Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)

Marvyn Inga Caqui Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Ingeniería

E-mail marvyn_16@hotmail.com

Resumen

En el siguiente informe se expone las partes que conforma un microscopio electrónico de transmisión (TEM) comenzando por describir las partes principales: el cañón de electrones, las lentes electromagnéticas, la cámara de observación, entre otros. Así también se describe las etapas más importantes, como la formación de imágenes, el del vacío que se debe generar dentro del microscopio para que se pueda hacer todo el proceso anterior, etc.

Abstract

The following report outlines the parts of a scanning electron microscope (SEM) beginning with the description of the principal parts: the electron gun, the electromagnetic lenses, the chamber of observation, among others. This also describes the most important stages, such as imaging, the vacuum that must be generated within the microscope so we can do all the above process, etc.

I. Introducción La microscopía electrónica ha revolucionado el conocimiento de las ciencias como la biología o la medicina, aunque su campo de aplicación se ha extendido a la mayoría de disciplinas científicas, incluidas las de materiales. La principal ventaja de este tipo de microscopía es alcanzar una extraordinaria amplificación de la imagen de la muestra manteniendo un poder de resolución casi mil veces mayor que el óptico. Estas magníficas propiedades se deben a que la fuente de iluminación usada es un haz de electrones. El funcionamiento de la microscopía electrónica, sobre todo la de transmisión (TEM), es análogo al funcionamiento de un microscopio óptico. El funcionamiento de los microscopios electrónicos (ME) se basa en la interacción de los electrones con la materia y a partir de esta obtener información tanto estructural como de caracterización de defectos. En muchos sentidos, el microscopio electrónico ME ofrece una solución ideal a los problemas que presentan los microscopios ópticos (λ≈0.5μm) que no pueden obtener resolución atómica ya que la longitud de onda de la radiación incidente es demasiado grande. Con un ME se pueden obtener electrones acelerados con λ asociada bastante menor de 1Å, y por tanto se puede obtener, al menos teóricamente, resolución atómica. Con las lentes adecuadas se puede transformar los electrones difractados en la imagen real. Además de usarse para difracción e imagen, el ME tiene otros usos. El Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM), que es el que vamos a describir ahora, es un instrumento que permite obtener una imagen aumentada de la muestra utilizando los electrones primarios que la atraviesan.

II. Fundamento Teórico A. Principio básico del TEM El TEM es muy similar al microscopio óptico, pues ambos tienen lentes y condensadores para concentrar la iluminación sobre la muestra (Ver FIG.Nº1). Los rayos de iluminación atraviesan la muestra y son enfocados por las lentes del objetivo y de proyección para formar una imagen aumentada sobre una pantalla fluorescente. Sin embargo el microscopio electrónico es mucho más complejo. Para que los electrones puedan ser acelerados hasta la velocidad prefijada, debe trabajarse en condiciones de alto vacío (10

-4 a 10

-6Torr; 1Torr =

1mmHg a 0°C). El sistema central del microscopio electrónico incluyendo la pantalla fluorescente y el equipo fotográfico, lo constituye un tubo hueco. El equipo eléctrico que suministra la corriente necesaria se halla generalmente situado a una cierta distancia para evitas la interferencia de los campos magnéticos dispersados. La mayoría de los microscopios están equipados con dispositivos de seguridad que no permiten conectar el filamento de alto voltaje hasta que no se ha conseguido el vacío apropiado. Las lentes magnéticas del microscopio electrónico están formadas por imanes en forma de herradura. El imán puede ser permanente o de tipo electromagnético. Variando la potencia de la corriente a la lente se consigue el efecto de variar la distancia focal de la lente continuamente, lo cual es muy similar al sistema de "zoom". Sin embargo, normalmente se preselecciona la corriente deseada. Se pueden ajustar los voltajes de aceleración en una gama que incluye 40, 60, 80 y 100kV, etc. Ajustando kV a un nivel inferior, se consigue aumentar el contraste.

FIG.Nº1. El sistema óptico de un microscopio clásico (izquierda) y un electrónico (derecha).

B. Componentes Básicos del SEM

Cañón de electrones: El tipo más usado de cañón electrónico consiste de un filamento de alambre de tungsteno doblado en forma de V. El electrodo de control se denomina cilindro de Wehnelt, y tiene una apertura circular de 1 a 3mm de diámetro centrada en el ápice del filamento. La superficie cóncava hace las funciones de ánodo, y utilizando una superficie convexa la imagen de la fuente electrónica puede reducirse en tamaño respecto al electrodo cóncavo. La intensidad total del haz de cátodo a ánodo puede ser de 10 a 400μA, pero solamente una pequeña fracción die éste llega hasta la muestra. También es posible obtener emisión de un material aplicando una diferencia de potencial (voltaje extractor) a una punta muy fina (por ejemplo un cristal de tungsteno); de tal manera que aparezca un campo eléctrico suficientemente alto que permita la tunelización de los electrones, los cuales son luego acelerados por la aplicación de un voltaje acelerador; este proceso se conoce como emisión por efecto de campo.

Condensadores. Los dos condensadores son capaces de dar una amplia gama de intensidad ajustando el cañón electrónico. Esto reduce el área iluminada en la muestra. Sin embargo, otras partes de la muestra también sufren los efectos del haz electrónico. El primer condensador reduce la imagen de la fuente mientras que el segundo condensador obtiene la la adecuada intensidad de iluminación.

FIG.Nº2. Esquema del cañón de electrones con el sistema de alta tensión, cilindro de Wehnelt y parte anódica.

Plataforma para la colocación de la muestra. La plataforma para colocar la muestra está situada en frente del objetivo. Se introduce la muestra en la columna del microscopio a través de una abertura.

Objetivo. El objetivo es la lente más importante en el microscopio electrónico. La distancia focal de esta lente está comprendida entre 1 y 5mm, siendo 1,1mm la más frecuente. Cuanto menor es la distancia focal, mayor es la resolución. Debido a que el haz de imagen tiene la máxima apertura angular en el primer objetivo, esta lente controla la calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberración esférica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite, introducir metal para compensar la inhomogeneidad inherente de la lente, y obtener elevada resolución. Otro accesorio importante, permite regular la apertura del objetivo, la cual limita la dispersión de los electrones, evitando así la degradación de la imagen. Esta apertura mejora el contraste siendo 20 y 40μm los más frecuentes.

Lente intermedia. La lente intermedia puede aumentar o disminuir la imagen. Se puede conseguir esto, aumentando o disminuyendo la potencia de la corriente a esta lente.

Lente de proyección. La lente (de proyección corresponde al ocular del microscopio óptico. Su función es la de proyectar la imagen real sobre la pantalla fluorescente, y permite una amplia gama de aumentos. Se puede variar la ampliación de 100X hasta 300.000X usando lentes intermedias y de proyección.

Cámara de observación. La cámara de observación y la pantalla fluorescente están situadas en el fondo de la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y el enfoque fino

se consigue con unos binoculares de 6 y 20X. El diámetro del punto de enfoque es de 100μm, por lo tanto la imagen debe ser mayor que este diámetro para ser resuelta. La cámara de observación está protegida por un vidrio grueso de plomo para evitar la emisión de rayos X.

Cámara fotográfica. La cámara fotográfica está situada debajo de la pantalla fluorescente. La pantalla fluorescente está sujetada por un lado, y al quitar el paso del haz electrónico la imagen se centra sobre la película fotográfica. Se pueden usar varios tipos de películas y placas de vidrio.

Platina del portamuestras. El porta-muestra se adapta para mantener un tamaño estándar de la muestra, el tamaño de la rejilla es 3.05mm de diámetro con una malla que se extiende desde unos pocos hasta unos 100 micras.los materiales son de cobre molibdeno, oro ó platino. C. Sistema de proyección o visualización de las

imágenes. En el caso del microscopio electrónico la formación de la imagen se produce por la dispersión de los electrones, mientras que en el óptico la imagen se produce por absorción de los fotones. Es decir la imagen que se observa en un microscopio óptico (MO) se debe a la diferente absorción de la luz por las distintas estructuras de la muestra, mientras que en el microscopio electrónico la formación de la imagen está en función de la dispersión y, por consiguiente, perdida de los electrones. Esta capacidad de dispersión va a depender de las distintas estructuras atómicas de la muestra. Las imágenes se pueden producir a partir de los electrones difractados (imágenes de campo oscuro) o a partir de los electrones directos que han atravesado la muestra sin interacción (imágenes de campo claro/brillante). Hay que tener en cuenta el espesor de la muestra y de las condiciones de focalización. Microcristales muy delgados son los ideales (espesor < 500Å) y se deben tomar varias fotos con diferentes condiciones de focalización. Las imágenes se pueden comparar con las generadas/calculadas a partir de una estructura modelo y de unas condiciones de focalización determinadas.

FIG.Nº3. Esquema del sostenedor de muestra TEM.

FIG.Nº4. Esquema de la columna electro-óptica de un

TEM. La imagen viene dominada por la presencia de átomos pesados ya que el factor de dispersión de los electrones varía mucho con el número atómico. También es importante recordar que la imagen que se graba es la proyección de la estructura a lo largo de la dirección del haz lo que conlleva problemas a la hora de la interpretación de las imágenes. No hay una forma directa de reconstruir la estructura tridimensional de un material a partir de una proyección determinada a lo largo de un eje. Por esto, los métodos para obtener las estructuras de compuestos a partir de imágenes TEM se basan en la comparación entre las imágenes observadas y las calculadas mediante un modelo estructural, para unos tamaños/espesores de cristal y condiciones de focalización dadas. Se debe partir de un modelo estructural bastante aproximado y la optimización de las coordenadas atómicas dan errores mucho mayores que los métodos basados en difracción de rayos-X y de neutrones. El contraste que se observa en las microfotografías TEM se debe a las diferencias en el potencial electrostático en el cristal. Un ejemplo de microfotografía TEM se da en la FIG.Nº5 La cordierita es un silicato que tiene canales amplios constituidos por anillos de seis tetraedros. La estructura ha sido determinada con datos de rayos-X de monocristal.

FIG.Nº5. Imagen TEM de la cordierita con una proyección de la estructura superpuesta.

D. Sistema de vacío Es necesario obtener un alto vacío en el microscopio electrónico. El vacío deberá ser siempre superior a 10

-4mbar Para la obtención de este alto vacío se

utilizan dos sistemas de bombeo:

Bomba rotatoria que permite hacer un pre-vacío; se obtiene así una presión de 10

-3 mbar.

Bomba difusora de aceite que permite obtener hasta 10

-6 mbar.

El uso de una bomba criogénica de N2 permite obtener mejor nivel de vacío y evita contaminación de la muestra y la columna. Así mismo, se utiliza el llamado "dedo frío" alrededor del sitio de la muestra para evitar contaminación de la misma.

E. Preparación de la muestra para la observación

en el TEM.

Como la imagen que se forma en el TEM depende de que los electrones puedan atravesar la muestra, ésta ha de ser suficientemente delgada para permitirlo. Todas las técnicas de preparación, tanto de muestras materiales como biológicas, persiguen el objetivo de adelgazar o conseguir secciones muy finas del espécimen, menores a 100nm, afectando al mínimo su estructura original.

Preparación de muestras biológicas para el TEM.

En general, la preparación de estas muestras siempre sigue el mismo protocolo básico: fijación química, lavado, deshidratación en series de concentraciones crecientes de alcohol o acetona, inclusión en resina y polimerización. Según el objetivo perseguido, en alguno de estos pasos se incluye una etapa de tinción con metales pesados, tales como el osmio, el wolframio o el uranio.

FIG.Nº6. Imagen Sistema de vacio provisto de bombas rotatorios (B.M) y una bomba de alto vacio de difusión de aceite (B.D).

La siguiente etapa consiste en obtener cortes muy finos del material polimerizado. Para ello se utiliza un ultra-micrótomo.

Preparación de muestras de materiales en polvo para el TEM.

En la preparación de este tipo de muestras sólo hay que diluir una cantidad muy pequeña de muestra en un disolvente orgánico que no la afecte, habitualmente dicloroetano o acetona. También se puede utilizar agua si no hay alternativa. A continuación se busca la máxima dispersión sumergiendo la solución en un baño de ultrasonidos y, al cabo de un tiempo, ya se puede depositar una gota sobre una rejilla filmada con carbono para ser observada directamente una vez se haya secado.

Preparación de muestras materiales compactas para el TEM

Para este tipo de muestras se sigue un proceso de adelgazamiento en el que es necesaria la utilización de varios aparatos. En primer lugar el usuario ha de aportar una muestra que no supere las 200µm. de grosor. A continuación, el primer paso es cortar un disco de 3mm. de diámetro con el “Ultrasonic Disk Cutter” pues este es el tamaño de la muestra que se puede introducir en el TEM. El siguiente paso es excavar el disco por ambas caras hasta obtener una zona central de unas 20µm. con el “Dimpling Grinder”. Una vez conseguido, se introduce este disco en el “Ion Milling” para que sea atacado por ambos lados con sendos haces de iones de argón hasta que estos realizan un pequeño orificio central, alrededor del cual queda una zona suficientemente delgada.

III. Observaciones y discusión. Una lente clásica tiene un índice de refracción

constante en todo el espacio que ocupa, mientras que en las lentes electrónicas el índice de refracción dependerá de la magnitud instantánea del campo en cada punto.

Fig.Nº7. Relación de la frecuencia de los electrones con la resolución de las imágenes obtenidas con un microscopio electrónico.

Se observo la necesidad de un sistema de refrigeración ya que el TEM trabaja con un sistema de enfriamiento interno y si no se refrigera externamente se produciría condensación sobre el microscopio y lo puede dañar.

Al igual que con la óptica clásica. En la óptica de electrones se considera a la lente objetiva como el elemento más importante del sistema, esta lente es el corazón de un TEM. La función de la lente objetiva es acortar la distancia a la cual se forma la imagen, como esto depende de la longitud focal, entonces cuanto más corta sea ésta más poderosa será la lente. Pero más que nada se considera como una lente transformadora, puesto que la podemos imaginar como si fuera una computadora óptica capaz de generar transformadas de Fourier instantáneas.

La lente transformadora forma un patrón de difracción de Fraunhofer de la red espacial en el plano de la transformada de Fourier, o sea en el plano posterior. Enseguida las ondas se propagan y recombinan hasta llegar al plano imagen. En otras palabras la imagen surge de un proceso de doble difracción. Podemos imaginar que la onda incidente es difractada por el objeto y la onda difractada resultante es difractada, una vez más, por la lente objetiva. Si la lente objetiva no estuviera colocada el patrón de difracción de la muestra cristalina aparecería en el plano de la imagen. En esta discusión se ha considerado que la lente es ideal. Es decir, que se trata de una lente sin aberraciones. la cual mapea el objeto-muestra en una correspondencia punto a punto en la imagen.

Algunos defectos comunes en microscopia electrónica son[5]: Un bajo contraste debido a una preparación

y exposición incorrecta de la muestra, lo que se hace en estos casos es emplear reactivos para mejorar el contraste, conseguir una apertura adecuada, o también un revelador adecuado.

Una imagen borrosa con falta de detalles, puede darse debido a la inestabilidad del instrumento o a que la columna está contaminada, para evitar esto debe prepararse la muestra correctamente.

Líneas de difracción alrededor del área de la muestra debido a que el sistema de lentes esté contaminado o con un enfoque incorrecto, lo que se puede hacer en estos casos es limpiar el sistema de lentes y ajustar el “stigmator”.

La pantalla de observación no está iluminada uniformemente debido a que el haz no está bien centrado o a que las lentes de los condensadores están mal ajustadas, en estos casos tenemos que centrar y ajustar los condensadores como es debido.

Una pequeña área con una elevada densidad en el centro del campo debido a un escape de la luz cuando no se está usando apertura, lo que se puede hacer es emplear una pantalla de alta intensidad.

Marcas estáticas o grietas en emulsión debido a una permanencia de la película en vacío por mucho tiempo, para evitarse este problema no debe cargarse la película si no se va a utilizar.

Rayas y puntos blancos debido al polvo sobre los negativos antes de ser expuestos o marcas de dedos al cargarse, para evitar esto lo negativos deberán estar limpios y deberán cogerse por los extremos.

La posibilidad de equivocaciones a la hora de estar formulando juicio, cuando se trabaja con un microscopio electrónico no se puede descartar. Esta posibilidad debe considerarse sobre todo cuando se hace trabajo de alta resolución, en cuyo caso es posible tener una imagen semejante para dos arreglos atómicos estructuralmente diferentes.

Otro posible inconveniente radica en las dificultades técnicas que a menudo se descuidan al operar un TEM. Existe un buen número de parámetros sensibles a las condiciones del TEM que podrían dificultar la toma de buenas y, sobre todo confiables fotografías.

En el trabajo de microscopía electrónica puede ocasionarse daño por radiación a la muestra que se observa. puesto que los electrones incidentes pueden ionizar y/o desplazar átomos del material.

IV. Aplicaciones del TEM. Un microscopio electrónico puede usarse en una gran variedad de áreas de investigación, bien para confirmar hipótesis o para realizar algún nuevo descubrimiento. En biología pueden estudiarse tejidos, huesos, morfología, virus, bacterias, células, proteínas, etc. En ciencia de materiales, para identificación de materiales geológicos, determinación de estructuras cristalinas, en materiales compuestos, películas delgadas. En materiales cerámicos y metales para localizar y estudiar defectos o para hacer análisis químicos. Aunque la información obtenida por medio de la microscopia electrónica pudiera no ser suficiente, sí es, con frecuencia necesaria para entender la estructura interna de la materia, especialmente la cristalina.

V. Conclusiones. Se obtuvo conocimientos generales de las partes elementales de un TEM, así como también de la parte física de su operación. En conclusión, gracias a este instrumento se puede ahondar más allá de nuestros límites visuales, permitiendo de esta forma a la ciencia seguir hondando en los límites de lo desconocido, debido a esto tenemos que ser conscientes de lo indispensable que es hoy en día un microscopio electrónico en los laboratorios de investigación.

VI. Bibliografía. [1]. An introduction to Electron Microscopy. Mikros Scopeo. FEI Company. [2]. Microscopia Electrónica. Ampliación de Química Inorgánica. Parte II: Técnicas estructurales, 5º curso, 2004/2005. [3]. Introducción a la Microscopía Electrónica. Centro de Microscopía Electrónica. Escuela de Biología, Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. [4]. Fundamentos del microscopio electrónico y su aplicación en la investigación textil. A. Naik. [5]. Serie Científica Avanzada: El Microscopio Electrónico. Centro de Extensión Biomédica Facultad de Medicina Universidad de Chile. M. L. López [6]. Electron Microscopy and Photography. Kodak Publication. [7]. Introducción a la microscopia aplicada a las ciencias biológicas primera edición. Gerardo Vásquez, Olga Echevarría, 2000. [8]. El abc de la formación de imágenes en un microscopio electrónico. A. Huanosta-Tera. Instituto de Investigaciones en Materiales, Universidad Nacional Autónoma de México. 1999