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5/5/2015
Lacriopreservacindelsemenporcino|AlbitarPortalVeterinaria
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PVALBEITAR19/2014
Artculosporcino(archivo)
Lacriopreservacindelsemenporcino09/02/2010@12:00:18GMT+1
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Enesteartculosepretendeanalizarsucintamentelalaborqueunequipodeinvestigacinmulticntricoestrealizando,desdediversasperspectivas,enelcampodelsemencongeladoenporcino.
Domnguez,J.C.1Cisale,H.2Kirkwood,R.1Breininger,E.3Gonzalez,R.Tejerina,F.3Alegre,B.Alegre,E.3Pelez,J.Garca,J.C.Bernal,S.Crdenas,S.Cordova,C.A.3Abad,M.
FacultaddeVeterinariadelaUniversidaddeLen([email protected])
1FacultaddeMedicinaVeterinaria.UniversidaddeBuenosAires(Argentina)
2LargeAnimalClinicalSciences.MichiganStateUniversity(USA)
3CentroTecnolgicodeInseminacinArtificial(CENTROTEC)
Lacriopreservacinespermticaesunabiotecnologadegrantrascendencia,todavezquetieneunpapelrelevanteenlaconservacinydifusinderecursosgenticos.
Sinembargo,enlaespecieporcinanohatenidoxitosuutilizacindebidoalaincapacidaddeobtenerresultadoscomparablesalosdelsemenfrescooconservadomedianterefrigeracina15C(Jonhson
Elusodesemencongeladoenestesectorrepresentaapenasel0,2%deltotaldeinseminacionesrealizadasenelmundo(grfica)suutilidadhaquedadorestringidapuntualmentealaproduccinenpurezadencleosdeseleccin,bancos
genticosytransporteinternacional(AlmlidyHofmo,1996),perdindoselagrandisponibilidadespacio/temporalqueofreceelsemencongelado.
Otrascausasdelabajautilizacindelsemencongeladoporcinoson:
Altocoste,conunaltonmerodeespermatozoidespordosisyunmanejocomplicado(Bolarinetal.,2006).
Excesivavariabilidaddelacongelabilidadentrerazas,individuosyeyaculados.
Imprecisindeloscriteriosdevaloracindelsemencriopreservadoenrelacinasufertilidad.
Precapacitacinydisminucindelavidatilespermtica.
Celoexcesivamentelargodelacerdayperiodoprolongadodeovulaciones.
Apesardeestepanoramadesalentador,lainvestigacinenelcampodelacrioconservacindelsemenporcinonohacesado,intentandomejorarlosresultadosdefertilidadyprolificidad.
Nuestrogrupodeinvestigacinaborda,entreotros,lossiguientesaspectos:laoptimizacindelosprotocolosdecongelacinlamejoradelacalidadseminalycapacidadfecundantemediantediversastcnicas(aditivos,antioxidantes,
plasmaseminal,etc.)eldesarrollodetestdecriorresistenciaytermorresistenciaespermticaqueprediganlacongelabilidadelestudioyevaluacinobjetivadelaslesionesdecapacidadfuncionalespermticamediantetcnicasdevisin
artificial(sistemasCASAASMA)ylainduccinysincronizacindeovulacionestraseldestetedelacerda.
EfectosdelacriopreservacinsobrelafuncionalidadyestructuraespermticaAcontinuacinsedescribenloscincoefectosdelacriopreservacinsobrelafuncionalidadyestructuraespermtica.
Alteracionesenlasmembranascelulares
Elplasmalema(membranaplasmtica)eslaestructuraespermtica(figura1)queresultamsseveramentedaada(Parks,1997),aunquelamembranaacrosmicaexternaylasmembranasdelamitocondriatambinsevenafectadas
(Watson,1995).
Estasalteracionesestructuralesprovocanprdidadeenzimasintracelularesytrastornosenelbalanceinico,conprdidadelapermeabilidadselectivadelplasmalemaytrastornosenelmetabolismoaerbicoyglucolisisanaerbica,
comprometiendotodasaquellasfuncionescelularesenergticodependientes,comolamotilidaddeigualformaseproduceprdidadeenzimasresponsablesdelametabolizacindelasROS(ReactiveOxigenSpecies)yladisminucinde
compuestosantioxidantes(alfatocoferol,cidoascrbico,taurina,hipotaurina,etc.)enelmedioextracelulartrasladiluciny/ocentrifugacinpreviaalacongelacin(Brouwersetal.2005).
Modificacionesdelmediointerno
Seproducenalteracionesenelbalanceinicodelsodio,zincycalcio,queseacumulanenelespaciointracelular,ydelpotasioymagnesio,quesalenmasivamentedelaclula(WatsonyPlummer,1985).
Aunqueexistengrandesdiferenciasindividuales,elincrementodecalciointracelularesmuycaractersticodelaespecieporcinaencomparacinconotrasespecies,ysedebeaunaalteracindelabombaqueloregula(White,1993),yaque
lasprotenasdemembranaquefuncionancomobombadeionesdisminuyensuactividadconeldescensodelatemperatura(WatsonyPlummer,1985).
Efectossobreelcitoesqueleto
Muchasdelasprotenasdelcitoesqueletoejercenunafuncinestabilizadoradelplasmalema(HoltyNorth,1991),conuncomportamientodedespolimerizacinyrepolimerizacindependientedelatemperatura(Watson,1995).
Elglicerol,adems,alteraalosmicrotbulos,loquerepercuteindirectamentesobrelamembrana.Porotrolado,losrpidoscambiosdelvolumencelularinfluyensobreelsostnesquelticodelasmembranasplasmticayacrosomal,aunque
pocoseconocealrespecto(Watson,1995).
Enlaalteracinestructuraldelamembranaplasmticadelareginacrosmicainfluyenlasdimensionesdelacabezaespermtica:enelespermatozoidedelasespeciesmsvulnerablesstaesalargadayplana,distintadelamspequea
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yconvexadelasespeciesresistentes.
Elcomponentecitoesquelticoestabilizadorparecenoestarpresenteenlareginanteriordelacabeza,conloquelasconsecuenciasdelenfriamientoseranmsgravesenlasespeciesconespermatozoidesdecabezaplanayalargada
(WatsonyPlummer,1985).
Congelacindesemendeporcino
Latecnologadecrioconservacinincluyeseisetapasimportantes:
1.Dilucinseminal.
2.Enfriamientodelasuspensinespermtica.
3.Adicindelagentecrioprotectoryenvasado.
4.Congelacin.
5.Almacenamientoenenvasecriognico.
6.Descongelacinyaplicacinalahembra.
Eldiseodecadaunadeestasfasesdebeirenfocadoaproducirelmenordaoposiblesobrelas
estructurasyelmetabolismodelespermatozoide,siendodeespecialimportancialafunciny
arquitecturadelamembranaplasmtica.
Lainadecuadaadaptacinalasetapascitadasanteriormente,ascomoloscambiosquevaasufrirla
cluladurantetandelicadoproceso,sonresponsablesdedaosoagresiones,quesuponenla
prdidadelacapacidaddelespermatozoideparallevaracabosusfuncionesconnormalidad
(Watson,1995Gaoetal.,1997).
Noobstante,seconsideraquelaadicindelagentecrioprotector(Watson,2001)ylasetapasde
enfriamiento,congelacinydescongelacin(Watson,1990)sonlasprincipalesfuentesdedaosobre
lasclulasenelconjuntodelproceso.
Detodoslosprotocolosdescritosdecongelacin,slohansidoutilizadosintensamenteanivel
comerciallosdePurselyJohnson,ydeWestendorfetal.(Johnson,1985).De1985aestaparteseha
desarrolladoungrantrabajoexperimentalparaestablecerlascondicionesptimasdecongelaciny
descongelacinyhacermsprcticoelusodesemen,perosiempretomandocomobaselosdos
protocolosanteriormentecitados.
Elprotocolodecongelacinutilizadopornuestroequipodeinvestigacineseldenominado
optimizadodeBwangaetal.(1990),basadoenlossiguientespasos:
Concentracinseminalporcentrifugacin.
Diluyentederefrigeracinconyemadehuevo.
Diluyentedecongelacinconglicerol.
Envasadoenminipajuelasde0,25ml.
Rgimentrifsicodecongelacindesde6Chasta100C,utilizandouncongeladordeNlquido
programableconcontroldeldescensodetemperatura.
Efectossobrelamovilidad
TalcomohaseadadoBrouwersetal.(2005),laperoxidacinlipdicaesparticularmenteintensaenlapiezaintermedia,loqueexplicaraladisminucindelamovilidadespermticatrasladescongelacin.
Loscambioscualitativosdelamovilidaddespusdeladescongelacin(Cremadesetal.,2005),presentansimilarescaractersticasalosespermatozoideshiperactivadosaconsecuenciadelacapacitacinespermticapreviaala
fecundacin(SchmidtyKamp,2004).
Efectossobreelncleo
Elfenmenodesupercondensacindelacromatinanuclearsehaconstatadoenespermatozoidescriopreservadosdeverraco(Hamamahetal.,1990),relacionndoloconunaalteracindelacapacidadfecundanteydeldesarrolloembrionario.
TambinMartnRilloetal.(1999)asocianlostrastornosdeldesarrolloembrionarioaalteracionesenlaorganizacindelacromatinanuclear,puesencuentranunamayorproporcindeembrionesenestadiosmenosavanzadosdeldesarrollo,y
tambindeembrionesdegeneradosencerdasinseminadasconsemendescongelado,encomparacinconotrasquelofueronconrefrigerado.
UnestudiodeFraseryStrzezek(2007)hadescritounincrementodelafragmentacindelADNdelncleodelosespermatozoidesporcinostraselprocesodecongelacindescongelacin.
AportacionesalacriopreservacinespermticaNuestrasaportacionesaestalneadeinvestigacinhansidonumerosasyendiferentesaspectos,queresumidamentepodemosagruparenlassiguientes:
1.Criorresistenciaytermorresistenciacomopruebasdelavaloracindelacapacidaddecriopreservacin.
2.Lesionesespermticasdurantelacriopreservacinyvitalidadespermtica.Utilizacindeantioxidantesensuprevencin.
3.AplicacionesdelasnuevastecnologasCASAyASMAenlacuantificacindelesionesespermticasdurantelacriopreservacin:desarrollodenuevastcnicasdevisinartificialenlavaloracindelaslesionesacrosomalesproducidas
durantelacriopreservacin.
4.UtilizacindeltesthomlogoFIVenlavaloracindelacapacidadfecundantedelsemendescongeladodeverraco.
5.Variacindelassubpoblacionesespermticasduranteelprocesodecongelacindescongelacin.
6.Protocolosdeinduccinysincronizacindelceloenlacerdaenlaayudaalprocesodeinseminacinconsemencriopreservado.
Lavaloracindelacriorresistenciadeuneyaculadodependedelparmetrodemedidadecalidadqueseconsidere(Pelez,2003Pelezetal.,2004).
Ennuestrotrabajolaestimacinmsprecisaseobtieneconsiderandoelporcentajedeespermatozoidesmtilesbajoestimulacinconcafenayelporcentajedeespermatozoidesconmembranaplasmticantegraevaluadaconel
fluorocromoyodurodepropidio.
Noobstante,lautilizacindeunapruebacomplementariadetermorresistenciaposdescongelacin,medianteincubacina37C,conunseguimientodelamotilidadespermtica(mejorquedelavitalidad)conysinestimulacinporcafena,
tienemayorcapacidaddiscriminativaycontribuyeaunavaloracinmsacertadadelacriorresistencia.
Unasencillapruebadetermorresistenciaesuntestinteresante,todavezquedemuestracmoelporcentajedeespermatozoidesvivosy/omtilessereduceconsiderablementealas23hdeincubacin,condificultadesenmuchoscasos
paraelmantenimientodelavitalidady/omotilidadespermticasdesdelosprimeros15minutos.
Tambinhemosdemostrado(Pelezetal.,2006)cmoelprocesodecriopreservacinmermaconsiderablementelacapacidadfecundantedelosespermatozoides,posiblementeprovocada,entreotrosfactores,porunatendencia
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extremadamenteaceleradaaexperimentarelfenmenodecapacitacinconreduccindesusposibilidadesdesupervivencia.
Porello,laadicindeplasmaseminalenelmomentodeladescongelacindelsemenquedetengaelprocesodecapacitacinhaciaelquellevalacriopreservacinestambinunabuenalneadeinvestigacinqueestamosllevandoacabo
(Abad,M.etal.,2006).
Enestosmomentostrabajamosenunproyectoquevalorelacapacidaddecriorresistenciasintenerquerealizarlacongelacin:esunapruebatambinbasadaenlatermorresistenciayotrabasadaenlainduccindeunshockafrigoredel
eyaculadorecinrecolectadoysimplementediluido.
Esperamosaspredecirlacapacidaddecriorresistenciadeloseyaculados,demaneraquesolamenteseprocedieraalacongelacinenaquellosquemerezcanlapena,segnsufertilidadposterior.
Otrafacetainteresantedenuestrasinvestigacioneseslaevaluacindelosfenmenosacaecidosduranteelprocesodecongelacindescongelacinmediantelatecnologadeanlisiscomputarizadodigitaldeimgenes
presentanumerosasventajas,talescomolaobjetividad,laindividualizacindecadaunadelasclulasespermticasvaloradasyladeterminacindeparmetrosqueportcnicastradicionalesseraimposiblederealizar.
Hemospodidocomprobarquetodosloscambiosmorfomtricosobservadosconmotivodelacriopreservacinespermticadeverracotienenlugarenlaetapacomprendidaentrelaadicindelagentecrioprotectoryladescongelacintodos
ellosderivandeunareduccinsignificativadelejelongitudinaldelacabezadelespermatozoide,conunadistribucinsubpoblacionalquevaraalolargodelprocesodecongelacindescongelacin,constatndoseunincrementodelos
espermatozoidesmvilesconcaractersticasprximasalahiperactivacindesdelarecogidaseminalhastaelfinaldelaincubacina5Cenelprocesodecongelacin,mientrasquedespusdeladescongelacinsonmayoritariaslas
clulasespermticasquedescribentrayectoriasmslinealesyregulares,conunavelocidadlinealmsalta(Tejerinaetal.,2005,2006,Tejerina,2008).
Elusodedescriptoresdeformaytexturadentrodelanlisisdigitaldeimgenesnosestpermitiendodesarrollarmtodosdevaloracinespermticarealmenteinteresantes,nosloparaelcontroldelprocesodecriopreservacin,sinoentodo
elconjuntodelainseminacinartificialporcina,incluidalatradicional(semenfrescoorefrigeracin)(Snchezetal.,2005Fernndezetal.,2005,Alegreetal.,2005).
Porltimo,tambinestamostrabajandoeneldiseodemtodosdeinduccindelcelotraseldestetequepermitanunbuenagrupamientodelasovulaciones,conobjetodeprogramarlasinseminacionesconsemendescongeladodeformay
maneraquecoincidalavitalidadespermticaconaqullas.
Unodelosmtodosquemejoresresultadoshaproporcionadoeselqueutilizaunadosisalta(900UI)deeCG(gonadotrofinacorinicaequina)enelmomentodeldestete,80hdespusseaplican750UIdehCG(Manjarin
procedindoseapracticardosinseminacionesespaciadas6hapartirdelas36hdelaadministracindelahCG.
Estemtodo,encombinacinconlaadicinposdescongelacindeplasmaseminal(Abadetal.,2006),nosestproporcionandofertilidadescomprendidasentreel7580%(datosprovisionales,sinpublicar).
Bibliografadisponibleenhttp://www.albeitar.grupoasis.com/bibliografias/congelacionsemenverraco119.doc
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