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INTERPRETANDO PERFILES DE ADN

Sinthia Pagano Siepierski PhD

ISHI 25 - GCLAITH Special Workshop

Phoenix, AZ

September 28, 2014

Figure 2: Mark A et al (2004) Nature Reviews Genetics 5, 739-751

¿Qué esperamos?

Objetivos de este taller

• Explicar los picos falsos, pull up, picos stutter, microvariantes, degradación, efectos estocásticos, pérdida alélica, mutaciones y dar posibles soluciones.

• Establecer los distintos umbrales y parámetros del instrumento.

• Influencia de factores externos a los resultados.

• Comprender como afectan los puntos anteriores en la interpretación de una mezcla.

• Requerimientos para una correcta interpretación de perfiles STR.

Validación

• Sensibilidad

• Reproducibilidad

• Precisión

• Heterocigosidad

• Valoración de mezclas

Ilustración esquemética de la separación y detección de los alelos STRs en un Analizador Genético ABI Prism 310, 3100 u otro instrumento

multicapilar.

Figure 9.3, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press

cátodo

capilar

ADN

Figure 6.3, J.M. Butler (2011) Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology © 2011 Elsevier Academic Press

Laser

Ventana de detección

Laser

ADN

Capilar Fluorocromo

Life(2012) DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis

Figure 13.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Calibración espectral ABI 310 Antes de la calibración espectral:

Después de la calibración espectral:

En ABI 3500

Picos falsos (artefactos)

• Ruido de fondo

• Spikes

• Burbujas

Ruido

• Picos a lo largo de la línea de base no reproducibles

• Consecuencia de: • Fluctuaciones de

corriente • Burbujas de aire • Cristales de urea • Contaminación en la

muestra

Spikes • Generalmente aparecen en todos

los colores y son más afilados que los picos corrientes

• Son consecuencia de la aplicación de altos voltajes en la electroforesis

• Resultan de la utilización de agua de baja calidad para la preparación del buffer y muestras. El problema desaparece cuando se utiliza agua de calidad HPLC

Burbujas dye blob

Ocurren por problemas de disociación del fluorocromo del primer.

• Se forman por un solapamiento en el espectro de emisión de los fluorocromos que se utilizan en el marcaje sobre todo si la muestra está sobreamplificada

• Altura menor que un alelo real y coinciden con los pares de bases de éste

• Se producen principalmente entre los fluorocromos que están más cercanos en el espectro de emisión

• Si el problema persiste hacer nueva matriz

Picos Pull-up


• Formación de stutters • Adición de nucleótidos • Microvariantes • Degradación • Inhibidores • Efectos estocásticos • Alelos nulos • Mutaciones • Patrones trialélicos

Bioquímica de los STRs

Bandas stutters


Picos que aparecen primordialmente una repetición menos que el alelo verdadero como resultado de ‘deslizamiento' de la cadena durante la síntesis de ADN

Formación de stutters

n - 4 producto

stutter

n + 4 producto

stutter

Deleción causada por deslizamiento en la cadena copia inferior

Inserción causada por deslizamiento en la cadena copia superior

• Son más pronunciados cuanto menor es la unidad de repetición Di>Tri>Tetra>Pentanucleótidos

• Menores a un 10% del pico alélico al que están asociadas

• Regiones de repeticiones largas generan más 'stutter'

• Cada producto de 'stutter' consecutivo es menos intenso

(alelo > repetición-1 > repetición-2)

• Picos de 'stutter' hacen más difíciles el análisis de las mezclas

Formación de stutters

• Taq polimerasa suele añadir una A al extremo 3’ (adenilación).

• Para favorecer la adición se añade una etapa final de extensión (15 a 45 min a 60 ó 72ºC)

• Artefacto dependiente de secuencia y en especial de cantidad de ADN molde

• Especial atención en aquellos loci que tengan microvariantes como TH01 (9.3 y 10)

Bandas N y N + 1

Concentraciones altas de ADN llevan a la adenilación incompleta

Deletion of T

Microvariantes alélicas

• Definidos como alelos que no son múltiplos exactos de la repetición básica o variantes de secuencia de la repetición o ambos

• Alelos con unidades de repetición parciales designadas por el número de repeticiones completas y luego un punto decimal seguido del número de bases en la repetición parcial (Bar et al. Int. J. Legal Med. 1994, 107:159-160)

• Ejemplo: Alelo TH01 9.3: [TCAT]4 -CAT [TCAT]5

Alelos off-ladder (OL)

Variantes alélicas http://www.cstl.nist.gov/strbase/var_tab.htm

Reporte de OL

Los alelos que son de menor tamaño que el alelo más bajo del ladder son reportados como “menor que X”

Los alelos que son de mayoar tamaño que el alelo más alto del ladder son reportados como “mayor que X”

Degradación

Pérdida de alelos de mayor tamaño

Muestra de referencia

Muestra de la evidencia

Muestras no degradadas también pueden dar electroferogramas con pendientes negativas

¿Cuán negativa tiene que ser una pendiente para indicar degradación?

– Experiencia, entrenamiento y práctica

Los controles positivos no

deben estar degradados

Inhibidores de la PCR

• Telas

• Colorantes

• Hemoglobina

• Ácido húmico

• melanina

• ……… Efecto de inhibición del ácido húmico

Inhibidores de la PCR

El inhibidor se une al primer El inhibidor se une a la Taq El inhibidor se une al ADN

Inhibidores

• Los más preocupantes son lo que se coextraen con el ADN

• El mecanismo puede variar de acuerdo al tipo de inhibidor y a la secuencia del amplicón

• Efecto menos predictivo que la degradación

• Producen: – Desbalance de alelos

– Perdida alélica

– Pérdica del locus

– Baja sensibilidad

An Investigation of the Effect of DNA Degradation and Inhibition on PCR Amplification of Single Source and

Mixed Forensic Samples Bruce McCord ; Kerry Opel ; Maribel Funes ; Silvia Zoppis ; Lee Meadows Jantz

Https://www.ncjrs.gov/App/Publications/abstract.aspx?ID=258707

https://www.ncjrs.gov/App/Publications/abstract.aspx?ID=258707



?

Efectos estocásticos

Efectos estocásticos Muestra de referencia

Muestra de la evidencia

Allelic Dropout

• Alturas de pico en evidencia muy bajas

– Mayoría por debajo de 150 rfu

• Alturas de pico en referencia mucho más altas

– Todas encima de 800 rfu

• Locus D13S317:

– Muestra de referencia: 8, 14

– evidencia: 8, 8

• Alelo 14: se perdió o no estaba?

1500

evidencia 150

Muestra de referencia

?

Desbalance alélico

En un individuo heterocigoto los alelos tienden a ser amplificados aproximadamente en iguales proporciones

¿individuo heterocigoto o mezcla?

Por falta de ADN

Por mutaciones en la zona de anillamiento de los primers

Alelos nulos • El alelo está presente en muestra de ADN pero no es

amplificado debido a un cambio nucleotídico en el lugar de enlace del primer

• Decaimiento alélico: puede llevar a confusiones porque las muestras heterocigotas aparecen como falsos homocigotos

• Dos grupos de primers de PCR pueden producir diferentes resultados en muestras que se originan de la misma fuente, fenómeno que debe tenerse en cuenta al utilizar bases de datos de ADN

• Se recomienda realizar estudios de concordancia antes del uso de nuevos kits de STR

Mutaciones en la zona de unión de los primers

No mutación

Mutaciones en el centro del lugar de enlace del primer

Mutaciones en el extremo 3’ del lugar de enlace del primer

ALELO NULO

Box 10.3, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press

• Baja incidencia: 0,01 a 0,001% por locus

• Muy improbable que un mismo individuo presente este fenómeno en dos loci distintos

• Si no hay mutación somática: los diferentes fluidos de un mismo individuo se comportarán igual

Mutaciones en la zona de unión de los primers

Importancia de los alelos nulos

12

12

14

Pplex 16

Identifiler

BASE DE DATOS DE

ADN


Impacto de la concentración de ADN en la amplificación de los STRs

Demasiado ADN: • Picos fuera de escala • Picos divididos (+/-A) • Desbalance entre locus

Muy poco ADN: • Desbalance de

heterocigotos • Pérdida alélica • Desbalance entre locus

Rango donde mejor trabajan kits STRs

• 0,5 a 2,0 ng

Importancia de cuantificar ADN humano

• La amplificación de multiplex STR es más eficiente en un rango estrecho de concentración (0,5 a 2,0 ng)

• Todo el ADN es extraído al tratar una muestra biológica,

• por lo tanto el ADN no humano (bacteriano, fúngico, animales y plantas) es extraído conjuntamente con el ADN humano de interés

Métodos disponibles • UV 280/254: baja sensibilidad y no es específico para

ADN humano • Semicuantificación en gel: no es específico para ADN

humano, poco sensible, se aprecia más la calidad que la cantidad del ADN

• Fluorescencia: no es específico para ADN humano, es sensible pero no provee información de la calidad del ADN

• Slot blot: específico para ADN humano, subjetivo, lleva mucho tiempo de trabajo manual

• Aluquant: poco sensible • RtPCR: específico para ADN humano, muy sensible, buen

rango dinámico

Grupo óptico Real time instrumento

Real time: concepto general

Activador de

Emisión de luz

Bloque térmico

Detector de emisión de luz

Reacción de PCR

Plot fluorescencia vs ciclos de PCR

Que se ve …

Fase Geometrica E=1

Eficiencia de amplificación del 100%

Cinética de amplificación= 2n

P= T*(1 + E )n

Fase Geométrica

Fase Geometrica E=1

Fase Lineal

Plateau

Cinética de Amplificación

Fase Geometrica E=1

P= T*(1 + E )n

Pn= Ti*2n Pn= Ti*2n

Fase Geometrica E=1

P = cantidad de producto generado a n ciclos T = cantidad de templado inicial E = eficiencia de la amplificación

¿Por qué qPCR por real time?

• Reducción de la contaminación: no hay manipulación post PCR

• Alta sensibilidad

• Amplio rango dinámico (aprox 30pg a 100ng)

• Ensayos específicos

• Posibilidad de multiplex

Log n° cópias

CT

CT

0 1 2 3 4 5 6 7

CT es directamente proporcional al log de cantidad inicial de DNA / RNA

Curva Standard de cuantificación absoluta

Sistemas de detección

Incremento en la fluorescencia por SYBR green

● Versátil

● Bajo costo

● Alta sensibilidad

● Ideal para ensayos de discriminación (screening)

● Desventaja: Fluorescencia inespecífica, ajustar muy bien el sistema de amplificación, evitar fragmentos inespecíficos y dímeros de primer.

Características de SYBR Green

Quencher R

Sondas TaqMan

• Detección de productos de manera específica

• Detección simultánea de múltiples productos de amplificación (Multiplex)

• Diseño de sondas para cada sistema de análisis en particular

• Mayor número de aplicaciones, análisis de punto final

Características del sistema TaqMan

Beacons moleculares

Características de los beacons moleculares

• Aumento de la especificidad

• Capacidad de multiplex

• El diseño puede ser engorroso

• La sonda debe ser desnaturalizada del templado por debajo de 72º para que la Taq no la digiera durante la extensión

T annealing < Tm < T extensión

Cebadores Scorpions

Plexor

Bajo número de copias (LCN)

• Cuando se trabaja con menos de 100pg de ADN genómico

• Cuando se trabaja por debajo del umbral estocástico donde el producto de PCR no es seguro ( 150-250 pg)

• Cuando hay que mejorar la sensibilidad de detección (34 ciclos en vez de 28 ciclos)

• Cuando hay muy pocas copias de ADN para asegurar una amplificación confiable

Otros términos para LCN

• Bajo nivel de ADN

• Trazas de ADN

• ADN de contacto

Estrategias para aumentar la sensibilidad

1. Aumentar el número de ciclos de PCR

Aumento del número de ciclos de PCR


Estrategias para aumentar la sensibilidad

1. Aumentar el número de ciclos de PCR

2. Purificación post PCR

3. Aumentar inyección capilar

4. Reducir el volumen de PCR

5. Nested PCR

6. Mejoramiento de los reactivos de PCR

Utilización de amplicones reducidos:

mini STRs

Primer convencional

Primer convencional

Mini primer

Mini primer

Mutaciones

16, 21 18, 20

16, 18

Mutación paterna

16, 21 18, 20

17, 18

Transmisión normal de alelos

http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/mutation.htm

Mutaciones

• Frecuencia de 1 en aproximadamente 1000 meiosis

• Mayor frecuencia de mutaciones paternas que maternas

• Frecuencias más altas de mutación: vWA, FGA, D18S51

• Frecuencias más bajas de mutación: TH01, TPOX, D16S539

Buffers y componentes de la muestra

¿Qué afecta la separación de los alelos?

• Recubrimiento del capilar

• Temperatura de corrida

• Formamida

• Buffer de electroforesis

• Polímero

Flujo electroforético y flujo electroosmótico


Movilidad

• Es el tiempo que le lleva al fragmento de ADN moverse del punto de inyección al punto de detección.

Factores a tener en cuenta en la preparación de la muestra

• Utilizar formamida de buena calidad para no afectar la conductividad

• Desnaturalización • Artefactos de la síntesis de los primers “dye blobs” • Prevenir el exceso de sales en la muestra debido a

la evaporación • Contaminación con iones metálicos • Purificación post PCR para reducir las sales

• Hidrólisis produce formiato de amonio • El aire ioniza el formiato produciendo hidróxido de

amonio y ácido fórmico • Impurezas como el ácido fórmico (iones negativos más

pequeños), amonio, y otras impurezas: • Compiten con los fragmentos de ADN reduciendo la cantidad

de ADN inyectada • Baja la señal y aumenta el ruido • Degrada y descompone los fragmentos de ADN reduciendo

resolución y selectividad

La descomposición de la formamida altera la conductividad de la misma

Porque utilizar formamida y no agua

• El ADN se puede descomponer en el agua • La formamida es más efectiva cuando se trabaja

con fragmentos grandes y altas concentraciones de ADN

• La formamida se evapora menos que el agua • La formamida a diferencia del agua mantiene el

ADN desnaturalizado

Muestra preparada con formamida de mala calidad

Misma muestra preparada con formamida de buena calidad

Efecto “Golden Gate”

Reannealing: produce picos fantasmas

• Son consecuencia de la desnaturalización incompleta o de la rehibridación

• El ADN de doble cadena migra más rápido que el ADN de cadena simple por lo que el pico extra aparece delante del pico principal

• Comúnmente se visualizan en el estándar de tamaño pero pueden aparecer en otros colores

La variación de la temperatura de corrida puede producir la rehibridización

Desnaturalización incompleta del estándar

Procesamientos post PCR

• La purificación post PCR reduce los niveles salinos permitiendo que más ADN sea inyectado al capilar

• Reprocesar una muestra luego de la PCR para concentrarla puede mejorar la señal

• También se remueven las burbujas dye blobs

• Disponibilidad en el mercado de distintos kits con columnas purificadoras

Factores externos

• Temperatura ambiente

– Pueden causar variaciones en la movilidad (excepto ABI3500)

– Ambientes muy húmedos: la temperatura afecta la conductividad eléctrica

• Limpieza

– Polvo

– La cristalización de la urea en el bloque puede causar obstrucciones, spikes, etc.

– La cristalización del polímero también puede causar obstrucciones

Efecto de la temperatura

• Afecta la viscosidad del polímero y la separación de los fragmentos de ADN causando OL

• Puede afectar la conformación de estructuras secundarias en el ADN

• Se recomienda que la T no fluctúe en + 2ºC

Limpieza

• La urea sublima generando compuestos iónicos que forman un camino a tierra

• De la misma manera si queda buffer o humedad bajo los viales forman un camino a tierra

• La ventana del capilar debe estar limpia para no afectar la lectura

• Los viales deben estar limpios porque podrían transferir ADN al capilar

Factores instrumentales

• Sistema óptico

• Sistema capilar

• Derrames de la jeringa

Sistema óptico

• La sensibilidad varía con el uso, con el diámetro del capilar, la limpieza del capilar y con la calibración del instrumento

• Monitorear la intensidad del laser ya que pierde intensidad con el tiempo

• Observar la relación señal ruido

Ventana de detección

• Verificar limpieza de ventana

• Verificar alineación del capilar con la ventana

Fluídos

• Efectos de burbujas, polvo, cristales de urea, derrames en la jeringa y en las férulas

• Cambios de viscosidad

• Agua en el bloque

• Burbujas

• temperatura

• Obstrucciones en el capilar

• Remover las burbujas de los canales

Esta imagen es cortesía de John Butler http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf

http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/Albany_Troubleshooting.pdf


Cristales de urea

• Se forman al sublimarse la urea cuando hay derrames en las válvulas del bloque

Matrices • Cambios en el buffer, sistema óptico, fluorocromos,

pueden afectar las calibraciones del software

• Una matriz de baja calidad puede dar una línea de base elevada asignándose demasiados picos

Problemas con el capilar

• Materiales en la superficie capilar pueden producir flujo osmótico, ensanchamiento de las bandas de ADN e inconsistencias en la resolución

Decaimiento alélicos causados por:

• Formamida de mala calidad • Conductividad causada por degradación de la urea • Agua en el polímero • Derrames de la jeringa • Excesos de sales que provocan renaturalización • Presencia de iones (detergentes o metales) • Capilar dañado • Daños en la ventana del capilar

Si la baja resolución es permanente entonces:

• Problemas de adsorción en el capilar

• Iniciación de flujo electroosmótico

• Mala composición del buffer causa cambios en la conductividad

• Cambios de concentración en el polímero causan cambios en la viscosidad

¿Qué se requiere para la correcta tipificación de los STRs?

Electrophoresis 2004, 25, 1397–1412. STR typing with ABI 310 and 3100

• Alta resolución espectral para distinguir los diferentes productos de PCR y que la detección de las microvariantes sea confiable

• Asignación de tamaño correcta en el rango de pares de bases estudiada

• Alta precisión entre corridas para permitir la comparación de perfiles

Recolección de datos

Revisión de datos

Separación de colores

Asignación genotípica

Medida de los picos

Confirmación de resultados

Comparación con escalera alélica

Identificar los picos

Matriz

Estándar interno

Muestra de escalera alélica

GeneScan

Genotyper

EXPERIENCIA

GeneMapper

¿Qué nos cuestionamos más frecuentemente en la

interpretación de los datos?

• ¿Es un pico o ruido?

• ¿Es un alelo o un artefacto?

• ¿Homocigoto verdadero o heterocigoto con pérdida alélica?

• ¿Mezcla?

• ¿Es un perfil interpretable?

150-200 RFU

30-50 RFU

Umbral estocástico

Umbral analítico

Figure 10.2, J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing, © 2009 Elsevier Academic Press

Debajo de este valor los picos observados no pueden distinguirse fehacientemente del ruido del instrumento

Por encima de este valor es razonable asumir que no ha habido pérdida alélica de un alelo hermano heterocigoto

¿Se puede utilizar este locus para la interpretación de resultados?

¿Cómo determinar estos umbrales?

Línea de base en un blanco

• Primero determinar el umbral analítico (límite de detección) para el laboratorio y para cada instrumento utilizando la intensidad de señal (depende del instrumento)

• Generalmente 3 veces la desviación estándar del ruido o 2x Np-p

Otros métodos

¿Es necesario especificar umbrales para cada fluorocromo?

Límite de cuantificación

• 10 veces la desviación estándar del ruido

• Se estima utilizando 7xNp-p (150-200 RFU)

• Por debajo de este valor las estimaciones de área o altura no son confiables

Umbral estocástico

• Depende de la sensibilidad biológica

• Por encima de este valor se puede asumir que en este locus no ha habido pérdida alélica de un heterocigoto; un solo alelo en este locus puede considerarse homocigoto

• Es la intensidad de señal por debajo de la cual una cantidad particular de ADN no puede detectarse con certeza

• El umbral estocástico debe ser superior que el límite de cuantificación

Determinación del umbral estocástico

SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by Forensic DNA Testing Laboratories

• Se establece en base a datos empíricos derivados del laboratorio y es específico para los sistemas de cuantificación, amplificación (kits) y detección empleados.

• Se evalúa las relaciones de alturas de picos en múltiples loci en una serie de diluciones

• El umbral estocástico es el valor de RFU por encima del cual es razonable suponer que, en un locus dado, no se ha producido la pérdida alélica de un alelo hermano

El umbral estocástico también puede ser definido como la concentración en la cual un conjunto de relaciones de alturas cae por debajo del 60%

Relación de alturas: por encima de este valor, dos alelos heterocigotos pueden agruparse como posible genotipo

¿Qué sucede con los datos que están por debajo del límite estocástico?

• Artefactos de la PCR y stutters adquieren importancia

• Aumenta el número de spikes

• Pueden aparecer picos –A

• Las burbujas de fluorocromos son más significativas

• Pueden aparecer picos de un segundo contribuyente

Por debajo del umbral estocástico: los artefactos de la PCR, spikes y burbujas adquieren importancia

Figura 9: Thompson et al. Evaluating forensic DNA evidence: Essential elements of a competent defense review

Determinación del PHR (equilibrio de heterocigotos Hb)


• El PHR para un locus determinado se calcula dividiendo la altura del pico del alelo de menor RFU entre la altura del pico del alelo de mayor RFU, multiplicando este valor por 100 para expresarlo como porcentaje

• Pueden aplicarse distintos PHR para loci individuales o un solo PHR para todos los loci

altura pico 1 (RFU) PHR = x 100 altura pico 2 (RFU)

1 2

Un individuo heterocigota para cierto locus teóricamente debería :

• Amplificar igualmente ambos alelos ya que se encuentran en la misma cantidad en el genoma

• Igual inyección capilar

• Relación de alturas de picos similares (100%)

¿Qué puede causar desbalance?

• Poca cantidad de ADN

• Inhibición

• Degradación

• Amplificación preferencial

• Stutter elevado

• MEZCLA DE ADN: hay presentes más de un contribuyente

Límite de linealidad

• Punto de saturación del detector del instrumento por lo que cantidades mayores del analito no producen una respuesta linear de la señal

• La cámara CCD al saturarse produce picos aplanados

Efecto en la matriz de una muestra sobrecargada

Rango dinámico comparativo de equipos ABI

Diferencias entre instrumentos

• Diferencias de sensibilidad entre instrumentos debidas a: – Parámetros de inyección – Iluminación del capilar (un capilar vs multicapilar) – Intensidad del lazer

• Las diferencias de sensibilidad afectan los datos de cualquier sistema

• Estas diferencias deben ser corregidas estableciendo los umbrales correspondientes.

Picos stutter


• En general, el criterio empírico está basado en las características cualitativas y/o cuantitativas de los picos. Por ejemplo, artefactos y spikes se distinguen de los picos alélicos por su morfología y/o reproducibilidad.

• Los stutters deben ser caracterizados por su medida relativa al pico del alelo al que están asociados.

Cálculo del stutter

alelo

Stutter N-4

altura pico N-4 (RFU) Stutter % = x 100 altura pico alelo (RFU)

Umbral stutter

• Aproximadamente 15%

• Por debajo de este valor un pico en posición stutter puede considerarse como tal en muestras de origen único o en determinados tipos de mezclas

Alelos del componente mayoritario

Alelo del componente minoritario

Stutter componente minoritario o ambos

?

Interpretación de potenciales picos stutter en una mezcla

Recomendación 6: si el perfil genético es una mezcla mayor/menor, donde los alelos menores son de la misma medida (altura o área) que los stutters de los alelos mayores, entonces los stutters y los alelos menores son indistinguibles. Bajo estas circunstancias los alelos en posisición stutter que no soportan la hipótesis Hp deben ser incluídos en la interpretación.

Conclusión

• Los picos stutters son problemáticos cuando se trabaja con mezclas con bajas cantidades de ADN

• Los laboratorios deben decidir cuando es apropiado quitar los filtros para stutters en los análisis, principalmente si el componente minoritario tiene una altura similar que los picos stutters

¿Cómo determinamos el número de contribuyentes a la muestra?

Desbalance de los heterocigotos

Más de 2 alelos

Extra bandas: ¿alelos reales o artefactos?

• Artefactos de la amplificación: bandas N + 1

• Artefactos de la detección: «pull-up»

• Artefactos producidos por la amplificación inespecífica de ADN no humano

• Contaminaciones extra/intra-laboratorio

• Fenómenos genéticos: trisomías, duplicaciones, traslocaciones, mutaciones somáticas, etc.

• Traslocaciones, duplicaciones, trisomías, fenómenos de inestabilidad genética (cáncer)

• Fenómeno muy infrecuente que aparece en un solo locus

• Problemático si se da un fenómeno de mosaicismo

Anomalías cromosómicas

http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/var_tab.htm

Patrones trialélicos

Si tenemos un patrón trialélico:

• Amplificar con un kit diferente; re inyectar la misma muestra no cambiará el resultado

• Asociadas a muestras con contaminación bacteriana o animal (toma vaginales, restos óseos, …)

• Tienen una secuencia diferente a los alelos y por ello migran diferente, son picos únicos y normalmente tiene un pico fuera del rango alélico del locus donde se detectan.

Bandas inespecíficas de ADN no humano

Los datos a tener en cuenta al momento de identificar el número de contribuyentes a una mezcla son:

– Número de alelos por locus

– Circunstancias del caso

– Posibilidad de individuos relacionados biológicamente en la mezcla

– Generalmente si son 2, 3 ó 4 alelos por locus, entonces serían 2 contribuyentes

– Si son 5 ó 6, entonces 3 contribuyentes

– Si son > 6 alelos por locus, entonces > 4 contribuyentes

Muy importante para realizar los cálculos estadísticos

¿Puede utilizarse la relación X/Y en la amelogenina como indicador del número

de contribuyentes?

• En casos de agresiones sexuales con mezclas de 2 personas femenino/masculino

• Poca utilidad en mezclas masculino/masculino o mezcla mujer/varios masculinos

• Tener en cuenta que mutaciones en la zona de inserción de primers puede causar deleciones de X o Y

• Si dos templados de ADN son mezclados entonces se espera que la razón/proporción de contribuyentes será preservada en la mezcla en cada locus

• Por lo tanto se puede suponer que el área de los picos en el electroferograma está relacionada con la cantidad inicial de los componentes

Estimar la proporción relativa de los individuos que componen la mezcla

¿Podemos reducir el volumen de las reacciones

de PCR?

Ventajas

• Se reduce el costo

• Aumento en la sensibilidad

• Aumento en la eficiencia

Figura 8: Gaines et al. J Forensic Sci 2002; 47(6):1224-1237. Reduced volume PCR amplification reactions using the AmpFlSTR Profiler Plus kit

Figura 10: Gaines et al. J Forensic Sci 2002; 47(6):1224-1237. Reduced volume PCR amplification reactions using the AmpFlSTR Profiler Plus kit

Desventajas

• Limita el volumen de muestra en la reacción

• Potencial pérdida alélica en muestras con muy poco ADN

• Muestra con inhibidores: menos diluído al reducir volumen de PCR



Burbujas de colorante




Sobreamplificación de un alelo




Ladders mal alineados




Contaminación



Desbalance de picos, artefactos en bajo número de copias




Sobreamplificación





pico debajo de burbuja “dye blob”



Problemas de separación, burbujas en el capilar




Current Spikes


Picos de corriente “spikes”



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