introduccion a la cromatografia

t0 1 2 3

211299 Análisis Instrumental II – Quimicos Analistas 2006

CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL

I: PRINCIPIOS Y PARAMETROS

Dr. Dietrich von Baer v. L.Dra. Claudia Mardones P.

Universidad de ConcepciónFacultad de Farmacia

Departamento de Análisis Instrumental

CROMATOGRAFIACHROMATOS = COLORGRAPHEIN = ESCRIBIR

Columna deCarbonato de Calcio

Mikhail Tswett: 1906: separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella

D. von Baer/C. Mardones 2008

Pigmentos naturales




Eter de petróleo

Pigmentos naturales





Martin y Synge (1952): Obtienen Premio Nóbel de Química por la invención de la Cromatografía de Partición en Papel: Clave para la separación de aminoácidos y diversos otros compuestos de interés biológico en mezcla.

Eter de petróleo

Pigmentos naturales

Martin y James (1952):Inventan Cromatografíade Gas (1er método instrumental)




Mikhail Tswett (1906): separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella

HOY: Conjunto de métodos de análisis químico instrumental que permiten separar los componentes de una mezcla, los cuales se distribuyen SELECTIVAMENTE entre:

FASE ESTACIONARIA (en reposo)

FASE MOVIL (se hace pasar a través de o en torno a FASE ESTACIONARIA )

Martin y Synge (1952): Reciben Premio Nóbel de Química por la invención de la Cromatografía de Partición en Papel: Clave para la separación de aminoácidos y diversos otros compuestos de interés biológico en mezcla.

Eter de petróleo

Pigmentos naturales

Martin y James (1952):Inventan Cromatografíade Gas (1er método instrumental)


CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS Según ESTADO FISICO de las FASES:

Crom. LIQ-

LIQUIDO

Crom. GAS-

LIQUIDO

Crom. LIQ -

SOLIDO

Crom. GAS –

SOLIDO

FASE MOVIL:

Líquido Gas

FASE ESTA- CIONARIA:

Líquido

Sólido

Cromatógrafode Líquidos

Cromatógrafode Gases

INSTRUMENTO

CROMATOGRAFODE LIQUIDOS

CROMATOGRAFO

DE GASES


CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS

Según el OBJETIVO:

Identificar y cuantificar componentes de una mezcla

Compuesto %

A 12,5B 25,0C 50,0D 12,5

• Analítica

• Preparativa

Aislar componentes de una mezcla


• PLANAR

Fase estacionaria

Fase móvilp1 p2 p3 m1 m2


Según la FORMA de hacerla:

En COLUMNA

COLUMNAS DE HPLC COLUMNA DE GC

Fase móvil

Fase estacionaria

p1 p2 p3 m1 m2

• PLANAR

COLUMNAS DE HPLC COLUMNA DE GC

Según la FORMA de hacerla:

En COLUMNA


Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:

• PARTICION O REPARTO: Solubilidad selectiva entre dos fases. Lo SIMILAR ES SOLUBLE EN LO SIMILARFase Estacionaria: LIQUIDOFase Móvil: LIQUIDO o GAS


• PARTICION O REPARTO• ADSORCION• INTERCAMBIO IONICO• EXCLUSION

• Para retener la fase estacionaria líquida, en la mayoría de los casos esta se une física- o química-mente a un soporte sólido

• EN CROMATOGRAFIA LIQUIDO/LIQUIDO: Para evitar que se mezclen las fases, se usan dos

líquidos no miscibles como fase estacionaria y móvil, uno polar y uno apolar.

F. est. polar /F. móvil apolar: Fase Normal F. est. apolar/ F. móvil polar: Fase Inversa• Casos particulares Crom. Reparto: - Crom. en Papel

y Crom. Liquida en Fase Inversa



• ADSORCION: Fenómeno de SUPERFICIELos solutos se concentran sobre la superficie de un sólidoFase Estacionaria: SOLIDO ADSORBENTE

• Centros activos en la superficie del sólido interac-cionan con grupos polares de los solutos, los cuales son desplazados por la fase móvil.

• Retención depende de área superficial, la cual depende del tamaño de partícula y de la superficie interna ido interaccionan con grupos polares de los solutos, los cuales son desplazados por la fase móvil.


• INTERCAMBIO IONICO:Intercambio estequiométrico de IONES de Muestra y Fase Móvil, que compiten unirse a Fase Estacionaria IONICA.

+++

+

+

+++

+



Fase estacionaria: Matriz rígida en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva- o negativamente y contraiones de carga opuesta, susceptibles de intercam-biarse con iones de la misma carga contenidos en en la Fase Móvil, la cual suele ser una solución tamponada,

SEPARACION se produce por competencia entre iones analito y de la Fase Móvil por los grupos ionizados de la Fase Estacionaria.


• EXCLUSION: Separación en función de tamaño molecular. Solutos más pequeños penetran más en poros de Fase Estacio-naria POROSA (tamiz molecular)



Fase estacionaria: Matriz inerte que contiene pequeños poros en los cuales pueden penetran más las moléculas más pequeñas y menos las más grandes.

La retención depende del tamaño de las moléculas solvatadas y del tamaño de los poros.


FASEESTACIONARIA

DETECTOR

FASE MOVIL

tm > retardo< retardo< retardo

COLUMNA


FASEESTACIONARIA

DETECTOR

FASE MOVIL

tm

COLUMNA


FASEESTACIONARIA

DETECTOR

FASE MOVIL


COLUMNA


FASEESTACIONARIA

DETECTOR

FASE MOVIL


COLUMNA


Señal

t

CROMATOGRAMA

INFORMACIÓN CUALITATIVA

INF

OR

MA

CIÓ

N C

UA

NT

ITA

TIV

A tM

0 1 2 3


Señal

t

CROMATOGRAMA


INF

OR

MA

CIÓ

N C

UA

NT

ITA

TIV

A tM tR1

0 1 2 3


Señal

t

CROMATOGRAMA


INF

OR

MA

CIÓ

N C

UA

NT

ITA

TIV

A tM tR1 tR2

0 1 2 3


Señal

t0 1 2 3

CROMATOGRAMA


INF

OR

MA

CIÓ

N C

UA

NT

ITA

TIV

A

tM

tR1

tR2


Señal

t0 1 2 3

CROMATOGRAMA


INF

OR

MA

CIÓ

N C

UA

NT

ITA

TIV

A

tM

tR1’tR2’

tR1

tR2

tR ’ = t

R- t

M


Fase estacionaria

Fase móvil

PARAMETROS CROMATOGRAFICOS

I. Factor de Retención (Factor de Capacidad)

= tR – tM

tM

ktR = tiempo de retención

tM = tiempo muerto (to )

Como tR’ = tR- tM

= tR’

tM

k tiempo del soluto en Fase Estacionaria

tiempo del soluto no retardado en Fase Móvil

Idealmente, k’ debe estar entre 2 y 10. En la práctica 1< k < 20 es satisfactorio.



Para modificar k: En HPLC modificando la proporción de modificador

orgánico de la fase móvil

EN GC: Variando T°

= tR2’

tR1’

para tR2’ > tR1’

= k2

k1

para k2 > k1

o bien

II. Factor de Separación (Factor de Selectividad)

El factor de separación describe la migración de un pico presente en la mezcla en relación al otro que sufre menos retardo > 1

recomendable que 1.1 < 1.5


= tR2’

tR1’


= k2

k1

para k2 > k1

Columna C-1

Columna C-8

o bien

(2,1) = 1.6

(2,1) = 2.1



= tR2’

tR1’


= k2

k1

para k2 > k1

¿ Es igual la calidad de la separación en casos A y B ?

o bien


= tR2’ ( cte)

tR1’ (cte)


Señ

al

t0 1 2 3 4

tR2

k y constantes, perocalidad separación no es constante

tM

tR1

Si tM, tR1 , tR2 = constantes

III. Eficiencia

N = Número de Platos Teóricos

h

w

< ancho > eficiencia: deseable

h

w

> ancho < eficiencia: NO deseable


Eficiencia N


Señ

al

t01 2

3

tR2

h

16 tR

wb

N =wb = ancho de pico

en la base

= 4

[ ]2


Eficiencia N


Señ

al

t01 2

3

tR2

h

5,545 tR

wh

N = [ ]2 wh = ancho de pico

a mitad de altura

16 tR

wb

N =wb = ancho de pico

en la base

[ ]2


N = 14

HETP = 2

HETP

N = 28

HETP = 1

HETP

HETP = 4

N = 7

HETP

> N,< HEPT = Mayor eficiencia

< N, > HEPT = Menor eficiencia

Altura Equivalente de Plato Teórico (HETP)Sección eficaz responsable de un equilibrio de intercambio

= L N

HETP

L = largo columnaN = número de platos teóricos

HE

TP

Fase móvilFase móvil

Fase estacionaria

L


A: Efecto de camino múltiple o de laberinto

HETP = A + B/ + C .

Ecuación de van Deemter

velocidad lineal media de lafase móvil

MMM

M

M

M

• A depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de separación > Eficiencia con partículas pequeñas de tamaño uniforme

• A NO depende del flujo de fase móvil

A = 2 . dp

=factor de empaque

dp = diámetro de partícula


A:Efecto de camino múltiple

MMM M

M

M

HETP = A + B/ + C .



• A depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de separación > Eficiencia con partículas pequeñas de tamaño uniforme

Forma partículaPartículas irregulares > A < eficiencia

Partículas esféricas < A > eficiencia

Incidencia Tamaño partícula


B: Difusión longitudinal o axial

HETP = A + B/ + C .



t1


B: Difusión longitudinal o axial

B depende de:• DM= Coeficiente difusión soluto en Fáse Móvil: mucho >

en un GAS que en un líquido + importante en GC que en HPLC

• = Factor de obstrucción o tortuosidad (sólo en columnas empacadas, 0 en columnas capilares)

HETP = A + B/ + C .



t1 t2

B/ depende del flujo a >< contribución de B/ a la

HETP > Eficiencia

Difusión longitudinal aumenta a medida que analitos permanecen más tiempo en la columna


C: Resistencia a la transferencia de masaC: Resistencia a la transferencia de masa

HETP = A + B/ + C .



Equilibrio

No equilibrio

• Término C Ec. van Deemter se refiere a la transferencia de masa del analito hacia y desde la Fase Estacionaria.

C * : aumenta directamente con el flujo

a > > C y < Eficiencia

Distribución del analito en situación de:


Efecto del flujo sobre el ensanchamiento del peak cromatografico

HETP= A + B/ + C*

HETP

C*A

B/

Global

Flujo óptimo

Crom. de Gas

Incidencia B mucho menor en Cromatografía Liquida que Gaseosa, pues DM es < en un líquido que en gas, pero Transf. Masa en Fase Móvil (Cm) adquiere > importancia.

HETP

Crom. Líquida


PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO:

RESOLUCION: Medida cuantitativa de las separación entre dos analitos contiguos en el cromatograma, considerando los anchos de los peaks en sus bases.

Señ

al

tR2- tR1



2 tR2 – tR1

wb1+ wb2

Rs=

Wb1 y Wb2 = ancho en la

base de dos picos vecinos

Rs = Resolución

Señ

al

tR2- tR1

RESOLUCION: Medida cuantitativa de las separación entre dos analitos contiguos en el cromatograma, considerando los anchos de los peaks en sus bases.



2 tR2 – tR1

wb1+ wb2

Rs= Wb1 y Wb2 = ancho en la

base de dos picos vecinos

Ecuación Maestra de la Cromatografía

Rs = Resolución

Si Wb1 ≈ Wb2

Rs = ( ) - 1

( ) k k + 1 ( )√

4N

Rs = 1,0 —> 97,9 % separación

= 1,25 —> 99,4 % separación = 1,5 —> 99,7 % separación > 2,0 —> separación TOTAL

Si dos picos vecinos tienen tamaño similar


Influencia de la eficiencia sobre la resolución cromatográfica

N = 712Rs=1.0

N= 1.600Rs=1.5

N = 2.844Rs=2.0

N = 11.344Rs=4.0

1:1 1:4 1:16

Rs=1.25

Rs=1.0

Rs=0.8

Rs=0.6

1:1 2:11:1 4:1 8:1 16:1 32:1

Resolución vs. proporciones de área de 2 picos vecinos

98 %

99,7 %

Total

Total


Influencia de factor de separación)sobre la resolución

cromatográfica

= 1.25Rs (3,4) = 2.0

= 1.15Rs (3,4) = 1.2

D. von Baer 2002

C8

C18

Factor de Asimetría (Tailing)

T = b0,1 / a0.1

(definición IUPAC)

T idealmente = 1, en la práctica T > 1


Nunca la primera separación es la mejor







Separaciones DEBEN OPTIMIZARSED. von Baer/C. Mardones 2008

Documents

introduccion a la cromatografia