RECURSOS NATURALES DE BAJA CALIFONIA SUR, UNA FUENTE POTENCIAL DE PLAGUICIDAS ORGÁNICOS Rosalba Encarnación Dimayuga

Universidad Autónoma de Baja California Sur. Área Interdisciplinaria de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agronomía. Laboratorio de Farmacognosia. A. P. 19-B, La Paz, B. C. S. 23080

INTRODUCCIÓN

Desde la antigüedad hasta nuestros días, los recursos naturales, específicamente las plantas medicinales han sido empleadas para el control y cura de enfermedades tanto del hombre, como de animales y de las plantas de interés económico. En los últimos cincuenta años, desde finales de la II Guerra Mundial, los agricultores habían dejado de utilizar los productos naturales, debido a la aparición de productos químicos sintéticos llamados pesticidas o plaguicidas, denominados según el fin para el cual eran empleados (nematicidas, herbicidas, fungicidas, termiticidas, acaricidas, repelentes, etc), cayendo en desuso los insecticidas caseros, por considerarlos anticuados y con poco futuro. Sin embargo, en la actualidad la aplicación de extractos y substancias naturales ha adquirido una gran importancia a nivel mundial, debido a su bajo impacto en el medio ambiente. La lucha contra las plagas siempre ha sido difícil para el agricultor, que en su deseo por obtener un cultivo sano y vigoroso, esta aplicando extractos o substancias naturales orgánicas. Por tal motivo, la investigación de los recursos naturales de Baja California Sur, se lleva a cabo en la UABCS desde 1983, con el objetivo de evaluar el potencial biomédico y agroquímico de las plantas medicinales del estado y de los organismos marinos del Mar de Cortés y con el fin de encontrar en los recursos de la entidad, aquel que sea potencialmente activo.

Neothyone gibbosa Deichmann (Cucumariidae) N. gibbosa se distribuye desde el Golfo de California hasta el sur de Perú y el pepino fué colectado en la Isla Cerralvo; sus vísceras fueron eliminadas y el resto de su cuerpo fué cortado y extraído con etanol. El extracto etanólico mostró actividad contra el hongo levaduriforme C.albicans y su fraccionamiento por diferentes técnicas cromatográficas con ayuda del ensayo biodirigido, condujo al aislamiento de 3 compuestos, cuya estructura química fue definida por Espectrometría de Masas y Resonancia Magnética Nuclear de +H y 13C, como glucósidos de naturaleza tritepénica. Se les denominó Neos A, B y C y su actividad contra los hongos fitopatógenos Aspergillus niger, Fusarium oxysporum y contra el protozoario L. mexicana ha sido determinada (14).

MATERIALES Y MÉTODOS

En la investigación del recurso activo, se ha considerado su uso en la medicina tradicional y popular de Baja California Sur (1), su abundancia y accesibilidad, que sea propio del estado, así como que no haya sido investigado. Como el recurso marino reportado en la medicina tradicional fue escaso, se procedió a colectar aquellos organismos pertenecientes a géneros que según la literatura científica, podrían ser portadores de compuestos activos, como esponjas, equinodermos, corales blandos, entre otros, seguido de la selección de sus extractos por diferentes pruebas biológicas, farmacológicas y toxicológicas y del fraccionamiento, purificación y caracterización química de sus compuestos activos al aplicar diferentes técnicas cromatográficas y el ensayo biodirigido. Selección: La selección de los recursos potencialmente activos se ha llevado a cabo con el desarrollo de diferentes proyectos, en colaboración con diferentes instituciones gubernamentales, nacionales y extranjeras al determinar diferentes actividades, como: Determinación de la actividad antimicrobiana por el Método de difusión en Agar (MDA) Fig. 1, empleando Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, y de la actividad antifúngica contra Candida albicans, Fusarium oxysporum y Aspergillus niger. Fig. 1. Método de difusión en Agar

Determinación de la actividad antituberculosa por el Método BACTEC 460 y MABA contra Mycobaterium tuberculosis HRv y una cepa de M. tuberculosis, multiresistente aislada de un enfermo con tuberculosis. Determinación de la Actividad antiprotozoaria, contra Entamoeba hystolitica, Giardia lamblia y Leishmania mexicana. Determinación de la actividad contráctil sobre el músculo de jejuno de conejo. Determinación de la actividad anticancerígena contra diferentes líneas de células tumorales del colon, del busto, de la próstata, del sistema nervioso central y leucemia. Determinación de la toxicidad por el uso de microtécnicas empleando el nemátodo Pangrelus redivivus y de la actividad nematicida contra nemátodos del orden Rhabditida (Fig. 2).

Fracionamiento: El recurso activo fue fraccionado aplicando diferentes técnicas cromatograficas (Fig. 3) con ayuda del ensayo biodirigido (MDA) hasta aislar los compuestos responsables de la actividad, cuya estructura química ha sido definida por diferentes técnicas espectroscópicas en colaboración con varios grupos de investigación nacionales y extranjeros.

P

Concentración

T°↑ <40

CC

Bioensayo

+

Hexano 100%

Hex:CH2C

l2 8:2

CH2Cl2:MeO

H 95:5

Tolueno

100%

MeOH 100%

TLC

Monitoreo TLC

El inventario de los recursos empleados en la Medicina Tradicional y Popular de Baja California Sur, arrojó el uso de: 369 plantas medicinales, 14 organismos marinos, 16 animales terrestres y 9 sustancias (1). Este inventario ha sido el punto de partida en el estudio del potencial agroquímico y biomédico de los recursos del estado. Diferentes grupos de plantas medicinales, y organismos marinos han sido sometidos a diferentes pruebas de actividad biológica y solo los potencialmente activos han sido investigados en su composición química. Compuestos activos conocidos y nunca antes reportados se han logrado aislar como por ejemplo de Happlopappus sonorensis, Lepechinia hastata, Calliandra californica, Neothione gibbosa, Aplysisna gerardogreeni, Muriciea cf. austera entre otros. Hierba del pasmo, Haplopappus sonorensis (A. Gray) S.F. Blake (Asteraceae) Es una planta ampliamente usada en la medicina tradicional del estado para las llagas, resfriados, infecciones, dolor de muelas, catarro, tétano, heridas, piquetes de animales ponzoñosos y para el mal olor de pies (1). Crece abundantemente en la región noroeste del país. El extracto etanólico que obtuvimos de la parte aérea de la planta, mostró actividad antimicrobiana, contra el músculo de jejuno, actividad nematicida, antimicobacteriana, y citotóxica contra las células tumorales del colon (HCT-116). El fraccionamiento por cromatografía en columna y la ayuda del ensayo biodirigido, condujo al aislamiento de tres flavonas: la 1:5.hydroxy.3,7,4´-trimetoxiflavona, 2:la ermanina y la 3: kumatakenina activas contra M. tuberculosis, siendo la ermanina la mas activa, y de la cual la actividad antiinflamatoria, antiviral y contra el fibrosarcoma humano ha sido demostrada. La actividad antiviral y contra las úlceras ha sido también demostrada con la Kumatakenina. La presencia de estos compuestos explica y correlaciona el uso de esta planta en la medicina tradicional. Además, la friedelina, y el friedanol también se han aislados de la hierba del pasmo y es ya conocida la actividad antialimentaria de la friedelina contra el insecto Spodoptera litoralis (4, 10).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Muricea cf. austera (Gorgonaceae) Esta muestra fué colectada en la Bahía de La Paz en 1999. Los

corales fueron extraídos con cloruro de metileno:Metanol al 30% y su extracto mostró actividad contra S. aureus y B. subtilis por el MDA, y contra M. tuberculosis. Tres compuestos han sido aislados de este recurso: un trihidroxiesterol activo contra S. aureus, B. subtilis y dos glucósidos esteroidales de estructura nueva de los cuales uno de ellos presentó actividad contra células tumorales del colon humano HCT-116 (11).

Tabardillo, Zapotillo o Cabello de Ángel, Calliandra californica Benth (Fabaceae) El cocimiento de su raíz o ramas es comúnmente empleado, para el mal de orín, inflamación de la próstata, fiebre, dolor de muelas y calambres (1). Sus sinónimos son: Fenillicea californica Kuntze y Anneslia californica Rose. Las Calliandras son hierbas perennes, arbustos o árboles pequeños con hojas pineadas, flores pequeñas en cabezas, axiales capitoneadas o racimos, cáliz de cinco sépalos, corola en forma de embudo de cinco lóbulos, y muchos estambres largos formando un tuvo corto. Dos flavonas de estructura novedosa fueron aisladas de esta planta y una de ellas resultó ser activa contra S. aureus (2). Los extractos hexánico y de acetato de etilo obtenidos de la parte aérea de la planta, después de someterlos a la prueba de actividad antimicrobiana por el MDA mostraron actividad contra S. aureus, S. faecalis y B. subtilis. El fraccionamiento del extracto de acetato de etilo obtenido por maceración de la raíz, por cromatografía en columna y ayuda del ensayo biodirigido condujo al aislamiento de dos diterpenos del tipo casánico de estructura nueva, denominados Escobarína A y B activos contra M. tuberculosis y contra células tumorales del colon (HCT-116), busto (MCF-7), leucemia (K.562 CML) sistema nervioso central (V-251 Glio) y próstata (PC-3), (7), lo que explica y correlaciona su uso en la Medicina tradicional. El extracto etanólico de la parte aérea de la planta presentó actividad contra los nematodos del orden Rhabditida, Fig. 5 (8), por lo que se continúa su estudio para evaluar su actividad nematicida e insecticida.

CH3O

OCH3

O

OR

OCH3

OCH3

CONCLUSIONES

Los resultados logrados nos muestran el gran potencial que poseen los recursos del estado, como fuente de substancias activas cuyos extractos o compuestos pudieran aplicarse en el control y cura de las enfermedades del hombre, animales y plantas, pudiendo contribuir por consiguiente en un futuro próximo a la solución de problemas del sector agrícola, acuícola, biomédico, alimenticio, etc. AGRADECIMIENTOS

LITERATURA CITADA 1.- Encarnación Dimayuga Rosalba. Medicina Tradicional y Popular de B. C. S. 1996. Artes Gráficas. UABCS 2.- Encarnación, D.R., Ochoa, N., Anthoni, U., Christophersen, C. (1994) and Nielsen, P.H. Two new flavones from Calliandra californica. Journal of Natural Products. 57(9),1037-1039. 3.- Encarnación, D. R. Almada T. G. and Virgen F. M.1998. Minimun Inhibitory Concentration of carnosol and of the ethanol crude extrat from Lepechinia hastata (A. Gray) Epling (Lamiaceae). Phytomedicine. 5(3) 1-5 4.- Encarnación, D.R., Álvarez, M.I., Nielsen, J., Christophersen, C.1999. Chemical Constituents from Haploppapus sonorensis. Fitoterapia. 70, 536-537. 5.- Encarnación D.R., Ramírez, M. R. and Luna-Herrera J. (2003). Aerothionin a bromotyrosine derivative with antimycobacterial activity from the Marine Sponge Aplisyna gerardogreeni (Demospongia). Pharmaceutical Biology. 41(5)384-387 6.- Encarnación-Dimayuga, R., Agúndez Espinoza J. y Camacho Espinoza L. 2005. Estudio preliminar de germinación con ácido giberélico

de Lepechinia hastata (Lamiaceae). Fitotecnia. En evaluación 7.- Encarnación-Dimayuga R. Agundez E. J. García A. Delgado G., Salinas-M. G. and Said F. S. 2005. Two new cassane type diterpenes from Calliandra californica Benth (Fabaceae) with antituberculosis and cytotoxic actvities. Planta Medica. En evaluación 8.- Jiménez Gallegos Alicia. Selección de Plantas Medicinales por su actividad Nematicida. Tesis. UABCS. Lic. Ing. Agrónomo. 2004 9.- León D. L. Aislamiento, purificación, identificación y evaluación de la actividad antimicrobiana de un compuesto de Aplysina gerardogreeni, Gomez y Bakus, 1992 (Porifera; Demospongia). Tesis de Maestría. CICIMAR. 2003. 10.- Murillo-Álvarez J.I,, Encarnación D.R., Malmstrom, J., Christophersen, C. and Franzblau S. (2003) Antimycobacterial compounds from Haplopappus sonorensis . Fitoterapia 74 (3) 226-230

11.- Murillo-Álvarez, J.I., and Encarnación-Dimayuga, R. 2003. New bioactive pregnadiene-derived glycosides from the Gulf of California gorgonian Muricea cf. austera. Pharmaceutical Biology. 41. 531-535

12.- Ochoa Avilés A. Samuel. Selección de plantas medicinales de B. C. S, por su actividad antifúngica. Tesis. UABCS, Lic. de Ing. Agrónomo. 2004. 13.- Piñuelas Cota Zaida. Estudio de la Chicura de la Sierra o Lepechinia hastata (A.Gray) Epling (Lamiaceae) como fuente de compuestos con actividad antimicrobiana. Tesis. Tecnológico de La Paz. Lic. Ing. Bioquímico. 2004 14.- Encarnación-Dimayuga R. Murillo-Álvarez, J. I.,Christophersen, C., Chan-Bacab, M. and Zaccino, S. 2005. Leishmanicidal and antifungal activity of triterpenoids glycosides isolated from the sea cucumber Neothyone gibbosa. Publicación en preparación.

metoxifenil) acético y un compuesto activo contra M. tuberculsosis cuya estructura esta en estudio. La aerotionina resultó ser un compuesto muy activo contra diferentes cepas de M. tuberculosis, multiresitentes a antibióticos de primera línea (5). El compuesto ácido, mostró una concentración mínima inhibitoria entre 62.5 µg/mL a 500 µg/ mL para S. aureus. B. subtilis, E.coli, C.albicans y Vibrio harveyi. (9 )

Acetilglucopiranosido IC50= 17.3 µg/mL con células tumorales del

colon humano HCT-116

Trihidroxiesterol MDA: a 200 µg, B.subtilis,

S.aureus

Glucopiranosido 1

O

O

HO

OH

O

O

HO

OH

OHHO

OH

O

O

HO

COOH

HO

COOH

Acido Ursólico B. subtilis

M. tb., Inhibió COX-2

ß-hidroxicarnosol S. aureus.

Factor de actividad de Plaquetas: IC50 = 28 µM

Carnosol S. aureus, S. facealis, B. subtilis

Factor de Actividad de Plaquetas: IC50 = 10.7 µM

Germinación de semilla de L. hastata con ácido giberélico

Siembra de las plántulas de L. hastata

Fig. 4. Análisis de extractos obtenidos de L.hastata cultivada

Sílica gel 60 A°, 250 mm, F254

CH3:EtOH (9.5:0.5)

Revelador: H2SO410% Vainillina 0.25

1.- Extracto de Cloruro de Metileno

2.- Carnosol

3.- Extracto Etéreo

4.- Acido Ursólico

5.- Extracto Etanólico

A DIGICSA-SEP, FOMES, CONACYT, DANIDA, SIDA, SIMAC-CONACYT, Universidad de Uppsala en Suecia, Instituto Scripps de Oceanografía, de la Universidad de California en San Diego, USA, UAM-Xochimilco, Instituto de Química de la UNAM, Instituto Orsted de la Universidad de Copenhague en Dinamarca, por el apoyo brindado en las colaboraciones establecidas, así como a la UABCS, profesores y estudiantes que durante mas de 20 años han contribuido al desarrollo de este programa de investigación. Cuerpo Académico: Farmacognosia

Colaborador: M. en C. Jorge Agúndez Espinoza

Estudiantes: Ing. Agr. Ma. Alicia Jiménez Gallegos

P. IBQ. Francisco Nieto Navarro

P. Ing Agr. E. Verónica García Sánchez

E. Ing. Agr. J. Roberto Salgado López

E. Ing. Agr. Juan Carlos Martínez Santiago

Es una planta perenne de 2 a 3 mm de altura con un tallo de 1 a 1.5 cm de grueso y flores de color violáceo. El material utilizado para este estudio fue colectado en la Sierra de la Laguna B. C. S. en 1987. El fraccionamiento de sus extractos por cromatografía en columna con ayuda del ensayo biodirigido condujo a la obtención de 6 compuestos que por Espectroscopía de Infrarrojo, Espectrometría de Masas y Resonancia Magnética Nuclear de 13C y 1H, resultaron ser Carnosol, β-OH carnosol, ácido ursólico B-sitosterol y 2 compuestos que están pendientes de definir en su estructura química (13). El carnosol ha sido reportado como un potente antimicrobiano, antioxidante, con actividad antitumoral (3). Debido a la dificultad de recolectar L. hastata, a que esta planta crece en un área restringida del estado y por el probable potencial biomédico que presenta, se pensó en someter a un estudio preliminar de germinación con ácido giberélico, a las semillas colectadas en 1997 en San Antonio de la Sierra, B. C. S. lográndose detectar en las plantas cultivadas (Fig. 4), los compuestos activos: carnosol y ácido ursólico (6).

Desarrollo de plántulas de L. hastata

Aerotionina MIC: 6.25- 25 µg/mL

M. tuberculosis

Ácido 2-hidroxi-3,5dibromo-4-metoxifenilacetico S.aureus, B. subtilis, S. faecalis y C. harveyii

Calafianina MIC: > 100 µg/mL, M. tuberculosis

Escobarina A: R1= CH=O MIC 13.13ug/mL M. tuberculosis H37Rv y 25.5 µg/mL M. tuberculosis aislado clínico resistente, Escobarina B: R1= CH2OH MIC 50 µg/mL and 100 µg/mL

Flavonas:

1: R= H

2: R= OH, activas contra B. subtilis y S. aureus

O O M e

O M e M e O

O H O 5- hidroxi -3,7,4’- Trimetoxiflavona

O

O O H O M e

O H M e O

Kumatakenina M.tuberculosis 48% Inh. a100µg/mL. IC50-80.9 µg/mL Células tumorales del Colon HCT-116

Ermanina M.tuberculosis 98% Inh. a 100µg/mL.

Friedelina. Actividad antialimentaria, Spodoptera litoralis

O

H

O

O

O

OO

HOMe

Me

M.tuberculosis 33% Inh. a 100µg/mL.

Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) en µg/mL de Neo A, B y C .

NeoA Neo B Neo C Ketoconazol C. albicans 625.0 375.0 466.0 21.8 A. niger 1 37.5 31.25 4.65 7.5 A. niger 2 37.5 18.7 7.8 25

Chicura de la sierra, lavanda o lengua de buey, Lepechinia hastata (A. gray) Epling (Lamiaceae)

El cocimiento de la raíz y parte aérea de esta planta es empleada en la Medicina tradicional del estado para las infecciones vaginales (1). Crece solo en Hawai, en Baja California Sur y en las Islas Revillagigedo, México.

Aplysina gerardogreeni

Aplysina gerardogreeni Gomez y Bakus (Porifera;Demospongia)

Esta esponja marina fué colectada en el complejo insular Espiritu Santo:La Partida, de la Bahía de La Paz y sus extractos mostrarón actividad contra S.aureus, B.subtilis, S. faecalis, E.coli, C.albicans , y M. tuberculosis, por lo que se procedió a su estudio, aislandose: la aerotionina, calafianina, el ácido (2-hidroxi-3.5-dibromo-4-

Hierba del pasmo

L.hastata

Tabardillo, C. californica

N. gibbosa

Fig. 3. Fraccionamiento

Fig. 2. Determinación de la actividad nematicida

Fig. 5. Actividad nematicida de plantas medicinales de B. C. S.