INTRODUCCION A LA PROTEINAS

Las proteínas son biomóleculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos.

Las proteínas proporcionan estructuras, catalizan reacciones celulares y llevan a cabo multitud de tareas. Su papel central en la célula queda reflejado en el hecho que la información genética se expresa en forma de proteínas. Existe para cada proteína un segmento de ADN que codifica la información que especifica su secuencia de aminoácidos.

FUNCIONES* Enzimas Proteínas variadas y altamente especializadas, con actividad catalítica para las reacciones químicas de las biomoléculas orgánicas en forma específica.

* Transporte Proteínas de transporte del plasma sanguíneo que fijan y transportan moléculas o iones específicos de un órgano a otro.- Hemoglobina: en los eritrocitos fija el O2 a medida que pasa la sangre pasa a través de los pulmones, lo transporta a los tejidos periféricos y allí lo libera para que participe en la oxidación de los nutrientes para la producción de energía.- Lipoproteínas: en el plasma transportan lípidos desde el hígado a otros órganos.- Proteínas de Membrana: adaptadas para fijar glucosa, aminoácidos u otras sustancias y transportarlas a través de la membrana.

* Nutrición y Reserva - Ovoalbúmina: proteína de la clara de huevo.- Caseína: proteína de la leche- Ferritina: en bacterias y en tejidos animales y vegetales almacenan hierro.

* Estructurales confieren la capacidad de moverse, contraerse, cambiar de forma.- Actina y Miosina: sist. contráctil del músculo esquelético y otras células no musculares.- Tubulina: forma los microtúbulos y estos actúan con la Dineina de los flagelos y cilios. Filamentos de soporte, que confieren fuerza o protección a las estructuras biológicas.- Colágeno: componente de tendones y cartílagos, posee una resistencia elevada a la tensión - Elastina: ligamentos, que se extienden en 2 dimensiones- Queratina: pelo, uñas, plumas

* Defensa contra la invasión por otras especies o protegen contra las heridas.- Inmunoglobulinas- Anticuerpos: fabricada por los linfocitos, pueden reconocer y precipitar o neutralizar bacterias, virus o proteínas invasoras.- Fibrinógeno- Trombina (enzimas): coagulación, impiden perdida de sangre al daño vascular.

* Regulación Hormonas: regulan la actividad celular o fisiológica.- Insulina: regula metabolismo glucocídico- Proteínas G: fijan GDP y facilitan la respuesta a muchas señales hormonales

NOMENCLATURASe suelen clasificar de acuerdo a los siguientes criterios:

* Según tamaño:Péptidos - Oligopéptidos: ( 2-10 aminoácidos) Ej: Aspartamo (2aa), Oxitocina (9 aa) - Polipéptidos: (10-100 aa) Ej: GlucagónProteínas: (1000-3000 aa)

* Según cantidad de cadenas polipeptídicas:Monoméricas: constan de una sola cadena, como la mioglobina, citocromo COligoméricas: constan de varias cadenas. Las distintas cadenas polipeptídicas se

llaman subunidades y se unen a través de enlaces no covalentes, y pueden ser iguales o distintas entre sí. Un ejemplo es la hemoglobina, formada por 4 subunidades.

* Según su forma:Fibrosas: Presentan cadenas polipeptídicas largas y una típica estructura segundaria.

Son insolubles en agua y en soluciones acuosas. Algunos ejemplos de estas son la queratina y colágeno. Por lo general, tienen funciones estructurales.

Globulares: Se caracterizan por doblar apretadamente sus cadenas en una forma esférica apretada o compacta. Ejemplo de éstas son la mayoría de las enzimas, anticuerpos, algunas hormonas, proteínas de transporte.

* Según su composición química:Simples u holoproteínas: Su hidrólisis sólo produce aminoácidos. Ejemplos de estas

son la insulina y el colágeno (fibrosas y globulares).Conjugadas o heteroproteínas: Su hidrólisis produce aminoácidos y otras sustancias no

proteicas “Grupo prostético” (sólo globulares).OJO= según las diapositivas las simples corresponden a las apoproteinas y las

holoproteinas serian las conjugadas.

PROTEÍNAS CONJUGADASCLASE GRUPO PROSTÉTICO EJEMPLO

Lipoproteínas Lipidos Β1-Lipoproteina de la sangreGlucoproteínas Glúcidos Ig GFosfoproteínas Grupo fosfatos CaseinaHemoproteínas Hemo (Ferroporfirina) HemogobinaFlavoproteínas Nucleotidos de flavina Succinato deshidrogenasa

Metaloproteinas He-Zn-Ca-Mb-Cu Ferritina- Calmodulina

ESTRUCTURA BASICA DE LAS PROTEÍNAS AMINOACIDOS

Existen 20 aminoácidos diferentes y todos ellos tienen una parte común en su molécula que consisten en un grupo amino (NH3) y un grupo ácido (COOH), unidos al mismo átomo de Carbono (Cα) . Se pueden representar como NH2-CHR-COOH, siendo R un radical o cadena lateral característico de cada aminoácido.

Existen 2 enantiómeros (imagen especulares no superponibles, pero que tienen las mismas propiedades físicas y químicas, excepto por la interacción con el plano de la luz polarizada) posibles, pero solo la forma L, se encuentra presente en las proteínas.

Neurotransmisores: GABA (derivado de glutamina)- Serotonina (triptófano)Hormonas : Tiroxina (tirosina) - Acido indol acético (triptófano) Intermediarios metabólicos: Citrulina- Ornitina

Se clasifican según sus radicales R. Hay varios tipos:

ESTADO DE IONIZACIONLos aminoácidos pueden tener carga neta positiva, negativa o cero.Portan por lo menos 2 grupos ácidos débiles ionizables –COOH y –NH3

+.

* El grupo carboxilo de los aa se comporta como ácido:COOH COO- + H+ pKa

* El grupo amino, actua como base:NH3

+ NH2 + H+ pKb

A pH del plasma y líquido intracelular (7,4 y 7,1), predominan las formas COO- y NH3+.

Se utilizan como mensajeros o precursores o mensajeros metabólicos

APOLARES- Glicina- Alanina- Valina- Leucina- Metionina- Isoleucina

AROMATICOS- Tirosina- Triptofano- Fenilalanina

ACIDOS- Ac. Aspártico- Ac. Glutámico

POLARES- Serina- Treonina- Cisteina- Prolina- Aparagina- Glutamina

BASICOS- Arginina- Histidina- Lisina

Aminoácidos proteicosAminoácidos no Estándar

Aminoácidos

Aceptores de protones:COO-

NH2

Las fuerzas relativas de los ácidos débiles son expresadas en términos de sus constantes de disociación de ácidos pKa

pK1 (carboxilo) 2-3 Si el pH ↓ 2-3 el grupo carboxilo estará protonado.Si el pH ↑ 2-3 el grupo carboxilo estará desprotonado.

pK2 (amino) 9-11 Si el pH ↓ 9-11 el grupo amino estará protonado.Si el pH ↑ 9-11 el grupo amino estará desprotonado

PUNTO ISOELÉCTRICO (PI)Existe un valor de pH característico para cada aa, en el cual la disociación de cargas

positivas y negativas se iguala y por lo tanto, la carga total del aa es nula. A este valor de pH se le denomina punto isoelectrico (pI) y el aa se encuentra en la forma de Zwitterion.

Corresponde al valor medio de los pKa que se encuentran a ambos lados de la especie isoeléctrica.

- Para aa neutros corresponde al valor medio de los pK1 y pK2. Existen solo 2 grupos disosiables

Ej: pI para la Alanina Si pK1= 2.35 y pK2= 9.69 pI = 2.35 + 9.69 = 6.02

2

- Para aa ácidos o básicos, depende de cada caso. Tomandose los valores más cercanos. Existen más de 2 grupos disosiables

Ej: pI para el Ac. Aspártico Si pK1= 2.09, pKr = 3.86 y Pk2= 9.82pI = 2.09 + 3.86 = 2.98 2

FORMACIÓN DEL ENLACE PEPTÍDICO

pH bajo, la mayor parte de los grupos disociables estarán protonados, y por lo tanto habrá un gran número de cargas positivas en la proteína

pH elevado, los grupos disociables no estarán protonados, con lo cual habrá mayor número de cargas negativas

Neutro

Hoja plegada

Hoja plegadaHélice alfa

Hélice alfa

Aminoácidos

Los L-α-aminoácidos se unen mediante enlaces peptídicos, para formar los péptidos.La unión entre dos aminoácidos, se establece

entre el grupo carboxilo (-COOH) de un aminoácido y el grupo amino (-NH2) del aminoácido inmediato, con la pérdida de una molécula de agua.

El enlace peptídico tiene un comportamiento similar al de un enlace doble, es decir, presenta una cierta rigidez que inmoviliza en un plano los átomos que lo forman Corresponde a una reacción de condensación.PROPIEDADES • Es rígido y planar.• Tiene carácter parcial de doble enlace.• Equilibrio de estructuras resonantes.• No tiene libertad de giro.• Es mas corto que otros enlaces C-N.• Se presenta normalmente en transformación “Trans”.• Los grupos C=O y N- H son polares y participan en la formación de puentes de hidrógeno.

ESTRUCTURAS DE LAS PROTEINASLa organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales.

• Es la secuencia específica y ordenada de aa que componen la cadena polipeptídica de una proteína. • Los aa como ya vimos están unidos por enlaces covalentes: enlace peptídico o amida.• Las proteínas homólogas tienen secuencias y funciones semejantes. • La comparación de secuencias permite establecer relaciones evolutivas.• Las mutaciones corresponden a variaciones en la secuencia:

Formación de un grupo amida.

paralela

▪ Los aa invariables son importantes para la función. ▪ Las mutaciones conservadoras son cambios entre aa químicamente semejantes. ▪ Hay mutaciones que se relacionan con enfermedades a nivel molecular Patología molecular

• Es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio (Plegamiento).• Se logra gracias a la capacidad de giro de sus enlaces que van adquiriendo una disposición espacial estable• El carácter de doble unión parcial entre el grupo carbonilo al nitrógeno α de la unión peptídica restringe de manera significativa las conformaciones posibles, debido a impedimentos estéricos entre los grupos –NH, -CO y R.• Lo rotación sólo puede darse alrededor de las uniones entre el Cα y el carbono carbonilo (Co) y al nitrógeno.• Por lo tanto depende de los valores de Φ y Ψ:

Angulo alrededor de la unión Cα -N fi (Φ) Angulo alrededor de la unión Cα – Co psi (Ψ)

• El Diagrama de Ramachandran ilustra las conformaciones permitidas que caracterizan a los dos tipos de estructura: ▪ hélice α ▪ lámina β antiparalela• Las conformaciones más favorables dependen de la secuencia de aa y se estabilizan por enlaces no covalentes:

▪ Puentes de Hidrógeno existe en un número muy elevado.▪ Interacciones Hidrófobas o van der Waals aa con cadenas laterales apolares.▪ Interacciones Electroestáticas o Puentes salinos grupos carboxilo y amino.

Hélice α • La cadena polipeptídica se enrolla en espiral sobre sí misma debido a los giros producidos en torno al carbono alfa de cada aminoácido. Se mantiene gracias a los enlaces de hidrógeno formados entre el grupo -NH de un enlace peptídico y el grupo -C=O del cuarto aminoacido que le sigue.• En las proteínas no tienen lugar las hélices con giro hacia la izquierda.• Las cadenas laterales se dirigen hacia fuera, lo que permite una mínima repulsión y posibles interacciones entre ellas.• Casi todos los grupos peptídicos participan en los enlaces H.• Existen algunos residuos que desestabilizan la hélice α:

▪ Glicina No tiene R, por lo tanto otorga demasiada flexibilidad▪ Prolina restringe el giro de Φ; no tiene –NH para formar puentes de H.▪ Residuos voluminosos Triptófano

Hoja β

• En algunos casos existen enlaces covalentes:▪ Puentes disulfuro

• Conservan su estructura primaria en zigzag y se asocian estableciendo uniones mediante enlaces de hidrógeno entre –CO y –NH de cadenas adyecentes.• Las cadenas laterales se disponen perpendicularmente a la hoja.• Es una conformación simple formada por dos o más cadenas polipeptídicas β :

▪ paralelas que corren en el mismo sentido▪ antíparalelas que corren en direcciones opuestas

• Disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular, tridimensional• Se mantiene por enlaces no covalentes:

▪ Iónicos▪ Hidrofóbicos▪ Puentes de Hidrógeno▪ Fuerzas de Van der Waals

• Estructura compacta que excluye las moléculas de agua de su interior.

• En el interior se agrupan residuos hidrofóbicos y al exterior los grupos polares.• La ausencia de agua facilita las interacciones iónicas y los enlaces de hidrógeno.• Las proteínas grandes suelen presentar Dominios estructurales:

▪ Son unidades estructuralmente independientes que presentan características y funciones definidas como la unión con ligandos específicos.

▪ Otros ejemplos: Mano EF (configuración hélice-vuelta-hélice) se une a Ca++ Dedo de Zn en proteínas que unen ADN.

• Unión mediante enlaces débiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar así un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero.• Las subunidades se organizan de manera simétrica.• 4 protómeros por ejemplo forman la Hemoglobina (2α2β)• Proporcionan mayor estabilidad y regulación alostérica• Se estabilizan a través de las mismas fuerzas que la estructura terciaria.

DENATURACIÓN DE PROTEÍNAS• Consiste en la pérdida de la estructura terciaria, por romperse los puentes que forman dicha estructura. • Una proteína soluble en agua cuando se desnaturaliza se hace insoluble en agua y precipita. • Se produce por agentes que interfieren en las fuerzas de estabilización: variación de pH, temperatura, detergentes (hidrofóbicos), Mercaptoetanol (enlace disulfuro), agitación. • La estructura primaria se mantiene intacta.• En la estructura secundaria las proteínas pierden todos los patrones de repetición regulares como las alfa-hélices y adoptan formas aleatorias.• La mayoría de las proteínas biológicas pierden su función biológica, por ejemplo, las enzimas pierden su actividad catalítica, porque los sustratos no pueden unirse más al sitio activo.• Es un proceso que puede ser reversible

▪ La desnaturalización de ácidos nucleicos como el ADN por altas temperaturas, produce una separación de la doble hélice, que ocurre porque los enlaces puente hidrógeno se rompen. Los filamentos del ácido nucleico vuelven a unirse una vez que las condiciones "normales" se restauran, pero si las condiciones son restauradas demasiado rápidamente, las cadenas pueden no alinearse correctamente.

SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PARA ANALISIS

Se utiliza la Centrifugación que es el método más común de separación. En este método, el tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado.

Luego se aprovechan las propiedades de las proteínas en solución para separar mezclas de éstas basándose en su:

Tamaño (peso) molecular Solubilidad Carga eléctrica Afinidad biológica por otras moléculas.

Las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por:Cromatografía: separa los componentes de una mezcla por su afinidad relativa a 2

fases, una móvil y otra estacionariaElectroforesis: separa los componentes en base a sus características de carga y/o

tamaño.Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al

polo positivo, mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un gel de poliacrilamida. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida

► Diálisis Las proteínas globulares se separan en disolución utilizando una membrana

semipermeable para retener moléculas de proteína, permitiendo que las moléculas pequeñas de soluto y de agua las atraviesen.

► Ultrafiltración

Se utiliza la presión de la fuerza centrífuga para hacer pasar por una membrana semipermeable agua y moléculas pequeñas, reteniendo a las proteínas.

Tamaño

► Centrifugación en gradiente de densidad.Se usa una solución de sacarosa cuya concentración varía de 20 al 60%, se

puede separar una mezcla de proteínas, que al centrifugar, se separaran en bandas, según su tamaño, forma y densidad.

► Cromatografía de exclusión molecular Filtración en gelSe utiliza como matriz un gel con esferas que poseen poros en su interior, entonces las

moléculas pequeñas penetran en los poros, en cambio las moléculas grandes, incapaces de penetrar por los poros, solo se mueven entre las bolas, donde la velocidad de solvente es superior.

Como consecuencia, las moléculas de mayor peso, son eluidas antes.

► Precipitación con sulfato de amonio Las sales neutras afectan la solubilidad de las proteínas globulares:

A ↓ concentraciones, las sales↑ la solubilidad de las proteínas ya que se induce la ionización de los grupos R disociables de la proteína.

► Solubilidad diferencial por diferentes solventesAdición de solventes orgánicos con el agua, como lo son el etanol y la acetona

disminuye la solubilidad de la mayor parte de las proteínas globulares, de tal forma que precipitan.

 

► Cromatografía de Intercambio Iónico Se basa en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria.

En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes.

► Electroforesis según Enfoque IsoeléctricoSe separan las proteínas en un gel donde se ha establecido un gradiente de pH y

al aplicar el campo eléctrico, las proteínas van a migrar hasta la zona del gel donde el pH sea igual a su punto isoeléctrico y en ese punto se detendrá

Solubilidad

Carga Eléctrica

► Cromatografía de Afinidad

Los bolas del gel estan recubiertas de un ligando por el que tiene afinidad algunas de las proteínas a aislar. Al pasar la mezcla compleja, ésta proteína es retenida en la superficie de las bolas, fluyéndose las demas.

MÉTODOS PARA LAS DETERMINACIONES ESTRUCTURALES DE PROTEÍNAS

Difracción de Rayos-X (Cristalografia) sólidos, estructura tridimensionalEspectroscopia circular del dicroísmo Estructura 2riaEspectroscopia determinación de cantidades muy pequeñas Resonancia magnética nuclear(NMR) espectroscopia provee información acerca de los átomos

RELACIÓN ESTRUCTURA-FUNCIÓN

Las proteínas están compuestas por cadenas de péptidos que para poder desempeñar su función biológica deben plegarse de una determinada manera, adoptando una forma tridimensional estable. Cuando una proteína pierde su estructura tridimensional, por denaturación también pierde su función, provocando una PATOLOGIA.

La concentración de una proteína es el resultado de un balance entre la velocidad de síntesis y degradación de la misma.

Transporte de Oxígeno Hemoglobina (4 subunidades) – Mioglobina (1 subunidad)Una modificación en la estructura de la hemoglobina, como alteraciones en la cadena

beta de la hemoglobina puede provocar la pérdida de función de la misma. Por ejemplo:

► Anemia Mediterránea o Talasemia β: producción defectuosa de hemoglobina que lleva a una disminución en la producción y un aumento de la destrucción de los glóbulos rojos.

Afinidad

Infiltración en gel

Intercambio iónico

Cromatografía por afinidad

► Anemia Falciforme o Hemoglobina S: mutación en donde el Acido Glutámico es sustituido por Valina de la cadena B. Cuando la hemoglobina S se desoxigena disminuye su solubilidad y precipita dentro del hematíe y da lugar a la formación de una red gelatinosa, produciendo eritrocitos rígidos y en forma de hoz, con menor capacidad de transporte de O2

Otro ejemplo de alteraciones estructurales es la Proteína PrionSu acción patógena consiste en ser una forma modificada de una proteína natural

existente en el organismo que al entrar en contacto con las proteínas originales las induce a adoptar la forma del prión, que suele ser una forma anormal y disfuncional, todo ello en una acción en cadena que acaba por destruir la operatividad de todas las proteínas sensibles al prión.

PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Son todas aquellas proteínas que están presentes en el plasma y que ejercen presión osmótica, con lo que son parte importante en la distribución del agua entre el plasma y los líquidos titulares.

Para su análisis hay que tener en cuenta:

► Concentración de proteínas totalesVelocidad de síntesis o degradación proteicaCambios en el volumen de distribución

► Solo la variación de las proteínas plasmáticas mas abundantes (albúmina- Ig) tendrán un efecto significativo

Función ProteínaTransporte Albúmina,

Apolipoproteína, transferían

Inmunidad InmunoglobulinasManutención Pº Osmótica Todas, principalmente

AlbúminaEnzimas Renina,

Factores de CoagulaciónInhibidores de proteasas Antitripsina α1Regulación del pH (tampón) Todas