Embed Size (px)
Citation preview
LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALES
WNT POR INHIBICIÓN EPIGENÉTICA DE
SUS GENES REPRESORES SE ASOCIA
AL PRONÓSTICO DE LA LMA
Vía Wnt
La vía de señalización Wnt es una de las rutas que comunica la
membrana con el núcleo celular.
Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos en embriones.
Mecanismos de auto-renovación, diferenciación y proliferación de las células madre hematopoyéticas.
El genoma humano tiene al menos 20 genes que codifican para
proteínas Wnt: glipoproteínas secretadas que regulan los procesos
implicados en el desarrollo y son las que inician la cascada de señales.
ACTIVAACTIVAINACTIVAINACTIVA
Vía Wnt
CICLINA D1 / C-MycCICLINA D1 / C-Myc
Gen Enfermedad Referencia
WNT1 Cáncer de mama murino Nurses & Varnus 1982
APC Cáncer de colon Polakis, 1997
AXINA-1 Carcinoma hepotocelular Clevers, 2000
Β-catenina Cáncer de colon y melanomas Su, 1993 & Rubinfeld 1993
LRP5 Defectos de la densidad ósea Boyden et al. 2002
Axina 2 Formación de los dientes Lammi et al. 2004
Vía Wnt
La vía Wnt se puede encontrar desregulada por alteración de los
componentes de la vía:
Vía WntLa vía Wnt en LMA
Constitutive activation of the Wnt/b-catenin signalling pathway in acute myeloid leukaemia.
Simon et al. Oncogene. 2005
Translocation products in acute myeloid leukemia activate the Wnt signalling pathway in hematopoietic
cells. Müller-Tidow et al. Mol Cell Biology. 2005
Flt3 tandem deplicarion mutations cooperate with Wnt signalling in leukemic signal transduction.
Tickenbrock et al. Blood. 2006
FZD3
WNT16
TCF1/LEF1
Ciclina-D1
RT-PCR CUANTITATIVA EN
TIEMPO REAL
Hdpr1
PCR ESPECÍFICA DE METILACION
CON ADN TRATADO CON
BISULFITO
Dkk 1, 2, 3, y 4
Wif1
Inhibidores / Activadores Wnt
Román-Gómez et al. Blood 2007
Líneas celulares + 261 LLA
Regulación epigenética de vía Wnt + Activación constitutiva de vía Wnt
sFRPs 1 ,2 ,3 ,4 y 5
20 LLA + 32 LPA + 50 LMA
Metilación Wif: factor pronostico independiente en LPAChim et al. Leukemia 2006
Hipótesis
La activación de la vía Wnt ocurre en muchos tipo de cáncer,
siendo el cáncer de colon el mejor estudiado. Esta desregulación
ocurre por la alteración de los componentes de la vía Wnt o sus
genes antagonistas.
En la LLA uno de los mecanismos que alteran los genes
antagonistas de la vía Wnt es la metilación.
En la LMA se ha demostrado que la vía Wnt se encuentra activada
de forma constitutiva. Nos proponemos investigar si la metilación
de algunos de los genes antagonistas es responsable en parte de
esta activación.
Objetivos
Determinar si los genes represores-Wnt se inactivan
por metilación en la LMA.
Determinar si dicha metilación activa la vía de señales
Wnt.
Determinar el papel de la metilación en la patogénesis
y pronóstico de la LMA.
Material y Métodos
Pacientes
184184 LMA al diagnóstico
110 hombres y 74 mujeres
Mediana de edad: 60 años (extremos 16 – 92)
Mediana de leucocitos: 9.4 x 109/L (extremos 0.6 – 620)
Clasificación FAB: 14 M0; 45 M1; 48 M2; 26 M4; 27 M5;
18 M6; 2 M7; 4 Otros
164 casos citogenética valorable:
15 grupo riesgo citogenético FAVORABLE
111 grupo riesgo citogenético INTERMEDIO
38 grupo riesgo citogenético ADVERSO
Material y Métodos
Modificación química del ADN
NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico
MSP-PCR
Primers específicos metilación:
sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3
Plataforma LIGHTCYCLER
Sybr Green
55ºC o/n
Control negativo Control positivo
Niveles de expresión
Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1
Plataforma LIGHTCYCLER
Sybr Green
Material y Métodos
Sybr Green
Material y Métodos
Modificación química del ADN
NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico
MSP-PCR
Primers específicos metilación:
sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3
Plataforma LIGHTCYCLER
Sybr Green
55ºC o/n
Control negativo Control positivo
Niveles de expresión
Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1
Plataforma LIGHTCYCLER
Sybr Green
Metilación Antagonistas WNT
41
32 31
22
16
4
05
1015202530354045
sFRP-1 DKK-1 sFRP-2 sFRP-5 DKK-3 sFRP-4
Resultados
I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt
Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA
Nº Genes Metilados
36
20 21
15
62 1
05
10152025303540
0 GENES 1 GENES 2 GENES 3 GENES 4 GENES 5 GENES 6 GENES
Resultados
I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt
Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA
Resultados
I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt
Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA
La metilación aberrante es un evento frecuente en la LMA: el 64%64% de los pacientes presentan algún gen metilado
Péfil de Metilación
36
64
0
10
20
30
40
50
60
70
0 GENES 1-6 GENES
Resultados
II. Sobre-expresión de los genes de la vía Wnt
La sobre-expresión de genes de vía Wnt ocurre entre los pacientes con fenotipo metilador
n=37 0 gen 1-6 gen
↓ TCF1 9 17
↑ TCF1 0 1111
n=40 0 gen 1-6 gen
↓ CD1 10 22
↑ CD1 0 88
n=31 0 gen 1-6 gen
↓ LEF1 5 18
↑ LEF1 0 88
Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo metilador
0.0020.014 0.01
Resultados
III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt
con las características clínico-biológicas de los pacientes
sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3p valor- + - + - + - + - + - +
FLT3ITD+ 62 38 69 31 96 4 73 27 69 31 87 13 58 42 n.s
NPM1+ 60 40 68 32 84 16 80 20 80 20 75 25 52 48 n.s
EDAD
n.s> 60 61 39 52 46 98 2 76 24 67 33 84 16 59 41
< 60 57 43 48 52 95 5 80 20 70 30 85 15 54 46
SEXO
n.sHombre 56 44 61 59 96 4 74 26 64 36 83 17 51 49
Mujer 63 37 39 41 96 4 84 16 74 26 87 13 65 35 LEUCOS
n.s> 10.000 61 39 68 32 96 4 80 20 68 32 84 16 59 41
< 10.000 57 43 70 30 96 4 76 24 68 32 85 15 54 46
CITOGEN
n.sFav 53 47 80 20 100 0 73 27 67 33 87 13 6 7 33
Int 58 42 66 44 97 3 83 17 68 32 86 14 58 42
Adv 68 32 63 37 97 3 60 40 68 32 84 16 47 53
- +
Perfil
0.015
Resultados
III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt
con las características clínico-biológicas de los pacientes
- +
Perfil sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3
- + - + - + - + - + - +
RC (1º ciclo) 52 52 51 56 52 75 54 46 53 49 53 48
55 48
RC (2º ciclo) 8 5 9 2 7 0 8 3 8 48 4
9 3
RESISTENC 22 22 23 18 22 25 17 40 20 2720 35
20 26
MUERTE 17 22 17 25 19 0 20 11 18 20 19 13 16 23
p valor n.s n.s n.s 0.03
n.s n.s n.s
Resultados
Supervivencia Global
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Serie Total
0.004
0-1
2-6
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Resultados
SLE
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Serie Total
0.06
0-1
2-6
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
SLR
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m1,2
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Resultados
0.2
Serie Total
0-1
2-6
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Resultados
SG
EDAD < 0.001
FLT3-ITD 0.1
NPM1 0.4
FLT3ITD + NPM1 0.06
SEXO 0.6
LEUCOS > 10.000 0.1
FAB 0.5
RC1º / RC2º 0.6
CITOGENETICA 0.008
sFRP1 0.01
sFRP2 0.7
sFRP4 0.1
sFRP5 0.03
DKK1 0.8
DKK3 0.2
Serie Total
IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la
LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Resultados
IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la
LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
SLE
EDAD < 0.001
FLT3-ITD 0.03
NPM1 0.4
FLT3ITD + NPM1 0.01
SEXO 0.2
LEUCOS > 10.000 0.2
FAB 0.5
RC1º / RC2º 0.3
CITOGENETICA 0.008
sFRP1 0.08
sFRP2 0.5
sFRP4 0.1
sFRP5 0.7
DKK1 0.6
DKK3 0.2
Serie Total
Resultados
SLR
EDAD 0.1
FLT3-ITD 0.005
NPM1 0.3
FLT3ITD + NPM1 0.003
SEXO 0.09
LEUCOS > 10.000 0.1
FAB 0.8
RC1º / RC2º 0.5
CITOGENETICA 0.1
sFRP1 0.08
sFRP2 0.4
sFRP4 0.8
sFRP5 0.7
DKK1 0.3
DKK3 0.3
Serie Total
IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la
LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Resultados
0-1
2-6
SG - DKK3
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SG - DKK1
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SG - sFRP5
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SG - sFRP2
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SG: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
SG - sFRP1
Meses
120100806040200
Sup
ervi
venc
ia a
cum
1,0
,8
,6
,4
,2
0.03
SG - sFRP4
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
0.5
0.04
0.09
0.8 0.035
IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas
de Wnt en la LMA
Resultados
IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas
de Wnt en la LMA
SLE - sFRP5
SLE
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SLE - sFRP2
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SLE - sFRP1
SLE
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
,2
,1
,0
SLE - DKK1
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SLE - DKK3
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SLE: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
0-1
2-6
SLE - sFRP4
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
0.05 0.6 0.14
0.04 0.9 0.14
Resultados
IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas
de Wnt en la LMA
SLR - sFRP5
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
,2
,1
,0
SLR - DKK3
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
,2
,1
,0
SLR - DKK1
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SLR - sFRP4
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
SLR - sFRP2
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
,2
,1
,0
SLR - sFRP1
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
,2
,1
,0
SLR: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
0-1
2-6
0.15 0.68
0.03 0.9
0.02
0.6
Supervivencia Global
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Resultados
Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
0-1
2-6
0.005
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA
SLE
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Resultados
Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
0.001
0-1
2-6
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA
SLR
Meses
120100806040200
Su
pe
rviv
en
cia
acu
m1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Resultados
Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
0.03
0-1
2-6
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA
Conclusiones
Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la
LMA. El 64% de los pacientes presenta algún gen metilado.
Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt
fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo
metilador.
La metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt se
asocia a la activación de la Vía Wnt en pacientes con LMA.
Conclusiones
La metilación de los genes no se asoció a las características
clínico-biológicas de los pacientes. Excepto sFRP5 que se
asoció al grupo de riesgo citogenético adverso y a la resistencia
tras la inducción.
El fenotipo metilador se asocia al subgrupo de mal pronóstico
en los pacientes jóvenes pertenecientes al grupo de riesgo
citogenético intermedio.
En el análisis univariante el gen sFRP5 se asocio a un mayor
riesgo de recaída.
Próximos experimentos
Estudio in vitro en 4 líneas celulares de LMA:
KASUMI-1: FAB-M2; t (8;21)
KG1A: FAB-M6
TPH1: FAB-M5; t (9;11)
HL60: FAB-M2 (c-myc)
METILACIÓN Y EXPRESIÓN
DE GENES ANTAGONISTASAS
AZAAZA METILACIÓN Y EXPRESIÓN
DE GENES ANTAGONISTASAS
EXPRESIÓN DE CD1, TCF1 Y
LEF1
EXPRESIÓN DE CD1, TCF1 Y
LEF1
