Integración de DNA en microorganismos:

herramientas genéticas II

Uso de sistemas de recombinación sitio-específica

• Preparación de GMOs• Integración en el

cromosoma• Expresión de genes

tóxicos

Ab

Ab

Liberación de GMOs: el problema de las resistencias

AbResolvasa

Ab

GMOs sin resistencias

Integrasa

Ab

Ab

Ab

Integrando en el cromosoma de un modo específico

++

+

+

-

Camino de ida pero no de vuelta

Invertasa

Expresión de genes tóxicos: una solución...

Resolvasa

Txt STOP

...y otra

Integración de DNA exogeno en el genoma bacteriano

• Recombinación homóloga• Recombinación sitio-específica• Recombinación ilegítima

– Transposición

Integración ilegitima: transposición

• Transposones: via intermediario de ADN– Secuencias de inserción

• Tipo I: IS50• Tipo II: IS3

– Transposones• TipoI (IS tipoI, Tn5)• TipoII (IS tipo II, Tn3)• TipoIII (fago Mu)

• Retrotransposones: via intermediario de ARN

tnpAIR IR

Clase I

tnpA tnpRresIR IR

Clase II

Secuencias de inserción

tnpA

OE

IE

IS50

5’CTGACTCTTATACACAAGT3’

DnaA

5’CTGTCTCTTGATCAGATCT3’

TnpInh

5’3’ 5’

3’

H-O-H

5’3’ 5’

3’OH

5’3’ 5’

3’

IS50: cortar y pegar

H-O-H

5’3’

5’3’ 5’

3’

5’3’

OH

5’3’

OH

IS50: cortar y pegar

• Dimerización• Papel de Inh• Acción en cis• Acoplamiento con replicación

IS50: mucho es malo

DNA binding dimerization

476 aa

Papel de la dimerización

476 aa

dimerization

421 aa

Inh y la dimerización

Acción en cis

tnpAIR IRen cis

tnpAIR IR

en trans

tnpAIR IR

tnpAIR IR

Acoplamiento con replicación

tnpA

OE

IE

OE tiene un sitio dnaA (OE y OI son suboptimos)

5’CTGACTCTTATACACAAGT3’

DnaA

P2 se activa por metilación dam

GATCCTAG

GATCCTAG

GATCCTAG

GATCCTAG

GATCCTAG

Tn5

OE

IE

OE

IEIS50L IS50R

kan bleo str

Mutación stop

Sitios dnaA