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Aislamiento de Frankia sp.
Escuela académico profesional de Biología y Microbiología
ASIGNATURA : Microbiología de Suelos
DOCENTE : Blgo. Isabel Ancco
ALUMNAS : [06-29559] Ana Julissa Naquiche Calero
[07-30712] Gricel Marilia Martínez Roncal
AÑO : 5to año
TACNA – PERU
2011
Aislamiento de Frankia sp. 2011
INTRODUCCIÓN
Frankia es una bacteria filamentosa o actinomiceto, fijadora de nitrógeno, que cuando vive
en asociación con ciertas plantas, induce en sus raíces la formación de nódulos fijadores
de nitrógeno.
Los beneficios de esta simbiosis se conocen desde hace muchos años y ya desde 1886
se suponía que el endofito de estas plantas era microbiano. Se han encontrado
evidencias fósiles del Pleistoceno del árbol aile o aliso cuyos nódulos albergaban
actinomicetos en su interior. Sin embargo no fué sino hasta 1978 en que el grupo del Dr.
Torrey, en la Universidad de Harvard, logró aislar y hacer cultivos puros del actinomiceto
Frankia.
La simbiosis formada por la bacteria Frankia y el nódulo radical de la planta se conoce
con el término de actinorriza. Se han descrito en la actualidad alrededor de 200 especies
de angiospermas, llamadas Plantas Actinorrízicas, distribuídas en ocho familias botánicas,
que son portadoras de nódulos radicales fijadores de nitrógeno formados por Frankia. El
hecho de que esta bacteria filamentosa haga simbiosis con miembros de varias familias,
muestra una de las grandes diferencias que existen entre ella y la otra bacteria simbiótica
fijadora de nitrógeno, Rhizobium, cuyos géneros hospederos pertenecen en su mayoría a
la familia de las leguminosas.
La capacidad de adaptación de las plantas actinorrízicas a suelos marginales
seguramente está relacionada no solo a su capacidad de autoabastecerse de nitrógeno a
través de su simbiosis con Frankia, sino también a que se asocian con hongos endo y
ectomicorrízicos, simbiosis que las provee de muchos nutrientes, sobretodo de fósforo.
Algunas de estas plantas responden a la falta de fósforo en el suelo con la formación de
raíces protoides o raíces en racimo, lo que les permite captar mas eficientemente el poco
fósforo disponible en el suelo.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
Este tipo de raíces se llaman proteoides porque fueron observadas por primera vez en la
familia Proteaceae y posteriormente han sido observadas también en las leguminosas y
en las plantas actinorrízicas. Se trata de grupos densos de raicillas de la misma longitud
que producen gran cantidad de pelos y ocurren en intervalos a lo largo de las raíces
laterales dando la impresión de ser un cepillón de botellas.
Fig. 01. Esquema de raíz lateral de una planta actinorrízica con raíces protoides o
agrupadas, con muchos pelos, que les permiten capturar nutrientes.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
En resumen, las plantas actinorrízicas son capaces de formar varias y diferentes
asociaciones con microorganismos del suelo
Fig. 02. Esquema de una relación tetrapartita, es decir, un árbol actinorrízico
asociado con 3 diferentes microorganismos del suelo formando diferentes tipos de
simbiosis, nódulos fijadores de N2, ectomicorriza y micorriza arbuscular.
I. GENERALIDADES
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
Esta revisión debe enfocar la bacteria Frankia, su morfología, su fisiología, su
genética y ecología. Sin embargo, no nos parece que esté de mas conocer un poco
a las plantas que la alojan en sus raíces, ya que hemos escuchado poco de ellas.
Quizá el lector se anime a buscar en las altiplanicies de los países tropicales otras
plantas que no han sido descritas como actinorrízicas, como nosotros, que tuvimos
esta emocionante experiencia. Es en los países templados donde se han hecho la
mayoría de las exploraciones. Esperemos que al conocer este recurso natural,
también podamos motivar a los estudiantes a estudiar la bacteria.
II. LAS PLANTAS HOSPEDERAS
Las plantas actinorrízicas son arbustos o árboles que habitan muy diversos
ecosistemas y se adaptan a condiciones ambientales extremas como suelos salinos,
terrenos pantanosos y ambientes polares. Todas estas plantas tienen en común que
son de rápido crecimiento y una gran capacidad de crecer en suelos de baja
fertilidad o después de algún disturbio (como erupciones volcánicas e incendios), y
son frecuentemente las pioneras en el desarrollo de la sucesion de la comunidad
vegetal
Ninguna de las especies hospederas de Frankia son plantas de interés agrícolas;
estas plantas tienen importancia económica como productoras de madera y de leña,
son de interés silvícola, recuperación de terrenos y algunas en jardinería. Aunque no
se conocen usos agrícolas de estas plantas, los frutos de algunas de ellas son de
consumo humano en Europa como es el mirto de mar (Hippophäe rhamnoides ),
cuyos frutos son ricos en vitamina C, E y F, carotenos, y los actualmente muy
mencionados ácidos omega 3 y omega 6 (ácidos linoleíco y linolénico); con estos
frutos se prepara cidra, cerveza y jaleas
Las plantas actinorrízicas son principalmente templadas, a diferencia de las
leguminosas que son en su mayoría y originalmente del trópico. Muchas de estas
plantas son muy importantes en países de latitud alta donde las condiciones no son
favorables para las leguminosas y sí para las actinorrízicas permitiéndoles un
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
crecimiento vigoroso. En los períodos glacial y post-glacial fueron muy abundantes
en América del Norte y en Europa donde colonizaron los depósitos glaciales pobres
en nitrógeno y aceleraron el desarrollo del suelo con incorporación de materia
orgánica rica en nitrógeno.
El significado de la simbiosis actinorrízica es su valor ecológico, no solo porque son
plantas que se adapten a los suelos empobrecidos y a ambientes extremos o
porque sean especies pioneras, sino porque además, esta simbiosis tiene un papel
ecológico en el balance global del nitrógeno e incrementa la productividad de
muchas comunidades vegetales vecinas.
Utilizando los mismos métodos de medición, las cantidades de nitrógeno fijado por
estas plantas usualmente son mas grandes o comparables con las cantidades
fijadas por las leguminosas; se considera que las tasas de acumulación anual de
nitrógeno van de 60 a 320 kg/ha/año en plantaciones de aile .
El incremento de la productividad de los sitios en las comunidades de plantas
vecinas se explica por diferentes razones:
1) se incorpora nitrógeno al suelo a través de hojarasca que cae al mismo
2) se transfiere parte del nitrógeno que ellas fijan hacia las plantas vecinas a través
de la red subterránea de hifas de la ectomicorriza que va de unas plantas a otras
3) el nitrógeno orgánico se mineraliza rápidamente en las plantaciones donde hay
plantas actinorrízicas; la cantidad de nitrógeno mineralizado en las plantaciones de
Elaeagnus umbellata llega hasta 236 kg por hectárea en un año.
La distribución filogenética de estas plantas entre las angiospermas ha conducido a
muchas dudas en cuanto a la evolución de las simbiosis fijadoras de nitrógeno.
Cronquist hace el siguiente esquema de clasificación con base en caractéres
morfológicos: tres de las familias actinorrízicas (Betulaceae, Casuarinaceae y
Myricaceae) se agrupan en la subclase Hamamelidae, otras tres (Elaeagnaceae,
Rhamnaceae y Rosaceae) se agrupan en la subclase Rosidae y las otras dos
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
familias (Datiscaceae y Coriariaceae) en otras dos subclases (Dilleniidae y
Magnolidae).
Sin embargo, la introducción de la filogenia molecular ha dado resultados muy
interesantes y se ha mostrado que las simbiosis rhizobiana y actinorrízicas forman
un solo grupo y apoyan un solo origen de la predisposición a la simbiosis. Un
estudio más profundo sobre el análisis de secuenciación de nucleótidos del gene del
cloroplasto que codifica para la subunidad grande de la ribulosa-1,5-bifosfato
carboxilasa/oxigenasa (Rubisco), reafirma que todas las plantas noduladas forman
un grupo coherente e indica múltiples orígenes de la simbiosis dentro del grupo
Finalmente, nos gustaría comentar que un árbol actinorrízico nativo de México, el
aile o aliso (Alnus sp.) muestra que tiene la potencialidad de ser usado con éxito en
restauración ecológica, problema que requiere solución urgente en México (y en
todo el planeta).
En México otro árbol actinorrízico ha dado buenos frutos, se trata de Casuarina.
Esta planta, capaz de crecer en arena, fue introducida para estabilizar los médanos
de la costa del Golfo de México (y evitar que el mar le ganara terreno al continente)
y como cortina para proteger a las poblaciones cercanas al puerto de Veracruz de la
lluvia de arena y sales producida por el arrasador y veloz viento del norte. Es
también un árbol capaz de tolerar la adversidad de los ejes viales de la ciudad de
México; ha podido crecer y fructificar en esas condiciones.
III. LOS NÓDULOS
Los nódulos actinorrízicos son perennes y tienen forma de estructuras coraloides
con muchos lóbulos; cada lóbulo es una raíz lateral modificada. El tamaño de los
nódulos varía con la planta de la que se trate y es muy común encontrar en el
campo nódulos de 3 a 5 cm de diámetro; nosotros encontramos uno de 15 cm en las
raíces de Alnus accuminata
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
En los nódulos de las leguminosas el tejido vascular se bifurca rodeando a las
células infectadas por Rhizobium, mientras que en los nódulos actinorrízicos el
tejido vascular se encuentra en la parte central y, hacia los lados, en el cortex, se
encuentran las células que contienen a la bacteria Frankia. Además de la estructura,
también la ontogenia de los nódulos es diferente en las leguminosas; en éstas el
primordio del nódulo se forma en el cortex, mientras que en las plantas
actinorrízicas se forma en el periciclo, de manera que la bacteria tiene que atravesar
casi o todo el cortex de la raíz para llegar a las células nodulares.
Los nódulos fijadores de N2 generalmente se forman y funcionan en las raíces (en el
suelo), aunque se han descrito nódulos aéreos formados en el tallo de algunas
leguminosas; en algunas plantas actinorrízicas también se han encontrado nódulos
caulinares como en Casuarina cunninghamiana y en C. equisetifolia.
El desarrollo de una interacción simbiótica involucra cierta diferenciación del
microsimbionte o endofito. En el caso de Frankia, su diferenciación depende de la
especie de la planta, que determina la morfología de las vesículas (en algunos
casos las vesículas no se forman, como en los nódulos de Casuarina), así como su
localización en las células infectadas. La planta también determina el sitio de
penetración de la bacteria (ya sea por los pelos radicales o intercelularmente), la
extensión de la infección y el número de nódulos.
IV. LA BACTERIA
Frankia es un procarionte gram-positivo con hifas o filamentos septados, con una
composición de su ADN de 70% de guanina mas citosina. Este alto contenido de G-
C está también presente en otros actinomicetos como Geodermatophilus; en otras
bacterias fijadoras de nitrógeno este nivel es mas bajo. Otra gran diferencia con
Rhizobium es que Frankia fija nitrogeno in vitro bajo las condiciones normales de
presión y temperatura; si bien Azorhizobium también fija N2 in vitro, es un genero
genéticamente muy diferente a los otros miembros de la familia Rhizobiaceae Son
bacterias microaerofílicas cuando utilizan nitrógeno atmosférico (N2) para crecer y
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
son absolutamente aerobias cuando se les proporciona nitrógeno combinado (NH3)
en el medio de cultivo.
4.1 Morfología.
Morfológicamente Frankia es un organismo complejo, presenta un crecimiento
pleomórfico; crecen en forma de filamentos y, como la mayoría de los
actinomicetos, las hifas se diferencian en esporangios. Estos contienen en su
interior gran cantidad de esporas en estado latente que germinan para formar
hifas cuando encuentran condiciones ambientales adecuadas. Todavía no se
sabe con precisión, cuáles son los factores que influyen en la formación de
esporangios ni en la germinación de las esporas.
Fig.03. Esporangios multiloculares llenos de esporas, de la bacteria filamentosa
Frankia. Algunos tienen aspecto de mazorca de maíz redondas o alargadas.
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Las hifas también pueden diferenciarse para formar una estructura que
constituye un rasgo sobresaliente de Frankia, la vesícula. Esta estructura está
especializada en la fijación de nitrógeno atmosférico. Las vesículas se
desarrollan como un hinchamiento de las hifas ramificadas lateralmente, son
redondas y de pared gruesa
La función de la vesícula es proteger a la nitrogenasa del efecto negativo del
O2. La nitrogenasa está localizada en el interior de las vesículas y es la enzima
encargada de la fijación de nitrógeno, es decir, de la transformación del
nitrógeno no asimilable por la planta (N2) a una forma asimilable (NH3). A mayor
concentración de oxígeno en el medio, la pared envolvente también aumenta y
las vesículas se evidencian al microscopio con mayor refringencia
Las especies de Frankia crecen muy lentamente in vitro, no forman micelio
aéreo en medio de cultivo solidificado por lo que se les propaga en medio
líquido donde el conjunto de filamentos tiene el aspecto de copos de nieve.
4.2 Aislamiento
Para aislar Frankia de los nódulos, los lóbulos de los mismos después de
desinfectarse cuidadosamente, se colocan en medio líquido o en medio sólido.
En ocasiones, después de un mes de incubación se logra obtener una colonia
de unos milímetros; a veces el período de incubación puede ser de 6 meses.
Muy pocas cepas de Frankia son cultivables; aquellas que pueden cultivarse
son las más saprofíticas o con requerimientos nutricionales menos estrictos,
como son las cepas de las Betuláceas (Alnus). En otros casos, como en
Casuarina, la mayoría de las cepas se encuentran dentro de los nódulos
radicales y son muy pocas las cultivables. De muchas otras plantas como
Adolphia, Datisca, Ceanothus, Dryas, hasta la fecha no se ha podido aislar su
microsimbionte fijador de nitrógeno.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
4.3 Taxonomía
La taxonomía del género se debe a Becking) quien propuso que el nombre
Frankia resurgiera en honor del microbiólogo suizo A. B. Frank, quien acuñó el
término simbiosis. El colocó al género en la familia Frankiaceae del orden
Actinomycetales. El mismo autor creó 10 especies de acuerdo a la especificidad
de Frankia para nodular plantas, según la usanza de los taxonomistas de
Rhizobium de esa época. En la actualidad, se aceptan tres grupos de plantas,
llamados grupos de especificidad de hospedero. Estos grupos se basan en la
especificidad que muestran las cepas cultivables para inducir la formación de
nódulos en ciertas plantas.
La validez de estos grupos se han confirmado con técnicas modernas de
análisis genético. Hay excepciones, como son algunas cepas de Alnus con
capacidad de nodular Elaeagnus y las cepas aisladas de Gymnostoma que
también nodulan Elaeagnus. Entre las plantas, también hay algunas que son
poco selectivas en cuanto a su compañero bacteriano y no muestras
preferencia por cepas específicas, lo que resulta en que forman nódulos con
cepas de Frankia que nodulan otras plantas, como es el caso de Myrica y
Gymnostoma.
V. LA BACTERIA EN EL SUELO.
El número de propágulos de Frankia presentes en el suelo está en pequeñas
cantidades, lo que limita los tipos de ensayos que se puedan hacer para contar la
bacteria en el suelo. Además, su aislamiento directo del suelo es muy difícil, de
hecho solo ha sido reportado una sola vez. Su presencia en el suelo ha sido
comprobada y cuantificada a través de bioensayos utilizando plantas hospederas y
verificando su nodulación, su número va de 0-4600 unidades de nodulación/gr de
suelo.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
En cuanto a estudios ecológicos de poblaciones de Frankia, es importante
considerar para ello las dificultades en su aislamiento y su lento crecimiento, por lo
tanto es necesario obviarse la etapa del asilamiento. Afortunadamente se ha
avanzado mucho en los métodos moleculares, los que proveen una vía alternativa
para medir cuantitativamente las poblaciones de Frankia en el suelo en forma
precisa y reproducible. La amplificación específica de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) tanto en su modalidad anidada (nested) como reforzada (booster)
son muy sensibles, con un potencial de detección de una sola unidad génica/gr de
suelo. Así mismo, la técnica de PCR del ADN extraído directamente del suelo e
hibridado posteriormente con sondas específicas muestra ser una herramienta
excelente para estudios de distribución de la población en el suelo. Hay que
enfatizar en el hecho de que estas técnicas tienen limitaciones en la práctica según
la pureza del ADN extraído del suelo y por las substancias inhibitorias del mismo.
En relación a otro estudios ecológicos, también se ha desarrollado métodos
moleculares para estudiar directamente en el interior del nódulo la presencia de
ciertas cepas de Frankia , tanto aquellas cultivables , como las no cultivables. Para
ello se han diseñado, al igual que en el caso anterior, sondas género específicas e
incluso de algunos tipos genéticos de cepas. Este punto lo tratamos ampliamente
adelante, en la sección de genética.
VI. GENÉTICA DE Frankia
Entre los propósitos de estudiar la genética de Frankia, como la de cualquier otro
microorganismo, está conocer su diversidad y su filogenia, y en su caso particular
entender a un nivel molecular las interacciones que se dan entre este actinomiceto
simbionte y sus hospederos, además de contar con herramientas para su estudio
ecológico.
Este actinomiceto además de ser difícil para cultivar, también es difícil para ser
modificado genéticamente. Hasta la fecha no ha sido posible obtener mutantes, lo
cual ha impedido conocer la función de muchos de sus genes. Además no se ha
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
logrado introducir ADN ajeno a su genoma, lo que ha impedido su manipulación
genética. Este hecho ha encontrado una explicación en los hallazgos de Tavares y
Sellstedt quienes demostraron que Frankia produce una gran cantidad de enzimas
que degradan al ADN (ADNasas), impidiendo de esta forma la incorporación de
ADN extraño. Por estas razones los estudios genéticos en esta bacteria se han
tenido que desarrollar comparándola con otros microorganismos. Como Frankia es
un simbionte fijador de nitrógeno y formador de nódulos, se ha comparado con
Rhizobium y como es actinomiceto se compara con Streptomyces.
De esta forma se han descrito genes muy importantes. La mayoría de ellos
involucrados en la fijación de nitrógeno o en el proceso simbiótico. Así, esta parte de
la revisión se enfocará a la descripción de dichos genes y el impacto que han tenido
para describir la diversidad y la filogenia de Frankia.
Genes ribosomales. Estos genes codifican para el ARN ribosomal (rARN), el cual
se ensambla con proteínas para formar los ribosomas, organelos celulares
involucrados en la síntesis de proteínas. Se dice que entre más copias de este gene
existan más rápido crece un microorganismo. Así por ejemplo, Escherichia coli tiene
6 copias de sus genes ribosomales y se duplica cada 20 min; en cambio, Frankia
tiene solo dos copias y se duplica cada 5 días.
La secuencia de los genes ribosomales define a cada microorganismo. Es decir, el
orden de las nucleotidos que forman dichos genes es para los microorganismos, lo
que las huellas digitales es para los humanos. Conocer la secuencia de estos genes
permitió construir el árbol genealógico de todos los seres vivos
Existen tres genes ribosomales, cada uno tiene diferente tamaño y en procariotes se
conocen como 23S, 16S y 5S. En el genero Frankia estos genes muestran la
estructura de cualquier bacteria, 16S-23S-5S, y presenta dos espacios intergénicos.
Estos espacios son fragmentos de ADN que no codifican para ningún gene, esto
hace que las mutaciones en el ADN se fijen con mayor frecuencia que en los genes
codificantes, sirviendo de esta forma como un reloj molecular que nos permite
diferenciar cepas muy emparentadas. El uso de estos fragmentos de ADN se
discutirá mas adelante.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
Genes simbióticos. Como se mencionó anteriormente existen grandes similitudes
entre las simbiosis entre Frankia y las plantas actinorrízicas y Rhizobium-
leguminosas, sobre todo en el proceso de infección y la fijación de nitrógeno
(revisado en Pawlowski y Bisseling). Estos estudios comparativos se han enfocado
principalmente a dos grupos de genes, los genes nod y los genes nif.
a) Genes nod. Sin lugar a dudas existen grandes similitudes entre los
procesos de infección de las simbiosis Frankia-plantas actinorrízicas y
Rhizobium-leguminosas, lo cual sugiere la existencia de analogías entre
ambos procesos. El primer reconocimiento entre Rhizobium y las
leguminosas se lleva a cabo mediante la liberación de algunos compuestos
conocidos como flavonoides por la planta. Algunos estudios sugieren que
esto puede ocurrir también en la simbiosis actinorrízica.
Los flavonoides de la planta activan varios grupos de genes de los
microorganismos, que al expresarse hacen posible la nodulación. Un grupo
de estos genes es conocido como nod (genes de nodulación). Varios
investigadores han tratado de utilizar genes nod provenientes de Rhizobium
y Bradyrhizobium como sondas para encontrar genes homólogos en
Frankia. Los resultados han sido poco alentadores. Otros investigadores
han intentado complementar mutantes nod- de Rhizobium con ADN de
Frankia, los resultados tampoco han sido positivos.
Los genes nod de Rhizobium son los responsables de la síntesis de una
molécula conocida como factor nod. Este factor cuando es aplicado a las
raíces de las leguminosas provoca deformación en los pelos de la raíz. Se
sabe de la existencia de un factor deformante de pelos radicales de plantas
actinorrízicas en el sobrenadante de cultivos de Frankia, tal como ocurre
con Rhizobium. Recientemente se ha estudiado la naturaleza de este factor
deformante y se ha comprobado que es diferente al de Rhizobium Aún no
se ha descrito con exactitud la naturaleza química de este factor
deformante, ni los genes que están involucrados en su expresión. Todavía
queda mucho por descubrir en esta simbiosis, especialmente en lo
referente a sus genes de nodulación.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
b) Los genes de la nitrogenasa. Una de las características más
importantes de Frankia es su capacidad de fijar nitrógeno tanto in vivo
como in vitro. La fijación biológica de nitrógeno es un fenómeno que se
lleva a cabo exclusivamente en procariotes. Este proceso consiste en la
reducción del nitrógeno atmosférico (N2) a amoníaco (NH3) mediante la
acción de una enzima conocida como nitrogenasa. La síntesis de esta
enzima esta codificada por tres genes llamados nifHDK, los cuales están
localizados en un operón.
Como los ensayos para desarrollar métodos de mutación en Frankia no han tenido
éxito y tampoco se han encontrado vectores de expresión adecuados, la localización
de los genes nif en Frankia se logró a través de hibridaciones heterólogas con
genes de otros microorganismos diazotróficos .Así fueron localizados y secuenciado
estos genes estructurales de la nitrogenasa; el gene nifH, el gene nifD y el gene nifK
Se ha estudiado muy a fondo la organización del operon nifHDK en Frankia se ha
observado la presencia de dos espacios intergénicos como los que hay entre los
genes ribosomales. En la mayoría de las cepas de Frankia estos genes están
contiguos y codificados en el cromosoma,, a diferencia de Rhizobium, cuyos genes
nif están en un gran plásmido.
El análisis de las secuencias del gen nifH de Frankia ha revelado que este gen se
parece más al gen nifH de la cianobacteria Anabaena que a los genes nif de otros
fijadores Gram positivos como Clostridium o Paenibacillus . Esto apoyaría la
hipótesis de que estos genes se han transmitido horizontalmente y no verticalmente
de un ancestro común
La presencia de los genes nif se considera un rasgo diagnóstico del género Frankia
y basados en las secuencias obtenidas se han diseñado algunos iniciadores Frankia
específicos para detectar este gen por la técnica de la PCR, permitiéndonos
identificar específicamente a Frankia en muestras de suelo o nódulos.
Los espacios intergénicos (IGS). Como se mencionó anteriormente los espacios o
segmentos intergénicos de Frankia han recibido gran atención. Debido a que son
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
relojes moleculares que caminan más rápido que los basados en genes, permiten la
diferenciación de los individuos hasta el nivel de cepa. Con el análisis de genes en
muchas ocasiones no es posible diferenciar entre cepas muy relacionadas.
El espacio entre los genes 16S y 23S ha sido usado para estudiar la diversidad
genética de cepas de Frankia aisladas y no aisladas de Casuarinaceas y se ha
podido demostrar que las cepas capaces de nodular Gymnostoma (Casuarinaceae)
son cepas nodulantes de Elaeagnaceas, también ha servido para demostrar co-
infección (doble infección) en nódulos de Casuarina collina con cepas compatibles
entre Casuarina y Elaeagnus. Estos estudios se han extendido a cepas
provenientes de muchas otras plantas actinorrízicas, incluyendo aislados
pertenecientes a muy diversos grupos genómicos,
Los genes nifHDK de Frankia también presentan dos espacios intergénicos, lo que
ha permitido desarrollar métodos que permiten el análisis de estas regiones tan
variables. Así mismo, se han diseñado iniciadores género específicos y se ha
encontrado que este espacio es más variable que el espacio ribosomal.
Este tipo de estudios ha demostrado una alta variabilidad genética dentro del género
Frankia, especialmente entre los aislados de Alnus y Elaeagnus y curiosamente una
baja diversidad entre los aislados de Casuarina. Estos estudios han sido utilizados
también para hacer estudios de tipo ecológico junto con otras herramientas que se
explicarán enseguida.
Marcadores Frankia específicos. Una de las grandes retos de los ecólogos
microbianos es conocer el comportamiento de los microorganismos a través del
tiempo y el espacio. En este caso en particular, es muy importante desarrollar
técnicas que nos permitan identificar rápidamente a una cepa de Frankia. Imaginen
que deseamos saber si una cepa de Frankia es capaz de sobrevivir en un nuevo
hábitat. Si siguiéramos los métodos clásicos de la ecología microbiana, tendríamos
que reaislarlo del hábitat al cual lo hemos introducido, ¡esto podría llevarnos meses!.
Por ello se han desarrollado algunos métodos moleculares que nos permiten seguir
a Frankia en el suelo o en los nódulos, ahorrándonos los pasos del aislamiento y el
cultivo.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
El análisis de las secuencias de los genes nif y ribosomales ha permitido la
utilización de secuencias de ADN complementarias a ciertas regiones específicas
del genoma de Frankia. Estas secuencias conocidas como sondas son marcadas
para su detección, ya sea con radioactividad o con fluorescencia. Estas sondas han
sido utilizadas para diferenciar cepas de Frankia dentro de los nódulos de árboles
que han sido inoculados con varias cepas para estudiar la competencia entre ellas,
para localizar a Frankia en el suelo y para detectar in situ las hifas de Frankia
usando fluorescencia. Estas técnicas han demostrado ser muy poderosas para
diferenciar cepas y han sido usadas para estudiar poblaciones de Frankia bajo
diferentes condiciones ambientales.
Otra técnica que nos permite diferenciar entre una cepa y otra es la conocida como
rep-PCR. Estos elementos son secuencias palíndromes, cortas, intergénicas que se
repiten y están muy conservadas y generan una huella digital genética que es
especifica para cada microorganismo, permitiéndonos diferenciar entre una cepa y
otra. Murry et al reportaron la utilidad de esta técnica para diferenciar cepas de
Frankia, y posteriormente ha sido utilizada para estudiar cepas dentro de los
nódulos de plantas actinorrízicas de las cuales no ha sido posible aislar al
actinomiceto. Con este método también ha sido posible diferenciar cepas de
Casuarina que por otros métodos no había sido posible
Diversidad genética de Frankia. El primer aislamiento de Frankia en 1978 dio la
pauta para que se aislaran cepas de Frankia de muchas otras plantas actinorrízicas.
Con las cepas aisladas, recordemos que se hicieron pruebas de su capacidad de
inducir la formación de nódulos en las plantas, lo que condujo a la formación de tres
grupos de bacterias, llamados grupos de especificidad de hospedero (o HSG, por
sus siglas en inglés)
Posteriormente, Fernandez et al, propusieron una nueva clasificación con base en el
parecido del genoma de una bacteria con otra (homología ADN/ADN total). Así, se
formaron 9 grupos genómicos de Frankia, que coinciden con los grupos de
especificidad de hospedero. Los grupos genómicos 1, 2 y 3 contienen cepas del
grupo de Alnus (HSG 1). Los grupos genómicos 4, 5, 6, 7 y 8 contienen cepas del
grupo de Elaeagnus (HSG 3), mientras que el grupo genómico 9 contiene
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
únicamente cepas de Casuarinaceae (HSG 2), Beyazova y Lechevalier cortaron el
ADN de muchas cepas de Frankia con enzimas (endonucleasas) en segmentos muy
grandes (perfiles de macrorestricción). Al analizar los datos se formaron grupos que
coincidieron en un 73% con los reportados por Fernandez et al.
Estudios más recientes hechos con base en las secuencias de ADN de las Frankiae
presentes en los nódulos actinorrízicos han revelado que en la naturaleza existe una
mayor diversidad que la detectada en los microorganismos cuando se estudian
cultivados.. Este es uno de los motivos por los que a últimas fechas se han
investigado las secuencias de ADN pertenecientes a las bacterias dentro de los
nódulos actinorrízicos. La mayoría de estos estudios incluyen cepas de plantas
actinorrízicas poco estudiadas como Ceanothus, Coriaria, Discaria, Purshia,
Colletia, Elaeagnus, Talguenea y Trevoa y diferentes especies de Myricaceas. Los
datos obtenidos en estos estudios, junto con los de Normand et al han permitido
establecer las relaciones que existen dentro de los miembros del género Frankia ,
como se explicará en el siguiente apartado.
VII. POSICIÓN FILOGENÉTICA DE Frankia.
Una de las preguntas que frecuentemente nos hacemos y que quisiéramos poder
contestar es ¿Qué relación tiene este microorganismo con otros?, es decir, ¿Cuál es
la filogenia de este microorganismo?. El estudiar la filogenia de Frankia nos permite
saber que relación tiene este microorganismo con otros y sobretodo conocer el
parentesco que tienen entre sí estos actinomicetos capaces de establecer simbiosis
con plantas tan disímiles pertenecientes a ocho familias botánicas diferentes.
La primera clasificación de Frankia fue hecha con base en el tipo de esporangios
que presenta este actinomiceto, así junto con los géneros Geodermatophilus y
Dermatophilus formaba la familia Frankiaceae. Esta primera clasificación
morfológica no coincidió con su identificación genética hecha posteriormente con
base en el análisis parcial de la secuencia nucleótidica del gen ribosomal 16S de
una cepa aislada de Alnus. Este estudio reveló una cercanía entre Frankia,
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
Geodermatophilus y con una bacteria del Mar Muerto conocida como "Blastococcus"
pero no con Dermatophilus, proponiéndose la exclusión de este último de la familia
Frankiaceae. Posteriormente el análisis de un mayor número de secuencias de este
mismo gene demostró que dentro del genero Frankia existen 4 grupos, concepto
actualmente aceptado, a saber:
Grupo 1: cepas infectivas en Myrica (Myricaceae), Alnus (Betulaceae),
Casuarina y Allocasuarina (Casuarinaceae).
Grupo 2: cepas no cultivables presentes en nódulos de Rosaceae,
Coriariaceae y Datiscaceae
Grupo 3: cepas de Eleagnaceas y Gymnostoma (Casuarinaceae).
Grupo 4: cepas aisladas de nódulos de diversas plantas que nodulan (pero
son nif -) o no Alnus.
En uno de estos estudios con base en la secuencia del gen ribosomal 16S, el
actinomiceto más cercano a Frankia fue Acidothermus cellulolyticus .
Recientemente otro análisis filogenético con base en el gen recA, que esta
involucrado en la reparación del ADN, ha comprobado la relación cercana entre
Frankia y Acidothermus. Acidothermus cellulolyticus, es un microorganismo
celulolítico de aguas termales que tiene un gran contenido de hopanoides, al igual
que Frankia. Los autores proponen que ambos actinomicetos tuvieron un ancestro
común, rico en hopanoides que quizá fijaba nitrógeno y que posteriormente ambos
tomaron direcciones divergentes, transformándose en microorganismos totalmente
diferentes.
VIII. FISIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA DE FRANKIA
Pared celular y química celular. La química celular juega un papel prominente en
la taxonomía de los actinomicetos al nivel de género. Los compuestos más
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
importantes incluyen: aminoácidos, aminoazúcares y azúcares presentes en la
pared celular, polisacáridos unidos no covalentemente a la pared celular, ácidos
grasos, fosfolípidos y menaquinonas.
El género Frankia posee una pared celular tipo III que es la más común entre los
actinomicetos, constituída fundamentalmente por ácido meso-diaminopimélico,
ácido glutámico, alanina, glucosamina y ácido murámico Con relación al patrón de
azúcares presentes en el género Frankia, se observa que es variable y depende de
cada cepa. Algunas cepas presentan el patrón tipo D (constituído de xilosa y
arabinosa), otras el tipo E (constituido de fucosa), algunas otras presentan el patrón
B (con madurosa) y otras tantas poseen el tipo C (con galactosa y glucosa)
Los fosfolípidos característicos del género son: fosfatidilinositol, fosfatidilinositol
manósidos y difosfatidilglicerol (patrón tipo PI). Las menaquinona predominante es
la MK9
Sideróforos. La quelación es un fenómeno rutinario en los sistemas biológicos y
consiste en la formación de complejos moleculares en donde participa un agente
quelante (molécula que atrapa) y un elemento quelatado (elemento atrapado). Un
ejemplo en el suelo, lo constituyen las estructuras moleculares complejas
denominadas como arcillas, que funcionan como agentes quelantes que atrapan o
liberan iones dependiendo de las condiciones imperantes en el mismo, afectando
esto la disponibilidad de iones para la nutrición de microorganismos y plantas.
Los sideróforos son agentes quelantes producidos por diferentes microorganismos
en el suelo; los microorganismos fijadores de nitrógeno producen sideróforos para
obtener el hierro necesario para llevar a cabo la fijación de este elemento.
Recordemos que la enzima nitrogenasa está compuesta de varios componentes
protéicos y que 36 átomos de Fe se requieren para su correcto funcionamiento. Se
ha observado en algunas cepas de Frankia que nodulan casuarina, la presencia de
sideróforos que forman parte de un mecanismo inducible de abastecimiento de
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
hierro cuando el microorganismo se desarrolla en condiciones limitantes de este
mineral
Hasta la fecha se han detectado dos tipos de sideróforos en las cepas de Frankia
estudiadas, los sideróforos tipo catecol y los sideróforos tipo hidroxamato. La
francobactina y la francobactina A son ejemplos de sideróforos tipo hidroxamato
descritos en Frankia sp cepas 52065 y CeSI5.
Resistencia a antibióticos.La búsqueda de marcadores genéticos en Frankia a
través de los patrones de resistencia y sensibilidad a antibióticos ha puesto en
evidencia la existencia de mecanismos de resistencia a los mismos en diferentes
cepas. Se sabe que hay cepas resistentes a rifampicina, estreptomicina,
kanamicina, tetraciclina, kasugamicina, lincomicina, gentamicina y novobiocina. Sin
embargo, estos microorganismos muestran sensibilidad a ampicilina, penicilina G,
neomicina, espectinomicina, thiostreptona, cloranfenicol y eritromicina. Es necesario
mencionar que los patrones de resistencia-sensibilidad a antibióticos pueden variar
dependiendo de las cepas probadas (en esto radica su valor como marcador
genético para la diferenciación de cepas) como en el caso reportado por Carú con
frankias de la familia Ramnaceae.
Proteosoma. Entre las diferentes proteínas que libera Frankia al medio circundante
destacan los complejos proteínicos multicatalíticos de alto peso molecular o
proteosomas. Estas macromoléculas pueden ser útiles como abastecedores de
aminoácidos cuando el microorganismo crece bajo condiciones saprofíticas.
También podrían participar en la colonización de la planta actinorrízica promoviendo
la despolimerización de proteínas de la pared celular del macrosimbionte. Esta
megaproteína es similar desde el punto de vista estructural, bioquímico e
inmunológico a los proteosomas característicos de las células eucariontes.
En la cepa de Frankia BR su proteosoma está involucrado en un fenómeno de
autólisis. Se ha demostrado que la actividad de su megaproteinasa se ve
incrementado cuando cesa el crecimiento en medio mineral con agitación
magnética, reflejándose esto en un decremento de la biomasa de hasta un 50%.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
Crecimiento. Como se mencionó previamente, la mayoría de las cepas de Frankia
no son cultivables y su crecimiento es extremadamente lento, su tiempo de
generación varía considerablemente en función de las condiciones de cultivo. Se ha
logrado una apreciable disminución en el tiempo de crecimiento cuando se cultivan
en agitación magnética a 200 rpm y agregando al medio fosfatidilcolina
Para el aislamiento y cultivo de Frankia, se recomienda el uso de propionato de
sodio como fuente de carbono, sin embargo, esta ácido orgánico de cadena corta
puede ser utilizada por otras bacterias y no garantiza el éxito en el aislamiento de
Frankia y sí el crecimiento de un contaminante. Los aislados nativos de Frankia
nodulantes del árbol Casuarina en México se obtuvieron sólo cuando se usó el
acetato de sodio en lugar de el propionato como fuente de carbono.Otro caso es el
del aislamiento de Frankia de nódulos de Ramnáceas en que el propionato se
substituyó por la glucosa.
Otro problema que se presenta para el aislamiento de este microorganismo es que
generalmente se recomiendan medios de cultivo líquidos (recordemos que no forma
micelio aéreo), los cuales no excluyen la posibilidad de obtener un co-cultivo,
además de que existe la posibilidad de que en un mismo lóbulo se encuentren
hospedadas más de una cepa de Frankia. Es por ello que se requiere obtener
cultivos clonales a partir de esporas o de filamentos del microorganismo para
estudios posteriores en donde es un prerrequisito contar con cultivos puros.
Fuentes de Carbono. Las fuentes de carbono utilizadas por Frankia para su
crecimiento y desarrollo generalmente son diversas. Estas incluyen los ácidos
grasos de cadena corta tales como el propionato y el acetato, ácidos grasos
derivados del tween, intermediarios del ciclo del ácido cítrico tales como el succinato
y el malato y algunos ácidos orgánicos como el piruvato.
Existen algunas cepas que se propagan con la utilización de glucosa como fuente
de carbono, tal es el caso de algunas frankias aisladas de los arbustos Colletia
hystrix, Retanilla ephedra y Telguenea quinquinervis, pertenecientes a la familia
Ramnaceae.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
El hecho de que muchas cepas de Frankia no puedan utilizar los carbohidratos se le
atribuye a la falta de sistemas transportadores de azúcares. La eficiencia en la
utilización de carbohidratos de ciertas cepas de Frankia puede mejorarse a través
del uso de tween, el cual incrementa la permeabilidad de la membrana celular.
En Frankia se ha demostrado la existencia del ciclo del ácido cítrico, ciclo del
glioxilato y actividades enzimáticas de la gluconeogénesis. Las cepas que son
capaces de utilizar la glucosa como única fuente de carbono, la catabolizan a través
de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas. El propionato es metabolizado por una
conversión a succinato a través de la vía de la propionil CoA carboxilasa.
Fuentes de Nitrogeno. Frankia puede utilizar el nitrógeno atmosférico, el amonio y
los nitratos, así como varios aminoácidos como fuente de nitrógeno para su
crecimiento in vitro. La asimilación del amonio producto de la fijación del nitrógeno
atmosférico se lleva a cabo por el sistema glutamino sintetasa-glutamato sintasa.
Como mencionamos previamente, la fijación de nitrógeno atmosférico o reducción
del mismo para el crecimiento de Frankia se lleva a cabo en el interior de las
vesículas. Estas estructuras producto de la diferenciación celular en este
actinomiceto, presenta una envoltura constituída fundamentalmente de dos tipos de
lípidos hopanoides, el bacteriohopanotetrol (tetrol) y su monoester con el ácido
fenilacético (ácido feniltetrol), además de escualeno. El bacteriohopanotetrol se
encuentra abundantemente en las células de Frankia, sin embargo, el ácido
feniltetrol se encuentra en altas concentraciones sólo en las vesículas. Los
hopanoides son triterpenoides tetracíclicos que tienen propiedades semejantes a los
esteroles en cuanto a que modifican la permeabilidad de la membrana de muchos
procariontes.
Cuando Frankia se encuentra viviendo en forma saprofítica o en simbiosis con las
plantas actinorrícicas, la envoltura de sus vesículas constituye una barrera física que
limita la difusión del oxígeno hacia la nitrogenasa, misma que si entra en contacto
con ese gas se inactiva permanentemente. Si la tensión de O2 aumenta, el grosor de
la pared envolvente también aumenta. Esto se observa tanto en los cultivos
bacterianos como en los nódulos . Esta variación en el grosor de la pared sugiere un
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
nivel específico de regulación del oxígeno en la vesícula que es dependiente del
mismo oxígeno
En los arbustos Coriaria y Datisca se ha visto que las vesículas de Frankia se
encuentran rodeadas de mitocondrias de la célula hospedero, tal parece que la
respiración mitocondrial juega un papel muy importante en la regulación de los
niveles de oxígeno en el área donde se fija activamente el nitrógeno atmosférico en
el nódulo.
Al igual que en la fijación de nitrógeno por Rhizobium, se ha demostrado que
Frankia nodulante de Casuarina, presenta una hidrogenasa, tanto en cultivo como
en simbiosis. Esta hidrogenasa recicla el hidrógeno que produce la nitrogenasa al
reducir los protones, incrementando la eficiencia de la nitrogenasa. Dicha enzima,
en Frankia requiere de niquel para su buen funcionamiento; cuando se agrega
níquel al medio de cultivo, se incrementa la toma de H2, pero no su
desprendimiento. Se desconoce si el níquel juega algún papel en este tipo de
hidrogenasas en Rhizobium.
En simbiosis, la planta hospedero afecta el metabolismo del hidrógeno en el
endosimbionte. Se ha observado que una misma cepa de Frankia que se asocia con
diferentes especies del árbol casuarina muestra diferencias en la fijación de
nitrógeno y el metabolismo del hidrógeno dependiendo ambos procesos de la
combinación Frankia-especie de planta.
IX. AISLAMIENTO DE Frankia sp.
a. Material bilógico
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
Nodulos de Casuarina sp.
Material de laboratorio
Medio Basal FM
Matraz erlenmeyer de 100 ml
Pipetas pasteur
Pipetas de 1 ml
Probeta de 100 m
Estiletes
Laminas porta y cubreobjetos
Azul de lactofenol
Agua destilada
Frascos de penicilina
Hipocloriton de Sodio al 1%
b. Toma de muestra
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
Se recolectan nódulos frescos obtenidos de la base de los árboles de
Casuarina sp que se encontraban en los alrededores de la UNJBG, se
recolectan en placas petri.
c. Esterilización de nódulos
Se colocan sobre un tamiz y se lavan con agua potable.
Tomar los nódulos claros y turgente.
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1 nódulo(14 -15
lóbulos)
Adicionar Hipoclorito de
sodio al 1%5’ (4-5 veces)
Sacar con ayuda del estilete los
lóbulos
SquashLiquidó sobrante, Sembrar en una Medio basal FMIncubar 30ºC por
3 a 7 días
Aislamiento de Frankia sp. 2011
Colocarlos en un pequeño frasco para esterilizar superficialmente con el
Hipoclorito de sodio al 1% (4-5 veces)
Figura 04: Nódulos de Casuarina sp.
Tomar un nódulo y colocarlo sobre un portaobjeto estéril, y con una laminilla
cubreobjetos, realizar el squash.
Figura 05: Squash de nódulos
Con un estilete, coger el liquido lechoso e inocularlo en Medio Basal FM.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
Figura 06: Componentes del Medio Basal FM
Figura 07: Medio Basal FM
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Figura 08: Siembra del liquido lechoso de los nódulos de Casuarina sp. En
Medio Basal FM
Incubar por 3-7 días a 30ºC
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
d. Resultados
Luego de 7 días de incubación se ha obtenido el crecimiento de l bacteria
problema Frankia sp. En Medio Basal FM.
El crecimiento se ve evidenciado, ya que en los viales en los cuales se ha
inoculado a esta bacteria, ha crecido en la superficie una película a manera de
una tela de araña, lo cual corresponde al micelio de esta bacteria.
EVALUACION MACROSCÓPICA
Figura 09: Viales con medio basal FM
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NEGATIVO CRECIMIENTO
POSITIVO CRECIMIENTO
Aislamiento de Frankia sp. 2011
EVALUACION MICROSCÓPICA
Se ha tomado una muestra de los viales en los que ha habido crecimiento, y se
ha colocado sobre una lámina portaobjeto en la cual se ha depositado
Lactofenol, se cubre con cubreobjetos, y se visualiza al microscopio.
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MUESTRA : Nódulos de Casuarina sp
AUMENTO : 40x
MICROORGANISMO : Frankia sp
DESCRIPCIÓN : Las hifas se diferencian en esporangios . Estos contienen en su interior gran cantidad de esporas en estado latente que germinan para formar hifas.
Las hifas también pueden diferenciarse para formar una estructura que constituye un rasgo sobresaliente de Frankia, la vesícula.
Aislamiento de Frankia sp. 2011
X. CONCLUSIONES
En los países tropicales de montaña existe un gran recurso natural al que
podemos recurrir para enfrentar un buen número de problemas del ambiente.
Nos referimos a las plantas actinorrízicas. Algunas pueden ser usadas en
restauración ecológica urbana y rural, otras en producción de madera y de leña,
etc.
Se desconocen muchos aspectos de la simbiosis que estas plantas llevan a
cabo con diferentes microorganismos, consideramos de suma importancia la
que lleva a cabo con su asociado fijador de nitrógeno, Frankia, pues un
conocimiento apropiado de esta interacción podría conducir a un estado óptimo
de eficiencia en su crecimiento y producción.
No menos importante es la falta de información sobre la bacteria misma. Esta
carencia la ha propiciado su lento crecimiento, que no ha permitido desarrollar
vectores genéticos ni mutantes que permitan conocer cómo funcionan sus
genes. Tampoco hemos sido capaces de desarrollar métodos de cultivo que
permitan aislar todo tipo de Frankia.
No obstante los científicos seguimos aceptando el reto de trabajar con este difícil
y quisquilloso microorganismo y deseamos que se unan a nosotros muchos
otros colegas.
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Aislamiento de Frankia sp. 2011
XI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ezziyyani M., C. Pérez, M. Requena, et al. 2004. Evaluación del biocontrol de
Phytophthora capsici en pimiento (Capsicum annuum L.) por tratamiento con
Burkholderia cepacia. Anales de Biología 26:61-68
Franco-Correa M. 1999. Aislamiento, Caracterización y Evaluación de
Actinomycetes inhibidores de algunos hongos fitopatógenos. Tesis de Maestría
en Microbiología, Departamento de química, Instituto de Biotecnología,
Universidad Nacional de Colombia. págs. 86
Martin A. 1981. Introducción a la microbiología del suelo. AGT editores. Ciudad
de México. pp.158
Martínez, M., M. Franco, & L. Díaz. 2003. Memorias del Curso de Microbiología
Aplicada a la Agricultura. Educación Continuada, Facultad de Ciencias, Pontificia
Universidad Javeriana. pp. 53
O´Gara F., D.N. Dowling & B. Boesten. 1994. Molecular Ecology of Rhizosphere
Valdés M., N. Perez, P. Estrada, et al. 2005. Non-Frankia Actinomycetes
Isolated from Surface-Sterilized Roots of Casuarina equisetifolia Fix Nitrogen.
Applied and Environmental Microbiology. 71, 1:460 466
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