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UNIVERSIDAD DE LA REPUBLICAFACULTAD DE VETERlNARIA
INVESTIGACI6N DE LA INMUNIDAD CRUZADA EN LA TOXOPLASMOSISCONGENITA EXPERIMENTAL
II. Desafios con quistes y ooquistes de Toxoplasma
Por
Ana CARDOSO LOPEZ
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TESIS DE GRADO presentado comouno de los requisitos para obtener altitulo de Doctor en Ciencias Veterinarias(Orientaci6n Higiene, Inspecci6n,Control Tecnologfa de los Alimentos)
MONTEVIDEOURUGUAY
2005
034 TGInvestigaci6n d
~il[f~lIffliliillliillll.1111111I11 IIIIFV/265B3
TESIS DE GRADO aprobada por:
Presidente de Mesa:Ora. Perla A. Cabre~a Stabile.Prof. de Parasitologla.
Segundo Miembro (Tutor):Dr Alvaro Freyre Mc. Call.Pr~f. Agdo de Parasitologia. D.T.
Tercer Miembro:Dr. Jesus Falc6n Banegas.Asistente
Fecha:
Autor:Ana V. Cardoso L6pez
II
AGRADECIMIENTOS
A la Facultad de Veterinaria de la Universidad de la Republica Oriental delUruguay por danna la posibilidad de lIevar a cabo esta Investigaci6n.
AI equipo de Investigaci6n del Laboratorio de Toxoplasmosis de la FV por elapayo tecnico y humane brindada.
Un partiCular agradecimiento a mi tutor, Dr. Alvaro Freyre.
A mis familiares y amigos per el apaye brindado.
TTl
LISTA DE CUADROS:
Cuadra I: Ensayos de transmisi6n trasplacentaria de Toxoplasma en ratas,par inoculaci6n oral...................................................................................... 6
Cuadra II: Resultados de la transmisi6n congenita de Toxoplasma en ratasinmunizadas per os y desafiadas per os durante la gestaci6n con capas hom61ogas yheter610gas del parasito, y sus respectivoscontroles " .. 11
IV
TABLA DE CONTENIDO
Pagina
pAGINA DE APROBACION IIAGRADECIMIENTOS................................................................................... IIIllSTA DE CUADROS Y FIGURAS.............................................................. N
1. RESUMEN.............................................................................................. 1
2. INTRODUCCION...................................................................................... 2
3. REVISION BIBLIOGRAFICA 43.1. EI madelo rata para el estudio de la inmunidad contra la toxoplasmosis
cannatal.......................................................................................... 4
4. MATERIALES Y METODOS.. 7
4.1. DISENO EXPERIMENTAL................................................................. 74.2. ANIMALES....... 74.3. CEPAS DE TOXOPLASMA.... 84.4. METODO PARA LOGRAR LA CONCEPCION DE LAS RATAS....... 84.5. OBTENCION DE QUISTES DE TOXOPLASMA............................... 94.6. OBTENCION DE OOQUISTES DE TOXOPLASMA...... 94.7. BIOENSAYOS................................................................................... 94.8. TRATAMIENTO ESTAOlsTICO H.... 10
5. RESULTADOS......................................................................................... 10
6. DISCUSION 12
7. CONCLUSIONES........................................................................................ 13
8. BIBLIOGRAFfA 14
1. RESUMEN
En Uruguay nacen cerca de 150 ninos toxoplasmicos anualmente, y la porci6nmedible de las perdidas por aborto ovino toxoplasmico son de 5 millones de d61aresanuales. Actualmente no se dispone de vacunas contra la toxoplasmosis aplicables alas personas, pero se ha desarrollado un modelo animal en la rata para el ensayo deinmun6genos contra la toxoplasmosis congenita. EI objetivo de esta tesis es ensayar laprotecci6n vaccinal contra la toxoplasmosis congenita en el modelo rata contra el desafiode dos estadfos evolutivos de cepas del parasito. Para ella, grupos de ratas inmunizadaspreviamente a la gestaci6n con Toxoplasma son desafiadas con 3 capas de Toxoplasmadurante la gestaci6n. AI parto, las camadas son bioensayadas . Sa observa que las capasM3 y Prugniaud de Toxoplasma, brinda protecci6n cruzada s610 parcial contra latoxoplasmosis congenita iniciada por las cepas Elg, Hopa Hopa y Prugniaud. Losresultados no se ajustan fielmente a 10 que sucede en la naturaleza con sus referenteshumane y avino, en los que los individuos inmunes protegen totalmente a sudescendencia contra la infecci6n congenita. La raz6n puede estar en el uso de dosis dedesaflo muy elevadas, entre otros. Sera necesario continuar estas investigaciones.
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2. INTRODUCCI6N
Los resultados de investigaciones Ilevadas a cabo por el equipo de investigaci6n delLaboratorio de Toxoplasmosis de Facultad de Veterinaria, indican que en Uruguay nacenceres de 150 ninos toxoplasmicos anualmente ( Freyre y col. 1992; Conti y col. 1998).Algunos de ellos mueren rapidamente, en tanto que la mayoria desarrolla lesiones decoriorretinitis ocular 0 sufren retraso intelectual mas adelante. Esta situacion es similar entodos los paises del globo (Freyre y Falc6n, 1989).
La prevenci6n de la toxoplasmosis humana congenita se efectua en el pais y en elexterior generalmente en tonna eventual, sobre la base de la detecci6n de la infecci6ndurante la gestaci6n, y el tratamiento de las madres detectadas infectadas. Este sistemaes de moderada eficacia. A ella contribuye que muchas madres comienzan la vigilanciaserol6gica en etapas considerablemente avanzadas de su gestaci6n; a que s610 una partede elias regresa para volverse a chequear serol6gicamente, y a que con frecuencia no seinterpretsn correctamente los resultados serol6gicos. Tambien es dable considerar queesta metoda es mas paliativo que preventivo, pues con cierta frecuencia, cuando seinstaura el tratamiento especifico a la embarazada, ya Toxoplasma ha causado lesionesque no revierten con el tratamiento, s610 se detienen. Desde luego, este sistema tienetambien su costo econ6mico, que no as desdenable.
Por otra parte, los ultimos estudios del equipo mencionado sobre toxoplasmosisovina indican que el aborto ovino toxoplasmico es responsable de perdidas economicasen la industria ovina del Uruguay por un valor de 2 a 5 millones de d61ares anuales(solamente la porci6n medible de dichas perdidas) (Freyre y col.,1999-b). Asimismo, laprevalencia de la infecci6n del ganado ovino en el Uruguay, que se situa en el entornodel 25%, as fuente de infecci6n humana, cuando se consume su carneinsuficientemente cocida. EI consumo de carne ovina es importante, particularmente enel interior del pais. La prevalencia de la infecci6n toxoplasmica ovina es de un tenorsimilar en atros paises productores de lana (Freyre y Falc6n, 1989).
Como alternativa ideal, se encuentra el desarrollo de una vacuna antitoxoplasmica.Existe una vacuna con alto nival de protecci6n contra la emisi6n de ooquistestoxoplasmicos por los gatos, cuya aplicaci6n contribuiria a disminuir la prevalencia de lainfecci6n toxoplasmica humana y tal vez tambien la de los animales de consumo (Frenkely col.,1991; Freyre y col.,1993; Choromanski y col.,1994). Tratandose de una vacuna aToxoplasma vivo, su aplicaci6n esta pendiente de que pueda ser elaborada y distribuidaen condiciones rentables. Existe asimismo una vacuna (Freyre,1998) que ayuda adisminuir las p8rdidas por el aborto ovino toxoplasmico (Freyre y col., 1996; Freyre ycol.,1997; Freyre y col.,1999-b), aunque su eficacia es solo del 70°A», y no impide lacolonizaci6n fetal por Toxoplasma, de modo que el consumo de la came asi producidacontinua siendo fuente de infecci6n para las personas (Dubey,1996; Freyre y col.; 1996).
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EI hecho de ser una vacuna viva agrega tres inconvenientes mas: que su transporte hastael establecimiento debe hacerse en tanques de nitr6geno, la duraci6n de su viabilidad enalmacenamianto as limitada, y su manipulaci6n peligrosa para las personas.
No existen actualmente vacunas aplicables a las personas (Freyre,1998), paraprevenir la toxoplasmosis connatal (Freyre y col. 1992; Conti y col.,1998) 0 latoxoplasmosis aguda en personas inmunodeficientes (Freyre y Falc6n,1989;Alexander,1996; Dubey,1996; Freyre y col., 2000)
Se dispone sin embargo, de modelos animales para el estudio de la inmunidadcontra ambas situaciones, que mayonnente utilizan la rata (Duquesne y col.,1990; Dubeyy Shen,1991; Dubey y col., 1991; Schoondermark y col., 1993; Zenner y col., 1993;Roberts y col., 1994; Freyre y col., 1999-a; Freyre y col., 2000; Freyre y col., 2004). Se hanefectuado experimentos prototipicos con estos modelos, cuyos resultados permiten seroptimistas respecto al logro de una vacuna contra la toxoplasmosis humana connatal asicomo contra el aborto ovino toxoplasmico, aun cuando son muy contados los ensayosefectuados con subunidades antigenicas, que se han dado a conocer (BQllow y Boothroyd,1991; Khan y col., 1991; Angus y col.,2000; Nielsen y col., 2000; Velge-Roussel y col.,2000; Vercammen y col., 2000). Se posee considerable conocimiento acarcs de losmecanismos implicados en la respuesta inmune contra la infecci6n toxoplasmica enanimates de experimentaci6n (Alexander,1996), 10 cual pennite hacer una selecci6nprimaria de los antigenos toxoplasmicos potencialmente protectores, asi como tambienseleccionar los adyuvantes te6ricamente mas apropiados (Khan y col., 1991).
En el Laboratorio de Toxoplasmosis se han desarrollado modelos en la rata parael estudio de la inmunidad contra la toxoplasmosis, tanto de la forma congenita, comode la forma adquirida. Dichos modelos han funcionado favorablemente a traves desucesivos proyectos de investigaci6n ya culminados. En la presente investigaci6n seindaga la inmunidad cruzada entre diferentes cepas de Toxoplasma, en el modeloserialado de toxoplasmosis congenita.
Existe el antecedente inmediato de la tesista Laura Correa, de ensayo deinmunidad cruzada en el modele rata, efectuando desafios con la fase quistica deToxoplasma. En elias se constat6 Is existencia de inmunidad cruzada en proporcionesmuy altas, aunque no en forma total. La intenci6n de la presente tesis, as ampliar losensayos con desafios quisticos y de ooquistes toxoplasmicos para el desafio vaccinal,en nuevos experimentos de inmunidad cruzada.
2.1. OBJETIVO
EI objetivo de la presente tesis fue ensayar la protecci6n vaccinal prototipicacontra la toxoplasmosis congenita en el modelo rata desafiada con dos estadiosevolutivos diferentes de capas completas del parasito.
La hip6tesis de trabajo fue que las capas M3 y Prugniaud de Toxoplasma,productoras de quistes y ooquistes, producirian protecci6n cruzada al menos parcialcontra la toxoplasmosis congenita experimental generada por otras 3 capas deToxoplasma diferentes.
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3. REVISION BIBLIOGRAFICA
3. 1. EI modelo rata para el estudio de la inmunidad contra la toxoplasmosis connata/.
Se han empleado varias especies de laboratorio para estudiar la inmunidadcontra la toxoplasmosis connatal . EI diseno utilizado consiste en inmunizar a las futurasmadres antes de la concepci6n, y desafiarlas durante la gestaci6n, para luego intentarla recuperaci6n de Toxoplasma a partir de los recien nacidos. Se constata asi latransmisi6n trasplacentaria de Toxoplasma, 0 par el contrario su ausencia, como reflejode la protecci6n inmunitaria alcanzada.
La especie mas utilizada en el modelo resumido, ha side la rata (Cuadro I).Dubey y Shen (1991), Dubey y col. (1991) y Zenner (1999), ampliaron en un numerolimitado de animales algunos experimentos preexistentes sobre transmisi6n connatal deToxoplasma en ratas gestantes inmunes y no inmunes, con las capas Sprague-Dawleyy Fischer. Los resultados en conjunto fueron: a) No obtuvieron transmisi6n connatal dela toxoplasmosis durante el periodo cr6nico de la infecci6n, es decir, en ratas infectadasalgunas semanas antes del inicio de la gestaci6n; b) obtuvieron transmisi6n deToxoplasma en todas las ratas infectadas durante la gestaci6n, independientemente de .si la inoculaci6n de Toxoplasma se hizo del 7° al 15° dia y de si se efectu6 con 104
bradizoitos 0 con 104 ooquistes de Toxoplasma; c) la infecci6n durante la gestaci6n deratas no inmunes, sa transmiti6 cuando menes a 1/3 de la camada, en ocasiones a todala camada; d) los fetos de las ratas inmunizadas antes de la gestaci6n, quedarontotalmente protegidos contra desafios efectuados durante la gestaci6n.
En el Laboratorio de Toxoplasmosis del Dpto. de Parasitologia de la Facultad deVeterinaria de Montevideo se ha ensayado la transmisi6n de la toxoplasmosis agudadurante la gestaci6n en ratas no inmunes. Se utilizaron las mismas razas de ratas(Sprague-Dawley y Fischer). Se inocul6 en el mismo momento de la gestaci6n y saemple6 el mismo bioensayo que los autores mencionados. Sa obtuvo transmisi6n en elo al 70 0A> de las ratas madres, empleando 12 cepas de Toxoplasma de diferentepatogenicidad para el rat6n, cada una en 4-14 ratas. Se observaron ampliasvariaciones individuales en la frecuencia de transmisi6n en ratas de la misma raza querecibieron in6culos similares. En dichos experimentos, la frecuencia de la transmisi6nno se vio afectada ni per la cepa, ni per la dosis de Toxoplasma , ni tampeco per almomento de la gestaci6n en que fueron inoculadas (6-8 0 15 dias).
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Sin duda, la raza de rata empleada tiene importancia en la tass de transmisi6nde Toxoplasma. Asi, se observ6 mas transmisi6n en ratas Long Evans que en ratasWistar. Paulino y col. (1999), obtienen tan s610 11.4 % Y 3 o~ de transmisi6n connatalen ratas Wistar y Holzman, respeetivamente, inoculadas con 102 ooquistes deToxoplasma.
En 1999, Zenner y col. dan a conocer nuevas aplicaciones de su modelo en rata.Producen infecciones cr6nicas en ratas (n=5 a 10) antes de la gestaci6n can las cepasRH, 76 K Y Prugniaud. Luego las desafian durante la gestaci6n en forma hom61oga yheter610ga (aunque no enfrentan la inmunizaci6n can RH y el desafio can las capascompletas 76 K 6 Prugniaud). Obtienen, en todos los casas, protecci6n completa de lascamadas (ausencia de infecci6n toxaplasmica en elias). En ensayos subsiguientes dela misma publicaei6n, inmunizan ratas (n=4 a 8) eon extraeto de taquizoitos RH enadyuvante de Freund incompleto, con taquizoitos RH viables, con taquizoitos RHirradiados, 0 bien con antigenos de secreci6n-excreci6n. Obtienen casi 100 % deprotecci6n, tambien en estos casas. Cabe destacar, sin embargo, que en esta nuevaserie de ensayos, desafiaron can la ceps RH (eapa incompleta) y por una via que no esla natural (puesto que por via oral los taquizoitos son inactivados por el juga gastrieo).Este aspecto es muy importante. Asi, per ejemplo Wilkins (1988) no consigue evitar lainfecci6n cannatal (aunque sf evita el aborto) de corderos cuyas madras fueroninmunizadas can una ceps igualmente incompleta y desafiadas oralmente con la cepscompleta S89. Ello, a pesar que el ovino as una especie considerablemente resistente ala infecci6n toxoplasmica, como la rata.
Sa sostiene que la rata sea tambien una especie adecuada para un modelo deestudio de inmunidad contra la toxoplasmosis connatal extrapolable a la mujer, porquedebido a su resistencia natural contra Toxoplasma, as posible inmunizarla inclusive concepas virulentas, sin necesidad de prevenir su muerte con terapia sulfonamidica.
Segun Thiermann (1957) y Freyre y col.(1999-a) la rata tambien es favorablepara el modele en cuesti6n, debido a la muy baja transmisi6n connatal de Toxoplasmadurante la etapa cr6nica de la infecci6n en esta especie.
Las investigaciones de toxoplasmosis congenita experimental se resumen en elcuadra I.
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Cuadro I.
Ensayos de transmisi6n traspl.centaria de toxoplasmaen ratas. por inoculaci6n oral.
Referencia Cep. y 8stadio(1) Camadas(2) recie" nacidos (2)
Dubey y Shen, 1991 (3) ooq. CT-1 9/9 23/29
Zenner 1993 (4 ) q.76K 6/6 19/54J
q. Pruignaud 22/22 142/203
Dubey at ai, 1997 ooq. VEG 4/4
Kempf et ai, 1999 q.NED 0/11 (ratas Lewis)8/8 (ratas Fischer)
Zenner et ai, 1999 q.76K 12/15 37/128q. Prugniaud 22/27 116/250
Freyre et ai, 2001 q. de 13 cepas 97/221 (0 a 90% de transmisi6n)
(1) q. =quistes ooq. =ooquistes(2) NO de camadas 0 de recitJn nacidos infectadosfNO total de camadas 0 recitJn nacidos investigados.(3) Tambien usaron /a vIa s.c. en experimentos simi/ares.(4) Tambien us61a via i.p. en alros experimentos.
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4. MATERIALES Y METODOS
4.1. DISEf:JO EXPERIMENTAL:
Las ratas inmunizadas con las cepas de Toxoplasma mencionadas en 4.3fueron servidas por los machos 2 meses mas tarde. La c6pula se constat6 mediante lavisualizaci6n de esperma en el hisopado vaginal. A los 12 de dias de gestaci6n fuerondesafiadas con 103 quistes y 104 00quistes de 3 capas de Toxoplasma referidas en 4.3.AI parto, las camadas fueron subinoculadas en ratones para determinar la protecci6nvaccinal cruzada 6 la transmisi6n congenita. Por cada cepa de desafio utilizada, seinocularon ratas no inmunizadas, que sirviaron de controles de transmisi6n congenita.
4.2. ANIMALES:
Se utilizaron ratas de la raza Sprague Dawley de 200 gr. de peso corporal, debido aque en el Laboratorio de Toxoplasmosis de la Facultad de Veterinaria se ha configuradoun modele de toxoplasmosis en esta raza especificamente. Se utilizaron ratones de lacepa CF-1, de 20 gr de peso corporal, para obtener quistes de Toxoplasma, asf comopara los bioensayos. Fueron alojados en el bioterio de la Facultad de Veterinaria yalimentados con raci6n para roed0 res 'del Molino San Jose, Dpto. de San Jose (19%proteina).
5610 se utilizaron ratas y ratones inicialmente libres de infecci6n toxoplasmica. Satestaron muestras de suero de los animales mediante la reacci6n de aglutinaci6n directa(AD) de Desmonts y Remington (1980). Se interpret6 como reactivo, un animal cuyo suerofue positivo a la diluci6n 1:64 0 mayor. La misma reacci6n se utiliz6 para comprobar lainfecci6n toxoplasmica (0 su ausencia) en ratones subinoculados con tejidos fetales. Lareacci6n de AD para toxoplasmosis ha demostrado alta sensibilidad y especific1dc1d enratas, ratones y ovinos con infecci6n natural y experimental a Toxoplasma, eninvestigaciones previas del Laboratorio de Toxoplasmosis ( Freyre y col., 1996, 1997,1999-a-b, 2001) .
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Se cumpli6 con los preceptos de la Comisi6n de Vigilancia de la Etica en Experimentaci6nAnimal de la Facultad de Veterinaria, con la Comisi6n Honoraria de Experimentaci6nAnimal de la UDELAR, con el Decreta de Protecci6n Animal del 29.2.2000 y con laOrdenanza sabre Uso de Animates de Experimentaci6n, Docencia e Investigaci6nUniversitaria del 21.12.99. Los recien nacidos y los adultos, fueron sacrificados pardesnucamiento, una vez concluido su periodo experimental.
4.3. CEPAS DE TOXOPLASMA:
Cepas usadas para inmunizar: Sa utilizaran las cepas Prugniaud y M3 deToxoplasma, que son capas completas del parasito. Esta ultima caracteristica seconsidera importante para que intervengan mas antigenos en la inmunizacion. Muchasotras capas podrfan cumplir este papel, ademas de las cepas mencionadas; simplementesa eligieron dos de elias. Se utiliz6 la via oral de inoculaci6n.
Cepas usadas para desafiar: Sa utilizaron las capas Elg, Hopa-hopa y Prugniaud, demodo que los desafios fueron hom61ogos y heter6lagos. La via de inoculaci6n fue la oral,pues debia imitar la ruta de infecci6n natural. Se administraron 103 quistes par rata en 2de las cepas (Elg y Hops Hops); en el caso de los ooquistes se administr6 104 ooquistespar rata en la capa restante (Prugniaud) (cuadro II).
4.4. METODO PARA LOGRAR LA CONCEPCION DE LAS RATAS
Para lograr la concepci6n de las ratas, fueron alojadas a raz6n de un macho cada treshembras.AI dia siguiente se inspeccionaron las hembras mediante hisopado vaginal, que permiteevidenciar los espermatazoides depositados en Is vagina. Su presencia guardscorrelaci6n de 95% con la futura gestaci6n. Este procedimiento fue reiterado hasta quetodas las ratas necesarias quedaran cubiertas. Esta metodologia sa ha revelado como lamas eficaz en investigaciones previas del Laboratorio de Toxoplasmosis (Freyre y col.,1999-a, 2001).
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4.5. OBTENCION DE QUISTES DE TOXOPLASMA:
Para la obtenci6n de quistes de Toxoplasma, se inocularon ratonesintraperitonealmente con quistes de las cepas mencionadas. Se utilizaron estos ratonesluego de 30-60 dias de la infecci6n, como dadores de quistes cerebrales. Los quistes saadministraron per boca a las ratas gestantes, a la desis de 103 quistes par animal.
4.6. OBTENCION DE OOQUISTES DE TOXOPLASMA:
Para la obtenci6n de ooquistes del parasito, se obtuvieron gatitos recientementedestetados, negativos a la AD para toxoplasmosis a la diluci6n de 1:64. Procedieron delcriadero del Laboratorio de Toxoplasmosis de la Fae. de Veterinaria. Se les suministrarael cerebro de un rat6n con infecci6n toxoplasmica cr6nica. Sa colectaran las heces de losdras 4 a 7 posinfecci6n, las que se concentraran por el metoda de Sheather modificado yse incubaran con agitaci6n en 2% de seido sulfurico durante 96 hs. hasta completar laesporulaci6n. Previa neutralizaci6n y enumeraci6n, los ooquistes seran inoculados porboca en ratas. La dosis de desaffo sera de 10.000 ooquistes esporuladas par rata.
4.7. METODO PARA LA DETECCION DE LA INFECCION TRASPLACENTARIA(BIOENSAYOS):
Una vez nacidas las camadas, sa subinocularon de inmediato en ratones. Los6rganos utilizados fueron higado, pulm6n y cerebro de los neonatos. Sa utilizaron los6rganos de la mitad de las camadas que tuvieron echo 0 mas neonates, y de tada lacamada cuando 88ta era menor a ocho neonatos. AI cabo de 30 dias, sa buscaronanticuerpos antitoxoplasmicos mediante la reacci6n de AD en el suero de los ratones. Saconsider6 que los fetos estaban protegidos, cuando las subinoculaciones de tejidos deneonatas resultaban negativas para Toxoplasma.
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4.8. TRATAMIENTO ESTAOisTICO:Para detectar tods asociaci6n entre transmisi6n congenita en ratas inmunizadas y
no inmunizadas (controles) y las cepas de Toxoplasma utilizadas para los desafios, seutiliz6 el test de asociaci6n de X2 can la correcci6n de Yates, al nivel de significaci6n de0,05.
Medidas para la protecci6n biologica de las personas involucradas en 81 proyectode trabajo.
Se aplicaron las Normas de Bioseguridad del Laboratorio de toxoplasmosis delDpto. de Parasitologia de la Facultad de Veterinaria, aprobados en abril de 2003 por elConsejo respectivo.
5. RESULlADOS
Los resultados obtenidos se resumen en el Cuadro II.
Se inmuniz6 un total de 33 ratas, con 2 cepas de Toxoplasma, que fueronposterionnente desafiadas con quistes y ooquistes de 3 capas del parasito. Treinta y ochoratas mas sirvieron de controles, siendo s610 inoculadas durante la gestaci6n.
En las ratas que fueron inmunizadas y luego desafiadas durante la gestaci6n concepas hom61ogas de Toxoplasma (Prugniaudl Prugniaud), se observ6 una protecci6nelevada (88%), estadisticamente significativa, contra la toxoplasmosis congenita, asicomo contra una cepa heter610ga en que la protecci6n si fue total (M3/Elg) y tambienestadisticamente significativa. Es decir, la protecci6n heter610ga no fue total en lamayoria de las combinaciones estudiadas, como las combinaciones Prugniaud/Elg,Prugniaudl HopaHopa, M3/HopaHopa y M3/Prugniaud.
En aquellas ratas que no fueron inmunizadas pero si desafiadas, se demostr6 latransmisi6n congenita en 7 de 10 ratas inoculadas con la cepa Elg, 7 de 14 ratasinoculadas con la cepa Hopa Hopa, y 6 de 14 ratas inoculadas con la cepa Prugniaud.
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CUADRON°II
Resultados de I. transmisi6n congenits de Toxoplasma en I'8tas inmunizadas per osy desafiadas per os durante's gesfaci6n con cepas hom6logas y heter6logas del
parllsito, y sus respectivos controles.
Cepas de Toxoplasmautilizadas para
inmunizar(200 quistes per os)
CeRa. de ToxoplasnJII utilizadas para 81 desafio
PRUGNIAUD
M3
Controles(ratas no inmunizadas,
pero desafiadas)
ELG
0/5
7/10
103 QUISTES
HOPAHOPA
3/5
2/5
7/14
104 00QUISTES
PRUGNIAUD
1/9
3/5
6/14
(I)Numerador: ratas en las que hubo transmisi6n congtJnita.Denominador: total de ratas investigadas.
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6. DISCUSI6N
Se observ6 protecci6n elevada, en el grupo de ratas inmunizadas pre-gestaci6n ydesafiadas durante la gestaci6n con la misma ceps del parasito y s610 an una cepaheter610ga de desaffo en la que la protecci6n fue total; perc en la mayoria de lascombinaciones heter610gas la protecci6n fue parcial 0 nula. Es decir, que no huboprotecci6n heter610ga total en todas las combinaciones estudiadas. Estos resultados sondivergentes con los obtenidos con 2 cepas de Toxoplasma en ratas (76 K Y Prugniaud),entre las que se manifest6 protecci6n total (Zenner, 1993; Zenner y col.,1999). No result6evidente el motivo de tal divergencia.
Opuestamente a los resultados de protecci6n heter610ga parcial aqui obtenidos, as unhecho bien conocido que Is infecci6n de la mujer y de la oveja con Toxoplasma, protege alfeto de una gestaci6n subsecuente, contra la infecci6n con el parasito.
Para explicar asta divergencia, se amite una hiD6tesis en tres proposiciones:
1. Antes de su primera gestaci6n, las mujeres tendrfan la opertunidad de infectarsecon mas de una capa de Toxoplasma inmunol6gicamente diferente, de modo queuna reinfecci6n durante la gestaci6n dificilmente resultaria heter6loga.
2. Otra explicaci6n saria que la mayorla de las mujeres de un mismo nicho ecol6gico,sa infectarlan antes y durante 18 gestaci6n con cepas toxoplasmicasinmunol6gicamente similares 0 identicas. Exista evidencia molecular que avala laexistencia de infecciones toxoplasmicas multiples en humanos (Aspinall y col.,2003).
3. Existirian particularidades de las capas de Toxoplasma y/o de los animales usadosen nuestro trabajo, responsables de la brecha observada respecto al referentehumano. En particular, la dosis de desafio utilizada, puede ser desproporcionadaen relaci6n al peso corporal de la rata. si se considers s610 aproximadamente, que50g de came de cerda pueden contener 1 quiste de Toxoplasma.( Dubey andThayer, 1994).
No es posible por ahora detenninar si alguna de las dos primeras proposiciones as lacorrecta. Existen ejemplos de varias capas de Toxoplasma aisladas de personas quehabitan an un mismo nicho ecol6gico. Saria necesario definir la eventual existencia deinmunotipos. En cambio, as mucho mas factible abordar Is tercera proposici6n,optimizando el modele rata empleado.
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7. CONCLUSIONES
» Las cepas Prugniaud y M3 de Toxoplasma, productoras de quistes y ooquistesbrindaron protecci6n inmunol6gica cruzada parcial contra la toxoplasmosiscongenita experimental, generada por 3 cepas de Toxoplasma diferentes, bajo dosestadios diferentes.
» La causa de aste desencuentro con los referentes humane y ovino (en los que lainfecci6n toxoplasmica previa ocasiona protecci6n completa), podria ser el uso dedosis demasiado elevadas de desafio con Toxoplasma.
En pr6ximos proyectos de investigaci6n, deberia evaluarse esta posibilidad. Si e8tano fuera la causa, se podrian incluir antigenos provenientes de atrss cepas que muestrenprotecci6n complementaria contra la toxoplasmosis congenita.
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8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Alexander, J.(1996) Immunological Control of Toxoplasma gondii and Appropriate VaccineDesign. In: Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 219. Ed. V. Gross.Toxoplasma gondii. Springer-Verlag. Berlin, pp. 183-195.
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