/NOMBRE :

TELEFONO :

MATRICULA :

CLAVE:,

J CARRERA:

AREA DE CONCENTRACION:

TRIMESTRE :

HORAS/SEMANA:

LUGAR DONDE SE LLEVARA A CABO EL PROYECTO:

FECHA DE INICIO:

JFECHA DE TERMINACION:

JTUTOR EXTERNO :

J

TUTOR EXTERN

De Las Peñas Nava Alejandro

549 - 55 - 19

80342609

cas Lie. Biología

Botánica

Universidad Nacional Autónoma de México Instituto de Investigaciones Bio- médicas Departamento de Biología del De- sarrollo Laboratorio de Mutagénesis

15 de abril de 1985.

15 de octubre de 1 9 3

Dra. Cristina Cortinas de Nava Investigador Titular Instituto de Investigaciones Bio- médica s

Evaluación genotóxica de agua re- sidual y renovada por medio de la prueba de microndcleos en meris- temos de raices primarias en 3- cia faba. --

. . Dra. Cristina Cortinas de Nava

PROYECTO INICIAL

1.

EVALUACION GENOTOXICA DE AGUA RESIDUAL Y RENOVADA POR MEDIO DE LA

RAICES PRIMARIAS DE VICIA FABA

Título - del Proyecto Inicial.

PRUEBA DE MICRONUCLEOS EN MERISTEMOS DE

2. Justificaci6n y Naturaleza - del Proyecto.

Uno de los problemas mas grandes a los que se enfrenta la

Ciudad de México es el del agua. Traerla, distribuirla y tratarla

son procesos que se llevan a cabo diariamente con la amenaza de

que en un futuro no lejano se acabe. En esta situacíon para po- I

der cubrir las necesidades de agua para la ciudad, se recurrirá

al agua renovada para redistribuirla;(el agua renovada es produc-

to del tratamiento por métodos fisico-químicos del agua residual

que proviene de casa, fábricas, industrias, etc.). Es por esto la

necesidad imperiosa de realizar con estas aguas, residual y reno-

vada,análisis de tipo genotóxico (determinar la presencia de agentes

mutágenos, carcindgenos o teratbgenos) ya que en un tiempo no muy

lejano esta agua será tomada por personas y animales. Además esta

agua renovada se utiliza para riego, raz6n por la cual es necesa-

rio el análisis para poder determinar si estamos o no contaminan-

do nuestro ambiente.

En el laboratorio de la Dra. Cristina Cortinas de Nava de

mutagenesis, carcincqénesis y teratogenesis se llevará a cabo la

evaluation genotóxica de estas aguas. Para poder realizar esta

1

2

t-

ir

i''

.d.

I*"

.L.

I- 1 L

I'

L 7 1

c'

I"

c 1:

evaluacibn se han escogido 5 sistemas biolbgicos:

Salmonella typhimurium

Bacillus subtilis

Saccaromyces creviceae

Médual bsea de rat6n

Vicia faba

por lo tanto, la naturaleza del presente proyecto es de investiga-

cibn aplicada ya que este proyecto consiste en el desarrollo de

la prueba de Vicia - faba como parte de la batería de pruebas para

el análisis de las aguas residual y renovada.

3 . introduccibn.

1 El avance de la tecnología en las últimas décadas ha traido

consigo efectos nocivos para la salud en la poblacibn humana. Exis-

te contaminacibn de aguas, suelo y aire por sustancias que son un

factor de amenaza para los seres vivos. Por ejemplo, el crecimien-

to de la industria ha producido mas de 50,000 sustancias que se

encuentran en el ambiente (Cortinas, -- et ai, 1 9 8 0 ) . Es necesario

entonces la evaiuacibn de estas sustancias para conocer cual de

ellas tienen efectos contrarios sobre la población humana para

legalizar, racionalizar o prohibir su uso.

En la última década se han llevado a cabo investigaciones

que han indicado que mutdgenos naturales y químicos producidos por

el hombre pueden ocacionar enfermedades genéticas. Es por esto que

cualquier sustancia que tenga acceso a diferentes tejidos de un

individuo y que esta no sea de origen fisiolbgico puede constituir

un riesgo que puede traducirse en efectos de mutagenicidad, carci- I

c:

3

nogenicidad, teratogenicidad (Cortinas, et al, 1980), conducta a-

normal, envejecimiento y deterioro de la fosa génica (Sandhu, 1980).

El conocimiento de la presencia de mutágenos químicos en el

ambiente ha provocado que se desarrollaran técnicas de investiga-

ción para la identificacibn de agentes potencialmente tóxicos.

Los sistemas biolbgicos que se exponen a dichas sustancias van

desde virus hasta linfocitos y espermatozoides de humano (Sandhu,

1980). Algunos de estos sistemas de prueba son (Cortinas, et al,

1980) :

I DNA

Se puede evaluar alteraciones del DNA tales como:

rompimiento de cadena sencilla y doble entrecruzamiento inter o intra cadenas alquilación de bases sustitucibn de bases entercalación de bases deleción de bases

I1 Microorganismos

Se emplean debido a su tamaño y corto tiempo de generación.

Son ejemplo de estos:

Bacterias - Escherichia coli Salmonella typhiÍnurium Bacillus subtilis

Hongos - Neurospora crasa Saccharomyces creviceae Aspergillus vidulanus

I11 Se usan diferentes líneas celulares tales como:

in vitro - linfocitos: humano y roedores fibroblasto: humano y roedores

in vivo - médual bsea: humano y roedores espermatozoides: humano y roedores espermatocitos: roedores hígado: roedores

- --

IV Plantas

Son ejemplo de estos organismos:

c

4

Vicia faba Aili'm cepa Tradescantia

V Insectos

El ejemplo de insecto es Drosophila meianoganster.

Estos sistemas biol6gicos son de gran ayuda para evaluar los

efectos de agentes químicos mutagénicos debido a su reproductivi-

lidad, relativa economía y corta duraci6n (Cortinas, et al, 1980).

En realidad estos estudios deberían de hacerse en humanos

para evaluar directamente el efecto de estos agentes. Sin embargo

existen diversas razones que impiden su realización tales como

problemas de orden ético, económico y la duración de los estudios

(Cortinas, _ - et al, 1980).

La extrapolación de datos bbtenidos en estos sistemas bioló-

gicos para el humano son cada vez menos confiables a medida que

estos sistemas se alejan desde el punto de vista evolutivo y fun-

cional del humano. Empero se puede decir que si hay coincidencia

de resultados en varios sistemas incluyendo algunos cercanos al

hombre, se puede opinar .sabre ciertas sustancias aun cuando no

se pueda con exactitud predecir el riesgo. Si una sustancia tiene

efecto positivo en varios sistemas, se puede tomar en cuenta como

amenaza para el humano.

4 . Antecedentes.

A través de la historia, las plantas han sido la opción de

la investigación para establecer principios de genética y citoge-

nética (Constantin, 1982). Sin embargo los sistemas de prueba en

vegetales para evaluar genotoxicidad no se han usado debido a la I

5

L C .

wr

,,..,

m-

u,

c

c.

I-

, L.

f- .̂

distancia filogenética que existe entre el hombre y las plantas

(Sandhu, 1 9 8 0 ) .

A pesar de la distancia filogenética entre las plantas y 10s

animales existen ciertas semejanzas tales como:

a) DNA vegetal y animal parece ser similar en función y estructu- ra, son organismos eucariontes.

b) El mecanismo de síntesis de proteínas parece ser el mismo. c) La división de cromosomas mitdticos en los vegetales sigue un

curso similar que en las celulas de mamíferos.

Vicia faba es una planta que se ha usado ampliamente para es-

tudios citogenéticos, fisiológicos y radiobiolbgicos. Es por esto

que tiene la ventaja de que ha sido investigada ampliamente desde

el punto de vista citológico y fisiológico; además de sus propie-

dades favorables para ser usada como un sistema biológico para

incluirla en una batería de pruebas para medir daño genetic0 (Kihlman, , 1 9 7 1 ) .

En V. - - faba la evaluación genotóxica de sustancias se puede

llevar a cabo en meristemos radiculares en los cuales se puede ob-

servar :

aberraciones cromosómicas micronúcleos

Las ventajas de usar 1. faba para pruebas de mutagenicidad son (Ma, 1 9 8 2 ) :

a) La semilla se puede usar aurante todo el año en los experimen-

b) Presenta pocos cromosomas y de número reducido. c) Los resultados pueden obtenerse en poco tiempo.

tos.

Los antecedentes de la prueba de micronúcleos (MN), en E. 3- - bar de la posibilidad de inducir MN con mutágenos, se ha sabido

por algún tiempo por los trabajos de Read y Kihlman, 1956. Recien-

temente se ha usado como una prueba para medir mutagenicidad (De- r,

i ..

c

c_

Pr

< 1

F*'

m

a,.

L

a-

/&

í'

1.

I::

c

6

grassi, 1982). La prueba de MN en V. - - faba se puede medir en:

a) Meristemos de raices primarias y secundarias. b) Células germinales (polen).

Un MN es un fragmento acéntrico de cromdtidas producidas co-

mo resultado de tratamientos con químicos clastogénicos, los cuales

no son transportados a los polos del huso durante la anafase y co-

mo regla no se incorporan a los núcleos de la células hijas. En

cambio permanecen en la regibn ecuatorial de la célula (Kihlman,

1966). También pueden ser cromosomas completos que queden retrasa-

dos durante la anafase debido al mal funcionamiento del huso mitb-

tico. Pueden formarse uno o varios MN y son de menor tamaiiiq que

el núcleo principal (Schmid, 1976). Estos MN se observan durante

la interfase.

I 1

I

La prueba de MN depende de las siguientes variables (Degrassi,

1982) :

a) Dbsis. b) Tiempo de tratamiento y fijacibn. c) Mecanismo de accibn del mutdgeno.

Ventajas de la prueba de MN (Degrassi, 1982):

i)

Mecesita bajos niveles de control. Presenta buena correlacion entre MN y aberraciones cromos6micas. Buena relacion dbsis - respuesta. Buena sensibilidad, confiabilidad y fdcil manejo. Rapidez de la prueba. Existe un buen conocimiento del sistema biolbgico. Costos reducidos. Presenta un espectro dmplio de daño mutagenico: se puede ana- lizar rompimientos cromos6micos o mal funcionamiento del huso mitbtico. La frecuencia de MN es directamente proporcional al índice mi- tótico.

Esta prueba se establecid en el principio de que agentes so-

lubles en agua pudieran ser absorbidqfácilmente por el tejido

meristemático de V. - - faba (Ma, 1982).y la principal cualidad de es- c' I I.

r- ii

ta prueba radica en que puede ser usada como una señal de alarma

en laboratorios decenfralizados que no estén bien equipados (De-

grassi, 1982).

La prueba de MN en E. faba se realizará en meristemos radi- culares debido a:

a) Fácil manejo. b) Existe un número elevado de células en mitosis. c) El meristem0 al estar expuesto directamente al compuesto, los

d) Los químicos que se quieran estudiar simplemente se disulven

e) Se pueden obtener durante todo el año.

efectos de las concentraciones conocidas pueden ser evaluadas.

en una solución acuosa o en agua corriente, en donde los meris- temos puedan crecer.

5. Objetivos.

El objetivo delpresente proyecto es el de evaluar la presen-

cia de mutágenos en el agua residual y renovada capaces de inducir

la formación de micronúcleos en los meristemos de raices primarias

de Vicia faba como parte de una batería de pruebas. No se evalua-

rá que tipo de mutágeno esta presente en el agua, sino el efecto

de estos mutágenos traducidos en la formación de micronúcleos.

6 . Programa y Metodología - de Trabajo.

Se analizarán 5 "paquetes" de aguas consistiendo cada paque-

te de 3 muestras de agua residual o renovada. Además se incluirá

un control positivo que será de .01% de X2Cr20, y un control ne-

gativo que ser$ de agua desionizada. En general se analizarán por

cada mes:

3 muestras de agua residual o renovada 1 control negativo 1 control positivo

La metodología será la siguiente:

8

a) La germinacidn de las semillas se realizará siguiendo la téc- nica descrita por Kihlman, 1977.

b) Se pondrán las radiculas directamente en las agua residuales o renovadas por un tiempo de tratamiento de 24 horas.

c) A las radsculas se les dará un tiempo de recuperacidn de 24 ho- ras.

d) La preparacidn de laminillas se realizará siguiendo la técnica descrita por Villalobos-Pietrini, 1966.

e) La preparacidn de laminillas permanentes se realizará siguien- do la técnica descrita por Conger y Fairchild, 1953.

f) Se analizarán las laminillas bajo el microscopio leyendose 1,000 células por radfcula (haba), se tendrán 3 radículas por grupo de agua y 3 por cada control.

g) Se leerán células con micronúcieos y células en mitosis.

En general se tendrá:

Muestra 1 - 3 laminillas - 1,000 células por cada laminilla. Muestra 2 - 3 laminillas - 1,000 células por cada laminilla. Muestra 3 - 3 laminillas - 1,000 células por cada laminilla. Control + - 3 laminillas - 1,000 células por cada laminilla. Control - - 3 laminillas - 1,000 células por cada laminilla.

Para poder obtener este nfimero de laminillas se sembrarán 80

semillas d= haba, de estas semillas se escogerán 12 radículas por

cada grupo de tratamiento, 6 para hacer laminillas y 3 para lectura 80 SEMILLAS

TRATAMIENTO 24 HR

M3 ... 1L

RECUPERACION 24 HR

M1 12

M2 12

c+ 1'2

M1 6

M1 3

M2 6

M2 3

- C 12

PREPARACION DE LAMINILLAS

M3 c+ 6 6

LECTURA DE LAMINILLAS

c+ 3

M3 3

- C 6 I

3

L

"I"-

9

1 . Cronograma Actividades.

I*-

I L ,

F

L

10

8. Literatura Citada.

Conger, A. y L.M. Fairchild. 1953. A quick freeze method for making smear slide permanents. Stain Technol. - 18: 281 - 283.

Constantin, Milton J. y Elizabeth T. Owens. 1982. Introduction and perspectives of plant genetic and citogenetic assays. A report of the US Environmental Protecion Agency, Gene-Tox Program. Mutqtion Research - 99: 1 - 12.

Cortinas de Nava, Cristina, Ostrosky de Wegman, Patricia y Silvia

Instituto de Investiga- C. Galvan. 1980. Principios de mutagenisis y su relación con carcinogénesis y teratogenesis. ciones Biomédicas, UNAM, Mgxioo. ‘28p.

Degrassi, Francesca y Marco Rizzoni. 1982. Micronucleus test in Vicia faba rot tips to detect mutagen damage in fresh water polution. Mutation Research 97: 19 - 33. -

Kihlman, B.A. 1966. Action of chemicals on dividing cells. Prentice - Hall, Inc., Engelwood Cliffs, New Jersey. 122p.

Kihlman, B.A. 1971. Root tips for studying the effects of chemi- I cals on chromosmes. In: Chemical mutagens. Principles and me- thods for their detection. Vol. 2 Edited by A. Hollander, Plenum Press, New York. 489 - 514p.

Kihlman, B.A. 1977. Root tips of Vicia faba for the study of chromosomal aberration. In: Handbookormutagenicity proce- dures. Edited by M. Legato, W. NIchols, B.J.Kilbey and C. Ravol, Elsevier, Amsterdam. 389 - 400p.

Ma, Te-Hsiu. 1982. Vicia cytogenetic test for environmental mutagenes. A report of the US Environmental Protection Agency, Gene-Tox Program. Mutation Research B: 257 - 271.

Sandhu, Shabeg. 1980. Potential utility of plant test systems for environmental monitoring: an overview. In: Short term bioassays in the analysis of complew environmental mixtures 11. Edited by Michael D. Waters, Shahbeg Sandhu, Joeilen Lowtas Huisingh, Larry Claxton and Stephen Nesnow, Plenum Press, New York. 203 - 210.

Schmid, W. 1976. The micronucleus test for cytogenetic analysis. In: Chemioal mutagens. Principles and methods for their de- tection. Vol. 4 Edited by A Hollaender, Plenum Press, New York. 31 - 53.

Villalobos-Pietrini, R. 1965. Alteraciones inducidas por los ra-

*’ 1 1 . ’

ri I c.

c

11

yos X en los cromosomas de las células meristemdticas de la raíz de Vicia faba. 1 Aspectos técnicos. Bol. Soc. Bot. Mex. 29: 179 - 183. -

i...

r- L”

”.. I L..

NOMBRE :

TELEFONO PARTICULAR:

CARRERA:

AREA DE CONCENTRACION:

TRIMESTRE:

HORAS SEMANA:

LUGAR DONDE SE LLEVO A CABO:

FECHA DE INICIO:

FECHA DE TERMINACION:

NOMBRE DEL TUTOR EXTERNO:

PUESTO Y ADSCRIPCION:

TITULO:

ALUMNO :

TUTOR:

Alejandro De Las Peñas Nava

549 - 55 - 19

Biologia

BÓtanica

30 Horas

Instituto de Investigaciones Bio- médicas Departamento de Biología del De- sarrollo Laboratorio de Mutagénesis

15 de abril de 1985.

17 de enero de 1986.

Dra. Cristina Cortinas de Nava

Investigador titular Departamento de Biología del De- sarrollo Instituto de Investigaciones Bio- médicas

Evaluación genotóxica de agua re- sidual y renovada p o r medio de la prueba de micronúcleos en me- ristemo urimario de Vicia faba

( 1 ~ ~ 4 A . @&& d%v4 Dra. Cristina Cortinas de Nava

c F' I L-

I*"

c-

CI

h.

*"

I..

c

rn . I

L,.

c:

r ! L.

c

1-

EVALUACION GENOTOXICA DE AGUA RESIDUAL Y RENOVADA POR MEDIO DE LA PRUEBA DE MICRONUCLEOS EN MERISTEM0 PRIMARIO DE VICIA FABA --

Introducción

El avance de la tecnologia en las Últimas décadas ha traido

consigo efectos nocivos para la salud en la población humana. Exis-

te contaminación de aguas, suelo y aire por sustancias que son un

factor de amenaza para l o s seres vivos. Por ejemplo, el crecimien-

to de la industia ha producido mas de 50,000 sustancias que se en-

cuentran en el ambiente (Cortinas, -- et al, 1980). Es necesario en-

tonces la evaluación de estas sustancias para cqnocer cual de ellas

. , ~

~

i

tienen efectos contrarios sobre la población humana para legalizar, I t

1 racionalizar o prohibir su uso.

En la Última década se han llevado a cabo investigaciones que

han indicado que mutágenos naturales y químicos producidos por el

hombre pueden ocasionar enfermedades genéticas (Sandhu, 1980). Es

por esto que cualquier sustancia que tenga acceso a diferentes te-

jidos de un individuo y que esta no. sea de origen fisiológico pue-

de consitutir un riesgo que puede traducirse en efectos de mutage-

nicidad, carcinogenicidad, teratogenicidad (Cortinas, -- et al, 1980),

conducta anormal, envejecimiento y deterioro de la fosa génica (Sand-

hu, 1980).

,

I I

El conocimiento de la presencia de mutágenos químicos en el am- I biente ha provocado que se desarrollaran técnicas de investigación

para la identificación de agentes potencialmente tóxicos. Los sis-

temas biológicos que se exponen a dichas sustancias v

hasta linfocitos y espermatozoides de humano (Sandh I

!

1

I:

IT: F'

L"

i

.F" t L

c F

, nos sistemas de prueba son (Cortinas, g , 1 9 8 0 ) :

I DNA

Se puede evaluar alteraciones del DNA tales como:

rompimientos de cadena sencilla y doble entrecruzamiento inter o intra cadenas alquilación de bases sustitución de bases intercalación de bases deleción de bases

2

I1 Microorganismos

Se emplean debido a su tamaño y corto tiempo de generación.

Son ejemplo de microorganismos: i

Bacterias: Escherichia - coli Salmonella typhimurium Bacillus subtilis

Hongos : Neurospora crasa Saccharomyces creviceae Aspergillus vidulanus

I11 Se usan diferentes líneas celulares tales como:

in vitro: linfocitos - humano y roedores -- fibroblacto - humano y roedores

in vivo: médula osea - humano y roedores -- espermatozoides - humano y roedores espermatocito - roedores hígado - roedores

IV Plantas

Son ejemplo de estos organismos:

Vicia faba Allium Tradescantia Zea mays -

r L

3

V Insectos

El ejemplo de insecto es el de Drosophila melanoganster.

Estos sistemas biológicos son de gran ayuda para evaluar l o s

efectos de agentes químicos mutagénicos debido a su reproductivili-

dad, relativa economía y corta duración (Cortinas, - et -> al 1980).

En realidad estos estudios deberían de hacerse en humanos pa-

ra evaluar directamente el efecto de estos agentes. Sin embargo exis

ten diversas razones que impiden su realización tales como proble-

mas de orden ético, económico y la duración de los estudios (Cor-

tinas, % s, 1980). La extrapolación de datos obtenidos en estos sistemas biológi-

cos para el humano son cada vez menos confiables a medida que estos

sistemas se alejan desde el punto de vista evolutivo y funcional del

humano. Empero se puede decir que si hay coincidencia de resultados

en varios sistemas incluyendo algunos cercanos al.hombre, se puede

opinar sobre ciertas sustancias a h cuando no se pueda oonlexacti-

tud predecir el riesgo. Si una sustancia tiene un efecto positivo

en varios sistemas, se puede tomar en cuenta como amenaza para el

humano.

Plantas

A través de la historia, las plantas han sido la opción de l a

investigación para establecer principios de genética y citogendbi,

ca (Constantin, 1982). Sin embargo,los sistemas de prueba en vege-

tales para evaluar genotoxicidad no se han usado debido a la dis-

tancia filogenética que existe entre el hombre y las plantas (Sand-

hu, 1980).

A pesar de esta distancia entre las plantas y l o s animales exis-

, 4

ten ciertas semejanzas tales como:

1 . DNA vegetal y animal parecer ser similar en funcion y estructu-

ra, son organismos eucariontes.

2 . El mecanismo de síntesis de proteinas parece ser el mismo.

3 . La división de cromosomas mitóticos en l o s vegetales sigue un

curso similar que en las células de mamfferos.

Sin embargo, al mismo tiempo de que existen semejanzas hay

ciertas diferencias:

1 .

2 .

3.

Las células vegetales presentan pared celular rigida de celulo-

sa y esto ciertamente afecta la penetración de determinadas sus-

tancias quimicas. Esto se traduce en diferencias selectivas en-

tre la célula del mamifero y la célula vegetal.

Las plantas superiores tienen mayor cantidad de DNA citoplasma-

tic0 que las células animales.

Meiosis y gametogehesis son muy diferentes.

Las plantas, además, presentan ventajas significativas sobre

otros organismos en determinadas circunstancias en l o s estudios de

mutagenicidad ocacionada por químicos (Constantin, 1 9 8 2 ) :

1.

2 .

3 .

1.

2 .

Las plantas han demostrado respuesta a mutágenos de una manera.

similar a la de los mamlferos y otros organismos eucariontes.

Las plantas se adaptan en forma Única a estudios -- in situ.

Ciertas especies de plantas presentan sensibilidad a mutágenos

y tienen un ciclo vital corto.

I

,

1

I

Existen otras ventajas (Sandhu, 1 9 8 0 ) :

Las plantas se pueden propagar vegetativamente y se pueden re- I

generar a partir de una célula.

Las plantas presentan un amplio rango de puntos genéticos; I

L..

F"

1 ..>

Cr

P

w

CI

L*

c

a..

F-

u..

'I- C...

I L..

C.

u-

rn-

mutacion de genes reparación de DNA aberraciones cromosómicas daño primario de DNA

5

3 . Cientos de - loci se pueden monitorear a 1A vez en las plantas.

4 . Los eventos de mutagenicidad son mas fáciles de valorarlos.

Los usos principales de los sistemas con plantas son:

a) Como parte de una bateria de pruebas a carto plazo en labora-

torios de primer o segundo orden

b) En estudios de monitoreo en el campo, - in -9 vivo como indicadores

de mutagenicidad de todo el medio ambiente.

En los sistemas de plantas para las pruebas genotóxicas, exis-

te una falta de conocimiento sobre los diversos procesos molecula-

res y en particular aquellos afectando el metabolismo de compuestos

extraños. Es por esto que es dificil extrapolar los datos derivados

de experimentación con plantas al hombre.

Para' demostrar que existe una relación en cuanto a la respues-

ta a mutágenos entre plantas y animales, Sandhu, 1980, presenta una

tabla donde compara las potencias mutacionales de 8 compuestos qui-

micos en bacterias, plantas, insectos y mamiferos.

Dentro de los sistemas biológicos en plantas para las pruebas

de mutagenicidad, los mas prácticos y Útiles son:

Vicia faba Allium Tradescantia paludosa Hordeum vulgare

Vicia faba - Es una planta que se ha usado ampliamente para estudios cito-

genéticos. fisiológicos y radiobiológicos. E s por esto que tienen

6

la ventaja de que ha sido investigada ampliamente desde el punto de

vista citológico y

para ser utilizada

bateria de pruebas

En V. faba la

>

- -

fisiológico; además de sus propiedades favorables

como un sistema biológico para incluirla en una

para medir daño genético (Kihlman, 1 9 7 1 ) .

evaluación genotóxica de sustancias se puede lle-

var a cabo en meristemos radiculares en los cuales se pueden obsdr-

var :

aberraciones cromosómicas

micronúcieos

Las ventajas de usar V. faba para pruebas de mutagenicidad son - - (Ma, 1982):

1. La semilla de V. faba puede usarse durante todo el año en los - - experimentos.

2. Presenta pocos cromosomas y de número rdducido.

3. Los resultados pueden obtenerse hasta en 4 8 horas.

Desde el punto de vista citológico V. faba presenta las si- - - guientes características:(Kihlman, 1971):

I Presenta 12 cromosomas (2n)

- 5 pares casi iguales de tamaño con centrómero subterminal, cromosoma S

- 1 par de cromosomas con centrómero medio, cromosoma M

Su ciclo mitótico varía entre 18 y 22 horas a 19'C. Evans y Scott

en 1956 encontraron el promedio de duración del ciclo mitótico

en raíz primaria, 19.3 horas: 17.3 hr. - Interfase

I1

4 . 9 hr. - G1 7.5 hr. - S

4.9 hr. - G2 2.0 hr. - MitÓsis

E: [: i" I L.

P

ci

P I C..

i 13

Lr

r L*

7

El laboratorio de Investigación sobre Efectos de la Salud

en el Research Triangle Park en Carolina del Norte, evaluó la

prueba de meristemos radiculares en V. faba para incluirse dentro

de la bateria de pruebas genotóxicas (Sandhu, 1980). Esta misma

prueba fue evaluada por el Programa Gene-Tox de la Agencia de Pro-

tección Ambiental de l o s Estados Unidos (E.P.A.) y resultó tener

suficientes datos para reunir l o s requerimientos del programa Gene-

Tox e incluirse en el mismo (Constantin, 1982).

Prueba de Micronúcleos en V. faba

- -

I

I

Los antecedentes de la prueba de micronúcleos (MN) en V. faba - - y de la posibilidad de inducir MN con mutágenos, se ha sabido por

algún tiempo por los trabajos de Read y Kihlman, 1956. Recientemen-

te se ha usado como una prueba para medir mutagenicidad (Degrassi,

1982). La prueba de MN en Y. fahil se puede medir en: 1. Mersitemos de raices primarias y secundarias 2. Células germinaies (poien)

>

Un MN es un fragmento acéntrico de cromátidas producidas como

resultado de tratamientos con químicos clastógenos, los cuales no

son transportados a l o s polos del huso durante la anafase y como

regla no se incroporan a l o s núcleos de las células hijas. En cam-

bio permanecen en la región ecuatorial de la célula (Kihlman, 1966).

También pueden ser cromosomas completos que queden retrasados du-

rante la anafase debido al mal funcionamiento del huso mitótico.

Pueden formarse uno o varios MN y son de menor tamaño que el núcleo

principal. Estos MN se observan durante la interfase y en la mitó-

sis. Algunos de mayor tamaño pueden llegar a sintetizar proteinas

(Arara, et al, 1969). ,

c

c- 8

c-

L.i

I

I..

*..

L C

c<.

L..

c..

e-

r L..

F

i..

P-

I,

r-

La prueba de MN depende de las siguientes variables (Degrassi,

1982) :

1. DÓsis 2. Tiempo de tratamiento y fijación 3 . Mecanismo de acción del mutágeno

Ventajas de la prueba de MN (Degrassi, 1982):

1. Presenta buena correlación entre MN y aberraciones cromosómicas 2. Buena relación dósis-respuesta 3 . Buena sensibilidad, confiabilidad y fácil manejo 4 . Rapidez de la prueba 5. Costos reducidos 6. Presen$a un espectro amplio de daño mutagénico: se puede anali-

zar rompimientos cromocómicos o mal funcionamiento del huso mi- tótico l ,

I P. La frecuencia de MN es directamente proporcional al índice mitó- tic0 i

Esta prueba se estableció en el principio de que agentes so -

lubles en agua pudieran ser absorbidos facilmente por el tejido me-

ristemático de V. - - faba (Ma, 1982) y la principal cualidad de esta

prueba radica en que puede ser usada como una señal’de alarma en

laboratorios descentralizados que no estén muy bien equipados (De-

grassi, 1982).

La prueba de MN en V. - - faba se realiza en meristemos radicula-

res debido a:

1 . Fácil manejo 2. Existe un número elevado de células en mitosis 3. El meristemo, al estar expuesto directamente al compuesto quimil

co, l o s efectos de las concentraciones conocidas pueden ser eva- luadas

4 . Los químicos que se quieren estudiar simplemente se disuelven en una solución acuosa o en agua corriente o en una soiucion nutri- tiva, en donde l o s meristemos crecen

I

9 1::

1..

p‘

L ..

r L F’

i r

c**

5. Se pueden obtener durante todo el año

Objetivo

En el laboratorio de Mutagénesis de la Dra. Cristina Corti-

nas de Nava en el Departamento de Biologia del Desarrollo en el

Instituto de Investigaciones Biomédicas se busca un sistema bioló-

gico que detecte mutagenos en forma rápida y económica en agua re-

sidual y renovada consideradas como mezclas complejas. La necesi-

dad de conocer la actividad mutagénica de estas aguas es de gran

importancia ya que hay 2 aspectos fundamentales relacionados en es

te aspecto. El primero consiste en que tanto en la Ciudad de MéKi-

co como en el campo se utiliza agua residual y renovada para el

riego de áreas verdes. Es importante saber si se esta o no conta-

I

I minando nuestro ambiente. El segundo aspecto es que en la Ciudad

de México se llegará a un momento en que no habrá manera de traer

agua potable a la ciudad y se tendrá que usar el agua renovada pa-

ra cubrir las necesidades de la ciudad. Es por esto que es impor-

tante conocer la actividad mutagénica deleste tipo de agua no comd

una prueba de calidad del agua sino pana eartwsada.ibomo un evdntual

criterio de control a l o s sistemas de reciclaje del agua.

A diferencia de otros sistemas, la prueba de en -- V.faba no

requiere de la concentración de las mezclas complejas como seria

el caso de l a prueba de Ames con Salmonella typhimurium, MN en mé-

dula Ósea de ratón, entre otros; y además las plantas se nutren

directamente de l o s compuestos que se encuentran disueltos en el

agua. Es decir que con esta prueba se utiliza una vía natural del

sistema para obtener sus nutrientes y de este modo inlcuir a l o s

mutágenos.

.

Asi pues, el objetivo principal del trabajo consistió en pro-

bar la eficiencia de la prueba de MN en - - V.faba: si es capaz de

reaccionar a mutágenos conocidcs y si puede detectar mutagenicidad

en mezlcG complejas sin la concentracion de las mismas.

Material

1. Material quimico

I

KN03 (Baker) Ca (NO3) (Baker) MgS04 (Baker) KH2P04 (Baker) HC1 (Baker) Na2S205 (Baker) Acido Acético (Baker)

2. Material biológico

-Semillas donadas por el Instituto de Investigaciones Agricolas (INIA) de Vicia faba var minor de la serie TLAX 1 2 .

-Semillas de -- Vicia faba var minor donadas por el Sr. Pedro LÓpez del poblado de Veladero, Municipio de Ciudad Serdán, Puebla.

Métodos

1. Preparación de soluciones

a) La solucioh Hoagland se prepara de la siguiente manera: Se pesan .O5554 gr de KN03

1.18075 gr de CaN03.4H20 1.23249 gr de MgS04.7H20 .13609 gr de KHZP04 y se disuelven en 1 litro de agua.

b) La tinción de Feulgen se prepara de la siguienbe manera: Se pesa 1 gr de fuscina básica y se le agregan 200 ml de agua enpunto de ebullición. Se agita y se deja enfriar a 26OC aproximadamente. Se filtra con un embudo Buchner a través de un filtro milipore de .45. Se agregan 20 ml de HC1 1N y 1 gr

10

Etanol (Baker) Butanol (Baker) Para fucsina (Sigma) Bálsamo de Canada (Sigma) Mitomicina C (Sigma) Carbón activado (Merck)

11

de Na2S205. Se guarda en la obscuridad en un frasco ambar a temperatura ambiente por 48 horas. Se le agrega despues 1 gr de carbón activado y se deja de 15 a 30 min. Se vuelve a fil- trar como en el paso anterior y se guarda en un frasco ambar a 4'C.

2. Muestre0 de las aguas

Se obtuvieron 3 muestras de agua por semana en 3 puntos dis- tintos de la planta de tratamiento de agua residual de C.U. durante 10 semanas. Estas aguas provienen de la zona de Copil- co el alto, desechos de laboratorios de C.U. y aguas provenien- tes de servicios sanitarios. Los muestreos se realizaron I Influente a las 12:OO PM

I1 Después del sedimentador

I11 Después del sedimentador del jueves siguiente

coles

en (Figura 1): del miércoles del Biodisco a las 7:30 PM del miér-

de Lodos Activados a las 8:OO AM

LOS tiempos anteriores son los tiempos teóricos que represen- tan la entrada del agua a las 12:OO PM por el influente y l o

que tarda esa misma agua en llegar al punto de muestreo. Es decir que el agua que entra a las 12:OO PM por el infuente tar- da 7 . 3 0 horas en salir por el sedimentador del Biodisco y 20 horas en salir por el sedimentador de los Lodos Activados. Es-

tos tiempos fueron proporcionados por la Q.F.B.Ruth Guerrero directora de la planta de tratamiento de agua residual de C.U. La directora tambien sugirió que los muestreos fueran l o s días miércoles a las 12:OO PM ya que es el día y la hora de mayor afluencia de agua a la planta.

3. Técnica

a) GerminaciÓn de las semillas (Kihlman, 1977):

- lavar semillas varias veces con agua destilada - remojar las semillas durante 24 horas a 2OoC - germinar las semillas entre algodones húmedos con agua des- tilada a 20°C en posición vertical durante 4 días

3

V

W P

el

P

v) W e:

3 H

4 3 U 4 w n

W n

z 4 el a

5 W n O z a 5

'1 O-or-cou.-'oc

1 2

I I

F i g u r a 1 ]

TL F Lt

I

w..

P bii

c:

'Z

F

L..

c

L

F-

*-.

y.

1 3

b) Tiempo de tratamiento y de recuperación - se seleccionan las semillas con radiculas de 2 - 4 cm - se ponen en tratamiento durante 24 horas en las muestras

- se cambian las radiculas para su recuperacion en un baño

Los tiempos de tratamiento y recuperación se obtuvieron por lo reportado por Kihlman, 1971 y 1977, en base al ciclo ce- lular de - - V.faba. Se tomaron los tiempos de recuperación y de tratamiento antes citadmya que con un tiempo de tratamiento de 24 horas se le permite al compuesto actuar en las 3 esta- pas del ciclo (G1, S, G2) y se le da un tiempo de recupera- cion de 24 horas que permite que esta población de células afectadas por el compuesto pasen por mitosis y se pueda expre-

el ciclo celular dura 20 horas) en el tratamiento y en la re- cuperacion para el caso en que por la acción de los compues- tos se retrase el ciclo celular y asi se pueda compensar el tiempo.

- se cortan las raices y se dejan en aceto-etanol 1:3 duran- t? 48 horas a 4°C (Comunicación personal con el Dr. Ma).

de agua

de solución Hoagland durante 24 horas

I

sar el daño en forma de MN. Se tomaron 4 horas de mas,(ya que I I

I

I c) Tiempo de fijación

d) TinciÓn (Kihlman, 1971 y 1977, Ma, 1982) - las raices del fijador lavarlas con agua destilada - dejar 15 min en HC1 1N a 6OoC - pasar a la tincidn de Feulgen durante 1 hora - cambi,ir a porta objeto, cortar zona meristemática y quitar '

- aplicar ácido acético al 45% - hacer squash

cofia ,

- para mayor informacioh sobre la tinción de Feulgen referir- I I

I I I

se a (Darlington y La Cour, 1976 y Sharma y Sharma, 1972).

e ) Preparación de laminillas permanentes (Conger y Fairchild, 1953) : 1

- poner las laminillas sobre hielo seco a que escarchen I

I

pl

i .<

r- k...

c

I..

c

... P

L..

c

i.,

'L F

L..

CI.

L".

c-

u...

m*

c.

f.

--MmoraJTm 14 && SERVICIOS DCJCUYuT&~ !amLb.*P(pw IZTAPAuTli

-quitar cubre objetos y dejar a secar la laminilla durante 2

-dar a las preparaciones un baño de ácido acético al 4 5 % y 2

-monta$ con bálsamo de Canadda

f) Análisis al microscopio

Se tienen 6 laminillas por tratamiento de las cuales se escojen

3 y se analizan 1000 células por laminilla. Se toman en cuenta

células en interfase, en mitosis, células en interfase con MN y

células en mitosis con MN. Los resultados se expresan en porciend

to de MN, se obtiene s u desviacion estaiidard y el porciento del

~

días

baños de butanol

índice mitótico, IM - - No. de células en mitosis x 100 Total de células proliferantes

g) Controles

- s e usará como control negativo a la solución HdAgland. -se usará como control positivo la mitomicina c (MMC) para probar si el sistema esta respondiendo o no. La MMC es un antibiótico compuesto de (Gilinan, - _ et al, 1 9 8 2 ) : un uretano un grupo quinina un anillo de azinidina La MMC se aisla por una especie de Steptomyces y tiene un efecto inhibidor poderoso sobre las células en división y síntesis de DNA sin influenciar marcadamente la síntesis de RNA y proteinas (Kihlman, 1 9 6 6 ) . El mecanismo de acción de la MMC se lleva a cabo de la si- guiente manera: Después de la reducción enzima'tica intrace- lular de la quinona y de la pérdida del grupo metoxi, la MMC se convierte en un agente alquilante bi o trifuncional. In- hibe la síntesis de DNA y forma ligaduras cruzadas con el mismo en grado proporcional a su contenido de guanina y ci- tocina. S u accion es mas prominente al final de la fase G1 y en el principio de la fase S del ciclo celular, &a WC es te-

I

I i-

1:

c

*."

I

I.-

"+-

I._

C Y

L

15

I ratógena y carcinogena (Gilman, _ _ et al, 1 9 8 2 ) . Para ver el grado de mutagenicidad de la MMC, Constantin, 1 9 8 2 , presenta una tabla de 8 químicos ordenados por su po- tencial mutagdeco. Esta tabla se obtuvo con experimentso en plantas -- in vivo y la MMC ocupa el segundo lugar de muta-

La respuesta de la MMC en ensayos con - - Vbfaba en el programa Gene-Tox y su clasificación carcinogénica fue (Constantin, 1 9 8 2 ) : -respuesta positiva para la clasificacion carcinogenica -respuesta positiva para l o s ensayos citogenéticos en - - V. faba La MMC en contacto con meristemos radiculares de -- V.faba pro-

genicida entre estos químicos. I

I ,

duce una frecuencia elevada Kihlman, 1966) y aumenta la Se utilizó la concentración portado por Degrassi', 1 9 8 2 , previas en el laboratorio.

Resultados

I de aberraciones cromosómicas (

frecuencia de MN. de MMC de 8 . 8 x 10-6M por lo re- I

I Arora, et al, 1980 y experiencias I

I I

--

Los resultados obtenidos en los 10 muestreos se encuentran ex-

presados en la Tabla 1 y en la Figura 2 . Los datos están expresados

en porciento de MN, desviación estandard del promedio de los MN y

porciento del índice mitótico. Se analinaron células con 1 o 2 MN

(Figura 4 ) , MN en mitosis (Figura 5 y 6 ) .

Cont ro 1 En lbs MN espontáneos de las muestras (M) I - V (Habas INIA)

hubo un incremento de 2 . 8 en la M I a 11.7 en la M V y dn las mues-

tras VI - X (Habas Puebla) hubo también un incremento de . 9 en la

M VI a 9 . 3 en la M X. El comportamiento de l a población en las M

I - V fue muy variable ya que encontramos desviaciones estandard (Des S) de . 8 a 7 . 3 y en las M V I - X fue menos variable con va- lores de Des S de .9 - 3 . 0 . El índice mitótico (IM) en las M I - V

s

2

2 E

w 3 e: a

w e U n

3

u W Fi

O F w 8 3 H w Fi

: cl

a

5 W Fi

4

E e. r

3 n Y VI w e.

3 c3 4 cl W

z O n U

4 4

n

3 w

< n U

* U cu ti O Y

U a O w r v>

z W

VI O W 4 u 3 z O a U z w n

1 :i c

17

c ..

c r- i..

. . I'

k:: 1 ,-', . . . . . . . . .

1

t . . . .

..

1 9

p""

L.

I-

4..

i"

L ,I

C I

F

w

f c: c: F

*.-

r"

con la excepcion de la M. I fueron altos,fde 7.7 - 11.9 y en las M VI - X fue mas alto el IM cuyos valores fueron de 8.5 - 14.1.

MMC La muestra I no puedo ser analizada por cuestiones técnicas.

Los MN de este grupo no fueron muy constantes en las M I1 - V ya que sus valores fueron de . 7 a 8.1 y en los M VI - X el porcenta-

je de MN fue mas constante, de 2.6 a 3.6. El IM fue muy bajo en los

M I1 - V con valores de .4 - 1.4 y en l o s M VI - X fue un poco ma- yor, de .4 - 11.3. El comportamiento de la población fue muy irre-

gular en los M I1 - V ya que presentan valores de Des S de .4 - 6.4

y en las M VI - X fue mas homogénea la población con Des S de 1.9 -

2.6.

Lodos El porcentaje de MN es alto en las M I - V que va de 2.0 a 1 7 . 1

y en las M VI - X es menor ya que l o s vakres son de .9 a 6.4. El

comportamiento de la población es muy variable en las M I - V pre-

sentando valores de Des S entre .7 y 5.3 y en las M VI - X, la po-

blación es menos heterogénea yaque sus valores de Des S están en-

tre .6 y 3.8. El IM es bajo en las M I - V cuyos valores van de 2.5 a

9.5 y es mayor el IM en las M VI - X con valores de 6 . 1 a 1 1 . 3 .

Biodisco La muestra V no pudo ser analizada por cuestiones téanicas.

El porcentaje de MN fue alto en las M I - IV con valores de 4.1 a

11.6 y en las M VI - X fue bajo con valores de .2 - 5.6. E l compor-

tamiento de la población fue muy variable en 1 ~ 1 s M I - IV con va-

lores de Des S de .8 a 5.9 y el comportamiento de la población de

las M VI - X fue mas homogénea con valores de Des S de .2 a 3.2. EL

IM en las M I - IV fue de 2.4 a 11.2 y de las M VI - X fue de 1.1 a

r. 2 0

1 4 . 1 . En general ambos grupos de muestras presentan un I M moderado.

i.

P"

...

c

L <*

v.

c..

P.

*.<.

P*

Inf luente Las muestras 111, V I I 1 , I X y X no pudieron ser analizadas por

cuestiones técnicas. El porcentaje de MN en las M I , 11, I V y V

fue moderadamente altos con valores de 5.6 a 6.1 y en las M V I y

V I 1 fueron muy bajos con vabres de .9 y 1.5. El comportamiento de I

la población fue muy homogkneo con valore de Des C para las M I , 11,

I I V y V de 1.3 a 2 . 8 y en las M V I y V I 1 de .2. El I M fue en las M

I , 11, I V y V aumentando de 4 . 8 a 11.5 y en las M V I y V I 1 el I M

fue alto con valores de 10.5 y 12.5 respectivamente.

Di scusi Ón

I I

bo respuesta del sistema, esto es que el porcentaje de MN espontá-

neos en el grupo control fue menor que el porcentaje de MN produci- 1

De l o s 10 muestreos realizados s o l o el I , 11, V I , V I 1 y I X hu-

I

dos por el efecto de la MMC. En cambio las muestras 111, I V , V , V I 1 y

X,el indice espontáneo de MN en el control fue mayor que el porcen-

taje de MN producidos por la MMC.

De lo anterior, sin embargo, hay un punto muy importante. Se

puede observar que el I M del grupo de la MMC en las muestras donde

no hubo respuesta del sistema (111, I V , V , V I 1 y X) y de ig$aelrilmasr

nara-para- as-muestras donde hubo respuesta del sistema,fue mucho

menor que el grupo control. Por ejemplo, en la muestra V en el con-

trol se tiene 9% de MN en 1 0 . 2 % de I M y en la MMC se tiene 7 .3% de

MN en . 4 % de IM. Debido a esta gran diferencia de índices mitóticos

y producción de MN, se aplicó a l o s datos un ajuste por frecuencias

relativas. Se consideró a l o s valores del control de MN e I M como

l o s valores reales. Es decir, que al valor de I M de l o s controles

se les consideró como el 100% y a l o s valores del I M de l o s demas

w P

2 5 5

2 o 2

s

z a

w La

4

z

* cl

n H

v) w a 4 3 c3 4 rl w

z O

n

U

2

w ::

3 rl 4

w La

VI U > w

w a v) 4 u z w 3 u W ¡Y u. cí O a w w v) r, 3 4

Y

2

H

H > w La

O U

3 2

w a O

w VI

a W E z W In O w 4 u 3 z O a u

H

2 w La

U F4 w 3 a a

:: 2 W i-

H Q w a

3

U

W

O w z w

n

z w

Y

u . Y r l d In r. I

> M I. N M

O rl N UY m

H N 01 d O I

c ~ m In N Ln Y

* d M N m m

H Y N N r. rl r.

Lo rl rl

00 I rl d m H N rl rl

i 2 i 2 a i 2 a

al V I h O a l a

22

m > .rl ci cd rl al h

m .rl V

c, 2

a

al h L .. VI O La O cl

' O N .d rl

2 m al VI

O z .. I

I

M

m h 3 M .d !.4

!

I

rl..

r.: I:: c: r' I t..

T t..

"" L."

P* 8 '

.-J

n L; f-1 I c .. c c..

c*

. .> c

LI

c.

..I

ñ*

r 1 L"

1 i.. .

I"" L

c-

L..

r-

c, ,

C"

2 1

grupos se ajustaron a 1 0 0 % . Con este dato se ajustó el número de

MN de los grupos a 100% y se compararon los vabres reales del con-

trol (Tabla 2 y figura 3 ) .

Los resultados obtenidos por este - ajuste nosrnuestran a di-

ferencia de l o s resultados expuestos en la Tabla 1 que s i hubo res-

puesta del sistema en 9 de los 10 muestreos con la excepción de la

muestra 111.

Tanto con l o s datos reales y los datos ajustados no se encuen-

tra mutagenicidad en las aguas salvo en e l caso de la muestra I 1

en la que si se ve mutagenicidad detectada por el sistema.

En general se puede decir respecto a los dos grupos de habas

utilizados durante el experimento es que el grupo de habas de Pue-

bla fue mucho mejor. Esto es que el grupo de habas Puebla presentó

un índice de EN espontáneos mucho menor que el grupo de habas I N I A .

El indice mitótico fue mayor en las habas $uebla que el de las ha-

bas I N I A y e l comportamiento de la población fue mas homogeneo en

las habas Puebla que en las habas I N I A .

Conclusiones

I

Con los resultados anteriormente descritos se puede decir que

e l sistema s i responde al efecto de mutágenos, hubo respuesta del

sistema ante la concentración de MMC usada. Este compuesto es un

excelente control positivo pero la concentracion usada fue muy ele-

vada por lo que se deberá probar otras concentraciones menores.

/

N o se detectó mutagenicidad en las aguas,pero esto puede ser J

debido a que l o s mutágenos se encuentran en estas aguas muy dilui-

dos por l o que se recomienda que los tiempos de tratamientos sean

continuos sin recuperacioh, fijando a determinado tiempo durante va-

rios inttJrvalos. Esto es con el objeto de que pueda haber un efec-

to de acumulacion de l o s mutágenos en la raiz y de este modo pro-

vocar s u efecto.

I

El problema principal que se tuvo fue que las semillas dc ha-

ba con las que se trabajó traian un indice espontáneo de MN muy al-

to y que además estos se incrementaban al paso del tiempo, reducien-

do de esta manera la sensibilidad del sistema. Por este aspecto se

recomienda tomar en cuenta O factores importanes:

1. El investigador tendrá que sembrar sus propias habas tratando

l

de evitsr cualquier tipo de contaminación que pueda afectar a

sus habas

2. Se tendrá que trabajar en una zona aislada del laboratorio libre

de contaminantes (solventes, mutagenos, polvo, smog, etc) 1

3. Se deberá utilizar raices secundarias. Esto se recomienda de- I

bido a que si las raices primarias tienen una basal alta de MN

esto significa que e l meristemo primario estuvo en contacto con

algún mutdgeno desde su formacion en el embrion y / o hasta su al-

macenaje. En cambio las raices secundarias no se encuentran en

el embridn de la semilla, es decir, que se forman a partir de un

tejido ya diferenciado, el periciclo.Un meristemo primario con- I

taminado dará origen a células con anomalias, las cuales no pue-

den pasar por el proceso de diferenciación y formar parte de un

tejido ya diferenciado. Es por esto que las células del pericí-

clo son células que han pasado por un proceso de selección y

diferenciación asi que darán raices secundarias sin un índice

elevado de anomalias espont6neas.El trabajo con raices secunda- I I

rias dará algunas ventajas muy importantes:

L"

P"

L/

. F'

c: ir

c

**.

c

.... h-

25

I -se reducir; el indice espontáneo de MN

-la poblacion de células será mas homogénea ya que las raices

secundarias pueden considerarse como un individuo y además

estas empiezan s u desarrollo a un tiempo determinado

-se obtienen entre 5 - 8 raices secundarias por semilla

4 . El almacenaje de las semillas deberá de hacerse a 4 O C oonovon-

tilacidn. , / , I

I

I

E s imperativo realizar una prueba donde se analicen aberracio-

nes cromocómicas vs. MN para poder validar definitivamente dicha

prueba.

Los datos, por comunicacion personal con el Dr. Ma, deberán

de analizarse por medio de la prueba estadistica de Dunnett.

En caso de que las raices secundarias presenten l o s mismos pro- 4

I blemas que las primarias, por comunicación personal con el Dr. Sandhu,

el Dr. Ma y l o s Drs. Jorge López Saez y Matilde Navarrete, recomien-

d a la prueba de MN y aberraciones cromocómicas con Allium cepa: Para concluir, las raices que se utilicen ya sea de - - V.faba o

de - A.= y que se pongan en tratamiento con mezclas complejas (agua

residual y renovada) deberá cuidarse que las raices que se bornen

duras y de color cafe, se les deberá aplicar un mayor tiempo de hi- / 1

drólisis para que el colorante pueda penetrar a las células.

se tanatun 3 nuestras de agua por senma en 3 puitos diferentes de la planta de tratamiento üe agua residual de C.U. (influente, biodisco y lodos adivados) a io largo de 10 S ~ M M S y se midio su mtagenicidaa niediante la prueba de Mcrcmu- cleos en raiz prinwcia de Vicia faba. Dicha pNeba 6e m i 0 can un control m a - tivo con solucion Hcagland y un cantrol positiw CM Mitahicina C. A los resulta- dos obtenidos se les aplico un ajuste por frecwncias relativas y se two una Ixie M respiesta del sistenia en 9 de l o ~ 10 nuestreos (la -tra I11 rn two respies- ta) y solo en la nuestra 11 e l sis- pia0 detectar nutdqenicidad.

26

REFERENCIAS

Arora, O.P., Shah, V.C. y S.R. Rao. 1969. Studies on micronuclei induced by MMC in the root cells of - - V.faba. Exptl. Cell Res. 56: 443 - 448. -

Conger, A. y L.M. Fairchild. 1953. A quick freeze method for I O ,

making smear slides permanents. Stain Technol. - 18: 281 - 283.

Constantin, M.J. y E.T. Owens. 1982. Instroduction and perspectives o f plant genetic and citogenetic assays. A report of the U.S. Environmental Proteccion Agency, Gene-Tox Program. Mutation Research 99: 1 - 12. -

Cortinas de Nava, C., Ostrosky de Wegman, p . y S.C. Galván. 1980. Principios de mutagénesis y su relacion con carcinogenesis y teratogénesis. Mexico. 28p.

Darlington, C.D. y L.F. La Cour. 1976. The handling of chromosomes. Allen and Unwin, London. 201p.

Degrassi, F . y M. Rizzoni. 1982. Micronucleus test in Vicia faba root tips to detect mutagen damage in fresh water pXiXioiiF Mutation Research 97: 19 - 33.

macológicas de la terapeutica. S.A., Buenos Aires.

Instituto de Investigaciones Biomddicas, UNAM,

- Goodman Cilman, A., Goodman L.S. y A. Gilman. 1982. Las bases far-

Editorial Médica Panamericana

Kihlman, B.A. 1966. tice-Hall, Inc.

Kihlman, B.A. 1971. on chromosomes. for their detec Press, New York

Kihlman. B.A. 1977.

Action of chemicals on dividing cells. Pren- Engelwood Cliffs, New Jersey. 122p.

Root tips for studing the effects of chemicals In: Chemical mutagens. Principles and methods ion. Vol. 2 Edited by A. Hollaender, Plenum 489 - 514p.

Root tips of Vicia faba for the study of chro- mosomal aberration. In: H a n d b o r n ZXZgenicity procedures. Edited by M. Legato, W. Nichols, B.J. Kilbey and C. Ravol, Elsevier, Amsterdam. 389 - 400p.

Ma, T.H. 1982. Vicia cytogenetic test for environmental mutagens. A report of t h e . S . Environmental Protection Agency, Gene-Tox Program. Mutation Research - 99: 257 - 271p.

Sandhu, S . 1980. Potential utility of plant test systems for en- vironmental monitoring: an overview. In: Short term bioassays

r

27

c

i...

in the analysis of complex environmental mixtures 11. Edited by M.D. Waters, S. Sandhu, J.L. Huisingh, L. Claxton and S . Nesnow, Plenum Press, New York. 203 - 210p.

Sharma, A . K . y A. Sharma. 1972. Chromosome technique, theory and practice. Butterworths London, University Park Press, Balti- more. 5 7 5 p .