Intolerancias Metabólicas al Ejercicio :

Aproximación diagnóstica

S. BIOQUIMICA CLÍNICA. i+12.

HOSPITAL UNIVERSITARIO 12 DE OCTUBRE. MADRID

U. 723

RUTAS METABÓLICAS Y EJERCICIO

Creatín-fosfato Creatina

ATP ADP +

Pi Ejercicio/ATPasa

ADP

AMP Adenilato quinasa

Mioadenilato

desaminasa

IMP

NH4+

Ciclo de los

nucleótidos

de purina Fumarato

Ciclo de

Krebs

Glucógeno Acidos grasos

ß-Oxidación

Glucogenolisis + Glucolisis aeróbica

Aspartato

Creatín quinasa

Cadena respiratoria

Glucolisis

Ejercicio y sustratos metabólicos • ISOMÉTRICO

• DINÁMICO.

Tipo de Ejercicio Intensidad VO2max Sustrato Comentario

Reposo 0 AGL (70%)

Submáximo

Baja < 50% Glucosa y AGL

Duración:

Glucosa

AGL

Media 50-70% Glucógeno,

Glucosa y AGL

Alta 70-80% Glucógeno

fatiga

Máximo 80-100% Glucosa

Glucolisis

Anaeróbica

• ALTERACIONES DE LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL

• ALTERACIONES DEL METABOLISMO PURÍNICO

– Déficit de mioadenilato desaminasa (AMPD1)

• ALTERACIONES DEL METABOLISMO LIPÍDICO

– Déficit de carnitina-palmitil transferasa II

– Deshidrogenasa de los acidos grasos de cadena muy larga forma adulta (Late-Onset VLCAD)

• ALTERACIONES DEL METABOLISMO GLUCÍDICO

– Déficit de miofosforilasa (Enf. McArdle) (Glucogenosis V)

– Déficit de fosfofructoquinasa (Enf. Tarui) (Glucogenosis VII)

– Otras Glucogenosis musculares (defectos de la glucolisis distal)

INTOLERANCIAS METABÓLICAS AL EJERCICIO

mtDNA

I

II

III

IV

V

C

Q

NÚCLEO

Componentes estructurales

de los complejos de la CRM

Otros factores involucrados

en la biogénesis de la CRM

MITOCONDRIA

Factores de ensamblaje

de la CRM

Estabilidad del mtDNA

CADENA RESPIRATORIA: CONTROL GENÉTICO DUAL ENFERMEDAD MITOCONDRIAL

GEN MITOCONDRIAL

GEN NUCLEAR

Herencia Materna

Multiples orgánulos por célula

Complementación

Heteroplasmia

Umbral

Redistribución aleatoria

Susceptibilidad del órgano final

INTOLERANCIA AL EJERCICIO

EN LAS ENFERMEDADES

MITOCONDRIALES

INTOLERANCIA AL EJERCICIO ES UNA QUEJA FRECUENTE EN PACIENTES CON ENCEFALOMIOPATIA MITOCONDRIAL, AUNQUE ES COMÚN QUE SE HALLE ENSOMBRECIDA POR OTROS FENOTIPOS MAS SEVEROS

•tRNAPhe (A606G)

•Deficiencia de CoQ

INTOLERANCIA AL EJERCICIO Y MITOCONDRIA

(N Engl J Med 1999;341:1037-44.)

INTOLERANCIA AL EJERCICIO

MUTACIONES ADNmt

NADH-UBIQUINONA REDUCTASA (COMPLEJO I)

ND1 inversión intragénica 7 pb

ND4 G11832A

ND2 W114X

UBIQUINOL-CITOCROMO C REDUCTASA (COMPLEJO III)

Cyt b:

G15615A, G15224A, G15762A, G15059A, del 24 pb, G14486A, G15168A, G15170A, G15084A, G15723A, G15761A, C15800T

CITOCROMO C OXIDASA (COMPLEJO IV)

COX I G5920A

COX III del 15-pb

COX II T7879C

tRNAs MITOCONDRIALES

tRNASer (UCN) (G7497A)

tRNASer (CUN) (G12334A)

tRNATyr (A5874G)

SOMÁTICAS CONFINADAS AL MÚSCULO ESQUELÉTICO

ADP ATP

Aspartato + GTP

NH3

GDP + Pi

CICLO DE LOS NUCLEÓTIDOS

DE PURINA

Adenilsuccinato liasa

AMP

Fumarato

ATPasa

Adenilato quinasa

Mioadenilato desaminasa

Adenilsuccinato sintetasa

DEFICIENCIA AMPD1

FUNCIÓN METABÓLICA

Adenilsuccinato

IMP

DÉFICIT DE MIOADENILATO DESAMINASA

• Mialgias, fatiga, dolor muscular y calambres moderados

• Mioglobinuria ocasional

• Asociada otras enferm. neuromusculares (50%)

• Asociada a “doble problema” • Inicio y diagnóstico: infancia, juventud y adultos

• Histoquímica MADA: ausencia de tinción

– Déficit de MADA: 2% biopsias musculares y 2% de controles sanos.

• Laboratorio:

– CK basal: aumento moderado en algunos casos

– PAEI: Curva de amonio plana

• Herencia autosómica recesiva

DÉFICIT DE MIOADENILATO DESAMINASA

GENÉTICA MOLECULAR

• Gen AMPD1:

– Codifica la isoenzima muscular de la AMP desaminasa (MADA)

– 16 exones (miniexón 2 con 12 bases)

• Mutación COMÚN:

– Mutación sin sentido Q12X en exón 2 (>95% de los pacientes)

– Frecuencia Alélica: 17% raza blanca

• Alelo Q12X +

• Otra mutacion Q156H identificada en una serie de pacientes caucásicos

• Q12X (c.34C>T) como factor protector cardiovascular

HETEROCIGOSIS Q12X EN CONTROLES

DÉFICIT DE MIOADENILATO DESAMINASA

FENOTIPO MUTACION Q12X (c.34C>T)

20 HOMOCIGOTOS Q12X

26/150 : 17,3%

HISTOQUÍMICA 20/1300: 1,6%

CRIBADO MOLECULAR MUTACION Q12X

15 Q12X

3 + R50X (PYGM)

4 DOBLE PROBLEMA Q12X +

1 + A3243G (ADNmt)

I.E. MODERADA

FENOTIPO I.E OSTEOMALACIA

FENOTIPO

MITOCONDRIAL (PEO)

1 Q12X + DEF. COMP III CRM

FENOTIPO

McARDLE

• Normal Respiratory chain activities • Normal mtDNA/nDNA ratio • Normal 15 frequent mutations and rearrangements of mtDNA

ACS

ESPACIO

INTERMEMBRANA

MEMBRANA INTERNA

MEMBRANA EXTERNA

CITOSOL

ACIL-CoA

ACIL-CoA

ACIL-CoA

AMP + PPi ATP + CoA AGCL

CPT II

ACIL-CARNITINA

ACIL-CARNITINA

CARNITINA

CARNITINA

CARNITINA

CARNITINA

CARNITINA

ACETIL-CARNITINA

ACETIL-CARNITINA

CICLO DE KREBS

MATRIZ

ß-OXIDACION

CoA CoA

ACETIL-CoA

CPT I

CATR

FUNCIÓN METABÓLICA CPT

CAT

Presentaciones clínicas deficiencia CPT II:

Neonatal Letal •Episodes of liver failure with hypoketotic hypoglycemia

•Cardiomyopathy

•Cardiac arrhythmias

•Seizures and coma after fasting or infection

•Facial abnormalities or structural malformations (e.g., cystic renal dysplasia, neuronal

migration defects)

•Onset within days after birth

Hepatocardiomuscular (infantil grave) •Liver failure

•Cardiomyopathy

•Seizures, hypoketotic hypoglycemia

•Peripheral myopathy

•Attacks of abdominal pain and headache

•Onset in the first year of life

Miopática del adulto •Recurrent attacks of myalgia accompanied by myoglobinuria precipitated by prolonged

exercise (especially after fasting), cold.)

DÉFICIT DE CPT II

FORMA ADULTA MUSCULAR

• Prevalencia estimada 1 : 300.000

• Crisis recurrentes de mialgias, calambres y rigidez muscular:

– ejercicio aeróbico de moderada intensidad y larga duración

– frio, infecciones, fiebre y estrés emocional

• No existe fenómeno de segunda entrada

• Mioglobinuria frecuente (70-80%) ------> fracaso renal

• Inicio: infancia y adolescencia

• Diagnóstico: 2ª-3ª decada

• Histología: Normal o en pocos casos aumento lípidos. No tinción

histoquímica.

• Laboratorio:

– CK basal: normal ; CK crisis: muy elevada.

– PAEI: curva de lactato y curva amonio normales

• Herencia autosómica recesiva

1. Espectrometía de masas en Tandem (MS/MS) de acilcarnitinas en suero/plasma

Sugestivo de defecto en β-oxidación mitocondrial: aumento de C2 a C18 acilcarnitinas especialmente de C16 y C18:1.

2. Actividad Enzimática CPT II

Actividad enzimática total CPT (CPT I y CPT II) palmitoyl-CoA + carnitine ↔ palmitoylcarnitine + CoA. •"radio isotope exchange assay”. •"isotope forward assay“ Actividad CPT II es la fracción no inhibida por malonyl-CoA.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Normal Déficit CPT

Diagnóstico Bioquímico del Déficit de CPT II

1 2 3 4 5

S113L

R124X

R151Q

P50H

178 ins T/del 25 pb

(L178fs)

Y628S

P604S

R631C

G549D Q550R

D553N

R503C F448L F383Y

413 delAG

(Q413fs)

Y479F

M214T

P227L

R161W

DÉFICIT DE CPT II

MUTACIONES GEN CPT2

Y120C 36_38 insGC

(Q36fs)

I502T

IVS3 + 5G > A

N146T

E174K E487K A515fs

D608H

50-80%

c.38delG (p.Gly13fs)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

S113L Otros alelos

%

• INTOLERANCIA AL EJERCICIO

• DEPOSITOS DE GLUCOGENO

• NEGATIVIDAD PRUEBAS HISTOQUIMICAS, Y BIOQUIMICAS DE OTRAS I.E. MAS FRECUENTES

DATOS: 32 PACIENTES SELECIONADOS PARA PRUEBAS

ENZIMATICAS EN HOMOGENADO MUSCULAR

NO SE IDENTIFICO NINGÚN DEFICIT ENZIMÁTICO

PHK1, PFKM Y GLUCOGENOSIS DISTALES

AFECTACIÓN MIOPÁTICA

Enfermedad de McArdle

Función Miofosforilasa GLUCÓGENO

GLUCOSA-1P

GLUCOSA-6P

VÍA

ANAERÓBICA

PIRUVATO

GLUCOSA

ATP ADP GLUCOLISIS

VÍA AERÓBICA (CICLO DE KREBS)

6 CO2+ 6 H2O+ 38 ATP ÁC. LÁCTICO+ 4ATP

FOSFORILASA A

(ACTIVA)

FOSFORILASA B

(INACTIVA)

ENFERMEDAD DE McARDLE

DÉFICIT DE MIOFOSFORILASA (glucogenosis tipo V)

Prevalencia estimada: 1 / 100.000 Texas. ; España ≈ 1/ 170.000

•Mialgias, fatiga prematura y calambres por dos tipos de ejercicio:

– ejercicio breve de gran intensidad (isométrico)

– ejercicio aeróbico de intensidad moderada/alta y mayor duración

•Fenómeno Segunda entrada (Second Wind): readaptación

fisiológica y bioquímica muscular para utilización primordialmente de glucosa sanguínea, y ácidos grasos.

•Mioglobinuria (50%) •Inicio: infancia

•Diagnóstico: 2ª-3ª decada, >50 a (debilidad fija)

•Histología: PAS +; Histoquímica MPL: Ausencia de tinción

•Laboratorio:

– CK reposo: elevada

– PAEI: Curva de lactato plana •Herencia autosómica recesiva

Herramientas de diagnóstico

• Casos inicio tardío de la enfermedad (Engel, 1963; Felice, et al., 1992; Pourmand, et al., 1983; Wolfe, et al., 2000). • 3 casos con debut en el periodo neonatal de una forma infantil fatal (DiMauro and Hartlage, 1978; Milstein, et al., 1989; Miranda, et al., 1979). • 1 caso de muerte súbita (el-Schahawi, et al., 1997). • Doble problema:

i. MADA (Rubio, et al., 2000c; Tsujino, et al., 1995a), ii. alteraciones mitocondriales (Mancuso, et al., 2003; Rubio, et al.,

1998), iii. hipertermia maligna (Isaacs, et al., 1989), iv. miastenia gravis (Lucia, et al., 2007b).

Heterogeneidad clínica

1993, 1ª mutación → Ene 2012 >130 mutaciones PYGM.

Mutaciones terminadoras, cambio de aminoácido, deleciones,

inserciones, mutaciones y polimorfismos que afectan al corte y

empalme de exones

Heterogeneidad molecular

. Spanish consortium diagnostic flowchart

Screening PCR-RFLP;

Genotyping real-time PCR

+

Sequencing

E1, E14, E17, E18

Genotipado Mutaciones Frecuentes Int. Metab. Ejercicio. Discriminación Alélica ‘Real Time PCR’

HOMOCIGOTO

HETEROCIGOTO

WILD-TYPEs

p.R50X-PYGM-McArdle

C PCR HM HT

306 pb 250 pb

146 pb

104 pb

56 pb

PCR-RFLP Nla III

Gen ACE, codifica ECA. Polimorfismo I/D. Alelo I, ↓ act ECA.

Martinuzzi et al, 2003: Mayor incidencia alelo D gen ACE en pacientes mayor severidad fenotípica.

Gen AMPD1, codifica MADA. Mutación p.Q12X.

Martinuzzi el al, 2003. No asociación.

Gen ACTN3, codifica α-actinina-3. Polimorfismo p.R577X.

Gen PPARGC1A, Coactivador-1 α del receptor-γ activado por proliferadores de peroxisomas . Polimorfismo p.G482S.

Moduladores fenotípicos

Mutaciones “silentes” ???; efectos mRNA

1 2 3 4

W798R/ K609K

K215K (c.645G>A) (Exón 5)

• p.R50X + p. K215K (mRNA : 5%)

• W798R + p.K215K Una familia: – Probando: p.R50X+ p.K215K+ p.T488N (cDNA Sangre)

– HIJOS (gDNA sangre):

• 2 : p.K215K+ p.T488N (Heterocigosis)

• 1 : p.R50X (Heterocigosis)

EXON 5

PATOGENICA:

- Estabilidad del mRNA

- ESS?

- ESE?

WT => AAG

K215K=> AAA

WT => AAG

K215K=> AAA

Electroferograma del ADNc procedente del ARNm del gen PYGM obtenido a partir de sangre periférica, mostrando la retención del intrón 6 como consecuencia del cambio c.645G>A.

c.645G>A

p.K215K

Expresión PYGM mRNA/cDNA en células sanguíneas “PCR ILEGITIMA” ----Diagnostico molecular

EXON 16 EXON 18

cDNA musc: clon Del ex17 cDNA PYGM DE LINFOCITOS

Probando: del exon 17 + p.R50X

Hijo 1: p.R50X en heterocigosis

Hijo 2: deleción exón 17 en heterocigosis

cDNA Linfocitos: p.R50X

Heterocigosis

ADNc MÚSCULO

c.(1969+214)_(2177+369)del

HOMO

ADNc SANGRE

p.R50X WT p.R50X

(p.R50X + p.V657_G726del)

c.(1969+214)_(2177+369)del

HETEROCIGOSIS

39

PCR ILEGITIMA DEL GEN PYGM

NMD

SANGRE

NMD

MÚSCULO

Expresión de GPM

40

CONTROLES

PTC PTC

GPM

Músculo Sangre

55 KDc 42 KD

97 KD

CARACTERIZACION DE LAS ALTERACIONES PROTEÍCAS EN LA ENFERMEDAD DE McARDLE

MIOFOSFORILASA

α- TUBULINA

WESTERN BLOT MIOFOSFORILASA

CUANTIFICACIÓN TRANSCRITOS DEL GEN PYGM MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL

Parece no existir relación entre los niveles de mensajeros y los niveles de proteína.

Análisis monodimensional

SERCA1

GPM

GS

α- Tubulina

Miosina

1. p.R50X + p.L5VfsX22

2. p.W798R HO

3. p.R50X HO

4. p.R50X + p.A660D

PACIENTES

104 KD

97 KD

84 KD

55 KD

217 KD

Análisis Bidimensional

44

CONTROL PACIENTE: p.W798R HOMOCIGOTO

Análisis Bidimensional - WB

C1

C2

p.W798R

p.R50X

06/12/2012 45

- GS-P

MPL GS SERCA1 α-Tubulina + GS SERCA1-P SERCA1

BN- Colocalizaciones

2D-PAGE-SDS: GS

47

CONTROL P21 P24

% G

S

0

20

40

60

80

TETRAMERODIMEROMONOMERO

A

B

CONTROL

PACIENTE 21

PACIENTE 24

T D M

1

2

3

p.R50X HOMO

p.R50X + p.R602W

CONTROL

GP

SERC

A1

GS

97 KD

a

104 KD

a

84 KD

a

1D-

BLU

E NATIV

E

3%

12 %

GP

1D

2D

2D

-PA

GE-SD

S

2A

2B

2C

90

ºC

3%

12%

1D- NATIVE

GP

SERCA1

GS

97 KDa

104 KDa

84 KDa

1D- BLUE NATIVE

3%

12 %

GP1D

2D

2D- PAGE-SDS

2A

2B

2C

90ºC

GS (84 KDa)

GS (84 KDa)

GS (84 KDa)

La ausencia de GPM en pacientes conlleva la desregulación de puntos clave en el control del metabolismo del músculo esquelético.

i. Una disminución de los niveles y del grado de fosforilación de SERCA1.

ii. Una reducción en la cantidad de GS activa, y un desplazamiento hacia su forma inactiva, lo que sugiere un efecto protector de sobrecarga de glucógeno en el músculo.

iii. Glucógeno sintasa (GS) y GPM parecen colocalizar en el músculo, de tal manera, que la ausencia de GP en los pacientes parece romper el equilibrio de los complejos que forman entre sí, desplazando la GS hacia complejos no activos.

INTRODUCCIÓN

CÉLULAS MADRE QUIMERA

RATONES PORTADORES p.R50X

Ratones portadores mutación p.R50X en el gen PYGM

Neo

Knock-in R50X (+Neo) HET

Knock-in R50X HET Knock-in R50X HET

25% WT, 50% Knock-in R50X HET, 25% Knock-in R50X HOM

Cre ubicua

R50X Mouse

• Período: 1998 – Enero 2011. •239 casos de origen Caucásico ( 102 mujeres) •Edad: 44±18 años (rango: 9 – 93) •Prevalencia ~1/167,000 •Alelos mutantes PYGM 99.6% de los casos •Existe heterogeneidad en la gravedad de los síntomas, pero hay cuatro características diagnósticas comunes:

i. 99.5% pacientes crisis aguda de intolerancia al ejercicio (con mioglobinuria recurrente en 50% de los casos)

ii. 58% pacientes inicia los síntomas en la primera década de vida iii. 86% pacientes experimentan el fenómeno ‘second wind’

repetidamente a lo largo de su vida iv. 99% pacientes tienen hiper-CK-emia basal (>200 U/L). v. Fracaso renal agudo: muy infrecuente (4%)

•Los pacientes físicamente activos tienen mayor probabilidad de mejora de su curso clínico (odds ratio: 232.3, 95%CI: 22.5 – 2324.4), y mejor capacidad cardiorespiratoria ( + 23% VO2peak , P=0.003).

REGISTRO NACIONAL DE ENFERMEDAD DE McARDLE (Hospital 12 de Octubre, Madrid; Hospital Val d’Hebron, Barcelona; and Hospital Meixoeiro, Vigo; Universidad Europea de Madrid )

PYGM (R50X, G205S, W798R)

CPT2 (S113L)

AMPD1 (Q12X)

LABORATORIO: CK basal HISTORIA CLÍNICA: Causantes IE, tipo ejercicio, Mb(o).; Second Wind

CRIBADO MUTACIONAL: PCR-RFLP o Discriminación Alélica (Genotipado)

ADN Sangre

Curva de Lactato PLANA Curva de Amonio PLANA Curvas en isquemia NORMALES/Acilcarnitinas suero

Caract. molecular

SI SECUENCIACIÓN PYGM Exones 1, 14 , 17 y 18

Caract. molecular

SI

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA MPL, CPT II; CRMito

Biopsia muscular

Caract. molecular

SI

Caract. molecular

SI

ESTRATEGIA DIAGNÓSTICA

SECUENCIACIÓN PYGM o CPT2; Análisis de cDNA

ANATOMIA PATOLÓGICA Histología: Glucógeno, Lípidos, RRF/COX Histoquímica: MPL, PFK, MADA, VLCAD

Second Wind Objetivo

physiology

genetics animal model