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1
Introducción a las técnicas de fluorescencia (2)
2
1. Ensayos de fluorescencia en cubeta (con ejemplos):
a. Características de los espectros de fluorescencia:Regla de la imagen especular, corrimiento de stokesb. Instrumentaciónc. Tiempo de vida.
Bibliografía general1. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Bernard Valeur,
Wiley-VCH
2. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Joseph Lakowicz. Plenum Press, New York
Temas de la clase pasada:
2
3
Temas de la clase de hoy:
a. Anisotropía de fluorescencia
b. Quenching (desactivación) de fluorescencia
c. FRET (Transferencia de energía por el mecanismo de Förster)
4
Anisotropía: Momento de una transición electrónica
fluoróforos
Luz polarizada linealmente: el vector E oscila en un plano determinado
Momento de la transición: durante una transición electrónica los e- se "desplazan": el momento dipolar del estado fundamental y el excitado puede ser distinto, generando un momento dipolar transitorio, asociado a la transición.
Para que se produzca la transición el momento de la transición debe tener un componente paralelo al plano de la luz polarizada
Fotoselección
excitación
3
5Bagatolli y col. Biophys J 1999
Para pensar: porqué la intensidad de fluorescencia no es homogénea?
Giant unilamellar vesicles (GUVs) marcadas con una sonda fluorescente lipídica que se intercala en la bicapa.Se observan por microscopía de fluorescencia con excitación por 2 fotones (por ahora no nos importa). Se utiliza un láser (polarizado) y sólo se detecta fluorescencia de el anillo central de la vesícula
6
Anisotropía de fluorescencia: Principios
Polarizador de excitación
Polarizador de emisión
Molécula fluorescente
Detector
4
7
Definición de anisotropía de fluorescencia (r)
⊥
⊥+−
=IIII
rll
ll2
muestra
Polarizador de excitación
Polarizador de emisión
-0.2 < r < 0.4 (para moléculas random)
⊥+= III lltotal 2
A veces se usa también el parámetro polarización (P)
⊥
⊥+−
=IIII
Pll
ll1
3
11
3
2 −
−=P
r
8
r
o/
rrφτ+
=1
Ecuación de Perrin
ro= anisotropía intrínsecaφr= tiempo de correlación rotacional τ = tiempo de vida de la sondaη= viscosidad V= volumen de la partícula (esférica)k= constante de Boltzmann T= temperatura v1 = volumen específico del H20 (1.0018 cm3/g)v2 = volumen específico de la proteína (0.73 ml/g)δ = grado de hidratación
proteínas esféricas
)(kTMr
kTVr 12 δν+νη≅η=φ
5
9
Aplicaciones: Determinación del volumen molecular
τη
+=
φτ+=
VkT
rrr oro1
11
11
r-1
T/η
ro-1
kτ/roV
11
Otras aplicaciones de anisotropía de fluorescencia:
Determinación del binding de calmodulina del péptido RS20(la secuencia del péptido correspondiente a la región de unión a calmodulina de la myosin kight-chain kinasa)
* El péptido tiene un residuo Trp (Cam tiene sólo 1 Tyr)
6
13
Determinación de anisotropía de fluorescencia (formato L)
Monocromador de excitación
muestra
Monocromador de emisión
detector
Fuente de excitación
Polarizadorde excitación
Polarizadorde emisión
Esquema de espectrofluorímetro
14
hh
hv
vhvvvhvv
II
G,GIIGII
r =+−
=2
⊥
⊥+−
=IIII
rll
ll2
Los monocromadores transmiten con distinta eficiencia luz polarizada vertical u horizontal.
Para el formato L:
Determinación de anisotropía de fluorescencia
7
15
Procesos intermoleculares que afectan a la fluorescencia
F* + Qk
products
16
Quencher (Q): molecule that provides a non-radiative path for deactivation of the fluorophore
Quenching: 2 posibles (pero no únicos) mecanismos
F* + Qkq
F + Q + heat collisional
F + QKs
F-Q static
no fluorescent
Como cambia la intensidad de fluorescencia en estos dos procesos?
8
17
Se puede explotar estos fenómenos para estudiar biomoléculas
Ejemplos:
18
Quenching dinámico
]Q[kIIo
oqτ+= 1 Stern-Volmer equation
Kd
F* + Qkq
F + Q + heat
F* kr
F + photon
F*knr
F
Io, in the absence of quencher
9
19
Quenching dinámico
La constante de quenching va a depender de la frecuencia y efectividad de los choques entre Q y F
kofk qq ⋅=
eficiencia del choque
R=radio de choque (Rf+Rq) [cm]Di= coeficiente de difusion de i [cm2/s]N = nro de Avogadroko = [M-1s-1]
20
Collisional Quenching: Applications
lipid vesicle
lisozyme
condition Kd (M-1)
buffer 7.8
PC vesicle 4
Gorbenko et al, Biophysical Journal 93:140-153 (2007)
acrylamide
10
21
Io, in the absence of quencher
Quenching estático
]Q[KIIo
s+= 1Stern-Volmer equation
F* kr
F + photon
F + QKs
F-Q
no fluorescente
F*knr
F
22
Diferencias entre quenching estático y dinámico
1) Tiempo de vida 2) temperatura3) alguna otra forma?
La forma de la curva es igual para dinámico y estático..como se pueden diferenciar?
11
23
Métodos radiométricos: determinación de [Cl-] por quenching
2 sondas en 1 molécula
aceptor de e-(quenchea por Cl-)
dador de e- (no se quenchea)
Jayaraman y col. Am J Physiol (1999)
27
FRET (Förster resonance energy transfer)
•Sirve para ver asociaciones•Medir distancias en el rango de los Å•Determinar cambios conformacionales•y muchas cosas más
En qué consiste FRET?
D*-Akt D-A*
Es un mecanismo de quenching, con propiedades muy interesantes
Ojo! no hay emisión y reabsorción de fotones! Es una interacción dipolar
12
28
Porqué es tan importante FRET en Biología?
61
=
τ rRkt o
oD
D* -Akt D-A*
Agregamos esta reacción a las anteriores y calculamos φt:
D* kr
D + photon
D*knr
D
Considerando una única distancia fija r entre D y A
66
6
rR
R
o
oT +
=φ
29
Resonance energy transfer
61
=
τ rRkt o
oD
66
6
rRR
kr)(knrkk
o
o
t
tT +
=++
=φ∑
1/τoD
D* + Akt
D +A*
D* D + photonkr
D* Dknr
τoD = donor lifetime, no acceptor
13
30
0 20 40 600.0
0.5
1.0
φ Tr (Å)
Ro
66
6
rR
R
o
oT +
=φ
Resonance energy transfer
Ro = Förster distance
range of FRET: 10-100 Å
El fenómeno de FRET ocurre a distancias moleculares
31
Orientationfactor
Overlap integral
∫∞
λλλελπ
φκ=
04
44
26
128
109000d)()(I
nN
)(lnR AD
A
oD
o
La distancia de Forster
14
32
∫∞
λλλελ0
4d)()(I AD
Integral de solapamiento
Fluo
resc
ence
Absorbance
λ
Para calcularla, normalizar el espectro de fluorescencia: ∫∞
=λλ0
1d)(ID
33
Factor de orientación
K2 = factor de orientación
K2 = 4 (colineales)K2 = 2/3 (random)K2 = 0 (perpendicular)K2 = 1 (paralelos)
φDA=ángulo entre los dipolos de emisión de D y de absorción de A (φT)φA(D)= ángulo entre el dipolo del A(D) de la transición y el vector de separación
15
34
0 20 40 600.0
0.5
1.0
φ Tr (Å)
Ro
66
6
rR
R
o
oT +
=φ
Resonance energy transfer
Ro = Förster distance
range of FRET: 10-100 Å
35
Consecuencias de FRET: estado estacionario
Donor
excitation
Acceptor
I
λ
� Fluorescence of the donor � Fluorescence of the acceptor (at λex, donor)Qué pasa con el τ del donor?
16
36
1. Fluorescencia del donor (evaluada a λD)
2. Fluorescencia del aceptor (evaluada a λem)
Estado estacionario
DoD
TI
I1−=φ
−
λλλλ
λλ=φ 1
)em,(I
)em,(I)(A)(A
AoA
D
AT
absorciónfluorescencia
D A
λ λemλD
37
Tiempo de vida del donor
0 10 20 300.0
0.5
1.0
Rela
tive
inte
nsi
ty
time (ns)
D
oD
tnrr
tT 1
kkkk
ττφ −=
++=
∑
with FRETD*+ A
ktD + A*
D* D + photonkr
D* Dknr
17
38
Aplicaciones 1: FRET en sensores biológicos
Kraynov y col, Science 2000
39
Aplicaciones 1: FRET en sensores biológicos
células que se mueven
célula quieta
alto FRET o I
bajo FRET o I
Kraynov y col, Science 2000
18
40
Aplicaciones 2: mecanismo de ATP sintasa
donoracceptor
ATP synthase
Zimmermann et al. EMBO J (2005)
ADP + Pi
ATP
H+
H+
donor (TMR)aceptor (Cy5 bis)
41
Aplicaciones 3: mecanismo de ATP sintasa
ATP síntesisATP hidrólisis
Zimmermann et al. EMBO J (2005)
19
42
Homo-FRET
fluoresceína
Hay solapamiento entre los espectros de absorción y emisión de la misma sonda, si el valor de k2 y r son los adecuados:
D + D* → D* + D
43
Homo-FRET
Cómo se detecta homo-FRET?
Intensidad?Tiempo de vida?Anisotropía?
20
44
Detección de la dimerización de Myo-VI en endosomas por Homo-FRET
Altman y col. Plos Biol 2007
endosomas