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Análisis de su diagnostico
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INTRODUCCIÓN
Es importante para cualquier químico-fármaco-biólogo en cualquiera de las áreas
en que se desarrolle conocer y entender cuál es el procedimiento y que es lo que sucede
químico, físico o biológicamente en cada método que realiza, además de saber cuál es el
método analítico que va aplicar en cada situación, así como saber explicarlo de manera
sencilla y entendible a cualquier persona.
Entendiendo esto y con el propósito de conocer los fundamentos y procesos de los
métodos y pruebas de análisis más frecuentes en el área clínica, especialmente se
presenta la siguiente investigación sobre una prueba sencilla de embarazo,
específicamente usando tiras reactivas, aunque el fundamento de las pruebas caseras es
el mismo. El resultado se da en minutos.
Se ha elegido esta prueba por su popularidad pero sobre todo por su sencillez,
puesto que no se ocupa de gran conocimiento para su interpretación, sin embargo debo
preguntarme ¿Qué hay detrás de esas rayas coloreadas ya sea en positivo o en
negativo?
Puesto que en esta prueba se constata la presencia de la hormona Gonadotropina
Coriónica Humana (hCG) en suero u orina en un tiempo inmediato, inclusive a los 7-8 días
de la gestación. Mediante este trabajo se trata de explicar la importancia de esta
hormona, el fundamento de la Inmunocromatografía con tiras, desglosando que es la
inmunología, que es la cromatografía y el uso de las tiras reactivas además de presentar
un ejemplo de la aplicación de la misma.
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1.- GONADOTROPINA CORIÓNICA HUMANA
(HCG ó hCG)
La Gonadotropina Coriónica humana (hCG) es una hormona glicoproteica formada por
dos subunidades diferentes (alfa y beta), la cadena alfa es común a la de las hormonas
TSH, FSH y LH, mientras que la cadena beta es específica de la hCG. Esta hormona es
secretada por las células trofoblásticas del tejido placentario y por algunas células
malignas y es secretada a la circulación sanguínea y excretada en la orina.
Es por ello que la determinación de hCG en suero u orina resulta de gran interés en:
1.- El diagnóstico temprano del embarazo: El papel fisiológico principal de esta hormona
es mantener el cuerpo lúteo durante el embarazo. La hCG es el más importante marcador
para el diagnóstico precoz del embarazo porque durante un embarazo normal los valores
de hCG se duplican de 1.3 a 2 días, alcanzando el valor más elevado entre las semanas 8
a 12. Después de este incremento el nivel de hCG disminuye lentamente hasta una
concentración que se mantiene durante todo el embarazo. Luego del término del
embarazo el nivel de hCG disminuye rápidamente al valor normal.
Mientras el nivel de hCG en mujeres no embarazadas y en hombre sanos está
normalmente bajo 1 a 2 UI/I, la hCG se eleva rápidamente y puede alcanzar
concentraciones iguales o superiores a 10 a 30 UI/I el día de la primera falta de
menstruación; hacia el octavo día después de la implantación, el óvulo fecundado inicia su
actividad trofoblástica produciendo millonésimas de miligramo de hCG que se pueden
detectar habitualmente en suero y orina. Una orina diluida puede originar resultados
negativos, pero si aún se sospecha un embarazo, es conveniente repetir el ensayo 48 h
después utilizando la primera orina de la mañana.
2.- La evaluación de trastornos del embarazo: En los trastornos a principios del embarazo,
como embarazo ectópico y la amenaza de aborto espontáneo, la concentración de hCG
en un determinado período de gestación y su ritmo de ascenso, es anormalmente baja,
aunque los valores oscilan en un rango muy amplio. No es posible distinguir un embarazo
normal de un embarazo ectópico únicamente sobre la base de los resultados del ensayo.
3.- Como marcador tumoral: La Gonadotropina Coriónica es considerada como un
marcador tumoral asociado a enfermedades malignas trofoblásticas de origen gestacional
y no gestacional y a tumores de células germinativas por lo cual se ha utilizado este
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marcador no sólo para el diagnóstico, sino para vigilar el tratamiento en pacientes con
tumores secretores de HCG.
4.- Marcador de riesgo para el Síndrome de Down: Varios investigadores reportaron
niveles significativamente elevados de hCG en el suero de embarazadas portadoras de un
feto con el Síndrome de Down.
Considerando la relación entre los niveles bajos de Alfa-fetoproteína y el Síndrome de
Down y la edad materna en esta aberración genética, se comprobado la utilidad clínica del
pesquisaje combinado de AFP y hCG más edad materna para calcular el riesgo de
Síndrome de Down entre las 15 y 19 semanas de gestación, con niveles de detección que
oscilan entre 55 y 65 % llegando en algunos casos hasta un 80 % para un 5 a 7 % de
falsos positivos.
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2- FUNDAMENTOS DE LA PRUEBA
En la actualidad, la inmunocromatografía es una de las técnicas de inmunodiagnóstico
más modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez del test debido a que
no es necesario reactivos ni instrumentación adicional y se viene utilizando para el
diagnóstico rápido de varias enfermedades, el ejemplo más conocido son los test de
embarazo de las farmacias.
INMUNOLOGÍA:
La inmunología es la ciencia biológica que estudia todos los mecanismos
fisiológicos de defensa de la integridad biológica del organismo. Dichos mecanismos
consisten esencialmente en la identificación de lo extraño y su destrucción. La
inmunología también estudia los factores inespecíficos que coadyuvan a los anteriores en
sus efectos finales.
El sistema inmune es el encargado de garantizar la integridad del cuerpo frente a
todos los “intrusos” y de reconocer y aplacar la degeneración celular, previniendo así
procesos cancerígenos. Para lograrlo cuenta con diferentes componentes: órganos,
células y sustancias.
El sistema inmunitario consta de varias "líneas de defensa" principales:
Inmunidad innata (natural o inespecífica): es una línea de defensa que permite controlar a
mayor parte de los agentes patógenos.
Inmunidad adquirida (adaptativa o específica): suministra una respuesta específica frente
a cada agente infeccioso. Posee memoria inmunológica específica, que tiende a evitar
que el agente infeccioso provoque enfermedad en una segunda infección.
Los ensayos inmunológicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos
como reactivos enlazantes “específicos” que tienen aplicación universal para la
determinación o cuantificación de fármacos terapéuticos y no terapéuticos, diversas
sustancias biológicas, sustancias infecciosas o anticuerpos de respuesta del huésped en
el suero, en la orina, en el líquido cefalorraquídeo, en saliva y en cualquier líquido
biológico donde se encuentre la sustancia a investigar.
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CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un método físico de separación, identificación y determinación
de los componentes químicos en mezclas complejas. Los componentes que se han de
separar se distribuyen en dos fases, una de las cuales se mueve en una dirección definida
(gas, un líquido o un fluido supercrítico). Esta fase móvil se hace pasar a través de una
fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o una superficie
sólida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos
componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la
distinta movilidad (puede ser también por sus cargas, masas, tamaños moleculares,
polaridad de sus enlaces, potenciales redox), los componentes de la muestra se separan
en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
Como resultado hay una gran variedad de técnicas para llevar a cabo la separación de
una sustancia, que se clasifica en cuatro grandes grupos según el mecanismo de
separación:
Cromatografía de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad.
Cromatografía de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción.
Cromatografía de exclusión: separa solutos según su peso molecular.
Cromatografía de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica.
Para la prueba de hCG se utiliza el principio de la cromatografía de adsorción y el de la
cromatografía de flujo lateral.
INMUNOCROMATOGRAFÍA.
La Inmunocromatografía es una técnica inmunológica que permite visualizar la
reacción antígeno-anticuerpo por la acumulación del oro coloidal del conjugado en zonas
específicas del papel de nitrocelulosa que presenta unida a su superficie un ligando
(anticuerpos de captura), una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las
proteínas presentes en las mezcla a separar.
Al atravesar la tira, si la muestra contiene el antígeno problema, éste se unirá al
conjugado formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de
nitrocelulosa, (el ligando secuestra la proteína afín), si no contiene el antígeno migrarán el
conjugado y la muestra sin unirse.
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La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro
epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la
unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará y la prueba
será positiva, de lo contrario, la prueba será negativa.
La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de
detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al
conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un
control porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas.
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TIRAS REACTIVASLas tiras reactivas son métodos de química seca, algunas de las cuales son de
uso habitual en el ámbito de la atención primaria. Su utilización permite realizar una
aproximación diagnóstica y el seguimiento de algunas patologías sin tener que retrasar la
decisión terapéutica a tomar. Su utilización es sencilla y no requieren de complejos
métodos que dificulten su empleo. Existen distintos tipos de tiras:
Las tiras multitest incorporan varias determinaciones que las hacen muy
polivalentes, por lo que permiten realizar una aproximación a patologías muy frecuentes
en la consulta diaria de atención primaria. Habitualmente incorporan la determinación de
pH, nitritos, leucocitos (estearasa leucocitaria), proteínas, glucosa, cuerpos cetónicos,
sangre (hemoglobina, mioglobina), bilirrubina y urobilinógeno.
Hay con menos determinaciones y usos más concretos.
Las tiras de monodeterminación son específicas para un solo tipo de prueba.
El área de la prueba de la tira reactiva contiene dos tipos de anticuerpos
monoclonales:
1. Anticuerpos monoclonales libres.
2. Anticuerpos monoclonales fijados al sustrato en la ventana de prueba.
Los anticuerpos libre son específicos para hCG y están marcados con un colorante. Los
anticuerpos fijados tienen especificidad contra el complejo hCG-anticuerpo libre. Cuando
la tira reactiva entra en contacto con la orina que contiene hCG los anticuerpos libres se
unen a la hCG y luego se unen a los anticuerpos fijados de modo que forma un
“sándwich”.
3. Entonces los anticuerpos marcados con colorante crean un cambio de color visible
en la ventana de prueba.
Comunmente utiliza un anticuerpo monoclonal de ratón específico al hCG en un
inmunoensayo cromatográfico de flujo lateral en un paso.
La tirilla de la prueba consiste de una almohadilla conteniendo un conjugado de
anticuerpo monoclonal de ratón anti-hCG conjugada a oro coloidal; y de una membrana
de nitrocelulosa conteniendo una línea de la prueba (línea T) y una línea de control (línea C).
Cuando una cantidad adecuada de la muestra es aplicada en la almohadilla del
dispositivo, la hCG en la muestra se une a sitios donde se encuentra el anticuerpo-dorado
conjugado sobre la almohadilla para formar un complejo y migra a través de la tirilla.
Si la muestra contiene HCG a niveles cercanos o mayores a 25 mlU/ml, el complejo se
unirá al anticuerpo capturado en la capa que existe en la línea T para formar una banda
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de color vino. Si la muestra no contiene HCG o los niveles de HCG son inferiores a los
niveles detectables, la Línea T no se formará.
La línea C está cubierta con un anticuerpo cabra anti-ratón, la cual se deberá unir al
anticuerpo-dorado conjugado y formar una línea color vino sin importar la presencia de la
hormona HCG.
Conservación:
Alejar de la luz, a 2–30ºC (la sensibilidad disminuye <2º C, temperaturas > 30ºC
reducen la vida media del producto).
Proteger de la humead y del calor excesivo.
Guardar en un área fría y seca en las condiciones apropiadas dentro de su embalaje
original hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
Revisar si hay roturas en el sobre contenedor. No abrir el envase hasta el
momento de realizar la prueba.
Revisar la presencia de líneas o manchas en la tira antes de su utilización, porque
si existe un cambio de color indica una pérdida de reactividad.
Control de calidad:
Control Interno.- La región de control (C) de la tira el cual permite confirmar que el
volumen de muestras utilizado en el ensayo ha sido el adecuado y el procedimiento ha
sido realizada de manera correcta. La aparición de una banda de color en la zona “C”
indica que el conjugado ha migrado correctamente a través de la zona de reacción. Si no
aparece la línea, la prueba debe considerarse no válida.
En los sueros muy positivos, la banda puede ser débil, aunque visible.
Se debe obtener un resultado positivo claro.
CRITERIOS DE DESEMPEÑO (dependen de la marca)
1. Exactitud.
En un estudio con un total de 150 muestras, la exactitud fue de 99%.
Falsos positivos son inferiores al 1%
Falsos negativos inferiores al 1%
2. Reproducibilidad.
La precisión fue determinada mediante 5 réplicas de 5 muestras que fueron identificados
correctamente el 100 % del tiempo.
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3. Especificidad.
Las siguientes concentraciones de hormonas homólogas a la hCG no presentaron
interferencia en el diagnostico
TSH 1000 mUI/L WHO 68/38
LH 300-500 UI/L WHO 2do IS 80/552
FSH 1000 UI/L WHO 1er IS 83/575
4. Sensibilidad.
Valor discriminante: niveles de hCG de 20 UI/L o superiores.
Muestras de orina con niveles de hCG (1 000 000 UI/L) resultan sistemáticamente
positivas.
Orinas de hombres sanos y mujeres no embarazadas presentan niveles de hCG no
detectables.
5. Efecto prozona
Ausente por lo menos hasta concentraciones de 1 000 000 mUI/mL de hCG.
INTERFERENCIAS
En los casos de embarazo ectópico, toxemia del embarazo y aborto inminente, la
excreción de hCG puede estar disminuida obteniéndose resultados falsos negativos.
Muestras de mujeres con enfermedades trofoblásticas como cori-carcinoma o mola
hidatiforme, que secretan hCG, pueden producir resultados falso positivos.
Cuando la orina es diluida la concentración de hCG puede no ser representativa
de la concentración en la sangre, y la prueba puede dar un falso negativo.
LIMITACIONES DEL MÉTODO.
o La prueba es sólo para diagnóstico in vitro profesional.
o Resultados preliminares cualitativos, no son concluyentes.
o Deben excluirse enfermedades relacionadas con hCG antes de realizar un
diagnóstico de embarazo.
o No puede distinguirse un embarazo ectópico.
o La tira reactiva si se mantiene dentro de la muestra mucho tiempo, las sustancias
químicas impregnadas en la tira tienen a disolverse, con lo que se obtendrán lecturas y
cifras pocos precisas.
o Si los reactivos de la muestra se mezclan, las lecturas también serán poco
precisas.
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3- REALIZACIÓN DE LA PRUEBA hCGTIPO DE ENSAYO: CUALITATIVOMUESTRA: SUERO / ORINASENSIBILIDAD: 25 mUI/MlESPECIFICIDAD: > 99 %MÉTODO : INMUNOCROMATOGRÁFICOPRESENTACIÓN: TIRAS REACTIVAS
MUESTRAS
Orina: recogido mediante procedimientos estándar en recipiente limpio y estéril
No es preciso filtrar ni centrifugar a menos que presenten precipitados visibles.
Se recomienda utilizar la primera orina de la mañana puesto que ésta contiene la máxima
concentración de hCG, aunque puede utilizarse orina recogida a cualquier hora del día.
La muestra debe ser analizada preferiblemente el mismo día de su recolección, si esto no
es posible consérvela en refrigeración. Las muestras son estables durante 2 días a 2-8ºC
o hasta un mes si se congelan a – 20ºC. Antes de realizar la prueba, la muestra debe
descongelarse completamente, homogenizarla y atemperarla. Evitar congelar y
descongelar repetidamente.
Suero: tomarse mediante venopunción normal, recolectarse en un recipiente sin
anticoagulante.
Puede obtenerse en cualquier momento pues no es necesario que el paciente esté en
ayunas.
No utilice muestras turbias ya que pueden estar contaminadas por microorganismos.
No utilice muestras hemolizadas.
Manipular todas las muestras y material utilizado como posiblemente infeccioso.
PROCEDIMIENTO ( Solo para uso profesional. )
1. Dejar atemperar los materiales y las muestras a temperatura ambiente.
2. Extraiga del recipiente de almacenamiento las tiras reactivas a utilizar e identificar
cada una con los datos de la muestra
3. Dispensar 0,5 mL de muestra en un pequeño tubo o frasco.
4. Sumerja la tira reactiva durante 10 a 15 segundos en la muestra de Suero/Orina
mientras el extremo de la flecha apunta hacia abajo. No sumerja la tira más allá de la
línea MAX (máxima) o roja.
5. Retírela y colóquela sobre una superficie plana, limpia, seca y no absorbente.
6. Examinar los resultados a los 3 minutos cuando analice una muestra de orina o a
los 5 minutos cuando analice una muestra de suero.
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Dependiendo de la concentración de hCG en la muestra, los resultados positivos pueden
observarse incluso antes de 40 segundos.
Para confirmar los resultados negativos, se requiere el tiempo completo de reacción
(cinco minutos).
LECTURA DE RESULTADOS:
La región de control (C) es la más cercana al lado de sujeción de la tira (cubierto con
película coloreada) y la región de prueba (T) es la más cercana al lado absorbente de la
tira reactiva.
No interprete los resultados después de 10 minutos de reacción.
Examinar la presencia de bandas coloreadas.
Resultado positivo. Aparecen dos bandas de color (rojo, violeta o rosa): una en la zona de
test “T” y la otra en la zona de control “C”.
El resultado es positivo aunque las bandas sean débiles, variar debido a que las
concentraciones de hCG varían en las diferentes etapas del embarazo.
La intensidad del color de la línea de la región de la prueba (T) puede variar dependiendo
la concentración de hCG presente en la muestra. Por lo tanto, cualquier coloración, por
muy débil que sea ésta, en la línea de la región de la prueba (T) deberá considerarse
positiva.
En los sueros con elevada concentración de hCG, la banda en la zona de control “C”
puede ser débil.
El resultado positivo indica que se ha detectado una concentración de hCG mayor o igual
a 20 mUI/ml en la muestra.
Resultado negativo. Aparece una banda de color únicamente en la zona de control “C”.
No hay una banda visible en la región de prueba (T).
Resultado Incorrecto. Ausencia de bandas de color o presencia de una única banda en la
zona de test “T”.
Repita de nuevo el procedimiento utilizando una nueva prueba reactiva.
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CONCLUSIÓN
Las tiras reactivas permiten la determinación visual cualitativa en un sólo paso de la
presencia de Gonadotropina Coriónica Humana (hCG) en muestras de suero u orina
como ayuda para detección temprana del embarazo mediante un inmunoensayo por
cromatografía de flujo lateral en fase sólida donde la mezcla fluye por capilaridad a través
de la tira.
La prueba utiliza dos líneas para indicar los resultados. La línea de la prueba utiliza una
combinación de anticuerpos que incluyen un anticuerpo monoclonal hCG-colorante para
detectar selectivamente niveles elevados de hCG. La línea de control está compuesta por
anticuerpos policlonales de cabra en fase sólida y partículas coloidales de oro.
Una vez sumergida la tira en la muestra, un anti-hCG marcado con oro coloidal se
solubiliza y se une a la hCG presente en la muestra.
En menos de 5 minutos, pueden detectarse niveles de hCG tan bajos como 10 mIU/ml.
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GLOSARIO
Análisis cualitativo: estudio detallado que detecta la naturaleza de las diversas
sustancias presentes en un material o muestra. Determina sus componentes y
propiedades.
Anticuerpo: son moléculas proteicas secretadas por un tipo celular del sistema inmune,
tienen afinidad por sus antígenos correspondientes.
Anticuerpo monoclonal:
Anticuerpo policlonal:
Antígeno: es una molécula de superficie celular, principalmente proteínas, que puede
inducir la formación de anticuerpos.
Epítopo: porción específica de un antígeno que es reconocida por las células
presentadoras de antígenos, produciendo de esta manera una respuesta inmune
específica.
Especificidad: es la capacidad que tiene de catalogarlo como sano cuando no lo es. La
propiedad de un método de responder exclusivamente a la característica o el analito
definido.
Límite de detección: es la cantidad más baja de analito que puede detectarse, pero no
necesariamente cuantificarse, bajo las condiciones experimentales establecidas.
Selectividad: es la capacidad del método para evaluar únicamente el principio activo
íntegro de forma exacta y específica, en presencia de los dos componentes que puedan
estar.
Sensibilidad: es la capacidad de una prueba de diagnosticar a un paciente como
enfermo cuando no lo es.
Oro coloidal: también conocido como “nanogold”, es una suspensión o coloide de micro-
partículas clasificadas de oro en un líquido, generalmente agua.
El líquido es de color rojo intenso para las partículas menores de 100 nanómetros o un
color amarillento sucio para partículas más grandes.
Las nano-partículas pueden venir en una variedad de formas: esferas, barras, cubos, y
casquillos.
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