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Identificación de subproductos y posibles daños celulares en Helicobacter pylori por acción del cloro y el ozono en agua potable . Jefe de proyecto: Ma. Teresa O rta de Velásquez Participantes Académicos : M. en C. Isaura Yáñez Noguez, Dr. Ignacio Monje Ramírez, - PowerPoint PPT Presentation
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Identificación de subproductos y posibles daños celulares en Helicobacter pylori por acción del cloro y el ozono en agua potable.
Jefe de proyecto: Ma. Teresa Orta de Velásquez
ParticipantesAcadémicos: M. en C. Isaura Yáñez Noguez, Dr. Ignacio Monje Ramírez,Fac. de medicina: Dra. Yolanda López Vidal, Dr. Gonzalo Castillo
Becarios:Maestría. Beatriz Casasola RodríguezLicenciatura. Priscila Ivette Román RománMarié Andreé Pierdat GallardoSalvador Rangel Guadalupe
Proyecto Interno: 9361
Vigencia: 2010-2011
Helicobacter pylori es una bacteria asociada a gastritis crónica y adenocarcinoma.
• Helicobacter pylori
• GRAM (-)• 2-6 FLAGELOS UNIPOLARES• 2 FORMAS MORFOLÓGICAS (COCOIDE, BACILAR)• FORMA COLONIAS TRANSLUCIDAS DE 1 mm• MICROAEROFÍLICA• (2-5% O2 Y 5-10% CO2) EL O2 ES SU ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES
• TEMPERATURA ÓPTIMA 37 º C• NEUTRÓFILA CON CRECIMIENTO ÓPTIMO PH: 5.5-8• REQUIERE MEDIOS COMPLEJOS, COMPLEMENTADOS CON
AGAR SANGRE Y SUPLEMENTOS DENT Y SKIRROW• ES DETECTADA AL AGREGAR TRIFENILTETRAZOLIO (TTC)• UREASA, CATALASA Y OXIDASA (+)• CATABOLIZA GLUCOSA SOLAMENTE• AMINOÁCIDOS Y UREA, FUENTE DE NITRÓGENO
Debido a su importancia, ha cobrado interés a nivel mundial:
En 1994 (IARC) y (OMS), lo clasificaron como carcinógeno de clase I dentro de los agentes causales.
2005 Marshall y Warren obtuvieron el premio nobel en medicina por el descubrimiento de la implicación de la bacteria en úlceras pépticas y gástricas.
*OMS 2008 México Mundial
• 50% de la población mundial está infectada
• 80% en países en desarrollo• Infectados con H. pylori
• 20% desarrollará cáncer gástrico
• 20% desarrollarán úlcera péptica.
Formas morfológicas transmisibles de H. pylori
BacilarEn cuerpo humano y
condiciones de laboratorio
Viable , Cultivable. Apta para pruebas
médicas
Cocoide Forma resistente en el
ambiente acuático
Viable no cultivable (VNC)
Apta para pruebas de desinfección en
condiciones naturales
No viable
• Azevedo et al. 2007 proponen que la forma cocoide es la forma en la que la bacteria se encuentre en el medio ambiente
Detección
• Inmunoensayo enzimático• Prueba de actividad de ureasa• Hibridación fluorescente in situ FISH:
(Fluorescent In Situ Hybridization)• PCR (polymerase chain reaction) en tiempo real
• Debido a que la forma (VNC) es la que se encuentra presente en los sistemas acuáticos, se utilizan diversos métodos que no involucran el crecimiento de la bacteria.
- PCR Técnica cuantitativa- PCR Detecta en tiempo real la amplificación de nuestro genoma de interés.
Se ha detectado HELICOBACTER PYLORI en:
• Agua superficial (Cutzamala).
• Agua residual tratada usada para riego (Xochimilco).
• Agua residual sin tratamiento (Gran Canal/Río de los Remedios).
Métodos más empleados para Desinfección
• Económico y eficaz• Buenas propiedades residuales• 1.1 mg/L residual
• Formación de trihalometanos en presencia de materia orgánica
(vegetal o animal) - Bromoformo
- Cloroformo
• Ozono
• Alto potencial de oxidación• Rápida descomposición• 0.1-0.4 mg/L residual
• Formación de subproductos en presencia de materia orgánica y bromuros.
-Bromato (25 μg/L)-Bromoformo
• Cloro• Hipoclorito y monocloramina (NH2Cl)
H. pylori ha mostrado resistencia a los niveles
habituales de cloro, por lo que la bacteria puede
permanecer viable el tiempo suficiente para llegar a
la población.
Buscar alternativas eficaces en los procesos de tratamiento de agua
potable y de reuso.
El tratamiento con ozono es una tecnología factible de desinfección
(Thanomsub 2002). Usó cultivos aplicando altos tiempos de contacto.
Daño en membrana
Desinfección
Objetivos específicos:
1. Cuantificar la densidad celular de H. pylori, para determinar la inactivación
aplicando la técnica de PCR en tiempo real.
2. Determinar posibles alteraciones en el DNA de H. pylori aplicando la técnica
de PCR el tiempo real.
3. Determinar posibles alteraciones en la estructura celular de H. pylori por
medio de microscopía electrónica.
4. Evaluar subproductos derivados de la desinfección con ozono .
OBJETIVO
Helicobacter
pylori
Establecer las dosis del ozono y cloro, así como tiempos de contacto necesarios para inactivar la bacteria H. pylori inoculada en una muestra sintética y en agua de pozo.
Suspensión bacterianaEn agua
Concentración conocida con PCR-tiempo real
Medición de concentración de
la densidadcon PCR-tiempo
real
Medición de subproductos por cromatografía de
gases
Daño en membranaMicrografía electrónica
METODOLOGÍA
13 ml de agua6x106 UFC de H. pylori
3 min 5 min 10 min
Resultados
Determinación de la solubilidad del
ozono en agua destilada
Para realizar los ensayos de desinfección
fue necesario obtener una solución
acuosa saturada de ozono, ya que no es
posible ozonizar directamente las
muestras sintéticas con H. pylori. Debido
a que se trabaja con volúmenes muy
pequeños de agua y las dosis de ozono
son bajas.
El Dr. Castillo de la Facultad de medicina recomendó promover las formas cocoides y realizar los ensayos de desinfección dentro de un periodo de 22 días posteriores.
Se realizaron diferentes ensayos, sin embargo no se observó crecimiento bacteriano en ninguna de las placas de agar.
Probablemente la bacteria sufre lisis por choque osmótico al entrar en contacto con el agua destilada.
Se efectuó el mismo ensayo, sustituyendo el agua destilada por Solución Salina Isotónica para determinar tiempo de vida de la forma bacilar de H. pylori en ella, sin embargo tampoco se obtuvo crecimiento de H. pylori en ninguna de las placas. Se determinó un tiempo de vida corto de la forma bacilar de H. pylori en agua destilada.
Debido a los resultados obtenidos se evaluó la posibilidad de trabajar con las formas cocoides, ya que estas son las que se encuentran en medios acuáticos como forma de resistencia de la forma bacilar de H. pylori.
Helicobacter pylori será proporcionada por la Facultad de Medicina (UNAM. 26695)
Suspensión celulares con 3x105 UFC/mL
Se incubó a temperatura ambiente en condiciones aeróbicas para inducir la transformación de las formas bacilares a formas cocoides.
Se realizaron tinciones de Gram de las 3 suspensiones a los 5, 6 ,7 y 10 días. En todos los casos se observaron formas bacilares y formas cocoides, pero las estructuras cocoides fueron aumentando
progresivamente y cada vez se observaron menos formas bacilares.
Al décimo día se obtuvo una suspensión que contiene más del 80% de las formas cocoides. (Tinción Gram)
Con esta suspensión se pretende trabajar para realizar los ensayos de desinfección.Los resultados que se obtengan serán de mayor relevancia debido a que las formas
cocoides de Helicobacter pylori juegan un papel importante en el proceso de transmisión por su capacidad de persistencia en ambientes acuáticos.
RESULTADOS
Bacilar
Cocoide
Obtención de las formas cocoides
Suspensión bacterianaFORMAS COCOIDES
Concentración inicial con PCR-tiempo real
Medición de concentración
con PCR-tiempo real
Medición de subproductos por cromatografía de
gases
Daño en membranaGenotoxicidad
ACTIVIDADES SEGUNDO AÑO