La Tricomoniasis Bovina y sus Efectos en la

FertilidadJosé Alejandro Ramírez Godínez*, Cathia Cecilia Lastra

González, Everardo González Rodríguez, Alberto Grado Ahuir, Ivan Leyva y Jeff Baxter

EXPOGAN 2017, Chihuahua, Chih.Septiembre 2017

Introducción• Enfermedad venérea (enfermedad contagiosa

que se contrae a través de relaciones sexuales)

• Causada por Trichomonas foetus

• Protozoo flagelado y se encuentra en ambientes pobres de O2

• Causa balanopostitis, vaginitis, infecciones uterinas, infertilidad y aborto

(OIE, 2004)

Etiología

• Protozoario

• Parabasalia

• Anaerobio

• Longitud 10 a 25 μm

(Bowman, 2009)

Morfología

• Forma de célula elíptica o periforme

• Mide aprox. 10 a 25 X 3 a 15 micras

• Móvil a 37°C

• Tres flagelos anteriores y uno posterior

• Reproducción por fisión binaria

Flagelos

(Quiroz, 1990)

Signos clínicos

Machos:Balanopostitis y nódulos

purulentos

Hembras:Vaginitis, metritis, piometra,

repetidoras, aborto

• Vacas: Muerte fetal (fetos momificados)Piometra Infertilidad

• Toros: Portadores asintomáticos?

• Grandes pérdidas económicas $$$$$

(Grahn et al., 2005 y Rae et al., 2004)

Patogénesis

• Infección desaparece en 4 a 5 meses (estros)

• Parasito se adhiere en la vagina y pasa al útero

• Parasito no afecta la fertilización?

• Hipotrofia de la placenta

• IgA e IgG causan aglutinación e inmovilización

(Corbeil et al., 2005, Iyer, 2014, Monteavaro et al., 2008, Singh et al., 2004)

Patogénesis • Se localiza en la mucosa del pene,

prepucio (criptas) y uretra (interior)

• No afecta la calidad del semen

• No se observan lesiones histológicas?

• No hay respuesta inmunológica

▫ Asintomática

▫ Infección persistente

• Infección crónica en animales > 4 años

• Parasito sobrevive a la criopreservación del semen

(Rae y Crews, 2006, Corbeil et al., 2005, Cobo et al., 2011, Felleise, 1999, González et al., 2012)

Epidemiología• Distribución mundial

• Monta natural como principal medio de reproducción

• E.E. U.U. Prevalencia de 1.25% - 6%

• Dx obligatorio en E.E. U.U.

(Rae et al. 2004, TAHC, 2015)

• Historia: Reportada por primera vez como causa de falla reproductiva en ganado bovino por Kunstler en 1888. En EE. UU., fue detectada en 1932 por Emmerson y para 1950 ya era prevalente en el hato Norteamericano

• Prevalencia: Casi todos los estudios de prevalencia han sido reportados utilizando el cultivo y microscopia con una sola toma de muestra por toro como medio de diagnostico (0.18-6%) en algunos de los estados de EE. UU. Sin embargo, la estimación exacta de la prevalencia actual y real en EE.UU no a sido reportada correctamente

• Prevalencia en México es desconocida: Pero en Estados vecinos como Texas en el año 2014, se muestrearon alrededor de 29 mil toros, y la prevalencia con diagnostico de PCR de Tiempo Real fue de 2.4%

• Economía: Impacto negativo sobre la reproducción

Revisión: Historia y Prevalencia de

Tricomoniasis Bovina

https://commons.wikimedia.org/wiki/File%3AAngus-bull-van-buren-tn1.jpg

-Monta natural-Sistema de producción extensivo-Época de empadre no definida-Toros comunales -Rancho aledaño a hato infectado-Mezcla de ganado-Falta de diagnostico-No haber muestreado el total de toros (tres muestreos para confirmar)-Inseminación artificial (IA) con semen contaminado-Infección iatrogénica

Factores de riesgo

Diagnóstico

• Microscopía directa

• Ténicas molec

Trichit™ TrichomoniasisKit

Diagnóstico

• 6 medio de transporte enriquecido (InPouch™, BioMed Diagnostics)

• Observar al microscopio

• Sensibilidad variable

(Yao, 2013, McMillen y Lew, 2006, Mukhufhi et al., 2003, Perez et al., 2006)

Diagnóstico

• PCR en tiempo real aceptado por la USDA

Tratamiento y control

• Raxol, colchicina, nocodazol y metronidazol(generan resistencia, no rentables)

Adoptar medidas de prevención y control

apropiadas

(Furtado y Benchimol, 2004, Rodning et al., 2011, Ortega y Pereira, 2001)

Vacunación

Vacunación con anticuerpos monoclonales TF1.17 y TF1.15:

• Evita la adhesión a las células epiteliales vaginales

• Inducen a los anticuerpos IgG e IgAen las secreciones vaginales y uterinas

• Depuración de la infección en 7 semanas

Vacunación con células enteras

(Singh et al., 2001, Cobo, 2004, OIE, 2004)

Vacuna mono y polivalente

(Trichguard™ y Trichguard V5L™)

• 4 semanas antes de la temporada de empadre

• Aplicación reduce la propagación

T. foetus

(Boehringer Ingelheim, 2016).

IMPORTANCIA EN HUMANOS (WHO)

• Más de 1 millon de enfermedades de transmisión sexual por día son adquiridas mundialmente (>350 millones/año)

• 78 mill gonorrea

• 5.6 mill sífilis

• 143 mill tricomoniasis• 131 mill clamidia

La mayoría de los hombres tratados para tricomoniasis reinciden (70%)

• México importa entre 250 y 350 mil toneladas de carne al año (15% del consumo nacional)

• Necesidad de mejorar y optimizar los sistemas de producción

• Tricomoniasis bovina genera perdidas de entre $2,000 a $2,500 USD por toro infectado en E.E. U.U.

(Fox et al., 1995)

Objetivo

Determinar la prevalencia e

identificar factores de riesgo de la infección de T.

foetus en toros del estado de

Chihuahua

Área de estudio

• Sementales de diferentes ganaderías del estado de Chihuahua

• Análisis de laboratorio se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Zootecnia y Ecología (UACH)

Descripción de la población• Muestras de 743 toros se obtuvieron de diversas

razas para producción de carne: Aberdeen Angus Brangus Charolaís Brahman Beef Master Hererford Criollo Rodeo Limousin Salers Pardo Suizo Simmental

Único criterio de selección que el toro hubiera comenzado su vida reproductiva (en el estudio se incluyeron toros de 1 a 15 años)

Sample size to estimate true prevalence

InputsAssumed true prevalence 0.25Sensitivity 0.98Specificity 0.98Population size 60000Confidence 0.95Desired precision 0.05

ESTUDIO DE LA PREVALENCIA DE Tritrichomonas foetus EN TOROS DE GANADO

COMERCIAL EN EL ESTADO DE CHIHUAHUA, MÉXICO

Sample sizes for varying sensitivity and specificity for population = 60000Samples sizes required for true prevalence = 0.25, precision = 0.05 and a range of sensitivity and specificity values are shown below:

Se = 0.7 Se = 0.8 Se = 0.9 Se = 0.95 Se = 0.99 Se = 0.999

Sp = 0.7 2220 1467 1039 892 795 775

Sp = 0.8 1320 957 727 643 585 573

Sp = 0.9 791 620 501 454 422 415

Sp = 0.95 603 491 410 377 353 348

Sp = 0.99 479 403 346 321 303 300

Sp = 0.999 453 385 332 309 293 289

Humphry RW, Cameron A, Gunn GJ, 2004. A practical approach to calculate sample size for herd prevalence surveys. Prev. Vet. Med. 65: 173-188

Sample size to estimate true prevalence based on sensitivity and specificity of the assay performed:

Results

Sample size requiredSample size

Population = 60000 320

Toma de muestra y manejo de muestra

1

• Usar guantes quirúrgicos

• Recortar el pelo del orificio prepucial, sí este se encuentra sucio lávelo con agua y seque

• Sí es necesario realizar un lavado de la cavidad prepucial con solución salina utilizando una jeringa de 50 ml o cateter de infusión

• Introducir el catéter en el

prepucio hasta que tope y

deslizar de arriba hacia abajo para

realizar el raspado

• Aspirar el esmegma con

jeringa de 20 ml conectada al

catéter 2Trichit™ Trichomoniasis Kit

Toma de muestra y manejo de muestra

• Vierta la muestra en la bolsa con el medio de incubación

• Aspire el medio 2 o 3 veces para evitar dejar residuos en el catéter y jeringa.

• Cierre la bolsa con el medio y colocar el medio con la muestra en hielo (<24 h) hasta su incubación

3

Toma de muestra y manejo de muestra

InPouch™ TF Bovine

Toma y manejo de la muestra

Las muestras son incubadas a 37°C x 24 hrs

4

• Consiste en aislamiento y purificación de moléculas de ADN del parasito

• Se basa en las características fisicoquímicas de la molécula

• Matrices inorgánicas (perlas magnéticas) capaces de retener microgramos de ADN

Extracción de ADN

(Alejos et al., 2011)

Extracción de ADN

1. 300 µl muestra

2. 350µl de lysis/BindingSolution Concentrate

3. 2 µl de Carrier RNA

4. 2 µl de XenoDNA

5. 350 µl de isopropanol al 100%

6. 10 µl de DNA Binding Beads

7. 10 µl de Lysis/BindingEnhancer

MagMAX™ Pathogen RNA/DNA KitLIFE TECHNOLOGIES

PCR en Tiempo Real

• Método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos

• Amplifica millones de veces una secuencia especifica de ADN

• Utiliza un molde de ADN, un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón y un fluoroforo (Fluorescencia).

(Tamay et al., 2013)

PCR en tiempo real

1. Master Mix 12.5 µl

2. Sonda Probe 1 µl

3. H2O 3.5 µl

4. Muestra 17 µl

5. Introducir al

termociclador

6. Correr el programa

Trichomonas Foetus DNA Test Kit

PCR en tiempo real

En el eje Y se muestra la cantidadde fluorescencia y en el eje X los ciclos de la reacción. La amplificación se detecta en cada ciclo de la reacción, midiendo el incremento de la fluorescencia que es proporcional al aumento de ADN.

Distribución geográfica del muestreo

MuniciospositivosMunicipios negativos

Resultados

Negativo77%

Positivo23%

Prevalencia de T. foetus en toros del estado de Chihuahua

Edad como factor de riesgo asociados a la

infección por T. Foetus

25

120

73

63 6470

66

53

25

81 12

8

1612

20

29 2925

8 51 10

20

40

60

80

100

120

140

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Edad como factor de riesgo a T. foetus

Negativos

Positivos

No

. d

e to

ros

Edad (años)

• Edad factor de riesgo de Trichomoniasis Bovina:

1. Desarrollo de criptas en el prepucio del toro

2. Promiscuidad asociada a toros adultos (son expuestos a más hembras en comparación a toros jóvenes)

3. Supresión del sistema inmunológico con la edad

4. Líbido y capacidad de monta

Distribución

de toros

infectados

001 Ahumada002 Aldama003 Allende004 Aquiles Serdán005 Ascención006 Bachíniva007 Balleza008 Batopilas009 Bocoyna010 Buenaventura011 Camargo012 Carichí013 Casas Grandes014 Coronado015 Coyame del Sotol016 La cruz017 Cuahutémoc018 Cusihuiriachi019 Chihuahua020 Chínipa021 Delicias022 Dr. Belisario Dominguez023 Galeana024 Santa Isabel025 Gómez Farías026 Gran Morelos027 Guachochi028 Guadalupe029 Guadalupe y Calvo030 Guazapares031 Guerrero032 Hidalgo del Parral033 Huejotitán034 Ignacio Zaragoza035 Janos036 Jiménez037 Juárez 038 Julimes

039 López040 Madera041 Maguarichi042 Manuel Benavides043 Matachí044 Matamoros045 Meoqui046 Morelos047 Moris048 Namiquipa049 Nonoava050 Nuevo Casas Grandes051 Ocampo052 Ojinaga053 Práxedis G. Guerrero054 Riva Palacio055 Rosales056 Rosario057 San Francisco Borja058 San Francisco Conchos059 San Francisco del Oro060 Santa Bárbara061 Satevó062 Saucillo063 Temósachi064 El Tule065 Urique066 Uruachi067 Valle Zaragoza

Prevalencia de T. foetus por raza

Raza No. de torosRepresentac

ión de la raza (%)

No. de positivos a

T. foetus

Prevalencia (%)

Aberdeen Angus

138 18.6 16 11.6

Brangus 182 24.5 47 25.8

Charolais 164 22.0 49 29.9

Criollo 35 4.7 13 37.1

Hereford 145 19.5 14 9.7

Salers 34 4.6 10 29.4

Limousin 21 2.8 8 38.1

Otros 24 3.2 5 20.8

Total 743 162 21.8

Alternativas de solución1. Sacrificar toros positivos

2. Repetir la prueba en sospechosos (a los 2 meses)

3. Realizar el dx de preñez en el hato

-Vacas vacías dejarlas repetir 2 o 3 ciclos

- Vacas preñadas que aborten eliminarlas

4. Uso amplio de la sincronización del estro e IA

Alternativas de solución

5. Evitar el uso de sementales mayores de 8 años de edad en hatos infectados

6. Introducir toros vírgenes o probados negativos

7. para admitir toros en los centros de recolección de semen sea necesario presentar certificado negativo

8. Dar a conocer la prevalencia de tricomoniasis en bovinos en foros y ferias ganaderas

9. No permitir la movilización de toros mayores de 18 meses de edad sin prueba negativa ya sea entre hatos o estados

PREGUNTAS y/o COMENTARIOS

GRACIAS

Referencias

• SIAP. 2014. Bovino carne. Población ganadera 2005-2014. En http://www.siap.gob.mx/opt/poblagand/bovcarn.pdf. Consultado 29 enero 2016

• Fox, E., D. Hobbs, J. Stinson y G. M. Rogers. 1995. A preliminary survey of North Carolina slaughterhouse bulls for Trichomonas Foetus. Animal Husbandry Newsletter. 5.

• Alejos L., A. Martinez y R. Cornejo. 2014. Extraccióny purificación de ADN. Herramientas molecularesaplicadas en ecología: 1-25.