L g i o t e n s i n a ii - Páginas - bradicinina...terior, se llevaron a cabo experimentos de patch–clamp en fijación de voltaje, en la configuración de célula entera (whole–cell)

La bradicinina incrementa una corrien-te de potasio tipo rectificador tardío

en tiempo y forma, como Lo hacen La an-giotensina ii y agonistas muscarínicos

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

Ricardo Duarte JáquezRector

David Ramírez PereaSecretario General

Manuel Loera de la RosaSecretario Académico

Daniel Constandse CortezDirector del Instituto de Ciencias Biomédicas

Luis Enrique Gutiérrez CasasCoordinador General de Investigación y Posgrado

Ramón Chavira ChaviraDirector General de Difusión Cultural y Divulgación Científica

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

eduardo iván acosta gómez

ciencias naturaLes y exactas

CoordinaCión General de investiGaCión y PosGrado

La bradicinina incrementa una corrien-te de potasio tipo rectificador tardío

en tiempo y forma, como Lo hacen La an-giotensina ii y agonistas muscarínicos

Lisbeily Domínguez Ruvalcaba Coordinadora de la ColeCCión

Acosta Gómez, Eduardo Iván.

La bradicinina incrementa una corriente de potasio tipo rectificad tardío en tiempo y forma, como lo hacen la angiotensina II y agonistas musca-rínicos / Eduardo Iván Acosta Gómez. Ciudad Juárez, Chih. : Universi-dad Autónoma de Ciudad Juárez, 2013. (Colección Textos Universita-rios, Serie Investigación)

44 p.; 30 cm.

Incluye bibliografía Colección Reportes Técnicos de Investigación ISbN: 978-607-7953-80-7Serie IIT, Vol. 8. ICb: 978-607-9224-98-1

Contenido:

1.– Introducción. 2.– Planteamiento. 3.– Metodología. 4.– Resultados. 5.– Conclusión. 6.– Referencias. 7.– Anexos.

D. R. © Acosta Gómez, Eduardo Iván.

La edición, diseño y producción editorial de este documento estuvo a cargo de la Direc-ción General de Difusión Cultural y Divulgación Científica, a través de la Subdirección de Publicaciones.

índice

Resumen 7Palabras clave 8Abstract 9Keywords 10Usuarios potenciales 10Reconocimientos 10

i. introducción

ii. pLanteamiento

iii. metodoLogía

Cultivo celular 19Registros electrofisiológicos 20

iv. resuLtados

Caracterización y viabilidad de neuronas del GCS de rata 23La BK mimetiza el efecto modulador de agonistas muscarínicos y de la Angio II sobre la IKV 27

v. concLusión

vi. referencias

vii. anexos

Anexo A 42

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resumen

Es bien sabido que la bradicinina (bK) vía receptores a la bradicinina tipo 2 (b2), excita a las neuronas simpáticas. Los efectos de este péptido, imitan en parte las acciones estimuladoras de la angiotensina II (Angio II), agonistas muscarínicos o de la acetilcolina, sobre neuronas del ganglio cervical supe-

rior (GCS). Por ejemplo, la despolarización de estas neuronas conlleva a la subsecuente liberación de norepinefrina (NA). Agonistas muscarínicos (Oxo – M), Angio II y bK, modulan la corriente de potasio Tipo M (IKM), y la corriente de calcio Tipo N (ICaN). Re-cientemente hemos encontrado que receptores a la Angio II, así como agonistas mus-carínicos, modulan a la corriente de potasio tipo rectificador tardío (IKV). Con base en lo anterior, en este proyecto se llevó a cabo, en primera instancia, la estandarización y posterior obtención de neuronas del GCS, en cultivo primario. Una vez hecho lo an-terior, se llevaron a cabo experimentos de patch–clamp en fijación de voltaje, en la configuración de célula entera (whole–cell) en las neuronas mencionadas para ver en parte la viabilidad celular en estos cultivos. Lo anterior correspondió a la obtención de corrientes características de estas neuronas ya descritas a detalle por otros investiga-dores (INa, IK sensibles al calcio y por supuesto a IKM e IKV) que sugieren la viabilidad de estas células en cultivo primario. Posteriormente, se procedió a ver el efecto de la bK sobre la IKV en estas neuronas, se observó un incremento de esta corriente con una EC50= 59.3 nM, obtenida a partir de una curva dosis–respuesta. Apegado a lo anterior, se llevó un análisis más a detalle del efecto de la bK sobre la IKV donde se observa que hay un corrimiento de las curvas corriente–voltaje de la IKV control, y con bK hacia la izquierda de 4.9 ± 0.7 mV. Al ver que la bK (500 nM) mimetiza el efecto de la Oxo–M (10 μM) y de la Angio II (500 nM) de incrementar a la IKV con valores de 13.9 ± 1.1 (n= 7), 10.4 ± 0.9 (n= 9) y 11.7 ± 1 (n= 7) pA/pF respectivamente a concentraciones supra molares. Y de igual manera, las constantes de tiempo (τ) obtenidas a partir del curso temporal del efecto de la bK, Angio II y Oxo–M, siendo éstas muy parecidas de 19.0 ± 4.1, 18.7 ± 2.2 y 17.7 ± 3.9 s, respectivamente. Estos resultados nos pueden estar sugi-riendo que estos receptores utilizan las mismas o parte de las cascadas de señalización involucradas en la modulación de la IKV en neuronas GCS. Sabiendo esto, se comenzó al esclarecimiento de la cascada de señalización involucrada en la modulación de IKV por

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La bradicinina incrementa una corriente de potasio tipo rectificador tardío en tiempo y forma, como lo hacen la angiotensina II y agonistas muscarínicos

bK. Primero se evaluó si el efecto de la bK sobre la IKV es sensible a la diálisis de 2 a 4 minutos, y se encontró que hay una caída del incremento generado por la bK sobre la IKV de 15.9 ± 1.4 a 8.6 ± 1.3 pA/pF (n= 5 para ambos casos). Este dato es muy similar a lo reportado por Acosta y cols., 2007, sobre el efecto de la diálisis en el incremento de la IKV por Angio II. Conjuntamente, se quiso evaluar la participación de la vía del adenosin mono fosfato cíclico (AMPc), en la modulación de la bK sobre la IKV y con esto empezar a indagar cuál proteína G pudiera estar involucrada. Lo anterior se llevó a cabo con un activador de la adenilato ciclasa, Forskolina; sin embargo, se encontró un efecto de bloqueo sobre la corriente rápido y reversible, al parecer independiente del AMPc, su-giriéndonos un bloqueo directo del fármaco sobre el canal generador de la IKV.

Palabras clave: bradicinina, Corrientes de potasio, Mimetización.


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abstract

It is well known that bradykinin (bK) imitates some of the stimulating actions of Angiotensin II (Angio II), muscarinic agonists and acetylcholine, over neurons of the superior cervical ganglion (SCG). For example, these neurons depolariza-tion, leads to the subsequent norepinephrine (NA) secretion. Muscarinic agonists

(Oxo–M), Angio II and bK modulate the potasium current type M (IKM) and the calcium current type N (ICaN). Recently we have found that the receptors for Angio II, as Oxo–M, modulate the delayed rectifier type potassium current (IKV). based on the above, this proyect started first of all with the standardization and extraction of neurons from the SCG, and placed on the primary culture. Once the above took place the experiment with patch–clamp technique with the voltage clamp, and the whole cell fixation of the mentioned neurons, this last remark with the purpose of proving the cell viability in the culture. The preview corresponded to the derivation of characteristic currents from this neurons already widely described by other investigators (INa, IK calcium sensitive and of course to IKM and IKV as well) that suggest the viability of these cells in a primary culture. After this we proceeded to observe the bK effect over the IKV of these neurons, we observed an increase of this current with an EC50= 59.3 nM, obtained from a dose–response curve. Along with the previously stated a more detailed analysis was made on the effect of the bK over the IKV where it was observed that there is a current curve shifting–IKV control voltage and a shift to the left of 4.9 + 0.7 mV with bK. As we ob-serve that the bK (500 nM) mimics the Oxo–M (10 μM) and Angio II (500 nM) increas-ing IKV effect with values of 13.9 ± 1.1 (n= 7), 10.4 ± 0.9 (n= 9) y 11.7 ± 1 (n= 7) pA/pF respectively to supramolar concentrations.

Likewise for the time constants (τ) obtained from the natural temporal course of the bK, Angio II and Oxo–M effect, this lasts being very similar to 19.0 ± 4.1, 18.7 ± 2.2 y 17.7 ± 3.9 s respectively. These results may be suggesting that these receptors use the same or a part of the signaling cascade involved in the modulation of IKV in the SCG neurons. With this acknowledgement we began the clarification of the signaling cas-cade involved in the modulation of IKV by bK. First we evaluated if the effect of the bK over the IKV is sensitive to a 2 to 4 minutes dialysis, in which it was found that there was a fall in the increase generated by the bK over the IKV of 15.9 ± 1.4 to 8.6 ± 1.3 pA/

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pF (n= 5 for both cases). This is a fact similar to the one reported by Acosta and cols. 2007, about the dialysis effect in the IKV increase by Angio II. Jointly, we wanted to evaluate the cyclic adenosine monophosphate (AMPc) participation in the nodulation of the bK over the IKV and with that begin to search which protein G could be involved. This last remark took place with adenylate cyclase activator, Forskolin, however we found a blocking effect over the fast current and also reversible, apparently AMPc in-dependent, suggesting a direct block from the block over the IKV generator channel.

Keywords: bradikinin, Potassium Current, Mimic.

Usuarios potenciales: Fisiólogos, farmacólogos, médicos, alumnos de licenciatura y posgrado en áreas

básicas y de la salud.

Reconocimientos: En primera instancia un reconocimiento al Instituto de Ciencias biomédicas de la

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, ya que es la que nos brindó tanto las ins-talaciones como equipo necesario. También es importante mencionar al PROMEP, ya que gracias a esta institución se obtuvieron los rubros necesarios para la compra de reactivos y material consumible utilizados. De igual manera un agradecimiento muy especial al M. en C. blas Humberto Ibarra Retana, por su apoyo incondicional en los problemas que surgieron durante la realización de este proyecto de investigación. Por último, a la médico Edith Sandoval por la traducción del resumen.


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i. introducción

La coordinación de las funciones celulares reside en las habilidades que tie-nen las células para traducir un estímulo extracelular a respuestas celula-res apropiadas. Estas respuestas celulares están dictaminadas por la na-turaleza de las vías de señalización intracelular que inicialmente desenca-

denan los receptores celulares. Sin embargo, en las células, el número de proteínas de señalización intracelular es limitado, siendo estas proteínas blancos moleculares de múltiples receptores de membrana (Delmas y cols., 2002). Durante décadas se ha preguntado cómo los mismos receptores, que se acoplan a proteínas traductoras de información y sistemas de segundos mensajeros idénticos, pueden producir se-ñales diferentes, o bien, varios receptores diferentes puedan llevar a cabo cascadas de señalización iguales. En relación a la excitabilidad celular, se puede decir que la modulación de canales iónicos por receptores acoplados a proteínas G, es uno de los principales mecanismos para la regulación de excitabilidad neuronal (Hille b. 1994). Por ejemplo la bK, un péptido generado en el plasma sanguíneo por daño tisular y que es formado a partir de kininógenos, por la acción de las kalicreínas. Este péptido contribuye a la estimulación de neuronas simpáticas (Lewis y Reit., 1965, 1966) y en parte gracias a esto, es un potente mediador de la inflamación y de la hiperalge-sia. Dado lo anterior, que es un modulador de la actividad simpática y, por ende, de muchos procesos fisiológicos que están en cercana relación con el sistema nervioso autónomo, es bien sabido que este efecto lleva a un aumento de la excitabilidad, con el subsecuente aumento de la liberación de noradrenalina. Lo anterior ha sido estudiado en varios animales de experimentación (Chulak y cols., 1995). Este efecto específicamente se debe a que es un potente inhibidor de la IKM (corriente de potasio de bajo umbral, que es uno de los mayores componentes que mantiene el potencial de reposo en la membrana) en neuronas simpáticas (Jones S y cols., 1995). El efecto esti-mulador de la bK sobre el receptor b2, así como muchos otros receptores (estudiados a detalle), por citar alguno, al receptor muscarínicos tipo 1 (M1) y varios receptores estimulados por péptidos como la Angio II (AT1), inhiben de similar manera a corrien-tes de potasio Tipo M, vía segundos mensajeros (byung-Chang y cols., 2004; Zaika y cols., 2006; Jones y cols., 1995; Cruzblanca y cols., 1998; Scholze y cols., 2002). Sin

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embargo, estos neurotransmisores o péptidos, no sólo tienen efectos sobre la IKM, sino que también lo hacen sobre un sinnúmero de canales iónicos que no han sido estudia-dos a detalle, como la IKM y la ICaN. Un ejemplo de lo anterior es el caso de la corriente de potasio tipo rectificador tardío, IKV, parte central de este trabajo; recientemente se ha encontrado evidencia de que la IKV también es parte fundamental en el aumento de la excitabilidad celular, que se traduce como aumento en el número de potenciales de acción generados en neuronas del GCS de rata (Malin y Nerbonne, 2002), contri-buyendo con esto en la modulación y mantenimiento de la presión arterial. Se sabe al respecto que la Oxo–M, así como la Angio II, tienen efecto modulador sobre esta corriente (Cruzblanca H., 2006; Acosta y cols., 2007). Por otra parte, poco o nada se conoce respecto a la modulación de la bK sobre la IKV , sin embargo, toda la evidencia apunta a que la estimulación de estos receptores podría estar utilizando las mismas o parte de las cascadas de señalización para la modulación de la IKV


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ii. pLanteamiento

La función de comunicación celular con el entorno, se inicia con la percepción del mensaje externo, función llevada a cabo por proteínas receptoras. Una vez captado el estímulo, éste se traduce en un mensaje interno a través de distin-tos mecanismos de señalización celular. Estos mecanismos transmiten seña-

les que resultan en la regulación de funciones celulares determinadas, dependiendo de los receptores membranales que reciben señales específicas y llevan a la célula a seguir un mecanismo específico de señalización. Actualmente se sabe que múltiples casca-das de señalización en una misma célula comparten numerosos componentes. Esta promiscuidad puede entenderse por el hecho de que todas estas vías se encuentran interconectadas y, con esto, las respuestas pueden generarse de forma más rápida y eficiente (Pujades, 2000). Comprender cómo la célula recibe y coordina señales del en-torno inmediato y de otras células del organismo, es esencial para entender los procesos fisiológicos celulares básicos. Este conocimiento a nivel celular es indispensable para comprender cómo se regulan variables fisiológicas sistémicas como la presión arterial, la osmolaridad del plasma sanguíneo o la excitabilidad del sistema nervioso.

La modulación de canales de K+ es uno de los más importantes mecanismos usa-dos por receptores acoplados a proteínas G (GPCR), para regular la excitabilidad neuronal. Por mencionar alguno, en neuronas simpáticas de rata del ganglio cervical superior (GSC) los receptores muscarínicos M1, angiotensina II AT1 y bradicinina b2, incrementan la probabilidad de disparo de potenciales de acción, a través de la inhi-bición de la corriente de potasio tipo M (IKM) (Delmas y brown, 2005). En relación a la modulación muscarínica por los GPCR para cerrar a los canales M (Kv7.2/Kv7.3) y con esto inhibir a la IKM, son ya identificados. Se acepta que la señal que inhibe a los canales M es la disminución de la concentración del fosfolípido fosfatidil inositol 4-5-bifosfato (PIP2) (Suh y Hille, 2002; Suh y cols., 2004; Zhang y cols., 2003; Zaika y cols., 2006; Winks y cols., 2005). La depleción del PIP2 se debe a la activación de la proteína Gq y de una fosfolipasa tipo C (PLC) (Delmas y brown, 2005). La identificación de las moléculas involucradas en la modulación de IKM se ha llevado a cabo fundamen-talmente en las neuronas GSC. Se sabe que esta corriente de K+ es modulada por el receptor M1, dado que la inhibición que produce este receptor es bloqueada por el

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ii. pLanteamiento

antagonista del receptor M1 pirenzepina, pero no por el antagonista del receptor M2, himbacina (bernheim y cols., 1992; Marrion y cols., 1989). Este hallazgo fue confir-mado cuando el gene que codifica al receptor M1 fue eliminado genéticamente (Hamil-ton y cols., 997); sin embargo, con lo que respecta a la modulación de IKM por agonis-tas muscarínicos, en las neuronas del hipocampo de este mismo ratón Knock-out, la inhibición muscarínica de IKM permanece intacta (Rouse y cols., 2000). Lo anterior indica que más de un tipo de receptor muscarínico puede contribuir a la modulación de IKM. El análisis de las proteínas G involucradas en la modulación muscarínica de la IKM mostró que el principal mediador es la proteína Gq. Este hallazgo fue reiterado en neuronas del GSC, donde se utilizaron los antisentidos contra Gα11, Gαq o Gαo, para bloquear transitoriamente la expresión de sus respectivos genes. En estas con-diciones la inhibición de IKM sólo fue significativamente reducida en aquellas células inyectadas con el antisentido contra Gα (Haley y cols., 1998). En un estudio posterior se encontró que en la ausencia de Gαq, Gα11 puede sustituir a la primera para mante-ner intacta la inhibición muscarínica de IKM (Haley y cols, 2000b). No obstante que Gαq y Gα11 estimulan a la fosfolipasa C-β (PLCβ), con la 2+ consecuente producción de diacilglicerol (DAG), inositol trifosfato (IP3) y liberación de Ca, estos segundos men-sajeros no parecen intervenir en la inhibición muscarínica de IKM (Cruzblanca y cols., 1998; del Río y cols. 1999). En el mismo sentido, también se ha estudiado a detalle el efecto de la Angio II, que mimetiza a los agonistas muscarínicos, sobre la excitabili-dad, y de igual manera, inhibe a la IKM de las neuronas GCS. Una de estas acciones consiste en disminuir la conductancia total de la membrana debida a la inhibición de la IKM (Shapiro y cols., 1994). En estas neuronas simpáticas, la Angio II también inhibe a la corriente de calcio (Ica), vía el receptor AT1 y una proteína G insensible a la PTX (Shapiro y cols., 1994). Al respecto, se propone que ambas corrientes iónicas son moduladas por similares vías de señalización. Algunos datos sugieren que en la acción de la Angio II está involucrada una proteína Gq, esto debido a que:

datos indirectos han demostrado que Ga. q interviene en la inhibición muscaríni-ca de IKM (Haley y cols., 1998; Haley y cols., 2000). datos indican que el péptido, antagonista GP-2A, así como la sobreexpresión de b. RGS2 (bloquean específica a Gq/11) reducen la modulación angiotensinérgica de IKM (Acosta, 2004, Acosta, 2007b). Un estudio realizado por Zaika y colaborado-res en el 2006 sostienen que la modulación angiotensinérgica de la IKM también se debe a la depleción del PIP2 por la PLC e independiente de aumento del calcio intracelular. Hoy la comunidad científica acepta que la inhibición de la IKM por agonistas muscarínicos, así como por Angio II, es debida a la depleción de los niveles de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) de la membrana celular (Suh y cols., 2006; Winks y cols., 2005; Zaika y cols., 2006).

Con lo que respecta a la modulación de la IKM por la bK en neuronas GCS, esta


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ii. pLanteamiento

corriente también es inhibida, específicamente por el receptor b2; esto se encontró ya que cuando se utilizó un antagonista selectivo de los receptores b2 como es el Hoe 140, al estimular con bK no se observó ningún efecto inhibitorio de la IKM (Jones y cols., 1995). En la inhibición de la IKM por el receptor b2 está involucrada una proteína Gq/11; esto se concluye porque al utilizar un anticuerpo contra la subunidad Gαq/11 el efecto inhibitorio de la bK se reduce. En el ratón Knock-out para Gq el anticuerpo contra Gq/11 bloquea el efecto inhibitorio de la bK, indicando que el receptor b2 se acopla prefe-rentemente con G11 para inhibir a la IKM (Haley y cols., 2000a). Al igual que con la vía muscarínica y angiotensinérgica, se conoce con razonable detalle el resto de la cascada de señalización usada por el receptor b2. Evidencia obtenida con antisentidos muestra que está involucrada específicamente la enzima fosfolipasa Cβ4; ya que en neuronas inyectadas con el antisentido contra la PLCβ4, no hubo ningún efecto inhibitorio de la bK. En contraste, sí se observó efecto en neuronas inyectadas con antisentidos contra la PLCβ1 y PLCβ3, ya que estas isoformas de fosfolipasas β también se expresan en las células GSC (Haley y cols., 2000b). Una vez activada la PLCβ4, ésta hidroliza al PIP2; al respecto, se ha demostrado que el IP3 y la posterior liberación de Ca2+ desde depósitos sensibles al IP3 es la señal que dispara la inhibición de IKM (Cruzblanca y cols., 1998). Esta conclusión se alcanzó porque: 1) al utilizar una concentración (20 mM) bAPTA el efecto inhibitorio de la bK fue menor en comparación con una baja concentración (0.1 mM) de bAPTA; 2) al medir la concentración de Ca2+ intracelular se observó que hay un aumento de este ión siguiendo un curso temporal similar al de la inhibición de la IKM (Cruzblanca y cols., 1998).

Evidencia posterior apoya la idea de que el Ca2+ al unirse a la Calmodulina (CaM), dicho complejo interacciona con la región C-terminal de las subunidades KCNQ del canal M, particularmente en el dominio IQ, ya que éste contiene isoleucina y glutami-na (Yus y cols., 2002; Wen y Levitan, 2002). Se sugiere que la CaM puede actuar como un sensor de Ca2+ y así puede mediar la modulación dependiente de Ca2+. Para poder demostrar lo anterior, se llevaron a cabo experimentos en neuronas GSC expresando un dominante negativo de la CaM, en donde no se observó un efecto significativo de la bK, por lo que se deduce que en la modulación de la IKM por la estimulación del receptor b2 el mensajero final es el complejo Ca2+- CaM (Gamper y Shapiro, 2003). También es bien sabido que las neuronas GSC expresan los dos tipos de receptores a la bK (Seabrook y cols., 1997); sin embargo, el receptor b2 es el más abundante y responsable de la mayoría de los efectos de la bK en estas neuronas. La estimulación de b2, al igual que el receptor AT1 y el M1, también estimula la liberación de nora-drenalina e inhibe a la IKM a través de la fosfolipasa C y la subsecuente liberación de Ca2+ desde depósitos sensibles al IP3 (Jones y cols., 1995; Hamilton y cols., 1997; Cruzblanca y cols., 1998; Haley y cols., 2000a; boehm y Kubista, 2002).

Otras corrientes de K+ activadas por voltaje, que contribuyen a regular la excitabili-

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ii. pLanteamiento

dad de las neuronas GCS, incluyen: 1) la rápida activación e inactivación de la corriente de K+ tipo A (IA); 2) otro tipo de IA pero con una inactivación lenta (IAS); 3) La IKV (Malin y Nerbonne, 2000). El relativo nivel de densidad de corriente de cada una de estas co-rrientes de K+ y su cinética, da el tipo de patrón de disparo en las células del GCS. (Ma-lin y Nerbonne, 2000, 2002; Wang y McKinnon, 1995). Además, hay diferencias sutiles a nivel molecular, que las neuronas GCS expresan IA e IKV, este último es generado por canales homoméricos formados por Kv2.1 y Kv2.2, donde sólo el Kv2.1 contribuye a la IKV, de tal modo que en estas células se expresan IA, IAS, IKV (Malin y Nerbonne, 2002). Los canales formados por Kv2.1 constituyen el mayor componente de la corriente de K+, tipo rectificador tardío en globo pálido, hipocampo y neuronas corticales piramidales (baranauskas y cols., 1999; Murakoshi y Trimmer, 1999). En estas neuronas centrales, los canales conformados por Kv2.1 preferentemente se localizan en el cuerpo celular y dendritas proximales (Hwang y cols., 1993; Misonou y cols., 2004); aquí regulan la excitabilidad somato-dendrítica dependiente de frecuencia (Du y cols., 2000). En neu-ronas del GCS, se sabe que agonistas muscarínicos y la Angio II incrementan, por un lado, a la IKV y, por otro, los mismos receptores anteriores, así como la bK, inhiben a la corriente de potasio tipo M (IKM). Estas dos corrientes iónicas en particular, al parecer son fundamentales para la estabilización de potenciales de acción de manera tónica (Malin y Nerbonne, 2002; Acosta y cols., 2007; Cruzblanca, 2006), sin embargo, el im-pacto de esta regulación por receptores acoplados a proteínas G o fármacos sobre estos canales involucrados en la generación de disparos o potenciales de acción repetitivos, no ha sido bien entendido y estudiado. En la actualidad se sabe con precisión muchos de los mecanismos y las cascadas de señalización que estos receptores emplean para inhibir a IKM e incrementar a la IKV.

Un dato de suma importancia es que, al igual que la IKM, la IKV también contribuye a definir los patrones de disparo neuronal, a través de su modulación por receptores muscarínicos y a neuropéptidos (Sumners y Gelband, 1998). Estudios posteriores han mostrado que la Oxo–M y la Angio II también modulan a la IKV generada por las neu-ronas GSC (Cruzblanca H, 2006; Acosta y cols., 2007). Se conoce que en neuronas del hipocampo, particularmente de la región CA1, los agonistas muscarínicos incrementan la corriente de K+ tipo rectificador tardío. En esta modulación se encontró que está in-volucrada una proteína G, ya que al utilizar el GTPγS hubo un incremento progresivo de la amplitud de la corriente de K+ y, al aplicar el agonista muscarínico carbacol, hubo un efecto de oclusión (Zhang y cols., 1992). En contraste, en neuronas donde se estimu-ló con el mismo agonista pero dializadas aquellas con el GDPβS, un inhibidor general de las proteínas G, no se observó dicho aumento de la corriente. Aparentemente, la fos-folipasa C es la vía que interviene en el aumento del rectificador tardío, dado que: a) la diálisis del IP3 ocluye el efecto del carbacol; b) al utilizar un quelante de Ca2+ (bAPTA), el efecto del carbacol no se observaba; c) los esteres de forbol que activan directamente a la proteína cinasa C dependiente de Ca2+ (PKC), también ocluyen el efecto del carba-col; d) por último se sugiriere que la modulación de IKV es dependiente de fosforilación. Para esto, dializaron en neuronas análogos del ATP (AMP-PNP o ATPγS), que subse-


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ii. pLanteamiento

cuentemente se estimularon con carbacol, observándose un decremento de la corriente con respecto al tiempo (Zhang y cols., 1992). Resuminedo lo anterior, en la modulación de la IKV por receptores muscarínicos en neuronas hipocampales, está involucrada una proteína G, la formación del IP3, con una subsecuente liberación de Ca2+ desde cister-nas intracelulares sensibles al IP3, donde posteriormente una PKC muy probablemen-te es la que modula a la proteína responsable de la corriente de potasio tipo rectificador tardío. Sólo falta conocer la identidad del receptor muscarínico involucrado en la mo-dulación del rectificador tardío de las neuronas del hipocampo.

Contrario a lo que sucede en el hipocampo, en las neuronas ventromediales del hipotálamo, el carbacol inhibe al rectificador tardío, efecto mediado por la subunidad α de la proteína G11. Este hallazgo es consistente con que: a) la diálisis del GDPβS reduce el efecto del carbacol; b) la toxina pertusis (PTX) y la toxina del cólera no blo-quean el efecto del carbacol, lo que descarta a las proteínas Go, Gi y Gs; c) en neuro-nas inyectadas con el antisentido contra Gq no bloquea la inhibición del rectificador tardío. Esto nos habla, entonces, de que en esta cascada de señalización está involu-crada una proteína G11 (Ffrench-Mullen y cols., 1994). Dado que G11 normalmente activa la vía de la fosfolipasa C, queda por confirmar la participación de esta cascada bioquímica en la inhibición del rectificador tardío.

Los ejemplos anteriores indican que la cascada de la fosfolipasa C, tiene un efecto opuesto, en las neuronas del hipocampo y del hipotálamo, sobre el mismo rectificador tardío. Se desconoce la razón de esta discrepancia, aunque una posibilidad es que la constitución molecular de los canales iónicos que generan la corriente rectificadora tardía, sea diferente en ambos tipos de neuronas centrales. Alternativamente, los efectos del carbacol pueden estar mediados por distintos receptores muscarínicos. Otro ejemplo de dualidad se ha reportado en la acción de la Angio II sobre el rec-tificador tardío generado en neuronas de rebanadas mixtas de hipotálamo y tallo cerebral. En estas células la estimulación del receptor AT2 se traduce en aumento del rectificador tardío, mientras que el receptor AT1 tiene un efecto inhibitorio. El grupo de Sumners se ha dedicado a identificar las cascadas de señalización respectivas. Al respecto, hay suficiente evidencia de que la acción del AT1 está mediada por la proteí-na Go y el resto de la cascada lo integran la fosfolipasa Cγ, el complejo Ca2+-CAM y las proteínas cinasas PKC y CAMII (Sumners y cols., 1996; Wang y cols., 1997a, 1997b; Zhu y cols., 1999). Por su parte, el receptor AT2 utiliza una proteína G PTX insensible que se acopla a la fosfolipasa A2 y la rama 12-HETE de la vía del ácido araquidónico (Kang y cols., 1994; Zhu y cols., 1998; Zhu y cols., 2000).

En lo que respecta a estudios recientes, hemos reportado que en las neuronas GSC la corriente de K+ tipo rectificador tardío IKV es blanco de los agonistas muscarínicos y de la Angio II. Por el momento, hemos identificado los receptores involucrados y carac-terizado parcialmente sus respectivas cascadas de señalización. En estas neuronas, el receptor muscarínico del tipo M2 y el receptor AT1 tienen el efecto de aumentar la IKV (Cruzblanca, 2006; Acosta y col., 2007a). Esto mismo sucede cuando se aplica el neuro-péptido bK. Sin embargo, se desconoce la identidad del receptor involucrado, como los

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elementos involucrados en la modulación de la IKV (Acosta, 2004). Por ahora podemos afirmar que la modulación muscarínica y angiotensinérgica de la IKV tienen las si-guientes propiedades: a) la modulación es sensible al inhibidor general de las proteínas G, GDPβS; b) los receptores M2 y AT1 se acoplan a una proteína G insensible a la PTX; c) la modulación muscarínica y angiotensinérgica es reducida por el análogo no hidro-lizable del ATP, AMP-PNP; d) la estimulación del receptor M2 ocluye la acción del AT1 y viceversa. Estos resultados indican que ambos receptores podrían estar empleando la misma cascada de señalización. A falta de demostrarlo, también podría estar utili-zando esta cascada de señalización la bK. Por otra parte, hemos encontrado ciertas diferencias entre la modulación de IKV e IKM, particularmente la angiotensinérgica, que nos sugiere que en ellas participan distintas rutas bioquímicas. Por ejemplo:

El curso temporal de la modulación de Ia. KV (τ = 29.3 ± 2.8 seg) es ostensiblemen-te lento en comparación con la modulación de IKM (τ = 10.8 ± 0.5) (Acosta 2004). Sin embargo, en relación con la evidencia de la modulación de la IKM por los receptores AT1, M1 y el receptor b2, que comparten los mismos efectos celula-res, es posible que este último también tenga una acción moduladora sobre la IKV. Esta posibilidad se refuerza, ya que en el músculo liso y en la línea celular HEK 293, los receptores AT1 Y b2 forman heterodímeros, y esta interacción di-recta se traduce en incremento en la activación de las proteínas G, a las cuales se acoplan (AbdAlla y cols., 2000). Por lo dicho, sería conveniente determinar si el efecto de la bK sobre IKV está mediado por la anterior vía de señalización, ya que es posible que la modulación peptidérgica de IKV , de igual manera que la IKM , sea parte de la respuesta celular que subyace al aumento del tono sim-pático inducido por Oxo–M, Angio II, y si de igual manera lo hace la bK. Poco se sabe o no se ha estudiado el efecto mediador de la bK y mucho menos los elementos involucrados para modular a la IKV. Si el receptor AT1 M1 y el recep-tor b2 comparten los mismos efectos celulares, es posible que este último tam-bién tenga una acción mimetizadora sobre la IKV. Es posible entonces que la modulación peptidérgica de IKV sea parte de la respuesta celular que subyace al aumento del tono simpático inducido por la agonistas muscarínicos, Angio II y la bK. Lo anterior es de suma importancia, ya que la evidencia muestra que la sobreestimulación del sistema nervioso simpático contribuye a la génesis y mantenimiento de la hipertensión (Guyenet, 2006), razón por la cual es de sin-gular importancia conocer con precisión los mecanismos iónicos, bioquímicos y moleculares que facilitan la liberación de NA de las neuronas simpáticas. Además, conviene estudiar los mecanismos iónicos, bioquímicos y moleculares empleados por la bK en la modulación y control de la excitabilidad de estas neuronas ganglionares simpáticas, así como identificar los posibles paralelis-mos de los efectos de la bK con la acción colinérgica y angiotensinérgica.


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iii. metodoLogía

Cultivo celular

Los experimentos se realizaron en neuronas del ganglio cervical superior, mantenidas en cultivo primario (rata Wistar, de 2-4 semanas de edad). Las ratas se anestesiaron con cloroformo y posteriormente se sacrificaron por decapitación; se disecaron rápidamente ambos ganglios, los cuales se en-

cuentran a nivel de la bifurcación de las arterias carótidas. Una vez extraídos, los ganglios se limpian y se decapsulan cuidadosamente para evitar dañar a las neuro-nas contenidas en ellos. Con el fin de facilitar la difusión de las enzimas durante la etapa de dispersión enzimática, se realizaron varios cortes transversales del GCS. Las enzimas que se emplearon en la dispersión fueron: papaína (Roche; 20 U/ml), colagenasa (Sigma; 1.8 mg/ml) y dispasa II (Roche; 5 mg/ml), disueltas en solución de Hanks modificada (Tabla 1); las soluciones se mantuvieron frías y continuamente se oxigenaron hasta antes de su uso, ya que esto permite una mayor sobrevivencia de las neuronas. Después de haber incubado con las enzimas, los trozos de ganglio se pasaron repetidamente a través de pipetas Pasteur con puntas pulidas al calor, con el fin de facilitar la disociación mecánica de las células. Una vez lograda la disocia-ción del tejido, las enzimas se diluyeron, añadiendo medio DMEM (Dulbecco’s Modi-fied Eagle Medium; GIbCO); la suspensión se centrifugó a 1500 rpm durante 3 min. Posteriormente se resuspendieron las neuronas con sumo cuidado en medio fresco, conteniendo además 10% de suero bovino fetal (SFb), para la inactivación total de las enzimas utilizadas en la dispersión celular. Más aún, se centrifugó por segunda ocasión a 1500 rpm durante 3 min. Después, las neuronas fueron nuevamente resus-pendidas en una pequeña cantidad de volumen, para posteriormente ser sembradas en fragmentos de vidrio (≈ 4 x 4 mm) tratados previamente con poli-lisina (500 ng/ml) (SIGMA); se dejaron reposar durante 2 horas para que las células se adhirieran al vidrio. Después de este periodo, a las neuronas se les adicionó DMEM + 10% SFb + una mezcla de antibiótico y antimicótico (ver soluciones) y se incubaron por lo menos durante 8 h. La incubación se llevó a cabo a 37 ºC y en una atmósfera de 5% CO2, hasta antes de su empleo, para la toma de fotografías de neuronas en cultivo primario de GCS de rata y registros electrofisiológicos.

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iii. metodoLogía

Registros electrofisiológicos

Para el registro de las corrientes iónicas en las neuronas del GCS (INa, IK sensibles al calcio, IKM e IKV), se transfirió uno de los fragmentos de vidrio, conteniendo neuro-nas en cultivo primario, a una cámara de registro de capacidad de 200 μl y se bañaron con solución Ringer Normal (Tabla 1) a una tasa de 2.5 ml/min. Las corrientes iónicas se registraron mediante la técnica de “patch-clamp” en la configuración de “célula en-tera”, se utilizaron pipetas de vidrio con una resistencia de 1–2 MΩ. Los registros se realizaron con el amplificador EPC10 (HEKA elektronics). Para el registro de la IKV e IKM, se bloquearon previamente las corrientes de Na+ (INa) y Ca2+ (ICa) con 500 nM de Tetrodotoxina (TTX) y 200 μM de CdCl2, respectivamente, siendo ésta la solución con-trol (Tabla 1); con el bloqueo de la ICa automáticamente se bloquearon las corrientes de potasio sensibles a calcio (IK) que pudieran contribuir tanto a la IKV e IKM. El ais-lamiento, la amplitud así como el efecto modulador sobre la IKV se generó con pulsos comando despolarizantes de 100 ms de duración, en el rango de -50 a 0 mV, como lo describe Cruzblanca en el 2006. El voltaje de sujeción fue de -50 mV, para la completa inactivación de la corriente de potasio tipo IA (Wang y McKinnon, 1995). Antes de su adquisición a 5 KHz, la IKV se filtró a 1 kHz. De igual manera, para la obtención de la curva corriente–voltaje se llevaron a cabo pulsos cada 4 segundos desde -60 a 60 mV con incrementos de 10 mV.

Por otro lado, la amplitud de la IKM o la deactivación de los canales M, se generaron con pulsos depolarizantes de 500 ms de duración, en el rango de un voltaje de suje-tación de -25 a -60 mV cada 4 segundos, como lo describe Cruzblanca y cols., 1997. Para la medición de las corrientes de cola generadas por las corrientes mencionadas anteriormente, se midieron las diferencias entre el promedio de un segmento de 2 ms al principio de la corriente de cola y un promedio durante los últimos 5 ms del registro de la corriente.

La observación y registro electrofisiológico se llevó a cabo gracias a una cámara para mantener las neuronas en cultivo primario, montada a un microscopio invertido Nikon TE2000U con microscopia de contraste de fases con los objetivos 10, 20 y 40X. Las fotos obtenidas se hicieron gracias a una cámara de video digital, DXM 1200C, montada al mencionado microscopio.

La estadística se llevó a cabo por promedios con sus respectivos errores estándar y éstos fueron comparados buscando significancia con la prueba de “t” Student entre dos grupos (P <0.05).

Solución antibiótico-antimicótico (100X): ɶ penicilina G sódica: 10.000 uni-dades/ml, sulfato de estreptomicina 10.000 μg/ml y anfotericina b 25 μg/ml en 0.85% de solución salina. Solución interna estándar de la pipeta para el registro de la IKV y la ɶcorriente generada por las subunidades Kv2.1 (mM): KCl, 175; MgCl2, 5; HEPES, 5; Na2-ATP, 3; Na-GTP, 0.1; bAPTA, 0.1; leupeptina, 0.08; pH 7.4 con KOH.


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iii. metodoLogía

Los reactivos que se utilizaron son los siguientes: colagenasa, poly-l-lisina, HE-PES, Na- GTP, TTX y forskolina (SIGMA, St. Louis, MO); bAPTA (Molecular Probes, Eugene, OR); papaína, dispasa II, leupeptina y K-ATP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania); DMEM, antibiótico/antimicótico, SFb y lipofectamina (GIb-CO/Invitrogen Co, Carlsbad, CA).

Tabla 1

Reactivo Hanks (mM) Ringer (mM) Control (mM)

NaCl 137 160 160

KCl 5.4 2.5 2.5

KH2PO4 0.44 - -

NaH2PO4 0.34 - -

HEPES 5 10 10

CaCl2 - 5 5

MgCl2 - 1 1

Glucosa 5 8 8

Tetrodo toxina - - 0.0005

Cd2+ - - 0.1

EGTA

PH 7.4 7.4 7.4

23

iv. resuLtados

Caracterización y viabilidad de neuronas del GCS de rata

En primera instancia, se llevó a cabo la caracterización de cultivo primario de neuronas del ganglio cervical superior de rata, para su posterior registro electrofisiológico. Para esto, se partió del procedimiento utilizado por Cruz-blanca en 1998. Como se puede apreciar en la Figura 1, se muestran varias

neuronas simpáticas del GCS en cultivo primario de 12 horas. En la figura 1 superior e inferior izquierda se aprecian algunas células grandes, y de ellas salen sus axones, dendritas. Conjuntamente, en la figura superior derecha, se aprecia perfectamente en una célula grande tanto el axón como el núcleo bien definido. Cabe mencionar que se pueden apreciar varias células pequeñas; lo anterior es visto con microscopía de contraste de fases. Conjuntamente en varios de los cultivos, después de 12 horas, se observaron varias células alargadas por todos los campos examinados, lo cual sugirió que eran fibroblastos por las siguientes razones:

No presentaron generación de corrientes iónicas al momento de hacerles regis-a. tro electrofisiológico; Son muy abundantes en el sistema nervioso periférico, debido a que los gan-b. glios cuentan con una recubierta llamada cápsula, que prácticamente está for-mada por ellos (datos no mostrados).

24


iv. resuLtados

Figura 1. Neuronas GCS de rata en cultivo primario. Se puede apreciar con microscopía de contraste de fases, en las figuras superiores, células grandes con axones y núcleo (40X). En la figura inferior izquierda se pueden apreciar, de igual manera, varias neuronas grandes con axones y dendritas (40X). Conjuntamente, en la figura inferior derecha se puede apreciar un campo con varias neuronas grandes (20X). Cabe aclarar que en todas las figuras mostradas se observan claramente varias células pequeñas.

Una vez que se obtuvieron las neuronas en cultivo primario, se procedió a ver la viabilidad celular de estas células, ya que el sólo verlas no nos dice cómo se encuen-tran bioquímica y fisiológicamente. Hay muchas técnicas donde se puede corroborar la viabilidad celular, pero se requiere de varios reactivos y de procedimientos largos. Una manera de hacer lo anterior de manera rápida, y que no se sale del estudio aquí presentado, es observar los efectos moduladores de fármacos como la bK, Angio II y Oxo–M sobre la excitabilidad en neuronas GCS, específicamente sobre la IKM e IKV (electrofisiología); lo anterior debido a que, en cualquier daño grave que tengan las células, se ven comprometidas las cascadas de señalización intracelular y la genera-ción de segundos mensajeros, por lo tanto, no se verían los efectos moduladores ya bien descritos por otros grupos de investigadores. Sabiendo lo anterior y con base en que las neuronas son por excelencia células excitables, las cuales presentan corrien-tes iónicas, voltajes dependientes y que estas corrientes a su vez son moduladas por


25

iv. resuLtados

fármacos o péptidos como los ya mencionados con anterioridad, se procedió a registrar en primer lugar algunas de las corrientes iónicas presentes en estas neuronas. Éstas pudieran verse afectadas por daño celular. Una de estas corrientes es la IKV, corrien-te iónica generada por un pulso despolarizante (Figura 2A) y parte central de este trabajo. En la condición control (*), el pulso comando genera una corriente entrante seguida de un componente saliente rápido y transitorio y otro sostenido. El bloqueo de los canales de Na+ y de Ca2+ (TTX+Cd2+) elimina la corriente entrante y el compo-nente saliente transitorio, dejando una corriente saliente sostenida, denominada IKV. En la figura 2b se muestra un registro de IKV durante una despolarización de 4 seg. de duración. Los registros de IKV mostraron el umbral de activación, siendo cercano a -30 mV, y su amplitud aumenta conforme más se despolariza a la membrana (Figura 6). Se sugiere que esta corriente registrada es la IKV y, por lo tanto, en cierta manera indica la viabilidad celular del cultivo.

A

*

*

-0mV

TTX + Cd2+

500 pA

1s

-60mV-50 mv

2 nA

B

Figura 2. Registros característicos de la IKV de neuronas del GCS de rata. Se muestran registros característicos de la IKV, generadas en las neuronas GCS de rata. En A se muestra el pulso depolarizante a partir de un voltaje de sujeción de -50 mV a 0 mV durante 100 ms. También en A, registro de co-rrientes iónicas antes (*) y después del bloqueo de las corrientes de Na+ y Ca2+ con tetrodotoxina (TTX) y cloruro de cadmio (Cd2+) respectivamente. La línea discontinua indica el nivel cero de corriente. En B se muestra un registro de la IKV, sin embargo, el pulso depolarizante es de 4 s de duración. Aquí se puede apreciar una caída de la corriente en relación al tiempo del pulso (inactivación por voltaje).

26


iv. resuLtados

Continuando con esclarecer la viabilidad celular de estas células, es bien sabido que uno de los mecanismos que contribuyen al aumento de la excitabilidad en estas neuronas, es la poderosa inhibición (90%) de la corriente de K+ tipo M. IKM es una corriente dependiente del voltaje que se activa en el rango subumbral y no presenta inactivación. Por ello, IKM domina la conductancia de la membrana, contribuyendo así al potencial de reposo de las neuronas GSC (Marrion, 1997). En este tipo de neuronas simpáticas se conoce con cierto detalle esta corriente, así como las cascadas de seña-lización que intervienen en la modulación de ésta (Haley J. y cols., 1998; Hamilton S. y cols., 1997). Se sabe que esta corriente es sensible a daño de la membrana plas-mática; como se describió con anterioridad en los antecedentes, para la estabilización de los canales M es necesaria la presencia del PIP2. También en posteriores estudios hemos visto que neuronas recién disociadas (menos de 8 horas) no se presenta esta corriente (daño membranal por dispersión enzimática), sino después de pasadas 12 horas (datos no mostrados), lo que nos sugiere que una célula viable a este tiempo de cultivo debería de presentar IKM. Entonces, tenemos que otra manera de corrobo-rar la viabilidad de nuestras células, por un lado, es el registro de dicha corriente, y más aún, ver el efecto modulador de agonistas muscarínicos y la Angio II sobre esta corriente. En la figura 3 se puede apreciar lo anterior: la figura 3A muestra el pulso repolarizante para generar las corrientes de cola de la IKM, más aún, se muestra que tanto la Oxo–M (Figura 3A), como la Angio II (Figura 3b) potentemente inhiben a la IKM (Figura 3A2, Figura 3b2), en comparación a la corriente control (Figuras 3A1 y 3b1). Este efecto es congruente con lo establecido ya a detalle por la comunidad científica. Todo lo anterior, sin duda alguna, nos sugiere que las neuronas en cultivo primario del GCS de rata, realizado en nuestro laboratorio, son células viables tanto de la membrana como las cascadas de señalización intracelular presentes en estas células.


27

iv. resuLtados

A-25 mV

1

2

-60 mV

1: Control2: Oxo - M

5 pA/pF

100 ms

B

1

2

1: Control2: Angio II

2 pA/pF

100 ms

Figura 3. Efecto inhibitorio de la Oxo–M y de la Angio II sobre la IKM. La IKM se generó a partir de un pulso repolarizante a partir de un voltaje de mantenimiento de -25 mV a -60 mV durante 500 ms (A). Lo anterior para obtener la desactivación de la IKM, y que es un reflejo de ésta; las líneas discontinuas observadas muestran el nivel de corriente 0. La IKM tiene la ca-racterística de no sufrir inactivación por voltaje. Se muestran las corrientes de potasio tipo M, control (A1 y B1), así como el efecto inhibitorio observado por la Oxo–M y la Angio II, A2 y B2 respectivamente; este efecto ya ha sido estudiado a detalle en nuestro laboratorio y en el laboratorio de Cruzblanca Hernández, CUIB–U de C, con el cual se tiene colaboración.

La BK mimetiza el efecto modulador de agonistas

muscarínicos y de la Angio II sobre la IKV

Una vez que se obtuvieron neuronas viables y como se había planteado, se pro-cedió a investigar si la bK es capaz de incrementar a la IKV, de igual manera que lo hacen la Oxo–M y la Angio II. La figura 4A muestra que la bK (100 nM) aumentó la densidad de corriente de la IKV que fue de 10.8 ± 1.8 pA/pF (/n= 15). Este valor es muy similar al efecto encontrado por la Oxo–M (Cruzblanca H., 2006) y por la Angio II (Acosta y cols., 2007) sobre la IKV. Cabe aclarar que la información referente al efecto modulador de la bK sobre la IKV, así como los elementos involucrados que subyacen al receptor a la bK, son prácticamente nuevos y desconocidos. Un estudio más a detalle de este efecto, nos llevó a obtener una curva dosis–respuesta del efecto mencionado (Figura 4b). La concentración media de la bK para obtener el 50 % de incremento de

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iv. resuLtados

la IKV (EC50) fue de 59.34 ± 3.1 nM (n= 8). Este dato es importante, ya que nos dice que la concentración usada aquí está por debajo de la concentración supramáxima, muy cercana a la encontrada por la Angio II, y que es 500 nM. Esto también explicaría por qué el incremento de la IKV por Angio II es mayor de 14 pA/pF (Acosta y cols., 2007), contra lo encontrado con la bK (100 nM). Cabe aclarar que posteriormente a que se supo la concentración supramáxima, a partir de aquí se continuó trabajando a una concentración de bK de 500 nM y a lo cual el incremento de la IKV fue de 13.9 ± 1.1.

A

2

1

10 pA/pF

1: Control2: BK (100 nM)

20 ms

B

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.00.1 1 10 100 100059.34

[Bradicinina nM]

Incr

emen

to d

e l kv

Figura 4. La BK incrementa a la IKV en neuronas GSC. Se puede apreciar en A, registros característicos de la IKV de neuronas GSC, antes (1) y después (2) de la aplicación de BK (100 nM). Hay un incremento notable de la IKV como se muestra en los mencionados registros. Dicho aumento de la IKV por la BK fue de más de 10 pA/pF (n= 15), siendo un valor similar al que se reporta por Angio II (500 nM), que es aproximadamente de 14 pA/pF. En B se muestra una curva dosis–respuesta normalizada del efecto de la BK sobre el incremento de la IKV. La EC50 obtenida fue de 59.34 nM (n= 8) (Figura B inset).

Siendo que la bK incrementó a la IKV de igual manera como la hacen la Oxo–M y la Angio II, se llevó a cabo un estudio más a detalle, el cual consistió de un análisis sobre los incrementos observados de la IKV en el tiempo (llamados cursos temporales de los efectos). Se pueden apreciar en la figura 5A, b y C los incrementos de las corriente de potasio por la bK (500 nM), Oxo–M (1μM) y la Angio II (500 nM) respectivamente, usando concentraciones supramáximas. Los incrementos para estos fármacos fueron de 13.9 ± 1.1 (n= 7), 10.4 ± 0.9 (n= 9) y 11.7 ± 1.0 (n= 7) pA/pF. En este mismo estudio, a partir de un ajuste no lineal de los incrementos observados en los cursos temporales, se obtuvieron las constantes de tiempo (τ), las cuales fueron para la bK 19.0 ± 4.1, Oxo–M 18.7 ± 2.2 y Angio II 17.7 ± 3.9 s (Figura 5D). Como se puede apreciar, tanto los incrementos como las “τ” son prácticamente iguales, ya que no se encontraron diferen-


29

iv. resuLtados

cias estadísticamente significativas; P< 0.05. Esto nos sugiere fuertemente, además de que el efecto de la bK sobre la IKV mimetiza a la Oxo–M y a la Angio II, más aún, muy probablemente los receptores involucrados en estas modulaciones utilizan las mismas cascadas de señalización y posiblemente hasta el mismo o mismos segundos mensaje-ros. Claro está, a falta de comprobarlo, ya que como se sabe: 1) Por un lado, en la mo-dulación de la IKM por Angio II y agonistas muscarínicos, utilizan una vía que involucra Gq/11, PLC–depletamiento de PIP2; por otro lado, la bK utiliza de igual manera Gq/11 y PLC; sin embargo, más que el depletamiento del PIP2, utiliza por IP3 una modulación de Ca2+-CAM (Cruzblanca H., y cols., 1998). 2) La modulación de la IKV por agonistas muscarínicos y por Angio II, utiliza una proteína Gq/11, PLC, DAG–PKC (Cruzblanca H. 2006; Acosta y cols., 2007).

Tiempo (s)

A

112

108

104

100

96

92

880 20 40 60 80

Angio II (500 nM)

Incr

emen

to d

e l kv

(pA

/pF)

B

60

56

52

48

44

40

360 20 40 60 80

Oxo M (10µM)

Tiempo (s)

Incr

emen

to d

e l kv

(pA

/pF)

C64

60

56

52

48

44

400 20 40 60 80

BK (500 nM)

Tiempo (s)

Incr

emen

to d

e l kv

(pA

/pF)

D

247 9

7

20

16

12

8

4

0Angio II500 nM

Oxo-M10 µM

Bradicinina500 nM

Con

stan

te d

e tie

mp

o τ

(s)

Figura 5. La BK incrementa la IKV de similar manera como lo hace la OxoM y la Angio II. En A, B y C se pueden apreciar los cursos temporales del efecto de la Angio II (500 nM), Oxo–M (1 μM) y BK (500 nM) sobre la IKV. Cada punto corresponde a un pulso despolarizante cada 4 segundos; los puntos negros in-dican la corriente control en todos los casos; los puntos blancos, al estar per-fundiendo el fármaco en cuestión. En todos los casos se observan claramente

30


iv. resuLtados

incrementos, los cuales fueron: para la BK, Oxo–M y Angio II, de 13.9 ± 1.1 (n= 7), 10.4 ± 0.9 (n= 11) y 11.7 ± 1.0 (n= 7) pA/pF respectivamente. En D se pueden apreciar los promedios obtenidos de la “t” de los efectos: para la Angio II, Oxo–M y BK fueron de 17.7 ± 3.9, 18.7 ± 2.2 y 19.0 ± 4.1 s. respectivamente. No se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos: P< 0.05.

Con base en que se desconoce mucho respecto al efecto modulador de la bK sobre la IKV, se procedió a hacer una curva corriente–voltaje, con el objeto de caracterizar el mencionado efecto (Figura 6). Por un lado, se encontró que el umbral de activación de la IKV fue cercano a -30 mV, su amplitud aumenta conforme más se despolariza a la mem-brana (figuras 6A, b y C), congruente con lo reportado por McFarlane y Cooper (1992) y por Malin y Nerbonne (2000) en este tipo de neuronas. Conjuntamente, en la figura 6C se observa que hay un corrimiento de la curva corriente–voltaje hacia la izquierda. El promedio de estos corrimientos fue de de 4.9 ± 0.7 mV cuando se estimula con bK (500 nM) (Figura 6D). Este corrimiento hacia la izquierda nos habla de que los canales que conforman a la IKV son blanco de una cascada de señalización y por ende de un segundo mensajero que pudiera estar interactuando con las subunidades del canal (Kv 2.1 y 2.2) de estas células, modificando así el umbral de activación de estos canales.


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iv. resuLtados

B BK (500nM)

50 ms

10

-10

2 nA-20

0

C

1.0

BK (500 nM) Control0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-60

l cola

max

/l cola

-40 -20 20 40 600mv

3

2

1

0

4

6 10

5

mV

Corrimiento de la Curva l-V de lkv por la BK

D

AControl

10

-10

-20

0

Figura 6. Corrimiento de la curva corriente–voltaje. En A y B se aprecia registros característicos de la IKV de neuronas GCS, al estar dando pulsos despolarizantes cada 4 s, comenzando a partir de -50 mV hasta 10 mV con incrementos de 10 mV; Antes (A) y después (B) de la aplicación de BK (500 nM). C muestra la comparación de las curvas típicas corriente–voltaje, con-trol (puntos negros) y al estar estimulando con BK (puntos blancos). En D se muestra el promedio de estos corrimientos entre las curvas mencionadas siendo de 4.9 ± 0.7 mV (n= 10).

Es bien sabido que una de las principales formas de señalización de los receptores de 7 dominios transmembranales o acoplados a proteínas G, es por medio de cascadas de señalización intracelular, de las cuales, éstas crean segundos mensajeros para la modulación de proteínas. Por ejemplo, los receptores muscarínicos, la Angio II y por supuesto la bK. Lo hacen para modular a la IKM; en el mismo sentido, los receptores muscarínicos y la Angio II también lo hacen para modular a la IKV, y como se mues-tra en este trabajo, la bK mimetiza este último efecto. Aquí surge una pregunta: ¿la modulación de la bK sobre la IKV utiliza la o las mismas cascadas de señalización intracelular que los agonistas muscarínicos y de la Angio II?

32


Hasta aquí lo que se sugiere es que la modulación de la bK sobre la IKV, de igual manera como lo hacen la Oxo–M y la Angio II, utiliza una cascada de señalización in-tracelular que subyace la activación del receptor involucrado. Por tal motivo, parte de este proyecto es comenzar a estudiar los elementos involucrados que se encuentran por debajo de la activación del receptor a la bK sobre la modulación IKV. Con base en lo anterior, se evaluó si la diálisis afecta el incremento observado de la IKV por bK, ya que muchos de los elementos involucrados se encuentran en el citoplasma. Siendo que la técnica de registro electrofisiológico se hace en la configuración de célula ente-ra, muchos de estos elementos intracelulares migran al interior de la pipeta y conjun-tamente la solución fisiológica de la pipeta de registro dializa el interior de la célula; esto, sin duda, disminuiría proteínas y demás involucradas en esta modulación, oca-sionando que haya una disminución del incremento encontrado aquí (Figura 4). Lo que se encontró se puede apreciar en la figura 7, donde una diálisis de 2 min. produjo un incremento de la IKV por la bK de 15.9 ± 1.4 pA/pF (n= 5), en comparación con una diálisis de 5 minutos, donde el incremento fue menor, de tan sólo 8.6 ± 1.3 pA/pF (n= 5); P<0.05. Este dato es muy similar a lo encontrado en la diálisis de estas neuronas, pero al estimular con Angio II (Acosta y cols., 2007) sugiriéndonos de entrada que en la modulación de la IKV por la bK utiliza elementos dializables y, por ende, moléculas que se encuentran en el citoplasma de la neurona. Más aún, y a espera de comprobar-lo, muy probablemente este receptor utilice la —o parte de la— cascada de señaliza-ción que utiliza la Angio II para incrementar a la IKV en neuronas GCS.

20

15

10

5

0

l KV (p

A/p

F)

BK(500 nM)

2 min

Diálisis

5 min

5

5

Figura 7. El efecto modulador de la BK sobre la IKV es sensible a la diálisis. Se muestra el promedio de los incrementos de la IKV al estimular a distintos tiempos: 2 min. (barras negras) y 5 min. (barras blancas) con BK (500 nM). Se aprecia que el incremento fue menor para las barras blancas, de sólo 8.6 ± 1.3 con respecto a las barras negras, que fue de 15.9 ± 1.4 pA/pF (n= 5 ambos casos). Se encontró que entre los dos grupos hay una diferencia estadística-mente significativa: P<0.05


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v. concLusión

En primera instancia, tenemos que en nuestras condiciones se pudieron obte-ner cultivos primarios de neuronas del GCS de rata viables, donde se encon-traron, por un lado: 1) células chicas que no mostraron las características esenciales de las neuronas después de 12 horas de reposo del cultivo (Figura

1), y tampoco las corrientes iónicas mencionadas (datos no mostrados). Se sugiere que estas células chicas y abundantes son neuronas que por daño mecánico y enzi-mático durante el proceso de obtención de neuronas disociadas en cultivo primario, entran en apoptosis por daño en la membrana, perdiendo así la capacidad de regular su volumen interno. 2) Se encontraron, en muchos de los cultivos realizados, células con una morfología alargada y hasta cierto punto plana, de las cuales se sabe que son fibroblastos por las siguientes razones: a) la morfología es característica de estas células; b) después de 12 horas de mantener al cultivo, hay reproducción de estas cé-lulas (las neuronas no se reproducen), a tal grado de cubrir a las demás células (datos no mostrados); c) no presentan corrientes iónicas, por ende, se descartan como células con potencial excitable, como lo son las neuronas; d) es bien sabido que el sistema ner-vioso periférico es recubierto o protegido por una cápsula, formada principalmente por fibroblastos; cabe aclarar que en cultivos GCS donde no se quitó perfectamente la cápsula se observó una cantidad exorbitante de fibroblastos, en comparación de donde sí se quito la mencionada cápsula (datos no mostrados). 3) Células grandes con algunas características esenciales de las neuronas, como las dendritas, axón, y en muchas de ellas, núcleo perfectamente observable (Figura 1); estas neuronas tuvie-ron corrientes iónicas, características de estas células (Figura 2). Lo encontrado fue que, al momento de dar un pulso despolarizante para la generación de la IKV (Figura 2), las corrientes nativas observadas aquí: corriente entrante de rápida activación pero de rápida inactivación, el componente saliente de rápida activación y de rápida inactivación y el componente sostenido hasta el final del pulso aplicado, sin la adición de TTX y Cd2+ (Figura 2*inset) y, además, lo observado al momento de aplicar estos dos fármacos, lo cual hace que nos quede en el registro electrofisiológico una corriente de lenta activación sostenida hasta el final del pulso (100 ms) o bien de muy lenta in-activación por voltaje (pulso largo de 4 seg.) (Figura 2). Conjuntamente, el umbral de

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activación encontrado de esta última corriente fue de aproximadamente de -30 mV; esto nos habla de que las propiedades biofísicas de estos canales son similares a los de la IKV, ya descritos en estas neuronas por McFarlane y Cooper (1992) y por Malin y Nerbonne (2000). Más aún, se obtuvieron los efectos moduladores esperados y ya descritos por otros grupos de investigadores, como los son agonistas muscarínicos y Angio II sobre la IKM (Figura 3). Todo lo anterior, sin duda, nos habla de que los cultivos neuronales realizados en nuestro laboratorio son viables o el cultivo está en condiciones para llevar a cabo su posterior estudio.

Parte central de este trabajo, y más importante que la de indagar la viabilidad de los cultivos, fue la de ver si la bK mimetiza el efecto de la Oxo–M y de la Angio II de incrementar a la IKV. Con base en lo anterior, se encontró que la bK mimetiza de igual manera (amplitud y curso temporal) el efecto de la Oxo–M y de la Angio II de incrementar a la corriente de potasio tipo rectificador tardío denominada IKV, en las neuronas disociadas en cultivo primario del GCS de rata. Lo anterior se concluyó de-bido a las siguientes razones: 1) La bK incrementó en similar manera la amplitud de la IKV como lo hacen la Oxo–M y la Angio II (Figura 4, 5 y 6). 2) El curso temporal del incremento de la IKV por los mencionados fármacos es muy parecido (concentraciones supramáximas), más aún, entre las “τ” encontradas aquí no se detectaron diferencias significativas (Figura 5). 3) El corrimiento a la izquierda de la curva corriente–voltaje de la IKV debido a la bK (Figura 6), de igual manera lo hace la Angio II (datos no mostrados). 4) La diálisis de dos a cinco minutos disminuyó de igual manera el efecto modulador de incrementar a la IKV por bK y por Angio II (Acosta y cols., 2007), dando muy parecidas las amplitudes al final de estos experimentos.

Hasta aquí, todo lo anterior nos dice que hay una mimetización de los efectos de la bK, Oxo–M y Angio II de incrementar a la IKV, sin embargo, surge una pregunta: ¿estos receptores utilizan las mismas o parte de las cascadas de señalización intra-celular? De inicio, se puede decir que los valores obtenidos en la diálisis (Figura 7), y los cursos temporales, así como las “τ” (Figura 5), nos hablan que muy probablemente estos receptores están utilizando las mismas cascadas de señalización intracelular, indicándonos que la mimetización no sólo es la de que todos estos péptidos o fármacos incrementan a la IKV, sino que utilizan los mismos elementos que se encuentran por debajo de los receptores involucrados.

Por otro lado, en este trabajo se comenzó a caracterizar la cascada de señalización involucrada en la modulación de la IKV por la bK. Para esto, se utilizó o se quiso abordar en primera instancia la vía del AMPc utilizando a la forskolina, un activador de la ade-nilato ciclasa, y con esto empezar a indagar cuál proteína G pudiera estar involucrada en esta modulación. Sin embargo, se encontró un dato no descrito en la literatura, y fue que la forskolina, al parecer, tiene un efecto directo de bloqueo sobre los canales que conforman a la IKV en estas neuronas (Anexo 1). Por lo tanto, este fármaco no nos sirve para ver la vía del AMPc. Cabe mencionar que este último párrafo es parte de otro pro-yecto de investigación, el cual ya se está llevando a cabo en nuestro laboratorio.


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vii. anexos

En este trabajo se abodró el tema sobre cuál o cuáles pudieran ser las casca-das de señalización intracelular involucradas en modulación de la IKV por bK; por tal motivo, quisimos ver en primera instancia la participación de la vía del adenilato ciclasa, ya que, como es bien sabido, esta enzima crea

al adenil monofosfato cíclico (AMPc), mejor conocido como el segundo mensajero por excelencia en las células, ya que participa en un sinfín de procesos celulares. Por lo tanto, saber si participa o no esta vía, nos puede decir qué proteínas pudieran estar involucradas en esta modulación. Para poder llevar a cabo lo anterior, probamos un activador de la adenilato ciclasa, la forskolina. Sin embargo, se encontró, como se muestra en la figura 8A, que al bañar las neuronas del GCS en cultivo primario este fármaco, bloqueó de manera reversible a la IKV, como se aprecia en la figura 8b (al lavar el fármaco se restablece la corriente); por tal motivo, y a reserva de compro-barlo, se sugiere que este rápido bloqueo es independiente del efecto modulador de la bK. Cabe mencionar que este efecto encontrado aquí no se ha estudiado en estas neuronas, ni en este tipo de corriente, lo cual abre un nuevo proyecto que ya se está llevando a cabo en colaboración con el grupo de Cruzblanca Hernández, profesor in-vestigador titular de la Universidad de Colima.

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500 pA

50 ms

1

2 1: Control2: FSK

700

600

500

400

3000 50 100 150

Tiempo (s)

Cor

rient

e d

e co

la l kv

(pA

)

20 µM

Anexo A. La forskolina bloquea a la IKV, independientemente del efecto de la BK. En A se puede apreciar registros característicos de la IKV antes (1) y después o durante la aplicación de forskolina 20 μM (2); cabe aclarar que no se estimula con BK. Se observa un bloqueo de la corriente. En B se aprecia el curso temporal de este efecto, donde hay un rápido bloqueo de la corriente, más aun al lavar el fármaco se observa de igual manera una rápida recupe-ración de la IKV, al parecer este efecto es independiente de la vía del AMPc y pareciera más un bloqueo directo del fármaco hacia los canales de potasio que generan esta corriente; esto no nos ayuda para el esclarecimiento de si hay la participación de la vía del AMPc en esta modulación.


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L g i o t e n s i n a ii - Páginas - bradicinina...terior, se llevaron a cabo experimentos de patch–clamp en fijación de voltaje, en la configuración de célula entera (whole–cell)