INTRODUCCIÓN A LA HISTOLOGÍA

MVZ Yolanda Romero Sánchez

Microscopía óptica

El microscopio óptico o compuesto es un elemento esencial para los

estudios generales de histología ya que nos permite observar las diferentes características morfológicas de las células y los tejidos. Se basa en el uso de lentes para aumentar los rayos de luz que atraviesan una muestra de tejido. Su invención se remonta al siglo XVII con los trabajos de Anton Van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (muestra o espécimen). Al uso de una única lente convexa se conoce como microscopio simple, aquí se incluye también la lupa.

Figura 1

Durante estos siglos los avances en la microscopía son muy notorios principalmente en la perfección y la calidad de su principal elemento, las lentes, las cuales aumentan la imagen de las secciones de tejido y permiten hacer visibles al ojo humano detalles nítidos que de otra manera sería imposible observar.

Los microscopios ópticos tienen un límite máximo de resolución 0.2 µm. El poder de resolución es la distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos. Este límite viene determinado por la longitud de onda de la fuente de iluminación, en este caso la luz visible.

Los microscopios básicos contienen normalmente dos lentes: el objetivo y el ocular. El primero recoge la luz que atraviesa la sección de tejido, mientras que el ocular es el que forma la imagen que observamos. El aumento total que permite un microscopio óptico se calcula multiplicando la magnificación que producen el objetivo por la que producen los oculares. Por ejemplo, si estamos usando un objetivo de 40X (aumenta 40 veces) y un ocular de 10X (aumenta 10 veces), el resultado final será de 400X, es decir, vemos la muestra aumentada 400 veces. Usando microscopios ópticos avanzados se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100X más oculares de 10X o 15X).

Tipos de microscopios ópticos o compuestos

-vertical, -invertido, estereoscópico, -quirúrgico, -fotónicos especiales:*de campo oscuro, *luz ultravioleta, *fluorescencia, *polarización, *de contraste de fase, *interferenciales. Partes de un microscopio

Un microscopio óptico básico o simple está formado por las siguientes partes: - Oculares -Diafragma - Objetivos -Lámpara luminosa - Platina -Macrométrico y micrométrico - Condensador

Figura 2

Las cuales se engloban en tres sistemas: * Mecánico * De iluminación * Óptico *Mecánico.- Funciona como palanca que sostiene, eleva y detiene el objeto

a observar. Este sistema comprende el pie, el tubo, el revólver, la columna, la platina, el carro y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de iluminación; Además, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto. -Pie y soporte: Es la base sobre la que se apoya el microscopio y generalmente tiene forma de Y o bien es rectangular.

-Tubo: Tiene forma cilíndrica y se encuentra en la parte superior de la columna funcionando a través de un sistema de cremalleras que permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos.

-Revólver: Es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posición de trabajo y se nota por el ruido de un piñón que lo fija.

-Columna o brazo (asa): Es una pieza en forma de C. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. -Platina: Es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con nuestro tejido. Posee un dispositivo para sujetar al portaobjetos, el cual se puede desplazar en el plano de la platina en forma manual. Presenta un orificio en el eje óptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación. -Pinzas: Son dos piezas metálicas que sirven para sujetar la preparación. Se encuentran en la platina. -Tornillo macrométrico o macroscópico: Permite el enfoque rápido de la preparación variando la distancia de la muestra a la lente del objetivo, mediante movimientos ascendentes y descendentes de la platina. -Tornillo micrométrico o microscópico: Permite el enfoque exacto y nítido, es decir ajustes finos de la preparación con movimientos casi imperceptibles. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm., que sirve para precisar sus movimientos y poder medir el espesor del objeto.

*De iluminación.-Su finalidad es dirigir la luz natural o artificial para iluminar la preparación u objeto a observar en el microscopio de manera adecuada. Está constituido por: fuente de iluminación, espejo, diafragma, condensador. -Fuente de iluminación: es la encargada de proporcionar la luz que atraviesa la sección de tejido, a través de una lámpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en versiones más modernas con leds. El haz de luz emitido atraviesa el diafragma, el condensador, la muestra y tras ello penetra por el objetivo y atraviesa los oculares hasta nuestros ojos. La intensidad de la fuente luminosa se puede regular mediante un reóstato. -Espejo: Los microscopios modernos sustituyen el espejo por una lámpara.

Figura 3

Recorrido de la luz desde la fuente, a través de los diferentes lentes de un microscopio básico, hasta el observador. -Diafragma: se sitúa entre la fuente luminosa y el condensador. Formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo, aumentando el contraste de la muestra y la profundidad de campo, es decir el espesor de la muestra que está enfocando. -Condensador: Es un dispositivo que contiene una lente (diafragma-iris), que concentra y focaliza la luz proveniente de la fuente sobre la sección de tejido. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, cerrándolo más de lo conveniente si se quiere aprovechar la resolución del sistema óptico.

*Óptico.- Es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes que lo componen y funciona por medio de filtros llamados de “antigel subsecuente”. Está formado por: el ocular y los objetivos. -Oculares.- Se encuentran situados en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercanía de la pieza con el ojo del observador. Tiene como función aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micrométrica; estos últimos tienen la finalidad de medir el tamaño del objeto observado. Todos los microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo, por lo tanto se llaman binoculares. A los que tienen una sola lente se les denomina monoculares. Hay microscopios más avanzados en donde tanto el objetivo como el ocular suelen estar compuestos por varias lentes. En los microscopios más básicos al menos uno de los oculares puede regularse, alejarse o acercarse al objetivo. Esto permite ajustar el enfoque a las condiciones de visión, dioptrías, de cada observador.

-Objetivos.- Son las lentes que reciben la imagen directamente de la sección histológica. Se disponen en una pieza giratoria denominada revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos a observar. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión. Las magnificaciones más usadas de los objetivos secos en un microscopio básico suelen ser de 10X, 20X y 40X. El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro ó aceite de inmersión entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

Figura 4

PROCESO Y TECNICA HISTOLOGICA EN CORTES POR PARAFINA (MÉTODO DE RUTINA)

Es el conjunto de procedimientos y técnicas de laboratorio aplicados a un tejido (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los diferentes tipos de microscopios. Existe una gran variedad de métodos y técnicas para cumplir con este objetivo, y se elegirán de acuerdo a las características morfológicas de los tejidos que se deseen observar.

De manera general, para alcanzar este objetivo, se deben cumplir los siguientes pasos: -toma u obtención del tejido -fijación -proceso de deshidratación, aclaración e infiltración en parafina -inclusión en parafina -corte -coloración o tinción -montaje

Toma u obtención de la muestra De un animal vivo (biopsia) De un cadáver (necropsia)

Fijación Definición: preservar las características morfológicas y moleculares de un tejido lo más parecidas posibles a las que poseía en estado vivo, evitando procesos degradativos: autolisis (acción de enzimas intracelulares “autodigestión”) y putrefacción (acción bacteriana)

Características de un buen fijador -Rápida velocidad de penetración.- determinada por el tamaño del tejido -Velocidad de fijación.- determinada por las propiedades químicas del fijador y del tiempo de fijación -Que sea de rápida difusión: que fije tanto la porción superficial como la parte más profunda del tejido confiriéndole un endurecimiento adecuado -Que sea de fácil manipulación -Que no disuelva los componentes celulares - Que sea fácil de conseguir y que sea barato

Clasificación de los fijadores -Por su forma de preparación y uso -Por su acción fijadora en el tejido.

Por su forma de preparación y uso Fijadores simples.- alcohol, ácido acético, ácido pícrico, formaldehido. Fijadores compuestos.-mezclas fijadoras en las que se utilizan más de una substancia fijadora.- Bouin, carnoy, formalina

Por su acción fijadora en el tejido Coagulación de proteínas: etanol, metanol, acetona, acido pícrico Precipitación de proteínas: formaldehido, glutaraldehído, tetróxido de osmio y en ambas insolubilizando las enzimas para mantener la morfología del tejido

Formaldehido (H2CO) Características: Es un aldehído conocido también como metanal Es un gas incoloro de olor picante Muy soluble en agua Licua en recipiente cerrado a -19°C, alcanzando una concentración final del 40% p/v. Emite vapores muy irritantes para las conjuntivas y la mucosa respiratoria Se emplea en solución al 10% (formalina al 10%) como fijador.

Formalina al 10% Es un fijador simple considerado como la substancia fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan técnica histológica. Se obtienen mejores resultados de fijación usando formalina bufferada al 10% (10 ml. de formaldehído por 90 ml. de agua), provocando coagulación de las proteínas. Posee un buen poder de penetración y de difusión, manteniendo de manera adecuada la estructura y facilita la coloración posterior de los componentes celulares y tisulares. El tiempo promedio de fijación es de entre 24 a 48 hrs. como mínimo dependiendo del tamaño de las muestras. Se le considera un Fijador Universal por reunir la mayoría de las cualidades esenciales que debe tener un fijador, ya que permite realizar técnicas de rutina, como también métodos enzimo e inmunohistoquímicos, PCR e Hibridación in situ, entre otras. Proceso de deshidratación, aclaración e infiltración en parafina

Las muestras fijadas se someten a un proceso paulatino de deshidratación (extracción de agua) para poder incluirlas en parafina. Esta deshidratación se realiza con alcoholes etílicos graduales crecientes hasta terminar en pasos de alcohol etílico absoluto para asegurar la completa extracción de agua del tejido. Se continúa con el paso de aclaración del tejido en sustancias que sean miscibles o intermediarias entre los alcoholes y la parafina (solventes como el xileno) que nos ayudan a disminuir los índices de refracción provocados por la acción de los alcoholes sobre los tejidos y poderlos sumergir en parafina líquida fundida a 56-58°C, y que corresponde al paso de infiltración en parafina, en dónde los tejidos adquieren cierta dureza para posteriormente proceder a la inclusión en parafina.

Este proceso se puede realizar en forma automatizada (procesador de tejidos o histoquinette) o en forma manual y dura entre 18-24 hrs. En la inclusión, el órgano procesado se sumerge en parafina líquida (para uso histológico con punto de fusión entre los 56-60°C) para formar un bloque que permita cortar al tejido en secciones muy delgadas que puedan ser observados al microscopio. Las secciones delgadas o “cortes” (5-6 micrómetros o micras) se obtienen utilizando instrumentos mecánicos denominados micrótomos y adhiriéndose a portaobjetos para posteriormente teñirse. En la figura 5 se muestra un esquema a grandes rasgos de este proceso

Figura 5

La mayoría de los tejidos son incoloros y por ello necesitamos teñirlos o colorearlos para observar sus características morfológicas. Las tinciones generales están basadas en el uso de colorantes que son sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades químicas. Se utilizan en forma general para teñir a las células y componentes celulares de secciones de tejido incluidos en parafina que

van a ser observados con el microscopio óptico. Las moléculas de los colorantes poseen tres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos radicales: cromóforo.-que aporta el color y el auxocromo.- permite la unión a elementos del tejido. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se denomina cromógeno.

Los colorantes se clasifican según la naturaleza química tanto del cromóforo como del auxocromo. Radical cromóforo.- nitrosos, ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas, entre otros. Radical auxocromo: Básicos, ácidos, neutros, indiferentes. *Básicos.- Son sales en la que la base aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora. Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN y ciertos componentes de la matriz extracelular como los glucosaminoglucanos, el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr que es muy abundante en los ribosomas y el retículo endoplásmico rugoso y ciertas matrices extracelulares ricas en componentes ácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, azul de metileno y la hematoxilina. *Ácidos.- Son sales con el anión coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y también el colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos de estos colorantes son la fucsina ácida, verde rápido naranja G y la eosina. *Neutros.-poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad de aportar color, es decir que son capaces de teñir tanto básicas como ácidas de los tejidos, ejemplo, eosinato de azul de metileno. *Indiferentes.- tienen la capacidad de disolverse en los elementos de los tejidos, como los lípidos contenidos en los adipocitos, ejemplo, sudán.

Existe una gama muy extensa de tinciones en histología para poner de manifiesto los componentes y estructuras de los tejidos, pero nuestro interés se enfoca principalmente en la coloración de Hematoxilina y Eosina (H-E) por ser la coloración de rutina o más utilizada en los laboratorios de proceso histológico e histopatológico. Tinción de Hematoxilina-Eosina (H-E) Es la técnica de coloración más usada en los laboratorios de proceso histológico, ya que las características de sus radicales ponen de manifiesto los componentes y las estructuras tanto básicas como las ácidas de los tejidos. En esta coloración, la hematoxilina que es un colorante básico o catiónico, tiñe en color azul los elementos celulares ácidos y por tanto se les denomina basófilos, en tonos azul y púrpura (ácidos nucleicos) que son los componentes básicos de los núcleos de las células. La eosina es un compuesto ácido (es decir con

polaridad negativa) lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva. Por ello colorea componentes y organelos citoplasmáticos, colágena y fibras musculares y por ello se les denomina acidófilos o eosinófilos.

La técnica en general consiste de los siguientes pasos: 1.-Desparafinado en xileno 2 pasos de 10 min. c/u 2.-Hidratación en alcohol absoluto, alcohol al 96%, alcohol al 80%, alcohol 70% 3 minutos en cada uno. 3.- Lavar en agua destilada 4.- Hematoxilina de Harris 10min. 5.- Lavado en agua corriente 5 min. 6.- Diferenciación en alcohol ácido paso rápido 7.- Lavado en agua corriente 3 min. 8.- Sumergir en agua amoniacal hasta que las secciones se vean de un color Azul brillante 9.- Lavar en agua corriente 10 min. 10.- Eosina alcohólica 3-5 min. 11.- Deshidratación en alcohol al 96% 2 pasos de 1 min. c/u 12.- Alcohol absoluto 2 pasos de 2 min. c/u 13.- Xileno 2 pasos de 5 min. c/u 14.- Montaje con resina sintética

El resultado final de esta técnica lo podemos observaren la figura 3 donde observamos en A un corte teñido exclusivamente con hematoxilina, en B un tejido teñido exclusivamente con eosina y en C el resultado de la combinación de estos dos colorantes.

Figura 6

En el curso de patología general se observarán coloraciones específicas que muestran diversas alteraciones patológicas o ponen de manifiesto algunos microorganismos: Gram (demostración de bacterias gram positivas y gram negativas), Ziehl-Neelsen (evidencia al micobacterium tuberculosis), Gomori-Grocott (demostración de hongos), Azul de prusia o Perl´s (demostración de hemosiderina), Tricrómica de Masson (alteraciones de los tres tejidos fundamentales).

Describiremos en forma breve los fundamentos de cada una de estas

coloraciones:

Coloración de Gram.- Una proporción importante de bacterias puede dividirse en dos grandes grupos: grampositivas (se observan de color azul- debido al colorante cristal violeta) y gramnegativas (pierden el cristal violeta y conservan la safranina – se aprecian de color rojo o rosado). La técnica se basa en las diferencias físicas fundamentales de la pared celular y emplea colorantes catiónicos (cristal violeta y safranina), que se combinan con elementos cargados negativamente. Las bacterias grampositivas cuentan con tres capas externas: cápsula (en algunos casos), pared celular gruesa y membrana citoplasmática. Las bacterias gramnegativas presentan cápsula (algunas), una pared celular delgada, membrana externa (que equivale al lipopolisacárido) y una membrana interna (citoplasmática). La pared celular le da forma a la bacteria y su composición varía entre bacterias. En bacterias grampositivas consiste de varias capas de peptidoglucano (formado por los azúcares N-acetilglucosamina más N-acetilmurámico y un tetrapéptido) que retiene el cristal violeta utilizado en la tinción de Gram; otros componentes de la pared incluyen redes de ácido teitoico y ácido lipoteitoico. Las bacterias gramnegativas cuentan con dos membranas (una externa y una interna) así como una capa delgada de peptidoglucano entre ambas, en un espacio llamado periplásmico.

Figura 7

Coloración de Ziehl-Neelsen (BAAR).- El Mycobacterium es un bacilo aerobio obligado, sin movilidad, de crecimiento muy lento. No produce cápsula de polisacáridos. Su envoltura celular es poco usual. Partiendo del interior hacia el exterior, presenta una membrana citoplásmica cubierta por una capa extensa de peptidoglicanos unidos a polisacáridos, los cuales se encuentran esterificados con los ácidos micólicos (60% del peso de la pared celular), formados por lípidos libres, glucolípidos y peptidoglucolípidos; tal estructura, que le brinda una apariencia cerosa, le confiere una alta hidrofobicidad, resistencia a la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia/bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR; también presentan resistencia a detergentes, a un buen número de antibióticos y a las tinciones habituales. La coloración clásica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Figura 8

Método de plata metenamina de Grocott (Gomori-Grocott).- Es la tinción especial más empleada para hongos. La reacción tintorial está basada en que, en presencia de ácido peryódico, los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; éstos a su vez, reducen el complejo nitrato-plata metenamina produciendo una coloración de café a negra, debido al depósito de plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos

Figura 9

Coloración de azul de Prusia (Perls).- Esta técnica sirve para detectar el

hierro que se localiza en las células en forma de gránulos de hemosiderina que es insoluble, pero no detecta el hierro contenido en la ferritina que es hidrosoluble. La reacción de Perls se basa en la liberación de los iones férricos asociados a proteínas mediante la acción del ácido clorhídrico, a su vez, los iones férricos liberados reaccionan con el ferrocianuro potásico formando un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico o azul de Prusia

Figura 10

Tricrómica de Masson.- Las tinciones tricrómicas son usadas frecuentemente para diferenciar entre colágeno y músculo liso en tumores e identificar incrementos en tejidos colagenosos en enfermedades como la cirrosis hepática. Hipotéticamente los ácidos usados en esta coloración (fosfotúngstico y fosfomolíbdico) forman enlaces salinos con sus grupos básicos uniéndose a muchas estructuras del tejido para ser teñidas selectivamente, particularmente el tejido conectivo, además se cree que actúen como medio de unión entre el colágeno y el azul de anilina que es el colorante que lo tiñe; la escarlata de Biebrich usada también para esta tinción, es un colorante ácido que tiñe todos los elementos acidófilos del tejido tales como el citoplasma y el músculo.

Figura 11

Interpretación y efectos de corte.

Para interpretar los cortes histológicos debemos tener conocimiento previo de las estructuras macroscópicas, es de mucha ayuda conocer como fue hecho el corte del órgano si fue un corte longitudinal, transversal u oblicuo, si fue solo una porción del órgano u el órgano completo, esto no es muy importante en órganos asimétricos como el bazo o el hígado donde la apariencia del órgano no es afectada por la dirección del corte, sin embargo por ejemplo en el intestino que es un órgano radialmente simétrico la apariencia si es afectada por la dirección del corte.

Debemos recordar que los órganos y sus componentes son estructuras tridimensionales que estamos observando en un corte bidimensional, las células son objetos tridimensionales con diferentes formas y tamaños, por ejemplo, algunas son largas y delgadas, otras cuboidales y esféricas u ovoides, como se observan depende tanto de su forma como de la manera que fueron cortadas. En la figura 12 podemos observar células fusiformes y columnares cortadas en diferentes planos y la forma que se nos presentan en un corte histológico, note que el núcleo puede o no estar incluido en ciertos cortes pero eso no indica que no esté presente en la célula.

Figura 12

En histología se examina estructuras multicelulares que tiene una amplia variedad de formas, algunas son huecas, algunas en rama, algunas son superficies, etc. La figura 13 y 14 muestran una variedad de estructuras tridimensionales y la forma en que presentan si se cortan en los diferentes niveles. Examine detenidamente. Estas figuras le ayudarán a comprender las situaciones que se encontrará en los cortes histológicos.

Figura 13

En la figura 14 podemos observar una ilustración del resultado del corte trasverso (4), oblicuo (1) y longitudinal (2, 3, 5, 6) de proyecciones e invaginaciones multicelulares. El plano 3 difiere de los otros porque pasa solo por la pared celular de la proyección y no por su luz por lo que la sección 3´aparece como una placa de células en lugar de una estructura hueca. También se debe ser consciente de que las estructuras a menudo pueden parecer sin relación a una

superficie u otra estructura, cuando en realidad si la tienen o forman parte de una sola estructura.

Compare los planos 5 y 6 con las secciones 5' y 6', en los que la continuidad de la invaginación con la superficie es evidente sólo en 6 y 6'. Aunque no es evidente a partir de una sola sección, tal continuidad podría hacerse evidente si se realizaran una serie ininterrumpida de cortes a través de toda la invaginación.

Figura 14

Artefactos.

Los artefactos o artificios en la técnica histológica son comunes y son el resultado de fallas o accidentes en el procesamiento de la muestra, tanto en la colecta, fijación, inclusión, corte y tinción de la misma, son de diversa índole y es importante aprender a reconocerlos para no distraer nuestra atención hacia ellos, a continuación se muestran y comentan los más comúnmente encontrados.

Precipitados de tinción.- Ocasionalmente las soluciones acumulan precipitados que se adhieren a la superficie del tejido en el momento de la tinción.

Separaciones (Espacios).- Los tejidos pueden ser sometidos a presiones excesivas, tensiones, o la contracción durante el procesamiento, lo que resulta en separaciones dentro del tejido.

Grietas.- Los tejidos altamente celulares, por ejemplo, el timo, el hígado, el páncreas y el bazo a menudo muestran numerosas grietas pequeñas a lo largo del corte.

Marcas de cuchilla (rasguños).- Estos defectos pueden ser causados por defectos en la cuchilla del micrótomo o por la acumulación de escombros en el filo de la cuchilla.

Pliegues o dobleces.- Se producen cuando las secciones de tejido no se difunden o montan adecuadamente en la superficie de la laminilla y son áreas que se superponen entre ellas.

Cuerpos extraños.- En algunas ocasiones cuerpos extraños pueden quedar atrapados o adheridos al tejido o en el medio de montaje, estos incluyen, fibras, pelo, polvo, etc.

Burbujas.- En algunas muestras se pueden apreciar pequeñas burbujas que se producen en el medio de montaje, y quedan atrapadas entre el portaobjetos y el cubreobjetos.

Referencias.

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