Investiga la vacuna del VIH

Taller de experimentaciónPROTOCOLO

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ResumenEl Instituto de Investigación del Sida IrsiCaixa está investigando una vacuna para proteger a las personas contra el virus del sida (VIH) y actualmente ya ha identificado a un candidato a vacuna, que se encuentra en proceso de desa-rrollo. Una de las principales dificultades a la hora de desarrollar la vacuna consiste en supe-rar la inmensa variabilidad del virus que circula por las distintas regiones del mundo. En este taller investigarás si la vacuna contra el VIH desarrollada por IrsiCaixa podría ser eficaz para proteger a la población de distintos conti-nentes.

IntroducciónMás de 33 millones de personas en todo el mundo están infectadas por el virus del sida, o VIH, y cada minuto se infectan seis nuevas personas. En la actualidad, ya disponemos de medicamentos para prolongar y mejorar la cali-dad de vida de las personas infectadas, pero no existe una cura definitiva ni tampoco contamos con una vacuna.

Hace más de 15 años que el Instituto de Inves-tigación del Sida IrsiCaixa investiga para desa-rrollar una vacuna y avanzar en la mejora de los tratamientos existentes. Mientras tanto, la mejor herramienta para combatir la pandemia es la prevención.

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Una vacuna es una sustancia que "enseña" a nuestro sistema inmunitario a reconocer virus o bacterias que causan enfermedades y defen-derse de ellos. Cuando nos vacunamos, nuestro sistema inmunitario reconoce los agentes de la vacuna como extraños y desencadena una respuesta contra ellos. De esta manera, cuando el microbio nos infecta, nuestro sistema inmu-nitario está preparado para responder.

1. La proteína candidata a vacuna estimula el sistema inmunitario para que produzca anti-cuerpos contra ella

2. Si un día la persona vacunada se infecta, ya tiene anticuerpos para luchar contra el VIH

3. Pero, si un día la persona vacunada se infecta con un VIH que tiene la proteína diferente, los anticuerpos generados por la vacuna no le ser-virían para luchar contra la infección

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La dificultad para desarrollar la vacuna contra el VIH radica en encontrar una vacuna que sea capaz de activar el sistema inmunitario para que elimine totalmente la infección causada por los millones de tipos de VIH que existen en todo el mundo.

Distribución de las distintas variantes de VIH-1 en todo el mundo. (Los Alamos HIV sequence Database, www.hiv.lanl.gov)

01 _ AE 13832 4,3 % 02 _ AG 9594 3,0 % A 22714 7,1 % B 199411 62,1 % C 42993 13,4 % DE 8465 2,6 % F 3050 0,9 % G 3909 1,2 % otros 17227 5,4 % - - - - - - - - - - - - total 321195 100,0%

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¿Cómo puedes participar tú en la investigación de la vacuna contra el VIH?

En este taller podrás investigar con una proteí-na del VIH que IrsiCaixa ha identificado como un posible componente de una vacuna para proteger a las personas contra ese virus. Se ha demostrado que, in vitro, esa proteína estimula la respuesta inmunitaria.

Actualmente, IrsiCaixa está realizando estudios in vitro para evaluar su eficacia y, si todo va bien, después se iniciarán fases de investigación más avanzadas que culminarán en pruebas con pacientes.

El objetivo del taller será averiguar si el can-didato a vacuna de IrsiCaixa será eficaz para proteger a las personas contra la inmensa variabilidad de tipos de VIH que circulan por las distintas regiones del planeta. ¿Tendremos que desarrollar diferentes vacunas para diferentes zonas del planeta?

Para investigarlo, tendrás que analizar si esta proteína está presente en variantes del VIH pro-cedentes de África, Asia y Europa.

Si está presente, la vacuna podría ser eficaz para prevenir la infección por estas variantes del VIH, ya que estimularía una respuesta inmuni-taria contra ellas. Por lo tanto, podría ser eficaz para proteger a la población de estos continen-tes.

Pero si alguna de las variantes no contiene la proteína candidata, entonces la vacuna no sería eficaz contra esta variante del VIH y habría que modificarla.

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Virus africano Virus asiático Virus europeo

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Objetivos

• Participar en el proceso de desarrollo de la vacuna del sida de IrsiCaixa, siguiendo las etapas de la metodología científica.

• Utilizar las técnicas de laboratorio que se uti-lizan en este campo de investigación, como la separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis o la segmentación de ADN por medio de enzimas de restricción.

• Investigar y familiarizarse con la inmensa variabilidad que posee el virus del sida.

• Comprobar si la proteína que IrsiCaixa ha identificado como posible candidato a vacu-na podría ser útil para estimular el sistema inmunitario de personas expuestas a las variantes mayoritarias del VIH de diferentes continentes: África, Asia y Europa.

Hipótesis

La proteína candidata a formar parte de una vacuna identificada por IrsiCaixa, no se ve modificada en la gran mayoría de variantes de VIH que existen en todo el mundo. Por lo tanto, una vacuna dotada de esta proteína debería ser igualmente eficaz para combatir la mayoría de las variantes de VIH que existen.

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Metodología

Trabajaremos con muestras de ADN de las tres variantes del VIH más comunes en tres conti-nentes: África, Asia y Europa.

También dispondremos de una muestra de ADN que contiene la información necesaria para producir la proteína candidata a vacuna de IrsiCaixa. Con estas muestras investigarás si las distintas variantes del VIH contienen la secuen-cia de ADN candidata.

ADN

ADN

ADN

ADN

Variante mayoritaria de VIH europeoProteína candidata

Variante mayoritaria de VIH asiáticoVariante mayoritaria de VIH africano

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TTTTA A CCC CT T TT GC

Para llevar a cabo esta investigación tendremos que desarrollar las siguientes tareas:

(A) Cortamos las cadenas de ADN de los virus de los tres continentes: Para ello, utilizaremos las llamadas enzimas de restricción, proteínas conocidas por los investigadores por su capaci-dad de cortar el ADN en zonas específicas. La enzima que utilizaremos corta específicamente el gen responsable de sintetizar la proteína candidata, pero no corta si ésta presenta alguna variación en la región de ADN en estudio. Por tanto, las muestras de ADN solo serán cortadas si tienen este gen conservado.

(B) Separamos los fragmentos de ADN: Con la ayuda de una técnica llamada electroforesis, vamos a separar los fragmentos de ADN resul-tantes de la digestión por las enzimas.

(C) Visualizamos los fragmentos de ADN: Visualizamos qué muestras de ADN han sido cortadas, y por tanto, qué variantes tienen la proteína candidata.

A

B C

T TA A A A A AAAG G G GC C

T TA A A A A AAAG G G G GC

T TA A A A A AAAG G G GC C

T TA A A A A AAAG G G G GC

TTTTA AG CCC

TTTTA A CCC C

T T TT GCTTTTA AG CCCT T TT GC

T T TT GC

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Resultados y conclusiones

Compararemos las secuencias genéticas de las distintas variantes de VIH, analizando el efecto de la enzima de restricción, y así identificaremos las diferencias entre sus ADN. Con esta infor-mación, podremos reflexionar sobre la inmensa variabilidad del VIH.

Con los resultados obtenidos podremos concluir si la proteína candidata de IrsiCaixa podría ser útil para proteger a la población de los distintos continentes, o si habrá que desarrollar diferen-tes vacunas, cada una adaptada a la secuencia del virus presente en cada área geográfica.

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Instrumentos y material de laboratorio

Instrumentos y materiales necesarios

Pipetas de 10 y 20 µl

Baño de agua y soporte para los tubos

Gel de agarosa

Rotulador para vidrio

Enfriador

Fuente de alimentación Cronómetro

Gradillas

Cubeta de electroforesis

3 contenedores (para teñir y limpiar el gel)

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Material fungible

Reactivos y disolventes *

Guantes y batas

ADN de virus de distintos orígenes

Tampón TAE500 ml de TAE 0,5x (3)

Tubos de 1,5 ml y/o 0,5 ml

Marcador de peso molecular (2)

Tampón de carga (4)

Líquido para teñir el ADN(Stain Fast 100x)

Puntas de pipeta

Enzima de restricción Nhel + tampón (1)

Agua destilada: 3 frascos de vidrio de 500 ml y un tubo de 1,5 ml.

(1) El tampón se usa para obtener un medio adecuado para la actuación de la enzima.

(2) El marcador lleva una etiqueta donde se indica: medidas de los diferentes fragmentos de entre 100 y 3.000 pares de bases.

(3) Para mantener el pH; también contiene sales para facilitar el paso de la corriente eléctrica (en concentración 0,5x para llenar la cubeta).

(4) Para dar color y densidad a las muestras y facilitar así su carga.

*Si queréis hacer este experimento en vuestro centro educativo o museo, poneos en contacto con divulgacio@irsicaixa.es para que os faciliten los reactivos necesarios.

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INTRODuCCIóN

Cortaremos los ADN de las tres variantes de VIH utilizando las llamadas enzimas de restric-ción, proteínas conocidas por los investigado-res por su capacidad de cortar ADN en zonas

específicas. La enzima que utilizaremos corta específicamente el gen responsable de sinteti-zar la proteína candidata, pero no corta si éste presenta alguna variación en la región de ADN en estudio. Por tanto, las muestras de ADN solo serán cortadas si tienen este gen conservado.

ProcedimientoA "Cortamos" las cadenas de ADN de los virus de los tres continentes +

TTTTA A CCC CT T TT GC

T TA A A A A AAAG G G GC C

T TA A A A A AAAG G G G GC

T TA A A A A AAAG G G GC C

T TA A A A A AAAG G G G GC

TTTTA AG CCC

TTTTA A CCC C

T T TT GCTTTTA AG CCCT T TT GC

T T TT GC

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PROCEDIMIENTO A

Preparamos con la pipeta los componen-tes de la reacción de digestión en cuatro tubos de 1,5 ml debidamente rotulados. Añadamos a cada tubo:

• Agua destilada 16 µl• Tampón para optimizar

la actuación de la enzima de restricción (color verde) 3 µl

• Enzima de restricción (en frío) 1 µl• Una de las cuatro muestras de ADN

(una de la proteína candidata y 3 de cada una de las variantes de VIH) 10 µl

Tapamos el tubo y sacudimos suave-mente con el dedo

Incubamos el tubo a 37 ºC durante 5 minutos para que la enzima de restric-ción corte el ADN

Pasados los 5 minutos, colocamos el tubo en el enfriador para detener la reacción de digestión

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INTRODuCCIóN

Para separar los fragmentos de ADN utilizare-mos la llamada electroforesis, una técnica muy utilizada en el laboratorio que nos permite se-parar los fragmentos de ADN según su longitud.

Para ello, las muestras de ADN se colocan sobre un gel poroso fabricado con una gelatina que se extrae de algas marinas. Para facilitar la colocación de las muestras y ver cómo se des-plazan, se añade un "tampón de carga" que les da densidad y color. El gel también se carga con un "marcador de ADN", que contiene fragmen-tos de ADN de medidas conocidas, para poder así deducir la longitud de los fragmentos de las muestras en estudio.

El gel se somete a una corriente eléctrica, de manera que en un extremo se queda concen-trada la carga negativa y en el otro la carga positiva. Como los fragmentos de ADN de forma natural tienen carga negativa, cuando los colocamos en un extremo del gel se desplazan atraídos por la carga positiva. La distancia que recorren los fragmentos a través del gel es pro-porcional a su longitud, de modo que los frag-mentos más pequeños podrán avanzar más que los fragmentos más grandes, que tendrán más dificultades para atravesar los poros del gel.

B Separamos los fragmentos de ADN cortados

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PROCEDIMIENTO B

Preparamos las muestras de ADN con tampón de carga: no hará falta añadir tampón de carga a las muestras digeridas con la enzima de restricción, porque el tampón de la enzima que hemos añadido antes ya llevaba incorporado un tampón de carga de color verde. Tomamos, pues, 3 tubos de 0,5 ml y les añadimos con la pipeta 2 µl del tampón de carga de color verde y 20 µl de la muestra original sin digerir. Estas muestras nos servirán de control.

Cargamos las muestras en los pocillos con la pipeta, en este orden:

• el primer pozo para el marcador de ADN (25 µl) • los tres siguientes para las muestras de ADN

de las variantes no digeridas (20 µl)• y los cuatro siguientes para las muestras

digeridas (primero el ADN del candidato y a continuación las muestras de las 3 variantes de VIH) (25 µl)

Colocamos el gel en el centro de la cubeta de electroforesis y con los pocillos en el extremo negativo. A continuación, llenamos la cubeta con la solución tampón TAE 0,5x, haciendo que caiga por los laterales para no romper el gel, hasta cubrirlo completamente.

Tapamos la cubeta y la conectamos a la fuente eléctrica a 130 V y 200 mA durante aproximadamente 20 minutos.

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Mientras el gel corre, practica: mapa de restricción

1. Identifica la/las secuencia/s diana de la enzima de restricción Nhel dentro de la secuencia completa del ADN de la proteína candidata

Secuencia completa del ADN candidato a vacuna:

3001 ...

... 1.400 pares de bases

330

360

340

370

350

380

310 320

400390 410

Secuencia diana de la enzima de restricción:

T T T T TT TA A A A A AG G GC C C C CC C CCC

G T

T

T T

T

T T

T

T T T T

T T TA A

A A

A

A

A A

A

A A

A A A AAG

G

G G

G G G G GG G

G G G G G G

C

C

C

C C C C C C CC C

C CCC

C

T AG GC C

A

A

A

A A A AA A A

A AAA A A

A A A A A A

A

GCT

T

T

TT T T T T

T T TT T T T T T

T T T T

T

G

G

G GG G G G G G G G

G G GG G

GGGGGG

G G G G G

C

C

C

C C C

T T T T T T T TTA AA A AAA A AGG G GGGC C CC CC

AAA A A A A A ATTT T TTTTTG G G G GGC C C C C C

C

CCCCC C C C C

C C C C C

C

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2. ¿Cuántos fragmentos de ADN obtendremos si la enzima encuentra su diana y corta el ADN? ¿De qué medida?

4. ¿Cómo crees que el marcador de ADN te ayudará a identificar las medidas de los fragmentos que obtendrás?

6. ¿Cuántos fragmentos de ADN obtendríamos si hubiéramos utilizado esta otra enzima? ¿De qué medida?

3. ¿Cuántos fragmentos de ADN obtendremos si la enzima NO encuentra su diana y NO corta el ADN? ¿De qué medida?

5. Identifica la/las secuencia/s diana de la enzima de restricción EcoRV dentro de la secuencia completa del ADN de la proteína candidata:

(En el experimento hemos utilizado la enzima Nhel porque la zona donde corta es la que nos interesa estudiar, dado que es la que es más efectiva a la hora de estimular el sistema inmunitario)

T TA AG C

A A GT TC

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Practica: observa cómo está corriendo el gel de electroforesis

7. ¿Por qué se separan los fragmentos? ¿Cómo separa los fragmentos la agarosa?

8. ¿Qué carga tiene el ADN? ¿Qué hubiera pasado si hubieras conectado los electrodos al revés?

9. ¿Qué visualizas? ¿Por qué has añadido el tampón de carga?

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INTRODuCCIóN

En esta etapa teñiremos los fragmentos de ADN para poderlos visualizar y observar así si han sido cortados. Solo aquellos que hayan sido cortados tendrán el gen responsable de sinte-tizar la proteína candidata de IrsiCaixa con la secuencia original, es decir, sin mutación.

C Visualizamos los fragmentos de ADN

3.000 pb

1.000

500

100

C

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Sacamos el gel de sus apoyos y lo sumergimos en una solución que lo teñirá (Stain Fast Blast) en un "conte-nedor" de tamaño apropiado durante unos 2 minutos.

PROCEDIMIENTO C

Hacemos un segundo lavado tal y como se describe en el apartado anterior.

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Transferimos el gela un "contenedor" más grande que contenga 500 ml de agua. Con cuidado, movemos el gel duranteunos 10 segundos para "aclararlo".

Ahora tenemos que lavar el gel: Transferimos el gel a un tercer "contenedor" con 500 ml de agua limpia y movemos el gel con cuidado una vez cada minuto, durante un total de 5 minutos.

Las bandas de ADN tienen que apare-cer ya en el gel, aunque se verán bas-tante borrosas. Si esperamos entre 5 y 15 minutos, se verán con más nitidez. *

*Para conseguir un mayor contraste, es necesario hacer más lavados con agua.

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Resultados y conclusiones

10. Observa las bandas de ADN que has obtenido con cada muestra de cada variante y dibuja los resultados a continuación. Indica también la longitud de los segmentos del marcador de ADN.

11. ¿Cuál ha sido el efecto de las enzimas de restricción en cada una de las variantes?

Virus africano Virus europeo Virus asiático

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13. Por lo tanto, ¿cuál es la conclusión de tu investigación? (haz referencia a la hipótesis inicial).

12. ¿Hay alguna variante del VIH en la que la enzima no haya actuado?

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Sobre Irsicaixa¿Qué es Irsicaixa?

El Instituto de Investigación del Sida IrsiCaixa es un instituto de referencia internacional que tiene como objetivo contribuir a mejorar los conocimientos, la prevención y los tratamientos de la infección por el VIH y el sida, con la finalidad última de erradicar la epidemia.

Impulsado por la Fundación "la Caixa" y el Departament de Salut de la Generalitat de Catalunya, IrsiCaixa se constituyó en 1995 como fundación privada sin ánimo de lucro, y está situado en el Hospital Universitario Germans Trias i Pujol de Badalona.

Dirigido por el Dr. Bonaventura Clotet, IrsiCaixa reúne a más de cincuenta investigadores que se dedican principalmente a la investigación básica para comprender los mecanismos de infección por el VIH y así poder desarrollar nuevas terapias y vacunas. Al mismo tiempo, IrsiCaixa participa en estudios clínicos para evaluar las nuevas estrategias terapéuticas y coopera con los países en vías de desarrollo en la lucha contra la pandemia a escala mundial.

La investigación científica del Instituto de Investigación del Sida IrsiCaixa se desarrolla en coordinación con los más reputados centros de investigación internacionales, y las publicaciones que se derivan se encuentran entre las que registran los más altos índices de impacto en este campo.

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INFóRMATELocaliza los elementos de seguridad del labora-torio o el espacio habilitado para experimentar (extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Lee atentamente las instrucciones antes de hacer un experimento. No olvides leer las etiquetas de seguridad de reactivos y aparatos.

uTILIzA VESTIMENTA ADECuADAGuantes, bata y gafas de protección.

NORMAS GENERALESEstá prohibido fumar, comer o beber en el laboratorio o en el espacio habilitado para experimentar. Trabaja con orden, limpieza y sin prisas. Si se vierte un producto, recógelo inme-diatamente. Deja siempre el material limpio y en orden. No uses nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. Lávate las manos antes de abandonar el labo-ratorio.

MANIPuLACIóN DEL VIDRIOProtege tus manos cuando manipules material de cristal y presta atención a su temperatura, ya que el cristal caliente no se distingue del frío. No uses cristal agrietado.

PRODuCTOS QuíMICOSNo uses ningún frasco de reactivos al que le fal-te la etiqueta o que no esté debidamente identi-ficado. No huelas, inhales, pruebes o toques los productos químicos. No pipetees nunca con la boca. Ponte guantes y lávate las manos a me-nudo si usas productos tóxicos o corrosivos. En caso de contacto con los ojos, lávatelos inme-diatamente con agua abundante. No acerques envases de reactivos a una llama. No calientes líquidos inflamables. Transporta las botellas cogidas por el fondo, nunca por la boca.

ELIMINACIóN DE RESIDuOSDeposita en contenedores especiales y debi-damente señalizados los residuos sólidos y líquidos que así lo requieran. Si tienes alguna duda consulta al educador. En ningún caso se verterán residuos sólidos por el fregadero.

RECuERDAEn caso de accidente, avisa inmediatamente al educador.

PRECAuCIONES ESPECíFICAS PARA ESTE TALLER

En esta práctica manipularás reactivos quími-cos, disolventes e instrumentos que presentan los siguientes grados de peligrosidad:

Tampón TAE: Es nocivo por ingestión y puede provocar irritación ocular grave. Requiere ser eliminado como residuo especial.

Gel de agarosa: Requiere ser eliminado como residuo especial. Como contiene tampón TAE, hay que seguir las indicaciones antes especifi-cadas.

Solución de tinción del ADN (DNA stain Fast Blast): Es nociva por ingestión. No hace falta eliminarla como residuo especial pero sí diluida con mucha agua.

Electroforesis: Hay que prestar especial aten-ción al riesgo eléctrico.

Precauciones de seguridad

Anexo

Investigadores que han contribuido con contenidos: Marta Curriu, investigadora de IrsiCaixa.

Esta obra está bajo una licencia Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Para ver una copia de esta licencia, visita http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

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