.121 13.676 1.91 1.87 DNA 50
167 m109 m INIFAP
28/04/2015 12:29:18 p. m. 625.9 ng/µl 12.519 6.419 1.95
1.94
1.93 DNA 50
168
m109 m D INIFAP
28/04/2015 12:29:39 p. m. 636.7 ng/µl 12.735 6.61 1.93 1.81 DNA 50
169
m110 vm INIFAP
28/04/2015 12:31:04 p. m. 324.7 ng/µl 6.493 3.709 1.75
1.745
1.33 DNA 50
170
m110 vm D INIFAP
28/04/2015 12:31:33 p. m. 323.1 ng/µl 6.463 3.713 1.74 1.33 DNA 50
HLB en cítricos de México Página 77
RECOMENDACIONES
Que el encargado del laboratorio se encuentre presente en el área de laboratorio, para resolver
cualquier duda que se presente durante la práctica, ya que el área de oficina y el laboratorio se
encuentran separadas.
Mejorar instalaciones de laboratorio.
Incluir señalamientos de seguridad en cada equipo presente en el laboratorio.
Tener a la mano hojas de seguridad de los reactivos con los cuales se trabaja, y mantenerlos
ordenados en el lugar que le corresponde.
Disponer de un área con más ventilación, en la cual se instalen las autoclaves.
Retirar el material utilizado para la lectura de geles de agarosa con bromuro de etidio, ya que a pesar
de que ya no se utiliza, el área donde se encuentra dicho material, esta compartido con el
termociclador y el nanodrop. Limpiar dicha área.
Uso obligatorio de cubre bocas, guantes y cofias, al hacer extracciones de ADN u otras actividades
dentro del laboratorio.
Evitar visitas dentro del área de trabajo, ya que se contamina el área con tierra de los campos de
trabajo.
Disponer de una bitácora, para el uso de equipos.
Desechar muestras viejas para evitar acumulamiento en el área de refrigeración.
Disponer de un área exclusiva para realizar extracciones.
